DE19712634A1

DE19712634A1 - Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus Escherichia coli und deren Verwendung als Immunmodulator

Info

Publication number: DE19712634A1
Application number: DE19712634A
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Laves
Original assignee: LAVES ARZNEIMITTEL GmbH
Current assignee: LAVES ARZNEIMITTEL GmbH
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-10-01

Description

Die Erfindung betrifft eine niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus Escherichia coli und deren Verwendung als Immunmodulator.

Als Immunstimulatoren oder Immunmodulatoren bezeichnet man Substanzen, die das Immunsystem auf unterschiedliche Weise aktivieren und die zur Förderung der Immunabwehr und bei Immundefektzuständen therapeutisch angewendet werden. Als Immunmodulatoren werden zur Zeit pflanzliche Stoffe wie z. B. Lektine eingesetzt, aber auch Extrakte aus Mikroorganismen, Impfstoffe, bestimmte Allergene zur Induktion einer verstärkten Immunantwort und physiologische, heute zum Teil gentechnisch hergestellte Immunmodulatoren wie Lymphokine, Interleukine, CSF (koloniestimulierende Faktoren) und Interferone. So ist bekannt, daß Extrakte aus Escherichia coli (E.coli) zu einer Stimulation der Interleukinproduktion, insbesondere von IL-6 führen (Thomsen und Loppnow, 1995, Drug Res. 45 (I), 5, 657-661). Die Forschung auf dem Gebiet der Immunmodulatoren ist noch lange nicht abgeschlossen, aber bisher hat sich bereits gezeigt, daß solche Substanzen entweder allein zur Behandlung bestimmter Erkrankungen oder als Begleittherapie eingesetzt werden können, wobei sie dann in der Regel zu einem schnelleren und besseren Ansprechen der eingesetzten Haupttherapeutika führen. Immunmodulatoren werden nicht nur zur Bekämpfung von Allergien und Autoimmunkrankheiten verwendet, sondern in zunehmendem Maße auch bei der Behandlung von Neoplasmen und in der Behandlung von Aids und ARS (Aids Related Syndrome).

Interleukine sind pleiotrope Cytokine, die im Immunsystem als Mediatorstoffe auftreten. Sie sind verantwortlich für die Induktion und Verlauf der T-Zell-vermittelten zytotoxischen Immunreaktion und der B-Zell- Aktivierung. Neben anderen Interleukinen spielt insbesondere Interleukin-6, im folgenden nur noch als IL-6 bezeichnet, eine zentrale Rolle bei der Proliferation und Differenzierung der T- und B-Zellen des Immunsystems.

Interleukine sind auch ein wichtiger Bestandteil des Inflammationsgeschehens. Immunantwort und Entzündungsgeschehen stellen eng miteinander verwobene Prozesse im Organismus dar. Insbesondere IL-6 wird eine Stimulation von Akutphaseproteinen zur Regulation von Entzündungsprozessen zugerechnet (Heinrich et al., (1990), Biochem. J. 265: 621-636).

Im Rahmen des Entzündungsgeschehens stellt die Akutphase-Reaktion die Antwort des Organismus auf Störungen der Homöostase durch Infektionen, Gewebeschädigungen, neoplastisches Wachstum oder immunologische Störungen dar. Die Wiederherstellung der gestörten Homöostase verläuft über eine lokale Reaktion am Ort der Verletzung, die mit der Feisetzung von Cytokinen, wie IL-6 einhergeht. Die Cytokine wirken über spezifische Rezeptoren auf verschiedenen Zielzellen und führen zu einer systemischen Reaktion charakterisiert durch Fieber, Leucozytose, Sekretion von Glycocorticoiden, Aktivierung von Complement und zu einer dramatischen Änderung der Konzentration der Akutphase-Proteine im Plasma, die eine die Entzündung regulierende und eindämmende Wirkung ausüben. Diese Akutphase-Proteine werden überwiegend in der Leber synthetisiert. Da aber meist Ort der Verletzung und Leber weit voneinander entfernt liegen, existieren hormonähnliche Mediatoren, die besonders von Leukozyten, Monozyten und Makrophagen produziert werden und unter denen Interleukin 6 eine zentrale Stellung einnimmt. Als Hauptfaktor für die Induzierung von Akutphase-Proteinen ist IL-6 somit ebenso wie alle Interleukine von großer Bedeutung für die Reaktion des Körpers auf Inflammationen.

