DE19711932A1

DE19711932A1 - In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms

Info

Publication number: DE19711932A1
Application number: DE19711932A
Authority: DE
Inventors: Anne Katrin Dr Werenskiold
Original assignee: Individual
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1997-03-21
Publication date: 1998-09-24
Also published as: WO1998043090A3; WO1998043090A2; CA2284790A1; EP0970378A2; US6399748B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnosti zieren eines Mammakarzinoms, Kits, die zum Durchführen dieses Verfahrens geeignet sind, sowie die Verwendung von T1-spezifischen Antikörpern oder Fragmenten davon oder von T1-spezifischen Oligonukleotiden zum Bestimmen von T1-Protein bzw. T1-mRNA in Patienten mit Mammakarzinom.

Mammakarzinome, insbesondere invasive Mammakarzinome, sind maligne Tu more mit extrem unterschiedlichem und bisher unvorhersagbarem klinischen Verlauf. Das invasive Mammakarzinom ist bei Frauen der am häufigsten auftre tende maligne Tumor; an ihm erkrankt im statistischen Mittel jede 16. Frau. Bei bestehendem Mammakarzinom wird als primäre therapeutische Maßnahme zu nächst der Mammatumor entfernt. Für die Prognose und weitere Therapiepla nung gelten heute in erster Linie der Nodalstatus, aber auch die Tumorgröße, der histologische Typ, der Differenzierungsgrad sowie der Hormonrezeptorstatus als wichtige Parameter. Der Schwerpunkt liegt aber auf der Beurteilung des axil liären Lymphknotenstatus. So wird z. B. bei Patienten mit zum Zeitpunkt der Tu mordiagnose bzw. Operation bereits bestehendem Lymphknotenbefall im Ach selbereich (Nodal-positiv, N(+)) in der Regel sofort eine Chemotherapie durchge führt, gegebenenfalls unterstützt von einer zusätzlichen Strahlentherapie. Patien ten mit negativem axilliären Lymphknotenstatus (Nodal-negativ, N(0)) haben ge nerell eine bessere Prognose und werden deshalb in der Regel weder chemo therapeutisch noch strahlentherapeutisch nachbehandelt. Statistisch entwickeln jedoch bis zu 30% der als N(0) eingestuften Patienten ein Rezidiv (Yuan 1992). Diese hohe Rezidivrate zeigt, daß die bisher bekannten Prognosefaktoren den Krankheitsverlauf nur sehr unvollständig beschreiben.

In den letzten Jahren wurde eine große Zahl von Molekülen im Hinblick auf ihre mögliche Verwendung als Prognosefaktoren für das Mammakarzinom untersucht (zur Übersicht: Schmitt et al., 1994; Hoskins and Weber, 1995), z. B. (Proto)On kogene wie c-erbB-2 (Allred et al., 1992, Archer et al., 1995), das Tumorsup pressorgen p53 (Barnes et al., 1993, Lipponen et al., 1993), der Urokinase-Typ- Plasminogenaktivator uPA (Jaenicke et al., 1993; Wilhelm et al., 1994), das Ad häsionsmolekül E-Cadherin (Rasbridge et al., 1993; Graff et al., 1995) und das Zytoskelettprotein Vimentin (Sommers et al., 1992). Die Vimentinsynthese korre liert mit dem invasiven Wachstum von Mammakarzinom-Zellinien in vitro (Thompson et al., 1991) und teilweise mit schnell wachsenden invasiven dukta len Brustkarzinomen mit schlechter Prognose in vivo (Domagala et al., 1990). Mögliche Prognosefaktoren bilden weiterhin zytometrisch bestimmte morphome trische und Texturmerkmale sowie DNS-Parameter (Auer et al., 1994).

Keiner der oben erwähnten Faktoren erlaubt jedoch eine ausreichend zuverläs sige Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs nach Mammakarzinomentfer nung.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, das eine aus reichend zuverlässige Prognose des weiteren Krankheitsverlaufs bei Mamma karzinompatienten erlaubt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein in vitro-Verfahren zum Progno stizieren des Krankheitsverlaufes von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms gelöst, das das qualitative oder quantitative Bestimmen von T1-Protein und/oder T1-mRNA in aus dem Patienten gewonnenem Probenmaterial umfaßt.

Das T1-Protein ist ein extrazelluläres, lösliches Glykoprotein von 60-70 kDa (Werenskiold, 1992) mit Homologie zu Mitgliedern der Immunglobulin-Super familie, insbesondere dem karzinomembryonalen Antigen (Klemenz et al., 1989).

Das Molekül wurde in einer Analyse früher Effekte von Onkoproteinen (p21^ras und p39^v-mos) auf die Genexpression in Fibroblasten identifiziert (Werenskiold et al., 1989). In der Maus erfolgt eine Synthese des T1-Proteins nur in embryonalen Geweben, sie ist im adulten Tier nicht nachweisbar (Rößler et al., 1995 a,b). Die Funktion des T1-Proteins ist noch nicht vollständig geklärt, doch gibt die lsolie rung einer zweiten, membranständigen Variante des Moleküls (T1-M) Hinweise auf eine Funktion als Zytokinrezeptor. Das membranständige T1-M-Protein weist große Ähnlichkeit mit dem IL-1-Rezeptor Typ 1 auf, besitzt jedoch keine Affinität zu den Zytokinen IL-1 α und β (Rößler et al., 1995 b; Danescu and Werenskiold, 1995) oder IL-1ra (Gayle et al., 1996). T1-M stellt einen neuen Mastzell-spezif ischen Zytokinrezeptor dar (Rößler et al., 1995 b; Thomassen et al., 1995). Die Onkogen-induzierbare lösliche Variante des T1-Proteins ist eine verkürzte Form dieses Rezeptors und entspricht dessen Liganden-bindender Domäne. Rekom binant hergestelltes, lösliches T1 aus der Maus (Rupp et al., 1995) blockiert das Wachstum von Mastzellen.

