DE19705289C1

DE19705289C1 - Method for collecting biological cell sample(s)

Info

Publication number: DE19705289C1
Application number: DE1997105289
Authority: DE
Inventors: Holger Paschold; Dirk Dr Weuster-Botz; Ulrike Schaefer; Wolfgang Boos
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1997-02-12
Publication date: 1998-06-25
Anticipated expiration: 2017-02-13

Abstract

Method for collecting biological cell samples comprises transporting a series of vessels sequentially beneath an alcohol dispenser and a sample dispenser so that each vessel is first filled to \- 50% of its capacity with aqueous alcohol and then charged with a sample. The aqueous alcohol contains 30-80 vol.% alcohol and is cooled to a temperature such that when the cell sample is added, the intracellular metabolic "conversion" rate is immediately reduced to zero.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur schnellen Probenahme biologischer Proben.The invention relates to a method for rapid biological sampling Rehearse.

Die innerhalb von Zellen ablaufenden stoffwechselphysiologischen Vorgänge sind sehr komplex und zum Teil noch unverstanden. Eine Möglichkeit zur Aufklärung solcher Vorgänge erfolgt über die Bestimmung intrazellulärer Stoffwechselmetabolite während der Zellkultivierung. Dafür werden im Laufe der Kultivierung dem Medium zu unterschiedlichen Zeiten Zellproben entnommen, die den zu untersuchenden Metaboliten entsprechend auf- und weiterverarbeitet und schließlich analysiert werden. Die zu den unterschiedlichen Zeiten der Kultivierung gewonnenen Analyseergebnisse geben in der Regel jedoch nur den zum Zeitpunkt der Probenahme vorliegenden Status quo innerhalb der Zelle wieder. Um aber Informationen über innerhalb der Zelle sich verändernde Stoffwechselflüsse zu bekommen (Aufbau und Abbau von Metabolitkonzentrationen), sind Probenahmen innerhalb von möglichst kurzen Zeitabständen notwendig.The metabolic physiological processes taking place within cells are very complex complex and partly still not understood. One way to clear up such Processes takes place via the determination of intracellular metabolic metabolites during of cell cultivation. In the course of cultivation, the medium increases Cell samples are taken at different times that contain the metabolites to be investigated processed accordingly and finally analyzed. The to the Analysis results obtained at different times of cultivation give in the As a rule, however, only the status quo at the time of sampling the cell again. But to get information about within the cell changing To get metabolic flows (build-up and breakdown of metabolite concentrations), Sampling is necessary within the shortest possible time intervals.

Dafür sind bereits unterschiedliche Probenahmetechniken entwickelt worden, so beispielsweise die schnelle Probenahme mittels eines Probenahmerohres. Bei dieser Art von Probenahme wird die Fermenter- bzw. Zellprobe kontinuierlich über einen bestimmten Zeitraum und gleichzeitig mit einem Inaktivierungsreagenz in ein Pobenrohr gefüllt und anschließend eingefroren. Für die Analysen wird die rohrförtnig gefrorene Probe in Teilstücke zerlegt. Der Probenahmezeit entsprechend befinden sich die Zellproben an den jeweils unterschiedlichen Positionen innerhalb des Rohres, wobei durch die kontinuierliche Probenahme die Zeitabstände praktisch "fließend" sind und daher die Dynamik des Stoffwechselprozeßes hinsichtlich bestimmter Metabolite analysiert werden kann. So wird durch die örtliche Fixierung des schnellen zeitlichen Reaktionsverlaufes bei dieser Vorgehensweise eine zeitliche Auflösung von 3 Proben/Sekunde erzielt. Allerdings hat diese Art der Probenahme den Nachteil, daß sowohl das verwendete Inaktivierungsreagenz wie auch die beim Einfriervorgang gebildeten Eiskristalle die Zellen häufig zerstören und damit eine Vermischung von internen und externen Metaboliten stattfindet, die die Analyseergebnisse verfälscht. Auch können aufgrund ungünstiger Volumenverhältnisse häufig interne Stoffwechselmetabolite nicht von externen unterschieden und Metabolite in geringen Konzentrationen nicht nachgewiesen werden.Different sampling techniques have already been developed for this, see above for example, rapid sampling using a sampling tube. With this species From sampling, the fermenter or cell sample is continuously passed through a certain period of time and at the same time with an inactivation reagent in a sample tube filled and then frozen. The tubular frozen Sample broken down into pieces. According to the sampling time, the Cell samples at the different positions within the tube, where Due to the continuous sampling, the time intervals are practically "fluid" and hence the dynamics of the metabolic process with regard to certain metabolites can be analyzed. So by the local fixation of the fast temporal The course of the reaction with this procedure has a temporal resolution of 3 samples / second achieved. However, this type of sampling has the disadvantage that both inactivation reagent used as well as those formed during the freezing process Ice crystals often destroy the cells and thus a mixing of internal and external metabolites takes place, which falsifies the analysis results. Also can internal metabolic metabolites are often not due to unfavorable volume ratios differentiated from external and metabolites in low concentrations not be detected.