Völlig überraschend wurde jetzt festgestellt, daß eine durch Mehrfachfiltration gewonnene, biologisch aktive Wirkstoff-Fraktion aus einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus Escherichia coli (E. Coli) hervorragende immunmodulierende Eigenschaften hat und auch bei Entzündungsprozessen modulierend wirkt.

So induzierte die Wirkstoff-Fraktion in erheblichem Umfang die Bildung von Interleukin-6 (IL-6) und zeigte in einem direkten Aktivitätsvergleich mit einem standardisierten, eiweiß- und zellfreien Peptidextrakt aus E. coli - in dosisabhängiger Reaktion - in überaus signifikantem Umfang eine deutliche Steigerung der induzierten Bildung von Interleukin-6 im biologischen Assay.

Des weiteren wurde völlig überraschend gefunden, daß die Kombination von Lipopolysacchariden (LPS), potenten Interleukin-1- und Interleukin-6- Aktivatoren, in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation mit der erfindungsgemäßen E. coli-Fraktion die Bildung von Interleukin-6 in synergistischer Weise induziert.

Erfindungsgemäß wird daher eine niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli vorgeschlagen, die dadurch hergestellt wird, daß E. coli fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 2 × 10¹² koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet wird, aus der gewachsenen Kultur auf an sich bekannte Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen und auf 2,3 mg Peptid/ml standardisiert wird, dieser Peptidextrakt mittels eines Stufengradienten von Puffer A (1,7% Natriumcitrat-dihydrat; 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitrat-dihydrat; 5% NaCl in Wasser pH 6) bei 58°C auf einer speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschersäule getrennt wird, wobei der Wirkstoff nach einer Retentionszeit von etwa 43 Minuten eluiert und durch einen Aminosäureanalysator nach dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) detektiert und quantifiziert wird, und die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen gepoolt und mittels Gelchromatographie (Sephadex G 10; Puffer: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Fließgeschwindigkeit 300 µl/min; Säulendimension 1 m × 2 cm, eingesetzte Menge 100 µl) entsalzt werden, wobei der die Wirkstoff-Fraktion enthaltende Peak anschließend eingetrocknet und in Wasser aufgenommen wird.

Weiter ist diese vorgeschlagene niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli dadurch gekennzeichnet, daß sie im Interleukin-Test nach van Snick et. al (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683), Loppnow und Libby (Exp. Cell Res. 1992, 198, 283-290) sowie Gillis et al. (J. Immunol. 1978, 120, 2027-2032) die Bildung von Interleukin 6 (IL-6) in beträchtlichem Umfang induziert.

Erfindungsgemäß wird ebenfalls eine Wirkstoffkombination vorgeschlagen, die sich aus der beanspruchten erfindungsgemäßen niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion und Konzentrationen an Lipopolysacchariden unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation zusammensetzt und die Bildung von IL-6 in synergistischer Weise induziert.

Des weiteren wird die Verwendung der erfindungsgemäßen eiweiß- und zellfreien Wirkstoff-Fraktion aus E. coli, entweder allein oder in Kombination mit LPS, als Immunmodulator, als Modulator des Entzündungsgeschehens und Interleukinbildungsstimulans vorgeschlagen.

Als weitere Verwendungen der erfindungsgemäßen eiweiß- und zellfreien Wirkstoff-Fraktion aus E. coli werden Verwendungen als Antidiarrhoicum und Cytoprotektivum - auch bei Neoplasmen - vorgeschlagen.

Die spezifische IL-6-induzierende Aktivität der erfindungsgemäßen Wirkstoff- Fraktion erfährt gegenüber derjenigen des eiweiß- und zellfreien Peptidextraktes aus E. coli eine Steigerung um mindestens 1200%. Bei der Kombination mit LPS in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation beläuft sich die Steigerung der spezifischen IL-6-induzierenden Aktivität auf mindestens 1500% im Vergleich zu der Kombination aus LPS und dem eiweiß- und zellfreien Peptidextrakt aus E. coli.