In Mammakarzinomen der Maus ist eine Überexpression des löslichen T1- Proteins bisher ausschließlich in invasiv wachsenden, schlecht differenzierten Tumoren beobachtet worden. Sowohl das Tumorstroma als auch die anaplasti schen Tumorzellen synthetisieren T1. In situ-Hybridisierungen zeigen eine er höhte Expression von T1 in Tumorzellen an der Peripherie von Tumorzellkom plexen und - möglicherweise von den Tumorzellen induziert - in den unmittelbar diesen benachbarten Stromazellen (Rößler et al., 1993). Die Induktion der T1-Ex pression in den Tumorzellen korreliert mit deren phänotypischer Transformati on und wird von einem Verlust der E-Cadherin- und Zytokeratin-Produktion be gleitet. Sie wird von einem AP1-abhängigen Promotor des T1-Gens gesteuert, der nur in nicht-hämopoetischen (z. B. fibroblastischen) Zellen aktiv ist (Thomassen et al., 1995). Während der phänotypischen Transformation der epithelialen Tumorzellen erfolgt die Induktion von T1 deutlich vor derjenigen des ebenfalls AP1-abhängigen, mesenchymalen Zytoskelettproteins Vimentin und bildet daher einen frühen Marker für den Transformationsprozeß.

Überraschenderweise hat sich nunmehr gezeigt, daß das Auftreten oder Fehlen einer T1-Transkription bzw. -Expression eine Aussage über den zukünftigen Krankheitsverlauf erlaubt, insbesondere Hinweise auf die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines Rezidivs oder der Entwicklung bzw. des Wachstums von Metastasen. Wie in den Beispielen ausführlich erläutert werden wird, korreliert in Patienten mit einem N(0)-Nodalstatus überraschenderweise ein hoher T1-Wert mit einer guten Prognose, während in Patienten mit N(+)-Nodalstatus ein hoher T1-Protein- bzw. T1-mRNA-Spiegel eine schlechte Prognose bedeutet.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das T1-Protein und/oder die T1- mRNA in einer Tumorgewebeprobe des Patienten bestimmt. Dazu werden z. B. Gewebeschnitte nach üblichen Verfahren angefertigt und fixiert und anschlie ßend entweder einen Immuntest zum Nachweis vorhandenen T1-Proteines oder einer Hybridisierung mit markierten oder markierbaren Oligonukleotiden oder DNA-Fragmenten unterworfen. Wahlweise kann aus dem Tumorgewebe nach üblichen Verfahren Gesamt-RNA oder Poly(A)⁺-mRNA isoliert werden, die dann z. B. nach gelelektrophoretischer Auftrennung oder nach Fixierung an eine feste Matrix wiederum durch Hybridisieren mit einem markierten oder markierbaren Oligonukleotid bestimmt werden kann.

T1-Protein ist nicht nur im Tumorgewebe selbst nachweisbar, sondern auch in verschiedenen Körperflüssigkeiten betroffener Patienten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Blut- oder Serumprobe durchgeführt.

Für die Bestimmung der T1-mRNA stehen eine Reihe von Verfahren zur Verfü gung. Wie oben bereits angedeutet, ist es zum einen möglich, T1-mRNA in situ oder in entsprechenden RNA oder mRNA-Präparaten durch Hybridisieren mit einer entsprechenden Oligonukleotidsonde oder einem DNA-Fragment nachzu weisen. Die Oligonukleotidsonde bzw. das DNA-Fragment kann selbst ein meß bares Signal abgeben, z. B. radioaktiv markiert sein, oder durch Wechselwirkung mit anderen Molekülen zur Signalgebung fähig sein. Zur besseren Auswertung der entsprechenden Tests empfiehlt es sich in den meisten Fällen, eine Amplifi kation des Signales herbeizuführen. Üblicherweise wird dazu die nachzuweisen de Target-Nukleinsäure amplifiziert.

Für die Amplifizierung der Target-Sequenz, d. h. der T1-mRNA, mit dem PCR-Ver fahren (Polymerase-Ketten-Reaktion) wird zunächst nach bekannten Verfah ren eine cDNA-Kopie hergestellt. Diese cDNA-Kopie wird anschließend einer PCR unterworfen. Die Sequenz des menschlichen T1-Genes ist bereits bekannt (Tominaga et al., 1992), die Auswahl geeigneter Oligonukleotide zur Durchfüh rung der reversen Transkription und des PCR-Verfahrens liegt daher im Bereich fachmännischen Könnens. Ein Beispiel eines geeigneten Oligonukleotides ist das Oligonukleotid mit der Sequenz 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' oder ein Fragment davon. Ein weiterer geeigneter Primer ist der anti sense-Primer 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' oder ein geeignetes Fragment davon. Bevorzugte Primer entstammen dem 3'-untranslatierten Be reich und/oder dem Bereich der Exons 8 und 9. Primer aus den genannten Be reichen haben den Vorteil, daß sie nur mit der für das tumorassoziierte T1-S- Protein kodierenden RNA hybridisieren, nicht jedoch mit der durch alternatives Spleissen entstandenen T1-M-mRNA. Einer der spezifischen Primer, sense- oder anti-sense-, kann gegebenenfalls durch einen kommerziell erhältlichen Random-Primer ersetzt werden. Im Stand der Technik sind inzwischen eine Rei he weiterer Verfahren bekannt, mit denen Target-Nukleinsäuren amplifiziert wer den können. In diesem Zusammenhang wird z. B. verwiesen auf das Q-NASBA-Ver fahren, bei dem die in der Probe vorliegende mRNA durch die konzertierte Aktion von reverser Transkriptase, RNAse H und T7-Polymerase amplifiziert wird (Kievits et al., 1991). Eine weitere Möglichkeit ist der Nachweis von nach rever ser Transkription erhaltener DNA durch die sogenannte "Strand Displacement Amplification" (SDA) (Walker et al., 1996, sowie darin zitierte Literatur). Dem Fachmann sind noch eine Reihe weiterer Verfahren bekannt, die zum Nachweis oder der Bestimmung der T1-mRNA ebenfalls herangezogen werden können.