Desweiteren existieren automatische Probensammler, mit denen über einen längeren Zeitraum steril Zellproben entnommen werden können. Die Proben werden anschließend bei 4°C gekühlt. Mit derartigen Autosamplern können nur eine geringe Anzahl von Proben abgefüllt werden (etwa 12 Proben/Versuch), und die zeitliche Auflösung ist sehr gering (≧ 1 Probe/Minute). Da in biologischen Proben selbst bei 4°C die Stoffwechselvorgänge nicht zum Stillstand kommen, ist die Reproduzierbarkeit der Probennahmen über einen längeren Zeitraum nicht gegeben. Ein Beispiel für einen Autosampler ist der BioSampler MX-3 von New Brunswick Scientific GmbH, Heusenstamm.There are also automatic sample collectors that can be used over a longer period of time Period of time sterile cell samples can be taken. The samples are then chilled at 4 ° C. With such autosamplers only a small number of Samples are filled (about 12 samples / trial), and the temporal resolution is great low (≧ 1 sample / minute). Since in biological samples even at 4 ° C the Metabolic processes do not come to a standstill, the reproducibility is the Sampling not given over a longer period of time. An example of one The autosampler is the BioSampler MX-3 from New Brunswick Scientific GmbH, Heusenstamm.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur schnellen Probenahme biologischer Proben mit hoher zeitlicher Auflösung zu schaffen, das gleichzeitig eine möglichst direkte Inaktivierung der Stoffwechselvorgänge bei der Probenahme ermöglicht, ohne daß Zellen zerstört werden.It is the object of the present invention to provide a method for rapid sampling to create biological samples with high temporal resolution, the one at the same time Inactivation of the metabolic processes as directly as possible during sampling made possible without destroying cells.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Aufnahme der Proben dienende Behältnisse, wie beispielsweise Zentrifugenröhrchen, nacheinander angeordnet sind und zunächst mit einem gekühlten Alkohol/Wassergemisch und anschließend mit Probe gefüllt werden, wobei der Füllvorgang taktweise erfolgt. Dafür wird ein erstes Probebehältnis mit einem Transportmittel unterhalb der Austrittsöffnung eines Behälters, der das Alkohol/Wassergemisch enthält, positioniert und mit dem gekühlten Alkohol/Wassergemisch soweit gefüllt, daß der Anteil des Alkohol/Wassergemisches mindestens etwa 50 Vol.-%, bezogen auf das Endvolumen, beträgt. According to the invention, this object is achieved in that for receiving the samples Serving containers, such as centrifuge tubes, arranged one after the other are and first with a chilled alcohol / water mixture and then with Sample can be filled, the filling process taking place in cycles. There will be a first Sample container with a means of transport below the outlet opening of a container, containing the alcohol / water mixture, positioned and with the cooled Alcohol / water mixture filled so far that the proportion of alcohol / water mixture is at least about 50% by volume, based on the final volume.