Die erfindungsgemäße niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus E. coli hat in ersten klinischen Versuchen eine deutliche Wirksamkeit als Immunmodulator bewiesen, und zwar insbesondere bei allergischen Reaktionen, wie beispielsweise Nahrungsmittelallergien, Asthma, Urtikaria, Lichtdermatosen und Neurodermitis und ebenso bei Erkrankungen, die zu den Autoimmunkrankheiten gezählt werden, wie MORBUS CROHN oder Colitis ulcerosa. Ebenso wurde eine erhebliche Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion als Modulator des Entzündungsgeschehens - vermutlich über die Stimulierung der Interleukinbildung, insbesondere von IL-6, - festgestellt.

Überraschend war aber auch die starke Ansprechbarkeit der Patienten mit Neoplasmen, und hier insbesondere bei metastasierenden Neoplasmen, insbesondere Mamma- und Colonkarzinom, bei denen gleichzeitige oder Vorabgabe der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion die Dosis der Zytostatika deutlich verringern konnte, was auch durch in-vitro-Experimente belegt werden konnte. Die erfindungsgemäße Fraktion entfaltete daneben auch eine gute Wirkung als Cytoprotektivum bei der Eindämmung reaktiver Sauerstoffspezies durch Erhöhung des Glutathion-Gehalts oder Inhibition der Radikalbildung. Die Fraktion konnte im Experiment außerdem die gastrointestinalen Nebenwirkungen der Cytostatika, wie Mucositiden und Diarrhöen, erheblich reduzieren. Auch bei Diarrhöen anderer Herkunft zeigte die Fraktion ein überraschende Effektivität. Ähnlich überraschende Erfolge lassen sich nach den ersten Untersuchungen auch bei der Behandlung von Aids oder ARS feststellen, da nicht nur eine subjektive Besserung der Symptome, sondern auch eine objektive Verringerung der notwendigen Dosis an Nukleosidtherapeutika feststellbar war.

Die Gewinnung der erfindungsgemäßen E. coli Wirkstoff-Fraktion erfolgt auf mikrobiologischem Wege. Besonders bevorzugt wird Escherichia coli des Serotyps 02:K1:H6 eingesetzt. Aus der auf einem Nährmedium gewachsenen Kultur wird durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen.

Die Reinigung und Auftrennung des standardisierten Peptidextraktes wird mittels einer Ionenaustauschchromatographie vorgenommen, wobei die Detektion und Quantifizierung der erfindungsgemäßen Fraktion analog dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) erfolgt. In einem abschließenden Aufreinigungsschritt wird die Wirkstoff- Fraktion über Gelchromatographie und Reversed Phase Chromatographie weiter gereinigt und gleichzeitig weitgehend von Salzen befreit.

Die wirksame Dosis der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion liegt im Bereich von etwa 0,1 µg Wirkstoff /kg/d bis ca. 60 mg/kg/d, die bevorzugte Dosierung bei parenteraler Gabe bei etwa 1 µg/kg/d bis 1 mg/kg/d, bei oraler Gabe bei etwa 3 µg/kg/d bis 3 mg/kg/d.

Die Verwendung der erindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion kann vorzugsweise parenteral oder oral, z. B. in Form von Injektionslösungen, Pulver, Granulaten, Tabletten, Kapseln oder Dragees, erfolgen. Da die Substanz gut durch die intakte Haut resorbiert wird, sind auch topische Zubereitungen möglich.

Die Herstellung der pharmazeutischen Darreichungsform erfolgt in einer dem Fachmann geläufigen Weise und ist unproblematisch.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispielenäher erläutert:

Beispiel 1 Gewinnung der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion aus einem Extrakt aus E. coli

. Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion aus E. coli wird bevorzugt E. coli des Serotyps 02:K1:H6 fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 2 × 10¹² koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet. Aus der gewachsenen Kultur wird in an sich bekannter Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen. Dieser Extrakt wird auf 2,3 mg Peptid/ml standardisiert und fraktioniert. Dazu werden beispielsweise 1,5 ml des Extrakts an einer, speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschersäule mit einem Stufengradienten bei 58°C getrennt, wobei die wirkstoff-haltige Fraktion mit dem Wechsel von Puffer A (1,7% Natriumcitrat-dihydrat, 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitrat dihydrat, 5% NaCl in Wasser, pH 6) nach einer Retentionszeit von ca. 43 Minuten eluiert und in Fraktionen aufgefangen wird. Die Detektion und Quantifizierung erfolgt durch Untersuchung der Fraktionen an einem kommerziellen Aminosäureanalysator (Beckmann 6300), im Prinzip nach dem Verfahren von Spackmann, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190). Die wirkstoff-haltigen Fraktionen der Ionenaustauschchromatographie werden gepoolt (1,2 ml) und entsalzt (z. B. 100 µl an Sephadex G10-Gelchromatographie (Säulendimensionen 1 m × 2 cm, Fluß 300 µl) in 0.1% Trifluoressigsäure in Wasser). Der den Wirkstoff enthaltende Peak, der - wie oben beschrieben - durch Aminosäureanalyse detektiert wird, wird eingetrocknet und in Wasser (z. B. 200 µl) aufgenommen. Der Wirkstoff kann so in einer Menge von mindestens 500 nmol/ml eiweiß- und zellfreiem Peptidextrakt aus E. coli, standardisiert auf 2,3 mg Peptid/ml, gewonnen werden.