Die gebildeten Amplifikations-Produkte werden auf dem Fachmann bekannte Weise nachgewiesen. So kann z. B. durch den Einbau Digoxigenin-haltiger Nu kleotide und anschließende Umsetzung mit enzymkonjugierten anti-Digoxigenin- Antikörpern die mit dem PCR-Verfahren synthetisierte DNA sichtbar gemacht werden. Mit dem anti-Digoxigen-Antikörper kann jedes zur Signalgebung fähige Enyzm konjugiert werden, z. B. alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Peroxidase, β-D-Galaktosidase, Glucoseoxidase und Meerrettichperoxidase. In Abhängigkeit vom verwendeten Substrat kann die T1-mRNA quantitativ, z. B. durch Messung der Absorption oder der Fluoreszenz löslicher Produkte, oder zumindest qualitativ nachgewiesen werden.

Zum Beispiel eignet sich der von Boehringer Mannheim erhältliche, mit alkali scher Phosphatase konjugierte anti-Digoxigenin-Antikörper gut zum Bestimmen der vorhandenen T1-mRNA. Dem Fachmann ist bekannt, daß es noch weitere Möglichkeiten des Nachweises amplifizierter Nukleinsäuren, z. B. durch den Ein bau biotinmarkierter Nukleotide und anschließende Umsetzung der Produkte mit Avidin- oder Streptavidin-konjugierten Enzymen, die eine Signalgebung ermögli chen, gibt. Ein solches Enzym kann schließlich auch an ein drittes Oligonukleo tid gekoppelt sein, das einem Teilstück eines Strangs einer der amplifizierten Nukleinsäuren komplementär ist.

Die folgende Tabelle gibt Aufschluß über üblicherweise verwendete Enzyme und in Verbindung mit diesen Enzymen möglicherweise zu verwendende chromoge ne Substrate.

Tabelle 1

Enzyme
Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase	4-Methylumbelliferylphosphat (), Bis(4-Methylumbelliferylphosphat), () 3-0-Methylfluoreszein, Flavon-3-Diphosphattriammoniumsalz (*), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase	Tyraminhydrochlorid (), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (), p-Hydroxyphenethylalkohol (), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazol insulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase	H₂O₂ + Diammoniumbenzidin, K₂O₂ + Tetramethylbenzidin
4. β-D-Galaktosidase	o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase	ABTS, Glukose und Thiazolylblau

Anm: (*): fluoreszierendes Produkt

Der Nachweis der Amplifikations-Produkte kann nach Gelelektrophorese des Reaktionsgemisches im Gel erfolgen, er kann aber auch in Lösung oder nach Bindung an eine feste Matrix erfolgen. Auf dem Markt ist derzeit eine Vielzahl von Systemen erhältlich, die dem Nachweis von amplifizierter DNA dienen und auf die Bedürfnisse des Nachweises von T1-mRNA zugeschnitten werden kön nen.

Während die oben erwähnten Verfahren die reverse Transkription und/oder Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäure, im vorliegenden Fall der T1-mRNA involvieren und dadurch einen Nachweis auch geringster Mengen T1-mRNA ermöglichen, beruhen andere Verfahren auf dem Nachweis der Moleküle durch Amplifikation des Signals. Ein Beispiel dafür ist bDNA-Verfahren (Pachl et al., 1994), bei dem die nachzuweisende Nukleinsäure über Hybridisierung mit einem Oligonukleotid an eine feste Matrix gekoppelt wird, über eine weitere Hy bridisierung mit einem zweiten Oligonukleotid an eine verzweigte DNA, die wie derum mit einer Vielzahl von mit einem signalgebenden Enzym gekoppelten Oli gonukleotiden hybridisiert. Durch die Verzweigung der DNA ist das Anheften ei ner großen Menge signalgebender Enzymeinheiten pro vorhandenem Targetmo lekül möglich.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Probenmaterial einem für T1 spezifischen Antikörper oder Fragmenten eines solchen ausgesetzt. Geeignete Antikörperfragmente sind z. B. Fab- und F(ab)₂-Frag mente. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können beispielsweise di rekt mit dem Gewebeschnitt inkubiert werden oder aber einem Immuntest ausge setzt werden, bei dem Proteinextrakt z. B. an Mikrotiterplatten fixiert wird, auf ei ner Gelmatrix aufgetrennt oder auf andere Weise dem Antikörper zugänglich gemacht und mit diesem in Kontakt gebracht wird. Bei den Antikörpern kann es sich um monoklonale oder polyklonale Antikörper handeln, es können z. B. Maus-, Kaninchen- oder Ratten-Antikörper sein. Die Antikörper sollten spezifisch mit dem T1-Protein bzw. ausgewählten Epitopen dieses Proteines reagieren. In einer Ausführungsform wird das Verfahren mit Antikörpern durchgeführt, die für das p9-Peptid oder das p16-Peptid aus Maus-T1 (Werenskiold, 1992) spezifisch sind. Das p9-Peptid stammt aus einem Bereich, der eine vollständige Immunglo bulin-ähnliche Halbdomäne des Proteins überspannt. Das p16-Peptid entspricht dem carboxyterminalen Teil des Proteins und enthält keine mit dem IgC2-Motiv der Immunglobulinsuperfamilie verwandte Sequenz. Die Antikörper können ge gen das p9- oder p16-Peptid aus der Maus oder korrespondierenden Peptiden anderer Säugetiere gerichtet sein, solange sie mit dem entsprechenden T1-Protein menschlicher Herkunft kreuzreagieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Antikörper gegen antigene De terminanten des menschlichen, löslichen T1-Protein gerichtet. Zur Minimierung der Gefahr einer Kreuzreaktion mit vollständigem Membran-gebundenen Rezep tor empfiehlt es sich, ein Peptid zu wählen, das im T1-Rezeptor nicht vorhanden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper gegen ein Peptid gerichtet, das die Sequenz p-SKEC umfaßt. Der für dieses Peptid kodierende Bereich liegt zwischen den Exons 8 und 9 und wird nur für das lösliche Protein (T1-S), nicht aber für den Rezeptor (T1-M) exprimiert.