Die Menge an gekühltem Alkohol wird über den Vordruck im Alkoholvorratsbehälter und die Öffnungszeit eines Alkohol-Dosierventils realisiert. Der Alkoholanteil im Alkohol/Wassergemisch beträgt 30 bis 80 Vol.-%, wobei das im Einzelfall konkret zu wählende Verhältnis von Alkohol: Wasser vom Volumen und der Art der zugegebenen biologischen Probe abhängt: Nach Zugabe der Probe sollte das Gesamtgemisch aus Alkohol, Wasser und Probe bei bis zu etwa -75°C nicht gefrieren und die Zellen durch den Anteil des zugegebenen Alkohols nicht zerstört werden. Im Alkohol/Wassergemisch wird als Alkohol vorzugsweise Methanol eingesetzt, wobei der Methanolanteil im Methanol/Wassergemisch insbesondere 60 Vol.-% beträgt. Desweiteren ist die Temperatur des Alkohol/Wassergemisches so gewählt, daß nach Zugabe der Probe zum Gemisch der Stoffumsatz innerhalb der Zellen direkt gestoppt wird bzw. die Reaktionsgeschwindigkeit direkt gegen Null geht. Dafür beträgt die Temperatur des Gesamtgemisches nach Zugabe der Zellprobe vorzugsweise höchstens -20°C. Werden beispielsweise Bakterienzellen bei 30°C kultiviert und soll ein Teil Probe davon auf zwei Teile Alkohol/Wasser gegeben werden, sollte das vorgelegte Alkohol/Wassergemisch auf eine Temperatur von etwa -40°C abgekühlt sein, damit nach Zugabe der auf 30°C erwärmten Probe eine Temperatur von etwa -20°C erreicht wird.The amount of chilled alcohol is determined by the pre-pressure in the alcohol storage tank and realized the opening time of an alcohol metering valve. The alcohol content in the The alcohol / water mixture is 30 to 80% by volume, this being the case in individual cases choosing ratio of alcohol: water by volume and type of added biological sample depends: After adding the sample, the total mixture should be out Alcohol, water and sample will not freeze and the cells will not freeze at temperatures down to about -75 ° C the proportion of added alcohol is not destroyed. In the alcohol / water mixture methanol is preferably used as the alcohol, the methanol content in the Methanol / water mixture is in particular 60% by volume. Furthermore is the Temperature of the alcohol / water mixture chosen so that after adding the sample to the The metabolism within the cells is stopped directly or the mixture Reaction speed goes directly to zero. For this, the temperature of the Total mixture after addition of the cell sample preferably not more than -20 ° C. Will For example, bacterial cells are cultivated at 30 ° C and a portion of the sample should be divided into two Parts of alcohol / water are given, the alcohol / water mixture should be added a temperature of about -40 ° C, so after adding the to 30 ° C heated sample a temperature of about -20 ° C is reached.

