DE19718652A1

DE19718652A1 - Vorrichtung zur Verbesserung der Trennung in der Flüssigkeitschromatographie

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Description

In der Chromatographie wird die Trennleistung über die Trennbodenzahl definiert. Diese ist von den unterschiedlichsten Faktoren abhängig. Sie wird beispielsweise durch feinere, porösere und größenhomogenere Trennmatrixpartikel verbessert.

Das Verhältnis von Fließgeschwindigkeit zur Parti kelgröße und zur Bindefestigkeit der Trennmatrix beeinflußt ebenfalls die Trennleistung. Hohe Fließ geschwindigkeiten führen zu einem starken Druck abfall im Trennrohr, was bei kompressiblen Matrices zur vollständigen Blockierung führen kann.

Sind alle matrixbedingten Parameter optimiert kann es immer noch dazukommen, daß es vor, während oder nach der Fraktionierung durch Störeinflüsse zu einer erneuten Durchmischung kommt, die die erreichte Trennung wieder zunichte macht. Ursachen hierfür können eine Kanalbildung in der Matrix ("chanelling") oder Toträume an den Enden des Trennrohres, in der Ableitung und in Detektoren sein. Auch die in einem Rohr eigentlich immer zu beobachtende Krümmung der Strömungsfront hat den gleichen Effekt der Materialverschleppung, was sich im Elutionsprofil als "tailing" bemerkbar macht.

Für die Verminderung dieser Fehlerquellen gab es die verschiedensten Ansätze. So wurde zur Vermeidung des "chanelling" die Baugrößen der Chromato graphiesäulen begrenzt und durch eine äußere Kompression die Matrixpackung stabilisiert. Eine Übersicht zu den verschiedenen Kompressions säulen sowie auch etwas zur Krümmung der Strömungsfront findet sich bei M. Perrut: J.Chrom. Ser.A 658 (1994) 293-313: Advances in supercritical fluid chromatographic processes.

Eine Vorrichtung zur Verminderung des "tailing" bei gekrümmter Elutionsfront findet sich in: DE G 93 17 551.5 (16.11.93). Der Hintergrund hierzu wird in DE OS 44 40 805.6-41 (16.11.93) beschrieben.

Unerwähnt blieben bisher die Ansätze, wie bei Trennrohren mit großen Durchmessern versucht wurde die unterschiedliche Durchströmung von Randzone und Zentrum auszugleichen:
DE OS 19 34 015 (15.11.70), DE OS 39 39 854 (13.06.90), EP OS 01 08 242 (29.09.83), DE 41 18 50 102 (03.06.91), DE OS 17 73 578 (06.06.68), DE OS 21 57 594 (20.11.72). Die letztgenannte Offenlegungsschrift benutzt als Zu- und Ableitung zur Peripherie und Mitte gleichlange Schlauchstücke. (Dies entspricht einem Teil des ersten Lösungsansatzes.)

Neben einer gleichmäßigen Stoffstromverteilung ist die Volumenänderung der Matrix während der Trennung ein weiteres Hauptproblem. Zur Behebung dieser Störung wurde die Auftragszone beispielsweise als Stempel ausgebildet: DE OS 30 21 366 A1 (06.06.81).

Bei einer anderen Kompressionssäule wiederum wird die Packung der Trennmatrix durch Hin- und Herschieben eines Dornes konstant gehalten.

Für solche Kompressionssäulen ist eine aufwendige Regelung und Mechanik notwendig. Außerdem treten bei den hohen Drücken an den beweglichen Teilen Dichtungsprobleme auf.

Wir sehen die erfinderische Aufgabe darin diese Nachteile zu beheben - oder zu wenigstens zu mildern.

Diese Nachteile seien nochmals zusammengefaßt:

- die über den Trennrohrquerschnitt ungleichmäßige Durchströmung,
- die Gefahr der Kanalbildung in der Matrixpackung bei Volumenänderungen,
- die bei Kompressionssäulen auftretenden Dichtungs probleme.