Beispiel 2 Bestimmung der Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoff- Fraktion nach Beispiel 1 auf die Bildung von IL-6

Mononukleäre Zellen werden aus heparinisiertem Blut gesunder Spender mit Hilfe einer Gradientenzentrifugation über Ficoll® isoliert (Loppnow et al., Infect. Immun. 1990, 58, 3743-3750), mehrere Male gewaschen und in serumfreiem RPMI 1640 nach Loppnow et al (J. Immunol. 1989, 142, 3229-3238) mit L- Glutamin und Antibiotika inkubiert. 50 µl der Zellsuspension (entspricht 2 × 10⁵ Zellen) werden vorgelegt. Hierzu werden jeweils 50 µl der zu testenden Substanzen und Kontrollen gegeben und der Ansatz mit den Zellen für 24 Stunden inkubiert. Die Überstände werden abgenommen, mit Schutzprotein versehen, bei -20°C aufbewahrt und anschließend in einem Cytokin-Test untersucht.

Im 7TD1-Assay nach van Snik et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683) wird die IL-6-induzierte Aktivität über den Einbau von radioaktivem ³H-Thymidin nachgewiesen.

Die erhaltenen Überstände der mononukleären Zellen werden in 96 Loch Kulturplatten in 8 Stufen verdünnt. Zu diesen Verdünnungsreihen werden 2000 Zellen/Loch der IL-6- abhängigen murinen B-Zell-Linie 7TD1 hinzugefügt, ähnlich wie für B9-Zellen bei Loppnow und Libby beschrieben (Exp. Cell. Res. 1992, 198, 283-290). Die Kulturen werden 72 Stunden inkubiert, für weitere 6 Stunden mit radioaktivem Thymidin versehen und die Proliferation der Zellen durch Messung der eingebauten Radioaktivität ermittelt. Die Bestimmung der Aktivität der Überstände erfolgt durch Vergleich der Proben mit einem definierten Standard mit Hilfe der Probit-Analyse nach Gillis et al. (J. Immunmol. 1978, 120, 2027-2032).

Eine auf den Aminosäuregehalt standardisierte erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 1 weist eine spezifische IL-6-induzierende Aktivität von 10,3 × 10⁶ pg IL- 6/nmol_Aminosäure auf.

Im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli steigert - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - die erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion die Induktion der Bildung von IL-6 um 1240%.

Beispiel 3 Bestimmung der Wirkung der erfindungsgemäßen Wirkstoff- Fraktion nach Beispiel 1 in Kombination mit LPS auf die Bildung von IL-6

In einem Testsystem gemäß Beispiel 2 wird die Wirkung einer erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 1 auf die IL- 6-Bildung in Kombination mit LPS getestet. LPS wird in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation, in diesem Fall 5 pg/nmol_Aminosäure eingesetzt.

Eine auf den Aminosäuregehalt standardisierte erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion nach Beispiel 1 weist in Kombination mit LPS eine spezifische IL-6-induzierende Aktivität von 17,8 × 10⁶ pg IL-6/nmol_Aminosäure auf.

Im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli mit LPS steigert - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - die erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion mit LPS die Induktion der Bildung von IL-6 um 1548%.