Das mit dem gekühlten Alkohol/Wassergemisch gefüllte Probenbehältnis wird anschließend unterhalb der Austrittsöffnung eines die Zellen enthaltenen Behälters, wie beispielsweise eines Fermenters oder Reaktors, transportiert, positioniert und mit Probe gefüllt, wobei die Probe in das entsprechend gekühlte Alkohol/Wassergemisch vorzugsweise gesprayt wird. Dabei sollten die Tröpfchen des "Probesprays" so fein verteilt sein, daß möglichst alle in der Probe enthaltenen Zellen direkt auf -20°C oder kälter abgekühlt werden. Es kann kalkuliert werden, daß, wenn innerhalb von 50 msec. eine Abkühlung von 30°C auf -20°C erfolgen soll, der Tröpfchendurchmesser maximal etwa 0,3 mm betragen darf Da in der Regel eine schnellere Abkühlung erwünscht ist, sollte der Durchmesser der Probentröpfchen unterhalb von 0,3 mm liegen. Beim Einprayen der Probe in das kalte Alkohol/Wassergemisch erfolgt somit ein schnelles Abkühlen und damit ein schnelles bzw. direktes Abstoppen der biologischen Reaktionen innerhalb der Zellen, ohne daß die Integrität der Zellen zerstört wird. Nach Beendigung des Füllvorgangs sind die Probenbehältnisse vorzugsweise mit 2 Teilen Alkohol/Wasser und 1 Teil Probe gefüllt. The sample container filled with the cooled alcohol / water mixture is then below the outlet opening of a container containing the cells, such as for example a fermenter or reactor, transported, positioned and with sample filled with the sample in the appropriately cooled alcohol / water mixture is preferably sprayed. The droplets of the "test spray" should be so fine be distributed that as possible all cells contained in the sample directly to -20 ° C or be cooled down colder. It can be calculated that if within 50 msec. a cooling from 30 ° C to -20 ° C should take place, the maximum droplet diameter may be about 0.3 mm.As a rule, faster cooling is desired, the diameter of the sample droplets should be less than 0.3 mm. At the The sample is sprayed into the cold alcohol / water mixture quickly Cooling down and thus a quick or direct stopping of the biological reactions within the cells without damaging the integrity of the cells. After completion During the filling process, the sample containers are preferably with 2 parts alcohol / water and 1 part sample filled.

Gleichzeitig mit dem Transport und der Positionierung des mit Alkohol/Wasser gefüllten Probebehältnisses unterhalb der Austrittsöffnung des die Zellen enthaltenen Behälters wird das nachgeordnete Probebehältnis unterhalb der Austrittsöffhung des Behälters, der das Alkohol/Wassergemisch enthält, transportiert und positioniert. Dieser taktweise Vorgang des Weitertransportes und der Positionierung wiederholt sich im weiteren Verfahren, so daß das jeweils nachgeordnete Probenbehältnis in einem ersten Takt zum Füllen mit Alkohol/Wasser unterhalb der Austrittsöffhung des Behälters, der das Alkohol/Wassergemisch enthält, transportiert und positioniert wird, während gleichzeitig das vorgeschaltete, bereits mit Alkohol/Wasser gefüllte Behältnis in einem zweiten Takt zwecks Probenahme unterhalb der Austrittsöffhung des die Zellen enthaltenen Behälters transportiert und positioniert wird. Die Zudosierung des kalten Alkohol/Wasser gemisches in das nachgeordnete Probenbehältnis erfolgt vorzugsweise gleichzeitig mit dem Einsprayen der Zellprobe in das vorgeschaltete Probebehältnis. Der beschriebene Vorgang der Probenahme wird wiederholt, bis alle Probenahmebehältnisse befüllt sind. Die Zellprobenahme erfolgt vorzugsweise kontinuierlich: Dafür bleibt am entsprechenden Behältnis, beispielsweise am Bioreaktor, das Probenahmeventil während des gesamten Probenahmevorgangs geöffnet, da die Probenahmen zeitlich so schnell erfolgen, daß die Schließ- und Öffnungszeiten des Probenahmeventils zu lang sind. Bei kontinuierlicher Probenahme von jeweils 5 ml Probevolumen können etwa 4 bis 5 Proben/Sekunde erhalten werden, so daß schnelle dynamische Stoffwechselprozesse untersucht werden können. Auch können in diesem kontinuierlichen Probenahmeprozeß hohe Probezahlen erreicht werden. Überschüssiges Probevolumen zwischen zwei Positionierungen der Probenahmebehältnisse wird über eine Ablaufrinne abgeführt.Simultaneously with the transport and positioning of the alcohol / water filled one Sample container below the outlet opening of the container containing the cells the downstream sample container is below the outlet opening of the container, the the alcohol / water mixture contains, transported and positioned. This clockwise The process of further transport and positioning is then repeated Method so that the respective downstream sample container in a first cycle to Fill with alcohol / water below the outlet opening of the container that holds the Alcohol / water mixture contains, transported and positioned while at the same time the upstream container already filled with alcohol / water in a second cycle for the purpose of sampling below the outlet opening of the container containing the cells is transported and positioned. The addition of the cold alcohol / water Mixture in the downstream sample container is preferably carried out at the same time spraying the cell sample into the upstream sample container. The described The sampling process is repeated until all sampling containers are filled. The cell sampling is preferably carried out continuously: for this, the relevant one remains Container, for example on the bioreactor, the sampling valve throughout Sampling process opened because the sampling time is so fast that the The closing and opening times of the sampling valve are too long. With continuous Sampling of 5 ml sample volume each can take about 4 to 5 samples / second can be obtained so that rapid dynamic metabolic processes can be studied can. High numbers of samples can also be used in this continuous sampling process can be achieved. Excess sample volume between two positions of the Sampling containers are discharged via a drainage channel.