Erfindungsgemäß wird weiter ein Kit zur Verfügung gestellt, der zum Durchfüh ren des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Kit enthält T1- spezifische Antikörper oder Fragmente davon sowie gegebenenfalls Mittel, den Antikörper oder seine Fragmente nachzuweisen. Bei diesen Mitteln kann es sich beispielsweise um enzymkonjugierte anti-Ig-Antikörper handeln, die spezifisch an die jeweils verwendeten anti-T1-Antikörper binden. Der Nachweis dieser Anti körper kann mit üblichen Methoden, die bereits oben diskutiert worden sind, er folgen. Die dafür erforderlichen Mittel, z. B. Enzymsubstrat, können im Kit eben falls zur Verfügung gestellt werden. Der Kit kann weiterhin so aufgebaut sein, daß die zum Nachweis geeigneten Antikörper bzw. Antikörperfragmente an eine feste Phase gekoppelt vorliegen. Die feste Phase kann z. B. die Form von Mikro partikeln, z. B. Glas-, Polyacrylamid- oder Sephadexkugeln haben, oder aus Mi krotiterplatten bestehen. Andere Möglichkeiten der Fixierung der Antikörper an eine feste Matrix sind ebenfalls eingeschlossen.

Bei dem im erfindungsgemäßen Kit vorgesehenen Antikörper bzw. Fragmenten davon kann es sich um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper han deln. Dieser wird auf dem Fachmann bekannte Weise durch Immunisieren mit dem jeweils gewünschten Antigen, z. B. dem p9- oder p16-Peptid, hergestellt. Ausreichende Mengen dieser Peptide können durch rekombinante Expression in eukaryontischen Systemen, z. B. im Vacciniavirussystem (Werenskiold, 1992), oder in prokaryontischen Wirten, z. B. in E. coli, B. subtilis oder Streptomyceten, zur Verfügung gestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform werden statt natürlicher oder rekombinant exprimierter Proteine synthetisch hergestellte Pep tide zum Immunisieren verwendet. Besonders bevorzugt sind dabei Peptide, die die Sequenz p-SEKC umfassen.

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der zum Nachweis von T1-spezifischen Nukleinsäuren, bevorzugt T1-spezifischer mRNA geeignet ist. Der Kit enthält mindestens ein Oligonukleotid, das zur T1-mRNA komplementär ist, daher mit dieser hybridisieren kann und gegebenenfalls als Primer für die reverse Transkription und/oder die Polymerasekettenreaktion die nen kann. Kits, die letztlich der Durchführung einer PCR dienen sollen, können weiterhin ein oder mehrere weitere Oligonukleotide enthalten, die dem sense- Strang der T1-mRNA entsprechen und in Kombination mit dem ersten Oligonu kleotid die Amplifikation der T1-mRNA erlauben.

Ein erfindungsgemäßer Kit zum Nachweis der T1-mRNA kann darüber hinaus die zur reversen Transkription und/oder zur Amplifikation notwendigen Enzyme, z. B. reverse Transkriptase, DNA-Polymerase, RNAse H, T7-Polymerase und/oder Mittel zum Nachweis der amplifizierten Produkte enthalten. Die Amplifi kations-Produkte können beispielsweise durch eingebaute modifizierte Nukleoti de nachgewiesen werden, z. B. digoxigenierte oder biotinylierte Nukleotide, oder aber durch Hybridisierung eines markierten oder markierbaren Oligonukleotids, das zur T1-mRNA oder ihrem komplementären Strang komplementär ist, nach gewiesen werden. Eine weitere Möglichkeit des Nachweises liegt in der Verwen dung modifizierter Primer, die beispielsweise an ihrem 5'-Ende mit einem Anti gen verbunden sind, das von einem enzymgebundenen Antikörper erkannt wird. In der Literatur finden sich ungezählte Beispiele solcher Nachweisverfahren, die dem Fachmann vertraut sind und die Ausgestaltung des Kits im einzelnen be stimmen.

Wie bereits erwähnt, ist die Nukleotidsequenz des T1-Genes und damit der ko dierenden Bereiche der T1-mRNA bekannt. In Kenntnis der Sequenz kann der Fachmann ohne weiteres geeignete Primer aussuchen. Bevorzugte Ausfüh rungsformen sehen die Verwendung eines Oligonukleotids mit der Sequenz 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' als erstem Oligonukleotid und die eines Oligonukleotids mit der Sequenz 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' als weiterem Oligonukleotid vor. In bevorzugten Ausführungsformen ist mindestens eines der Oligonukleotide an seinem 5'-Ende mit einem Antigen oder einem zur Signalgebung fähigen Enzym konjugiert.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von T1-spezifischen Antikörpern oder Fragmenten solcher Antikörper zum Nachweisen der Gegenwart von T1- Protein in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mamma karzinom. Der Nachweis des T1-Proteines kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von T1- spezifischen Oligonukleotiden zum Nachweisen von T1-mRNA in Probenmaterial aus Patienten mit Mammakarzinom. Bei dem verwendeten Oligonukleotid kann es sich um sense- oder anti-sense-Oligonukleotide handeln.

Die Abbildungen und die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1: Nachweis humaner T1-mRNA-Spezies in kultivierten Zellen und in Primärgewebe. Gesamt-RNA (10 µg, Spuren 1, 3, 5) oder Poly(A)⁺-RNA (1 µg, Spuren 2, 4) aus etablierten Keratenozyten der Haut (Ha-Cat, Spuren 1, 2) und Mastzellen (HMC-1, Spuren 3, 4) sowie aus reifer Plazenta (5) wurden mit einem 1%igen Agarosegel fraktioniert, auf eine Nylonmembran transferiert und mit T1- spezifischen Proben hybridisiert.