Wir möchten zwei Lösungen für diese Aufgabe vorstellen. Ihnen ist die Kompression durch einen beschleunigten Stoffstrom innerhalb der Matrix packung gemeinsam. Beide Lösungen unterscheiden sich andererseits aber in Probenauftrag und in der Nachführung der Siebplatte in der Auftragszone.

Im ersten Falle werden für Probe und Puffer das selbe Stoffstromverzweigungssystem verwendet und die Siebplatte wird der Matrixoberfläche pneumatisch nachgeführt.

Es handelt sich hier um eine Kompressionssäule, deren Kräfte innerhalb des sich stetig verengenden Trennrohres durch den beschleunigten Stoffstrom auf gebracht werden. Die eigentliche Kompressionsarbeit wird also von der Flüssigkeitspumpe geleistet. Die an sich bekannte Art der Stempelkompression wird hier nicht - wie sonst in Kompressionssäulen - zur Kompression der Matrix eingesetzt, sondern nur zum Nachführen und oberflächliches Anpressen der Siebpatte im kurzen zylindrischen Trennrohrbereich der Auftragszone. Hierdurch soll einer Spaltbildung zwischen Siebplatte und Matrix vorgebeugt werden. Pneumatisch muß deshalb nur ein geringfügig höherer Druck als von der Flüssigkeitspumpe aufgebracht werden. Hierin besteht ein wesentlicher Unterschied zu den beschriebenen Kompressionssäulen bei denen der Druck zum Komprimieren der Matrixpackung ausreichen muß. Die mit der Verengung des Rohres einhergehende Krümmung der Elutionsfront ist bis zum Durchmesserverhältnis eins zu drei für die meisten Anwendungen vernachlässigbar. Soll die Elutionsfront aber dennoch entzerrt werden gibt es hierfür wiederum zwei Lösungen:

1. Die Verwendung gewölbter Chromatographie böden wie in DE G 93 17 551.5 beschrieben oder
2. das Einsetzen von geschlossenen Kegeln oder Kegelstümpfen zur Laminasierung der Stoffströ me wie in Fig. 7B und C dargestellt.

Beide Entzerrungsverfahren werden bei Bedarf auch bei der folgenden zweiten Lösung angewendet.

Im zweiten Falle handelt es sich wiederum um eine Kompressionssäule, die nach dem Prinzip der strömungsbedingten inneren Kompression arbeitet. Hier wird Probe und Elutionspuffer über zwei verschiedene Leitungssysteme in einen großen Totraum, zum Schichtaufbau außerhalb der Matrix, geführt. Außerdem wird eine die Matrixoberfläche stabilisierende Loch- und Filterplatte durch ihre Eigenschwere, bzw. bei umgekehrter Anordnung durch mechanische Federn, angepreßt. Die Federn sind so stark ausgelegt, daß sie das Gewicht der Matrix in Position halten können wenn das Trennrohr umgedreht wird. Im Gegensatz zur ersten Lösung müssen sie hier nicht auch noch dem Druck der Flüssigkeitspumpe entgegenwirken, weil sie sich gemeinsam mit der Matrix im Trennrohr befinden. Hierdurch entfallen die Dichtungsprobleme einer konventionellen Kompressionssäule.

Die Pufferzuführung mündet an der Spitze eines kegelförmig ausgebildeten Innenlumens hinter einer porösen Diffusorplatte, die der Durchmischung im Totraum entgegenwirkt. Entgegen gängiger chromato graphischer Praxis wird hier also in der Auftrags zone ein großes Totvolumen angestrebt. In diesem Falle wird es allerdings ähnlich wie in einem Scheidetrichter zum Schichtaufbau genutzt. (Aller dings zeigt das Totvolumen im Vergleich zu letzte rem eine umgekehrte Anordnung.) Entgegen gängiger Meinung chromatographischer Praxis kann also trotz großen Totvolumens eine ausgezeichnete Trennung erreicht werden wenn gewährleistet ist, daß in ihm eine Durchmischung unterbunden wird. Durch den Schichtaufbau außerhalb der Trennmatrix wird über den ganzen Querschnitt eine gleichförmige Stoffver teilung erreicht. Dies macht ein verzweigtes Zulei tungssystem überflüssig.