Untersuchungen von sich verändernden Stoffwechselflüssen innerhalb der Zelle erfolgen in der Regel nach Anregung des Metabolismus durch Ausübung eines dynamischen Pulses, beispielsweise durch pulsartige Zugabe einer Substratkonzentration. Dabei erfolgen Stoffwechselflußänderungen vor allem innerhalb einer Zeitspanne direkt nach Ausüben des Pulses; im Verlauf der weiteren Kultivierung erreicht der Stoffwechselfluß dann wieder seinen Ausgangslevel. Eine kontinuierliche Probenahme ist daher insbesondere in einer gewissen Zeitspanne nach Ausüben des Pulses von Interesse, während zu einem späteren Zeitpunkt der Kultivierung der Zeitabstand zwischen zwei Probenahmen nach und nach verlängert werden kann. Dafür wird die kontinuierliche Probenahme auf eine diskontinuierliche umgestellt, indem das Alkohol/Wassergemisch- und Probenahmeventil geschlossen werden. Soll eine weitere Probenahme erfolgen, werden die Ventile wieder geöffnet. Die erste Probe des nach Öffnen des Probenahme ventils gefüllten Probebehältnisses wird in der Regel verworfen, da sich - je nach Wartezeit bis zur nächsten Probenahme - das bereits im Probebehältnis befindliche Alkohl/Wassergemisch soweit erwärmt hat, daß eine rasche Abkühlung der Zellen bzw. eine direkte Inaktivierung des Stoffwechsels innerhalb der Zellen nicht mehr gewährleistet ist. Bis zum Schließen der Ventile kann die Probenahmen wieder kontinuierlich erfolgen. Insgesamt können also mit dem erfindungsgemäßen Verfahren die Probenahmen im Laufe des gesamten Probenahmevorgangs beliebig flexibel und variabel gestaltet werden. Der gesamte Ablauf der Probenahmen erfolgt Rechner gesteuert.Investigations of changing metabolic flows within the cell are carried out usually after stimulating the metabolism by exercising a dynamic Pulses, for example by adding a substrate concentration in a pulsed manner. Included Changes in metabolic flow occur mainly within a period of time directly after Exercise of the pulse; in the course of further cultivation the metabolic flow reaches then back to its starting level. Continuous sampling is therefore essential especially in a certain period of time after exercising the pulse of interest, while at a later stage of cultivation the time interval between two Sampling can be gradually extended. For this, the continuous Sampling switched to a discontinuous one by the alcohol / water mixture- and sampling valve are closed. If another sample is to be taken, the valves are opened again. The first sample of the after opening the sampling valve filled sample container is usually discarded because - depending on Waiting time until the next sample is taken - the one already in the sample container Alcohol / water mixture has warmed up to the point that the cells resp. a direct inactivation of the metabolism within the cells no longer occurs is guaranteed. Sampling can take place again until the valves are closed take place continuously. Overall, with the method according to the invention the sampling in the course of the entire sampling process flexibly and as required can be designed variably. The entire sampling process is done by computer controlled.