Beispiel 4 Erhöhung der Konzentration an reduziertem Glutathion (GSH) in der Ratte

Narkositierten männlichen Ratten mit 120g Körpergewicht wird der Bauchraum eröffnet und eine definierte Menge einer erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion gemäß Beispiel 1, bzw. einer Salzlösung (Kontrolle) intraportal in die Leber injiziert. 2 Minuten nach der Wirkstoffgabe wird der Lobus dexter der Leber mittels einer tiefgekühlten Zange schockgefroren, aus dem Intraperitonealraum entfernt, unter Stickstoff gemörsert und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. In einem anschließenden Fluoreszenztest werden 50 mg Probe in einem mit 3,75 ml Tris- Puffer (0,1 M, pH 8,0) und 1 ml einer 25%-igen meta- Phosphorsäure beschickten Zentrifugenglas 20 Sekunden mit Ultraschall homogenisiert und anschließend bei 104.000 g in der Ultrazentrifuge zentrifugiert. 0,5 ml des erhaltenen Überstandes wurden in 4,5 ml Phosphat-EDTA-Puffer (K₂HPO₄ (0,1 M) mit EDTA (0,005 M), pH 8) pipettiert. Anschließend wurden zu 0,1 ml dieser Mischung 1,8 ml Phosphat-EDTA-Puffer sowie 0,1 ml einer methanolischen o-Phthalaldehyd-Lösung (1 mg/ml) zugefügt. Die Probe wurde gut gemischt und 15 min bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wurde die Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von 423 nm im Fluorometer gemessen. Die Berechnung erfolgte in µmol/g Frischleber.

Die Glutathionkonzentration steigt nach Behandlung mit der erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion gemäß Beispiel 1 signifikant an.

Beispiel 5 Hemmung der Superoxyd-Aktivität von Granulocyten

Bei der Phagocytose durch Granulocyten tritt zunächst eine Sauerstoff-Aufnahme auf, der anschließend die Abgabe von Superoxyd-Radikal-Anionen und Wasserstoffperoxyd folgt. Granulocyten werden zur Phagocytose angeregt und die entstehenden Superoxyd-Radikal-Anionen über Fluoreszenz- Messungen bestimmt. Dabei wird die Wirkung einer erfindungsgemäßen Wirkstoff-Fraktion gemäß Beispiel 1 untersucht.

Granulocyten werden aus dem Blut gesunder Spender über eine Säule mit Ficoll-Paque/Polyvinylalkohol isoliert. Zu 50 µl einer ca. 2 Mio Zellen/ml enthaltenen Granulocyten-Suspension in PBS, einer phosphatgepufferten, pH-neutralen und isotonische Kochsalzlösung, werden 5 µl einer N-Formyl-methionyl-leucyl phenylalanin-Lösung in PBS mit einer Konzentration von 10 pmol/l und 5 µl einer Lucigenin/Luminol-Lösung von 100 pg/ml in PBS gegegeben. Die Kontrolle wird mit 10 µl Aqua bidest versetzt, die Proben mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten, in PBS gelösten Wirkstoffmengen. Anschließend wird die Fluoreszenz der Proben bestimmt und die Inhibition errechnet.

Die erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion gemäß Beispiel 1 kann die Superoxyd-Aktivität von Granulocyten zu 100 Prozent hemmen.

Beispiel 6 Applikationsart als Injektionslösung

Für eine rasche und von der Zuverlässigkeit des Patienten unabhängige Therapie kann sich eine parenterale Applikation des Medikaments empfehlen. Der Magen-Darmtrakt wird bei der Aufnahme zunächst umgangen. Die erfindungsgemäße Wirkstoff-Fraktion gemäß Beispiel 1 ist hervorragend wasserlöslich. Es ist daher möglich, diese gelöst in Wasser als Injektionslösung zu verwenden. Die Injektionslösung könnte bei gewünschter rascher Wirkung intravenös (i.v.) oder für eine langanhaltenderere Depot-Wirkung subcutan (s.c.) appliziert werden. Eine bevorzugte Dosierung sind etwa 1 µg Wirkstoff /kg/d - 1 mg/kg/d. Die Injektionslösungen werden in an sich bekannter Weise hergestellt.

100 ml einer Wirkstoffraktion aus Beispiel 1 werden bei Bedarf mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, sterilisiert und mit einer Wirkstoffkonzentration von 51,5 µg/ml in Ampullen zu 10 ml portioniert.