A: Hybridisierungsprobe aus dem ORF (Positionen 45-602 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992); detektiert werden 3 mRNA-Spezies mit Größen von 5 kb, 2,7 kb und 2 kb.

B: Hybridisierungsprobe aus dem 3'-untranslatierten Bereich (Position 990-1310 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992); detektiert spezifisch die 2,7 kb-T1- mRNA (sowie unspezifisch 28 S rRNA in Gesamt-RNA-Proben). Die Position der ribosomalen RNA (28 S und 18 S) ist links angegeben.

C: Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis der 2,7 kb-T1-mRNA. T1-positive Gesamt-RNA aus Planzenta wurde in T1-negativer Gesamt-RNA der Zellinie U2OS seriell verdünnt und die RNA-Gemische wurden revers transkribiert. Al quots der cDNA, die jeweils 25 ng RNA-Gemisch/Test entsprechen, wurden mit tels PCR analysiert (siehe Material und Methoden: 25 ng für T1-PCR, 1 µl dar aus für Aktin-PCR). Die Menge von Plazenta-RNA (in ng) pro 25 ng Gesamt- RNA ist über den Spuren angegeben. (Null: Reaktion nur mit T1-negativer RNA; Minus: Negativkontrolle, d. h. PCR ohne cDNA-Matrize). Je 10 µl der Reaktions produkte wurden in einem 2% TBE (TrisboratIEDTA-Puffer) Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt.

Abb. 2: Semiquantitative RT-PCR zum Nachweis von 2,7 kb T1-mRNA in Gesamt-RNA aus Mammakarzinomen. Durchführung siehe Material und Metho den. Es wurden je 10 µl der Reaktionsprodukte auf Agarosegelen aufgetrennt und Ethidiumbromid angefärbt.

Quantitative Auswertung: Densitometrische Bestimmung der Etidiumbromidin tensität der spezifischen Amplifikate der Aktin- und T1-mRNA. Die beobachtete T1-mRNA-Expression wurde wie folgt bewertet:

Signalstärke T1: Aktin < 0,1: T1-negativ, Klasse I
Signalstärke T1: Aktin = 0,1 bis 1: T1-positiv, Klasse II
Signalstärke T1: Aktin < 1: T1-positiv, Klasse III

Abb. 3: Metastasierung in Nodal-negativen Patientinnen. Aufgetragen ist die Anzahl überlebender Patientinnen in Abhängigkeit von der Zeit und unterteilt nach Patientinnen, deren Mammakarzinom-Zellen T1-negativ bzw. T1-positiv war.

Abb. 4: Nachweis von T1-Protein in Mammakarzinomen. Die Immunfärbung wurde wie in Beispiel 5 angegeben durchgeführt.

A) Duktales Karzinom; B) Duktolobuläres Karzinom.

T1-spezifische Signale (dunkle Färbung) können nur in Tumorzellen, nicht aber in umgebenden Stroma beobachtet werden.

Beispiele Material und Methoden 1. RNA-Präparation

1.1 Für die Isolierung von Gesamt-RNA aus tiefgefrorenem Tumorgewebe wurde das Gewebe zunächst unter flüssigem Stickstoff in einem RNAse freien Mörser pulverisiert. Zu je 100 mg pulverisierten Gemisches wurde 1 ml Gua SCN-Lösung (4 M Guanidiniumisothiocyanat, 25 mM Natriumcitrat pH 7,0, 0,5% Natriumlauroylsarcosinat, 0,1 M β-Mercaptoethanol) pipet tiert. Die Suspension wurde in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (ERG) über führt. Zu dieser Suspension wurden nacheinander 90 µl 2 M NaAcetat pH 4,0 (1/10 Vol.), 900 µl wäßriges Phenol und 180 µl Chloroform/Isoamyl alkohol (49 : 1; v:v) zupipettiert, wobei nach jedem Schritt sorgfältig gemischt wurde. Anschließend wurde 15 min auf Eis und 10 min bei RT inkubiert und danach 10 min mit 10000 × g zentrifugiert.

Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgehoben und in ein neues ERG transferiert. Die RNA wurde mit 900 µl Isopropanol (1 Vol.) bei -20°C gefällt (< 1 Std.).

Reinigung

Sobald die RNA gefällt vorlag, wurde auf RNAse-freies Arbeiten geachtet (RNA-Lösung wurde stets auf Eis gekühlt, es wurde nur frisch autoklavier tes Wasser verwendet; das Tragen von Handschuhen war obligatorisch).

Zur Reinigung der RNA wurde eine zusätzliche Ethanolfällung durchge führt: Die Isopropanol-gefällte RNA wurde abzentrifugiert (4°C; 10000 g; 10 min) und mit 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in 300 µl H₂Obidest vollständig gelöst und danach mit 1/10 Vol. Na-Acetat (s. o.) und 900 µl (3 Vol.) eiskaltem Ethanol_(absolut) versetzt. Die RNA wurde erneut bei - 20°C über Nacht gefällt. Nach Zentrifugation bei 4°C (20 min; 10000 × g) wurde das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20-50 µl H₂Obidest aufgenommen. Die RNA wurde entweder bei -70°C oder in Et hanol bei -20°C aufbewahrt.

1.2 Poly(A)⁺-RNA wurde unter Verwendung von Poly(A)-Quicksäulen (Strata gene, Heidelberg, DE) angereichert oder durch Chromatographie auf Oli go(dT)-Zellulose isoliert, wie beschrieben in Maniatis, T., et al., 1982, Mo lecular Cloning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor, N.Y.