Üblicherweise wird die spezifisch schwerere Probe, dem sich bereits im Totraum befindlichen Puffer, bei anfangs geschlossenen Säulenauslaß und geöffnetem Überlauf, unterschichtet. Der Auftrag muß hierfür spezifisch schwerer als der Puffer sein - oder er muß spezifisch schwerer gemacht werden. Falls dies nicht möglich oder nicht erwünscht ist, wird das Trennrohr umgedreht, damit der Auftrag aufschwimmt und sich unterhalb der Trennmatrix sammeln kann.

Wenn äußerst scharfbegrenzte Auftragszonen er wünscht sind kann die Zone des ersten verdünnteren Auftrages über das Ausgleichventil entfernt werden. Diese Möglichkeit besteht beim ersten Lösungsansatz nicht.

Beide beschriebenen Lösungen verbessern die Trennung in chromatographischen Verfahren und erlauben den Betrieb von Trennrohren mit größeren Durchmessern als bisher. Dies bringt weitere Vorteile:

1. Die Trennmatrix wird intensiver genutzt und man kommt vergleichsweise mit weniger Matrix aus.
2. Der Bau von Anlagen mit größeren Durchmessern führt zu sinkenden Produktionskosten.
3. Größere Durchmesser bei gleichem Füllvolumen und gleicher Trennleistung führen zu geringeren Bau höhen. Dies bringt weitere Vorteile:
- bei gleichem Betriebsdruck und bei gleicher Trennkapazität verkürzen sich die Trennzeiten,
- dadurch werden in der automatischen Produktion mehr Trennzyklen pro Zeiteinheit möglich,
- die Trennungen können bei geringerem Druck durchgeführt werden. Dies stellt geringere Anforderungen an die Geräte und die Druck unempfindlichkeit der Trennmatrix.

1. Beispiel Vorrichtung zur präparativen Auftrennung von Inhaltsstoffen aus einer im Vergleich zum Elutionspuffer spezifisch schwereren Lösung oder Suspension

Besonders vorteilhafte Anwendungen für dies Bei spiel sind die Entsalzung einer Proteinlösung und die fraktionierende Kristallisation. Fig. 2 zeigt das Oberteil, Fig. 6 das Unterteil des Trennrohres. (Bis zu einem Durchmesserverhältnis von eins zu drei ist ein gekrümmter Trennboden entbehrlich.)

Fig. 1 zeigt das Flußschema für seine Anwendung.

2. Beispiel

Vorrichtung zur präparativen Auftrennung von Inhaltsstoffen aus einer im Vergleich zum Elutionspuffer spezifisch leichteren Lösung oder Emulsion.

Im Vergleich zu Beispiel 1 muß die Vorrichtung modifiziert werden. Die Trennrichtung ist jetzt von unten nach oben (Richtung weicht von der Darstellung in Fig. 1 ab). Entsprechend muß auch das in Fig. 3 dargestellte Auftragsendstück verwendet werden. Da die Schwerkraft der Trennrichtung entgegenwirkt muß auch eine andere Eluatableitung gewählt werden die nicht mehr von der Schwerkraft abhängt. Ein geeignetes Endstück ist in Fig. 5 und Fig. 11 dargestellt.

3. Beispiel

Für die gleiche Aufgabe wie in Beispiel 1 bzw. 2 kann man auch präparative Säulen mit einem kegelförmigen Verdrängungskörper in der Anordnung B oder C wählen. Diese Säulen haben dann einen ebenen Boden.

Zu diesem Zweck kombiniert man das Oberteil in Fig. 8 mit dem Unterteil aus Fig. 11 zu einem Trennrohr. In der Anordnung C stellt die Fig. 11 den Querschnitt durch eine Seite des unten ringförmige ausgebildeten Trennrohres dar.

4. Beispiel Vorrichtung zur analytischen Auftrennung (Fig. 4)

Für die analytische Trennung wird im Vergleich zu den vorherigen Beispielen ein sehr viel schlankeres Trennrohr verwendet. Die Elutionsfront wird durch den eingesetzten Kegel weitgehend begradigt.