Beispiel 7 Orale Applikation

Für die Selbstapplikation des Patienten empfiehlt sich im allgemeinen eine orale Gabe des Wirkstoffes. Die erfindungsgemäße Wirkstoffraktion gemäß Beispiel 1 kann in getrockneter oder gelöster Form appliziert werden. Möglich wäre dabei eine Gabe als Lösung, Pulver, Granulat, Dragee, Tablette oder Kapsel. Eine bevorzugte Dosierung sind etwa 3 µg Wirkstoff /kg/d - 3 mg/kg/d. Die oralen Präparate werden in an sich bekannter Weise hergestellt.

Die erfindungsgemäße Wirkstoffraktion gemäß Beispiel 1 wird durch schonende Trocknung unter sterilen Bedingungen von Wasser befreit. 500 mg des Feststoffes werden unter sterilen Bedingungen mit 99,5 g Trägersubstanzen (Magnesiumstearat, Polyvidon, Lactose oder Stärke) gemischt und zu Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulat und Dragees mit Wirkstoffmengen von 0,5 mg verarbeitet. Möglich ist auch die Herstellung einer Lösung. Dazu werden 100 ml der erfindungsgemäßen Wirkstoff- Fraktion gemäß Beispiel 1 bei Bedarf mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, sterilisiert und mit einer Wirkstoffkonzentration von 51,5 µg/ml in Ampullen zu 10 ml portioniert.

Literaturverzeichnis

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Claims

1. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli, herstellbar dadurch, daß E. coli fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 2 × 10¹² koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet wird, aus der gewachsenen Kultur auf an sich bekannte Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen und auf 2,3 mg Peptid/ml standardisiert wird, dieser Peptidextrakt mittels eines Stufengradienten von Puffer A (1,7% Natriumcitrat-dihydrat; 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitrat-dihydrat; 5% NaCl in Wasser pH 6) bei 58 °C auf einer speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschersäule getrennt wird, wobei der Wirkstoff nach einer Retentionszeit von etwa 43 Minuten eluiert und durch einen Aminosäureanalysator nach dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) detektiert und quantifiziert wird, und die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen gepoolt und mittels Gelchromatographie (Sephadex G 10; Puffer: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Fließgeschwindigkeit 300 µl/min; Säulendimension 1 m × 2 cm, eingesetzte Menge 100 µl) entsalzt werden, wobei der die Wirkstoff-Fraktion enthaltende Peak anschließend eingetrocknet und in Wasser aufgenommen wird.

2. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie gemessen in einem Interleukin-Test am Einbau von ³H-Thymidin in interleukinabhängige 7TD1-Zellen (van Snick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683; Loppnow und Libby, Exp. Cell Res. 1992, 198, 283-290; Gillis et al., J. Immunol. 1978, 120, 2027-2032) die Bildung von Interleukin-6 in beträchtlichem Umfang induziert.

3. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung von Interleukin 6 in humanen mononukleären Zellen im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - um mehr als das Doppelte induziert.

4. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung von Interleukin 6 in humanen mononukleären Zellen im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - um mehr als das Zehnfache induziert.

5. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Bildung von Interleukin 6 bei Zugabe von 50 µl einer die Wirkstoff-Fraktion enthaltenden Lösung zu 50 µl humaner mononukleärer Zellsuspension (entspricht 2 × 10⁵ Zellen) - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 10 × 10⁶ pg IL-6/nmol_Aminosäure induziert.

6. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie kombiniert mit Lipopolysaccharid in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation gemessen in einem Interleukin-Test am Einbau von ³H-Thymidin in interleukinabhängige 7TD1-Zellen (van Snick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83, 9679-9683; Loppnow und Libby, Exp. Cell Res. 1992, 198, 283-290; Gillis et al., J. Immunol. 1978, 120, 2027-2032) die Bildung von Interleukin-6 in beträchtlichem Umfang induziert.

7. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie kombiniert mit Lipopolysaccharid LPS in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation die Bildung von Interleukin 6 in humanen mononukleären Zellen im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli, kombiniert mit der gleichen Lipopolysaccharid-Konzentration, - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - um mehr als das Doppelte induziert.

8. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1, 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie kombiniert mit Lipopolysaccharid LPS in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation die Bildung von Interleukin 6 in humanen mononukleären Zellen im Vergleich zu einem eiweiß- und zellfreien Extrakt aus E. coli, kombiniert mit der gleichen Lipopolysaccharid- Konzentration, - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - um mehr als das Fünfzehnfache induziert.