2. Northern Blots

Zum Durchführen von Northern Blots wurden zunächst 5 pg RNA glyoxyliert und auf einem 1%igen Agarosegel aufgetrennt, (McMaster et al., 1977). Die Gele wurden vor dem Transfer auf Biodyne-Membranen (Pall Ultrafine Filtra tion Co., Glen Cove N.Y.) mit Akridinorange gefärbt. Die RNA wurde an schließend durch einstündiges Backen bei 80°C an der Membran fixiert.

RNA-Blots wurden mindestens 3 Stunden in Hybridisierungspuffer (50% Formamid, 10 mM Tris-Hydrochlorid pH 7, 5, 2 × SSC (20 × SSC: 3 M NaCl + 0,3 M Natriumcitrat), 5 × Denhardt's Lösung (50 × Denhardt's Lösung: 1% Fi coll, 1% Polyvinylpyrrolidon, 1% Rinderserumalbumin), 1% Natriumdodecyl sulfat und 0,1 mg denaturierte DNA pro ml) vorinkubiert. Anschließend wur den sie in frischem Puffer, enthaltend 0,5 × 10⁶ bis 2 × 10⁶ cpm radiomarkier ter Sonde pro ml 15 Stunden bis 3 Tage bei 45°C in einem rollenden Ofen (Bachhofer) hybridisiert. Die Filter wurden gründlich in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C gewaschen und autoradiographiert.

3. PCR-Reaktion 3.1 Qualitative PCR

Für die Durchführung der PCR-Reaktion wurde 1 pg Gesamt-RNA 5 Minu ten bei 95°C denaturiert, in 20 µl RT-PCR-Puffer (50 mM KCl, 20 mM Tris, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, jeweils 1 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP pH 8,4, 0,5 Einheiten RNasin, 0,09 OD₂₆₀-Einheiten Ran dom-Primer (BRL, Eggenstein, DE) aufgenommen und mit 200 Einheiten Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV) Reverser Transkriptase (BRL) ver setzt. Die Reaktionsansätze wurden 10 Minuten bei 20°C und anschließend 45 Minuten bei 42°C inkubiert und die Reaktion dann durch 5 Minuten Er wärmen auf 95°C beendet. Für die Amplifikation wurden die cyclischen Re aktionen in einem Thermalcycler (TC1, Perkin Elmer, Überlingen, DE) durchgeführt. Jeder Zyklus bestand aus 1 Minute Denaturieren bei 94°C, 1 Minute Hybridisieren bei 55°C und 3 Minuten Polymerisation bei 72°C. Es wurden 30 Amplifikationszyklen durchgeführt. Im letzten Zyklus wurde die Polymerisation um 10 Minuten verlängert.

In jedem Amplifikationstest wurde ein 10 µl Aliquot des Reversen- Transkriptionscocktails verwendet. Die Aliquots wurden in einem Gesamt volumen von 50 µl in RT-PCR-Puffer inkubiert, der 10 pmol jedes der bei den spezifischen Primer, und 1 Einheit DNA-Polymerase (AmpliTaqu, Per kin Elmer) enthielt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Pro ben mit Chloroform extrahiert und die Reaktionsprodukte nach Auftrennung der Aliquots der Reaktion auf 2%igen Agarosegelen beobachtet.

3.2 Semiquantitative PCR

Für die semiquantitative PCR-Analyse werden parallele Ansätze mit ver schiedenen cDNA-Verdünnungen (entsprechend 500 ng/125 ng/31 ng Ge samt-RNA) für die T1-PCR-Reaktion (50 µl) eingesetzt. Aus dem fertig pipettierten, aber noch nicht amplifizierten Reaktionsgemisch werden 2 µl entnommen und in einem separaten 50 µl Ansatz zusammen mit 10 pm Ak tinprimer unter den gleichen Bedingungen, wie für die qualitative PCR be schrieben, amplifiziert. Für die Auswertung werden gleiche Mengen der amplifizierten T1-Ansätze und der Aktinreaktionen auf 2%igen Agarosege len elektrophoretisiert. Das Verhältnis der Bandenstärken der T1- bzw. Ak tin-spezifischen Banden wird densitometrisch bestimmt.

4. In situ-Hybridisierung

Gefrierschnitte gefrorenen Tumorgewebes von 7 bis 9 µm Dicke wurden bei -20°C geschnitten, auf Silan-beschichtete Objektträger übertragen und in 4% Paraformaldehyd (PAF) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 1,4 mM Kali umdihydrogenphosphat, pH 7,3) 30 Minuten fixiert. Fixierte Schnitte wurden bei 43°C getrocknet. Vor der Hybridisierung wurden die Schnitte 5 Minuten bei Raumtemperatur in PBS rehydriert, mit Proteinase K (2 µg/ml in 100 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) 5 bis 10 Minuten bei 37°C behandelt und 5 Minuten in 4% PAF in PBS bei Raumtemperatur refixiert. Anschließend wurden die Proben 3 × 3 Minuten in PBS gewaschen und 10 Minuten unter tropfenwei sein Zusatz von 0,25% Essigsäureanhydrid in 100 mM Triäthanolamin inku biert. Die Schnitte wurden mindestens 1 Stunde bei 37°C in 50% Formamid, 2 × SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7) vorhybridisiert. Anschlie ßend wurden jedem Gefrierschnitt 20 µl Hybridisierungspuffer (50% Forma mid, 2 × SSC, 10% Dextransulfat, 0,1% SDS, 250 µg/ml denaturierte Lachs sperma-DNA, pH 7), enthaltend 1 × 10⁶ cpm ³⁵S-markierte RNA-Sonde, zuge fügt und die Hybridisierung 16 bis 18 Stunden bei 42°C in einer feuchten Kammer durchgeführt. Die Schnitte wurden 3 × für 20 Minuten in 4 × SSC bei 42°C gewaschen, mit RNAse A (20 µg/ml in 0,5 M NaCl, 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) 30 Minuten bei 37°C behandelt, 1 × mit 2 × SSC und 1 × mit 1 × SSC 30 Minuten bei 42°C gewaschen, in Ethanol dehydriert und luftgetrock net. Die trockenen Objektträger wurden in Kodak NTB-2 Fotoemulsion (Tecnomara, Fernwald) getaucht, 1 bis 3 Wochen exponiert, dann entwickelt (Kodak D19) und fixiert (Unifix, Kodak). Schließlich wurden die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, dehydriert, in Eukitt (Kindler, Freiburg, DE) eingebettet und unter Verwendung eines Zeiss Axioskops mit Hell- und Dun kelfeldeinrichtung angesehen.