5. Beispiel Trennsäule mit externer Kompression

Nach dem in Fig. 10 und Fig. 11 dargestellten Prinzip, der Aufteilung der Austrittsfläche in kleinere Flächen von denen einzeln zu- bzw. abgeleitet wird, können nicht nur präparative Säulen (wie hier dargestellt) sondern auch analytische Säulen (hier nicht dargestellt) konstruiert werden. Bei solchen Säulen kommt man wegen der kleineren Durchmesser mit einer geringeren Zahl von Stoffströmen aus. Eine geeignete Anordnung ist der Auftrag über einen Ringkanal (entsprechend Fig. 10-5) mit der Zuführung von 6 Teilströmen und die Ableitung über nur eine zentrale trichterförmige Bohrung (entsprechend Fig. 11-5).

Für dieses Beispiel findet das Stoffstromschema aus Fig. 12 Anwendung.

6. Beispiel Laminarisierung des Stoffstromes in konischen Trennrohren durch Verwendung von kegelförmigen Verdrängungskörpern

Fig. 7 zeigt in einer Übersicht auf welche Weise der Stoffstrom innerhalb eines sich konisch verengenden Trennrohres laminarisiert (Herstel lung einer Parallelströmung) werden kann. Im dargestellten Schema ist maßstabsgerecht der Querschnitt solcher Trennvorrichtungen gezeigt deren Auftragsflächen sich zur Elutionsfläche wie 3 (F3) zu 1 (F1) verhalten. Die in B dargestellte Trennvorrichtung erhält man am einfachsten indem man von vornherein mit einer nach unten sich ringförmig öffnenden Trennvorrichtung arbeitet.

Man kommt natürlich auch zum selben Ergebnis wenn man die in Fig. 2 dargestellte Auftragszone mit dem Auslaß von Fig. 11 verwendet. Allerdings muß man dann aber die Verteilerplatte gegen eine Platte mit integrierten Kegel, wie in Fig. 10 dargestellt, austauschen. Wie aus der schematischen Darstellung der Fig. 7B hervorgeht kann man bei dieser nach unten ringförmig auslaufenden Trennvorrichtung keine vollständige Parallelisierung des Stoff stromes erwarten. Bei den dargestellten Durchmesser verhältnissen sind die Abweichungen jedoch so gering, daß sie tolerierbar sind.

Zur vollständigen Korrektur kann man bei anderen extremeren Durchmesserverhältnissen zwei Wege gehen. Bei der ersten Lösung fügt man einen zweiten nach unten kegelförmig zugespitzten Ring in die Trennvorrichtung ein. Dies bedeutet, daß man die in Fig. 7B und Fig. 7C dargestellten Korrekturen gleich zeitig in der selben Vorrichtung verwendet (ein Kegel kommt von unten, der andere von oben).

Der zweite Lösungsweg ist die Verwendung von ge krümmten Trennböden, die die Elutionsfront entzerren. Zur Entzerrung kann man also beliebige Kombinationen von eingefügten Kegeln und gekrümmten Trennböden verwenden. Es sind Verfahren die zum selben Ziel führen.

Bezugszeichenliste

Fig.

1
Fließschema für getrennten Probe- und Pufferauftrag

1

Ventil zur Wahl zwischen Probe (PE, a) und Puffer (BR, b)

2

Pumpe zum Proben- und Pufferauftrag

3

Ventil: Normalbetrieb (a) oder Rückspülung (b)

4

Ventil zur Wahl des Auftragsortes in der Trennsäule Trennmatrixoberfläche (a) oder Elutionskonus (b)

5

Ventil zur Wahl zwischen Pufferauftrag (a) und Öffnen des Druckausgleiches/Überlaufes (b)

7

Absperrventil am Trennrohrende, zu (a), auf (b)

8

Ventil zur Wahl des Behälters für Produkt (EL, b) oder Abfall (WA, b)

Fig.