9. Niedermolekulare Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 und 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie kombiniert mit Lipopolysaccharid LPS in Konzentrationen unterhalb der niedrigsten Konzentration mit maximaler Stimulation die Bildung von Interleukin 6 bei Zugabe von 50 µl einer die Wirkstoff-Fraktion enthaltenden Lösung zu 50 µl humaner mononukleärer Zellsuspension (entspricht 2 × 10⁵ Zellen) - standardisiert auf den Aminosäuregehalt - mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 15 × 10⁶ pg IL-6/nmol_Aminosäure induziert.

10. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 9 als Immunmodulator.

11. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 10 in Kombination mit Lipopolysaccharid als Immunmodulator.

12. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 11 als Interleukinbildungsstimulans.

13. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 12 zur Induktion der Bildung von Interleukin 6.

14. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 9 als Modulator des Entzündungsgeschehens.

15. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 9 als Antidiarrhoicum.

16. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 15 bei carcinombegleitenden Diarrhöen und Schleimhautschäden.

17. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 15 bei antibiotikainduzierten Diarrhöen und Schleimhautschäden.

18. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 15 bei Enteritis, Colitis, Enterocolitis und entzündlichen Darmerkrankungen, wie Morbus Crohn.

19. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1 bis 9 als Cytoprotektivum.

20. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 19 bei Entzündungsprozeßen.

21. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 19 zur Verminderung der Bildung von Radikalen und reaktiven Sauerstoffspezies.

22. Verwendung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 19 bei der Karzinombehandlung.

23. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli fünf Tage bei 37°C bis zu einer Wachstumsdichte von 2 × 10¹² koloniebildenden Einheiten/ml auf einem Nährmedium auf Fleischpeptonbasis bebrütet wird, aus der gewachsenen Kultur auf an sich bekannte Weise durch Mehrfachfiltration ein eiweiß- und zellfreier Extrakt mit den Stoffwechselprodukten gewonnen und auf 2,3 mg Peptid/ml standardisiert wird, dieser Peptidextrakt mittels eines Stufengradienten von Puffer A (1,7% Natriumcitrat-dihydrat; 0,5% NaCl in Wasser, pH 4 mit HCl) zu Puffer B (1,9% Natriumcitrat-dihydrat; 5% NaCl in Wasser pH 6) bei 58 °C auf einer speziell für die Trennung von Aminosäuren geeigneten Kationenaustauschersäule getrennt wird, wobei der Wirkstoff nach einer Retentionszeit von etwa 43 Minuten eluiert und durch einen Aminosäureanalysator nach dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) detektiert und quantifiziert wird, und die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen gepoolt und mittels Gelchromatographie (Sephadex G 10; Puffer: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Fließgeschwindigkeit 300 µl/min; Säulendimension 1 m × 2 cm, eingesetzte Menge 100 µl) entsalzt werden, wobei der die Wirkstoff-Fraktion enthaltende Peak anschließend eingetrocknet und in Wasser aufgenommen wird.

24. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß E. coli des Serotyps 02:K1:H6 eingesetzt wird.

25. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß 1,5 ml des auf 2,3 mg Peptid/ml standardisierten eiweiß- und zellfreien Peptidextraktes auf den Ionentauscher aufgegeben wird.

26. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß von der nach dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) aufgetrennten, detektierten, quantifizierten und nach etwa 43 Minuten von der Säule eluierten Fraktion 0,5-2,0 ml gepoolt werden.

27. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß von der nach dem Verfahren Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) aufgetrennten, detektieren, quantifizierten und nach etwa 43 Minuten von der Säule eluierten Fraktion 0,8-1,5 ml gepoolt werden.

28. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß von der nach dem Verfahren von Spackman, Stein und Moore (Anal. Chem. 1958, 30, 1190) aufgetrennten, detektierten, quantifizierten und nach etwa 43 Minuten von der Säule eluierten Fraktion 1,2 ml gepoolt werden.

29. Verfahren zur Gewinnung der niedermolekularen Wirkstoff-Fraktion aus eiweiß- und zellfreien Extrakten aus E. coli nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß 100 µl des gepoolten Eluats gelchromatographisch aufgetrennt werden, wobei der Peak 2 isoliert, eingetrocknet und in 200 µl Wasser aufgenommen wird.