Beispiel 1 Expression von T1-mRNA in Humanzellen und -gewebe

Die T1-mRNA-Expression wurde in Gesamt-RNA und Poly(A)⁺-angereicherter RNA analysiert, die aus kontinuierlichen Keratinozyten (Ha-Cat) und reifer Pla zenta isoliert worden waren. Die Northern Blot-Hybridisierung mit Sonden, die den 5'-Teil des offenen Leserasters der T1-cDNA enthalten, zeigte 3 Transkripte von 2 kb, 2,7 kb und 5 kb (Abb. 1A). Die Größe der letztgenannten 2 Transkripte stimmt gut mit Ergebnissen überein, die in Mäusezellen erhalten worden sind, in denen eine T1-mRNA von 5 kb den Transmembranrezeptor T1-M und eine T1-mRNA von 2,7 kb das tumorassoziierte lösliche T1-Protein ko diert. Die Hybridisierung mit einem Fragment des 3'-nicht-translatierten Berei ches (Positionen 45-602 der cDNA-Sequenz nach Tominaga, 1992) der huma nen T1-cDNA bestätigte die Identität der humanen 2,7 kb mRNA mit der das ausgeschiedene T1-Protein kodierenden Spezies (Abb. 1B).

Für einen empfindlicheren Nachweis von T1-mRNA in Tumoren wurde ein semi quantitativer RT-PCR-Test etabliert. Für die ausgeschiedene tumorassoziierte T1-Variante spezifische PCR-Primer wurden so ausgewählt, daß sie zur Erzeu gung eines 322 bp-Fragmentes im 3'-nicht-translatierten Bereich führten. Als interne Kontrolle wurden Aktinsequenzen koamplifiziert. Nach RT-PCR von RNA- Präparationen, die sich in Northern-Blot-Hybridisierungen als positiv erwiesen hatten, wurden Amplifikationsprodukte der erwarteten Größe erhalten. Die quantitative Auflösung des Verfahren wurde in einem Verdünnungsexperiment demonstriert. Es wurde eine Verdünnungsreihe von T1-positiver Plazenta-RNA in T1-negativer RNA gleicher Konzentration angelegt und mittel RT-PCR analy siert. Wie in Abb. 1C gezeigt ist, wurde eine lineare Abnahme des T1- spezifischen Amplifikationsproduktes in Reaktionen beobachtet, die 25 bis 1,5 ng Plazenta-RNA enthielten. Aufgrund der Gegenwart ansteigender Mengen T1- negativer RNA in diesem Test wurden konstante Mengen Aktin-spezifischer Pro dukte in allen Reaktionen erhalten.

Beispiel 2 T1-mRNA-Expression in Mammakarzinomen

Es wurde die Gesamt-RNA aus frisch eingefrorenem Gewebe von 41 Patienten mit invasivem Mammakarzinom und 6 Patienten mit Mastopathie isoliert; als positives Kontrollgewebe wurde Plazenta verwendet. Die Expression der 2,7 kb T1-mRNA wurde mittels des oben beschriebenen semiquantitativen RT-PCR untersucht.

Für die quantitative Bewertung der T1-Expression wurden die coamplifizierten Aktinsequenzen aus der gleichen Probe als interner Standard verwendet (siehe Abb. 2).

In allen 6 Proben von Mastopathiepatienten wurde keine T1-mRNA oder nur ver nachlässigbar geringe Mengen nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigten die T1-mRNA-Spiegel in aus Tumorgewebe gewonnener RNA eine hohe Variabilität. Die quantitative Auswertung erfolgte densitometrisch (siehe Legende zu Abb. 2). Für die weitere Analyse wurde ein Klassifikationsschema mit 3 Kategorien ver wendet. Die T1-mRNA-Spiegel wurden wie folgt bewertet:

(I): T1-negativ: T1-Amplifikationsprodukt nicht nachweisbar oder nur sehr schwach sichtbar (T1: Aktin < 0,1);
(II): T1-positiv: mittlere T1-mRNA-Werte, eindeutig nachweisbar, aber schwächer als das Aktinsignal (T1: Aktin = 0,1 bis 1);
(III): T1-positiv: hohe T1-mRNA-Werte, Signal gleich stark oder stärker als das Aktinsignal (T1: Aktin < 1).

Beispiele für das Bewertungsmuster sind in Abb. 2 gezeigt. Bei Anwendung dieses Schemas umfaßte die Klasse I alle 6 Mastopathie-Proben und 34% der Tumore (N = 13). 49% der Tumore (N = 21) wurden als II bewertet und 17% der Tumore (N = 7) zeigten hohe T1-mRNA-Spiegel (III) (siehe Tabelle 2).

Beispiel 3 Korrelation der T1-Expression mit bekannten Prognosekriterien 3.1 T1-Expression und histologischer Typ

Bei den 40 untersuchten Karzinomen handelte es sich um 12 lobuläre Karzino me, 7 duktolobuläre und 21 duktale Karzinome. Bei diesen Tumoren wurde fol gende T1-Expression festgestellt:

TABELLE 2

3.2 T1-Expression und Tumorgrading

Die T1-Expression zeigte keine Korrelation mit dem Tumorgrading.