2
Auftragsseite für normale Trennrichtung und ge trennten Auftrag von Probe und Puffer

1

Trennmatrix

2

Verteilerlochplatte mit hohem Eigengewicht

3

konisches Trennrohr

4

konischer Deckel

5

Siebplatte

6

Diffusor: Siebplatte zur Verteilung des Puffers

7

Probenzuleitung

8

Ringdichtung mit Dreiecksquerschnitt

12

Clampdichtung

13

Deckel

14

Überlauf bzw. Pufferzuführung

15

Verschluß/Stopfen

16

O-Ring

Fig.

3
Auftragsseite für beliebige Trennrichtung mit getrennter Zuleitungen für Probe und Puffer

1

bis

4

;

6, 7

und

12

bis

16

sind identisch mit

Fig.

2

5

Faservließ dient als Sieb und als seitliche Abdichtung

8

Druckfeder aus nichtrostenden Stahl

9

Platten aus nichtrostenden Stahl zur Positio nierung der Federn

10

Lochplatte zur Aufnahme des Federdruckes

11

Flanschdichtung für Druckplatte und Deckel

Fig.

4
Kompressionssäule für analytische Trennungen

1

Trennmatrix

2

Lochplatte mit integriertem Verdrängungskörper

3

Trennrohr

4

Schraubdeckel

5

Siebplatte

6

Diffusor

7

federnde Kanüle als Probenzuleitung

8

Anpreßfeder aus nichtrostenden Stahl

9

schwach gewölbte Siebplatte (Wölbung nicht essentiell)

10

Auffangtrichter mit Gewinde

11

O-Ringe

12

Ringdichtungen mit Dreiecksquerschnitt

13

Führungsrillen, die als Pufferzuleitung dienen

14

Pufferzuleitung

Fig.

5
Ableitung von der gewölbten Lochplatte durch ein geschlossenes Schlauchsystem für beliebige Trenn richtung
(Der Trichter als Gehäuse zum Aufbau eines pneumatischen Gegendruckes wurde zur Vereinfachung weggelassen.)

1

gekrümmte Lochplatt mit konischen Bohrungen und Nippeln zur Ableitung des Eluates

2

Siebplatte aus nichtrostenden Faserfließ

3

konisches Trennrohr

4

Schlauchlumen der Ableitungen sind gleich groß

5

Konische Bohrung

6

Zusammenführung der Schlauchleitungen

Fig.

6
Fakultativ offene Stoffstromableitung am gewölbten Chromatographieboden

1

gekrümmte Lochplatte

2

drahtgewebeverstärktes Faservließ

3

komisches Trennrohr

4

Abtropfdrähte

5

Auffangtrichter

6

Auslauf

7

absperrbare Belüftungs-/Waschöffnung

8

Zusätzliche Öffnung für Puffer bzw. Eluat

9

Buchse für Meßfühler

Fig.

7
Schematische Darstellung von Stromlinienverläufen
A im konischen Trennrohr
B im konischen Trennrohr nach Einsetzen eines Verdrängungskörpers mit der Spitze nach oben
C im konischen Trennrohr nach Einsetzen eines Verdrängungskörpers mit der Spitze nach unten
F1, F3 bedeuten 1 bzw. 3 Flächeneinheiten

Fig.

8
Auftragsseite mit getrennter Zuführung von Probe und Puffer mit integrierten Verdrängungskegel
Die Benennungen sind identisch mit

Fig.

2, lediglich der Verdrängungskegel (

2

) ist zusätzlich in die Lochplatte integriert. Bei normaler Trennrichtung ist er massiv und bei umgekehrter Trennrichtung hohl ausgebildet damit er aufschwimmt.

Fig.

9
Auftragsseite für normalen und umgekehrten Betrieb mit verzweigter Zu- und Ableitung
Die Benennungen sind außer denen von

7

und

14

mit denen in

Fig.

2 identisch

7

Druckzufuhrleitung

14

Puffer und Probenzuleitung

Fig.

10
Auftragsseite für normalen und umgekehrten Betrieb mit verzweigter Zu- und Ableitung sowie Ver drängungskörper

Fig.

11
Die Benennungen sind identisch mit

Fig.

9
Ebene Trennrohrendplatte zur Verwendung in belie biger Fließrichtung (Der Trichter als Gehäuse zum Aufbau eines pneumatischen Gegendruckes wurde zur Vereifachung weggelassen.)