3.3 T1-Expression und Tumorgröße

T1-Expression und Tumorgröße korrelierten wie folgt:

TABELLE 3

3.4 T1-Expression und Nodalstatus

Zwischen T1-Expression und Nodalstatus wurden folgende Zusammenhänge beobachtet:

TABELLE 4

Beispiel 4 Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression 4.1 Prognostische Signifikanz für alle Patienten

Von 32 beobachteten Patienten überlebten den Beobachtungszeitraum von 47 Monaten 24 Patienten (75%). Innerhalb dieses Zeitraums traten Karzinome in 16 der beobachteten Patienten wieder auf (50%). Bei einer univariaten Analyse aller Patienten erlaubte die T1-Messung keine Vorhersage über Rezidiv oder Überle ben. Die klassischen Prognosefaktoren Lymphknotenstatus und Tumorgröße waren dagegen von hohem prognostischem Wert.

4.2 Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression in axilliär Nodal negativen Patienten

Die Nodal-negative Gruppe umfaßte 18 Patienten, von denen 7 (39%) ein erneu tes Karzinom entwickelten. In der Nodal-negativen Patientengruppe war der Grad der T1-Expression ein starker prognostischer Indikator für ein Wiederauf treten der Erkrankung, vergleichbar dem bekannten Ki67-Marker, während sich die Tumorgröße als prognostisch wertlos erwies. Keiner der 8 Nodal-negativen, T1-positiven Patienten entwickelte während des Beobachtungszeitraums eine beide überlebten während des Beobachtungszeitraums. Im Gegensatz dazu entwickelten 5 von 8 Nodal-negativen, T1-negativen Patienten (62,5%) ein er neutes Karzinom und 2 (25%) starben innerhalb des Beobachtungszeitraums (siehe Abb. 3).

4.3 Prognostische Signifikanz der T1-mRNA-Expression in axilliär Nodal positiven Patienten

Die Nodal-positive Patientengruppe umfaßte 14 Patienten, von denen 9 ein Kar zinomrezidiv entwickelten. Von diesen waren nur 4 T1-negativ. In einem Patien ten wurden zum Zeitpunkt der Operation Metastasen diagnostiziert. Die 3 Nodal negativen Patienten ohne Metastasen blieben karzinomfrei. Von den 10 Nodal positiven, T1-positiven Patienten entwickelten 8 (80%) ein erneutes Karzinom und 6 (60%) verstarben innerhalb des Beobachtungszeitraums.

Beispiel 5 Immunhistochemische Analyse von Mammakarzinomproben

5 µm dicke Gewebeschnitte von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettetem Gewebe wurden deparaffiniert und mit einem polyklonalen Antiserum gegen die carboxyterminale Sequenz von T1-S (Rössler, 1995a) inkubiert (8,5 µg IgG/ml). Die T1-spezifische Immunreaktion wurde mittels eines sekundären biotinylierten anti-Kaninchen-Antikörpers, eines Avidinperoxidasekomplexes und Diamino benzidinfärbung nachgewiesen (Immunostaining Kit: Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories via SERVA, Heidelberg, FRG). T1-spezifische Färbung: braun, Gegenfärbung mit Hämatoxylin: blau. Die Analyse belegt die Anwesenheit von T1-Protein in den Tumorzellen, nicht aber im umgebenden Stroma (Abb. 4). Die Ergebnisse der immunhistochemischen Analyse entsprechen daher denen der in situ-Hybridisierung mit T1-spezifischen Sonden.

Literaturliste

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Claims

1. In vitro-Verfahren zum Prognostizieren des Krankheitsverlaufs von Patienten mit Mammakarzinom und/oder zum Diagnostizieren eines Mammakarzinoms, umfassend das qualitative oder quantitative Bestimmen von T1-Protein und/oder T1-mRNA in aus dem Patienten gewonnenem Probenmaterial.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß T1-Protein und/oder T1-mRNA einer Tumorgewebeprobe des Patienten bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß T1-Protein in einer Blut- oder Serumprobe bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß T1-mRNA mit einem auf PCR beruhenden Verfahren bestimmt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenmaterial einem für T1 spezifischen Antikörper oder Fragmenten da von ausgesetzt wird und T1-Protein qualitativ oder quantitativ bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ge gen das p9-Peptid gerichtet ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ge gen das p16-Peptid gerichtet ist.

9. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 8 geeignet ist und einen T1 -spezifischen Antikörper oder Fragmente enthält.

10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der T1-spezifische Anti körper ein monoklonaler Antikörper ist.

11. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der T1-spezifische Anti körper ein polyklonaler Antikörper ist.

12. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der T1-spezifische Antikörper gegen das p9-Protein gerichtet ist.

13. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der T1-spezifische Antikörper gegen das p16-Protein gerichtet ist.

14. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 geeignet ist und mindestens ein Oligonukleo tid enthält, das zur T1-mRNA komplementär ist, sowie gegebenenfalls ein oder mehrere weitere Oligonukleotide, die die Amplifikation von T1-spezifischer mRNA und/oder eines dazu komplementären Stranges erlauben.

15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er weiterhin RNAse H und reverse Transkriptase enthält.

16. Kit nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß das zur T1-mRNA komplementäre Oligonukleotid die Sequenz 5'-CTT TGA TCA CCT GAA CTT TCT CTA GCA-3' aufweist.

17. Kit nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere Oligonukleotid die Sequenz 5'-AGT TTT CGG TTG TTG GTG CAT TTC-3' als weiterem Oligonukleotid vor. In bevorzugten Ausführungsformen aufweist.

18. Verwendung eines T1-spezifischen Antikörpers oder von Fragmenten davon zum Nachweisen der Gegenwart von T1-Protein in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mammakarzinom.

19. Verwendung eines T1-spezifischen Oligonukleotids zum Nachweisen von T1-mRNA in Gewebeproben, Blut- oder Serumproben eines Patienten mit Mammakarzinom.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das T1- spezifische Oligonukleotid zur T1-mRNA komplementär ist.

21. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz des T1-spezifischen Oligonukleotids einem Teil der Sequenz der T1-mRNA ent spricht.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die T1-mRNA ganz oder teilweise amplifiziert wird.