1

Lochplatte mit konischen Bohrungen

2

Verdrängungskegel (optional)

3

konisches Trennrohr

4

Nippel zur Eluatableitung

5

Siebplatte

6

Schlauchsystem zur Ableitung

Fig.

12
Fließdiagramm des Stoffstromes bei Kompressions säulen mit verzweigtem Leitungssystem

1

Ventil zur Wahl zwischen Probe (PE, a) und Puffer (BR, b)

2

Pumpe zum Flüssigkeitstransport

3

Ventil für pneumatische Kompression (a) oder Entlastung (b)

4

Pumpe zum pneumatischen Druckaufbau

7

Absperrventil des Trennrohres, zu (a), auf (b)

8

Ventil zur Wahl zwischen Produkt (EL, b) und Abfall (WA, a)

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Verbesserung der Trennung in der Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß sich das Trennrohr in Fließrichtung im unteren Teil stetig verengt. Dadurch wird der Stoffstrom beschleunigt, was die Matrixpackung komprimiert und stabilisiert.
An den Enden des Trennrohres befinden sich zwei unterschiedlich ausgebildete Abschlußstücke mit jeweils mindestens zwei Öffnungen.
Dasjenige an der Auftragsseite hat ein großes, bevorzugt in einen Kegel auslaufendes, Todvolumen. Darin befindet sich eine beweglich gelagerte Sieb platte und bei Betrieb entgegen der Schwerkraft auch Rückhaltefedern.
Dasjenige an der Auslaufseite hat eine feste Siebplatte und einen Trichter zum Sammeln des Eluates mit mindestens einem Auslauf und mindestens einer weiteren verschließbaren Öffnung am oberen Trichterrand.
Die Trennmatrix wird zwischen den beiden Sieb platten in Position gehalten, wobei die Siebplatte der Zulaufseite über eine schwere Lochplatte, bzw. bei umgekehrter Anordnung zusätzlich durch Federn, der Matrix angepreßt wird.
Die Probenzuleitungen münden direkt an der Loch platte. Die Pufferzuleitung mündet hinter einer Diffusorsiebplatte am äußersten Ende des Auftrags konus in den Totraum.

2. Eine Vorrichtung zur Verbesserung der Trennung in der Flüssigkeitschromatographie ist dadurch gekennzeichnet, daß sich das Trennrohr in Fließrichtung im unteren Teil stetig verengt. Dadurch wird der Stoffstrom beschleunigt, was die Matrixpackung komprimiert und stabilisiert.
An den Enden des Trennrohres befinden sich zwei unterschiedlich ausgebildete Abschlußstücke mit jeweils mindestens zwei Öffnungen.
An der Auftragsseite befindet sich eine beweglich gelagerte Siebplatte mit einer aufliegenden, in der Peripherie abdichtenden, Lochplatte. Zu den Löchern der Platte führen als Zuleitung gleichlange Schlauchstücken. Diese werden zu einer Leitung vereinigt, bevor diese das Endstück verläßt.
Die Auslaufseite hat eine unbewegliche Siebplatte und eine wie die Zuleitung ausgebildete Ableitung. Sie verläßt den Trichter über seinen unteren Auslaß.
Die Trennmatrix wird zwischen den beiden Siebplatten dadurch in Position gehalten, daß auf die zweiten, noch nicht belegten, Öffnungen der Endstücken der selbe externe Gasdruck gelegt wird.

3. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2 ist dadurch gekennzeichnet, daß ein geschlossener kegelförmiger Verdrängungskörper in den sich verengenden Bereich des Trennrohres eingesetzt wird, um die durch die Verengung bedingte Krümmung der Elutionsfront zu mindern.

4. Die Vorrichtung nach Anspruch 1 und 2 ist dadurch gekennzeichnet, daß eine gekrümmte Sieb platte zur Entzerrung der Elutionsfront an der Aus gangsseite verwendet wird.

5. Die Vorrichtung nach Anspruch 3 und 4 ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Kombination von Verdrängungskörper und gekrümmter Siebboden zur Entzerrung der Elutionsfront verwendet wird.