Nach Beendigung der Probenahme werden die Probebehältnisse verschlossen und können in einer Kühltruhe bei etwa -70°C bis zur Probenaufbereitung gelagert werden. Da der Alkohol die Bildung von Eiskristallen verhindert und eine Vielzahl von Zellen den Alkohol innerhalb bestimmter Konzentrationsbereiche aufgrund ihrer Membran zusammensetzung tolerieren, werden die Zellen nicht zerstört. Zur Analytik der intrazellulären Metabolitkonzentrationen können die eingefrorenen Proben bis auf beispielsweise etwa -40°C wieder aufgetaut und das Alkohol/Wassergemisch in einer Tiefkühlzentrifuge von den Zellen getrennt. Das verbleibende Zellpellet kann dann aufgeschlossen und die extrahierten Metabolite mit Standard-Laboranalysetechniken gemessen werden. Da die Zellen durch die Methode der Probenahme nicht zerstört werden, kann nach der Separierung zwischen externen und internen Metaboliten unterschieden werden. Durch Aufkonzentrierung der Proben können auch in sehr geringen Konzentrationen vorliegende Metabolite nachgewiesen und bestimmt werden. After completion of the sampling, the sample containers are closed and can be stored in a freezer at around -70 ° C until the sample is prepared. Because the alcohol prevents the formation of ice crystals and a large number of cells den Alcohol within certain concentration ranges due to their membrane tolerate composition, the cells are not destroyed. For the analysis of the intracellular metabolite concentrations can up to the frozen samples for example about -40 ° C thawed again and the alcohol / water mixture in a Freezer centrifuge separated from the cells. The remaining cell pellet can then digested and the extracted metabolites using standard laboratory analysis techniques be measured. Because the cells are not destroyed by the method of sampling after separation between external and internal metabolites can be distinguished. By concentrating the samples can also be in very metabolites present in low concentrations can be detected and determined.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand des folgenden Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die beigefügte Fig. 1 näher erläutert:The method according to the invention is explained in more detail using the following exemplary embodiment with reference to the attached FIG. 1:

Embodiment:

Zur Messung der Dynamik intrazellulärer Metabolitkonzentrationen von E. coli nach einem Glukosepuls wird ein kontrollierter Standardbioreaktor 1 kontinuierlich betrieben. Nach Erreichen eines Fließgleichgewichtszustandes mit wachstumslimitierenden Glukosekonzentrationen im Bioreaktor wird der Metabolismus der im Bioreaktor kultivierten Mikroorganismen 2 durch pulsartige Zugabe eines Glukosekonzentrats dynamisch angeregt. Die schnellen dynamischen Änderungen intrazellulärer Metabolit konzentrationen als Folge dieses Substratpulses sollen gemessen werden. Hierzu wird die schnelle Probenahme eine Sekunde vor Auslösen des Substratpulses gestartet, indem das Probenahmeventil 3 am Bioreaktor und das Methanolventil 4 an der Methanol/Wasser- Vorlage 5 geöffnet wird. Hierdurch strömt 30°C warmes Medium mit Mikroorganismen in ein Probengefäß 7 und -40°C kaltes 60% Methanol in das nachfolgende Probengefäß. Die Probengefäße mit einem Volumen von 50 ml (Durchmesser 30 mm, Höhe 110 mm) befinden sich in Probenmagazinen 6, die taktweise an den Ventilöffnungen vorbeibewegt werden. Der schrittweise Transport der Probenmagazinen 6 erfolgt über einen zweiseitigen Zahnriemen 8, der von einem Schrittmotor 9 bewegt wird. Die außen liegende Verzahnung des Zahnriemens dient zur Mitnahme der Magazine 6, die an der Unterseite ein entsprechendes Gegenprofil besitzen. Das Gegenprofil ist mit Einführschrägen versehen, so daß die Magazine von einer Führung auf den Zahnriemen 8 geschoben werden können. Die Zuführbewegung wird ebenfalls durch einen Zahnriemen übertragen, der nach dem Durchtakten der Magazine in die Ausgangsposition zurück fährt.To measure the dynamics of intracellular metabolite concentrations of E. coli after a glucose pulse, a controlled standard bioreactor 1 is operated continuously. After reaching a steady state with growth-limiting glucose concentrations in the bioreactor, the metabolism of the microorganisms 2 cultivated in the bioreactor is dynamically stimulated by the pulsed addition of a glucose concentrate. The rapid dynamic changes in intracellular metabolite concentrations as a result of this substrate pulse are to be measured. For this purpose, the rapid sampling is started one second before the substrate pulse is triggered by opening the sampling valve 3 on the bioreactor and the methanol valve 4 on the methanol / water template 5 . This causes a 30 ° C warm medium with microorganisms to flow into a sample vessel 7 and -40 ° C cold 60% methanol into the subsequent sample vessel. The sample vessels with a volume of 50 ml (diameter 30 mm, height 110 mm) are located in sample magazines 6 which are moved cyclically past the valve openings. The step-by-step transport of the sample magazines 6 takes place via a two-sided toothed belt 8 which is moved by a stepping motor 9 . The external toothing of the toothed belt is used to take along the magazines 6 , which have a corresponding mating profile on the underside. The mating profile is provided with lead-in bevels so that the magazines can be pushed onto the toothed belt 8 by a guide. The feed movement is also transmitted by a toothed belt, which returns to the starting position after the magazine has been cycled through.

Die Aufenthaltszeit der Probengefäße unterhalb der Ventilöffnungen beträgt 150 msec.; die Positionierzeit (= Verschieben der Magazine) beträgt 80 msec. Damit ergibt sich eine gesamte Probenahmezeit von 230 msec (mehr als 4 Proben/Sekunde). Die Vordrücke in der Methanolvorlage von 1.3 bar und im Bioreaktor von 1.2 bar sind so eingestellt, daß jeweils 15 ml -40°C kaltes Methanol/Wasser und 5 ml Medium mit Mikroorganismen in die Probengefäße abgefüllt werden. Durch die Vermischung der Mikroorganismen mit der eiskalten Methanollösung verlöscht der Stoffwechsel der Zellen augenblicklich (= quenchen).The dwell time of the sample vessels below the valve openings is 150 msec .; the positioning time (= moving the magazines) is 80 msec. This results in a total sampling time of 230 msec (more than 4 samples / second). The prepressures in the methanol receiver of 1.3 bar and 1.2 bar in the bioreactor are set so that 15 ml each of -40 ° C cold methanol / water and 5 ml medium with microorganisms in the sample vessels are filled. By mixing the microorganisms with With the ice-cold methanol solution, the metabolism of the cells is instantly extinguished (= quench).

Sobald ein Probenmagazin 10 befüllt ist, wird es pneumatisch vom Zahnriemen geschoben (in Fig. 1 schematisch durch den Pfeil mit Bezugszeichen 12 angedeutet). Ebenso erfolgt das Nachschieben von neuen Magazinen (in Fig. 1 entsprechend durch den Pfeil mit Bezugszeichen 11 angedeutet). Die Probengefäße werden manuell verschlossen und bei -60°C tiefgekühlt. Das im Probengefäß befindliche Methanol verhindert dabei die Bildung von Eiskristallen. Damit bleiben die Mikroorganismen intakt. Die Analyse von Zellinhaltsstoffen erfolgt nach Abzentrifugieren der Zellen bei -20°C und Aufschluß und Extraktion der Zellen z. B. mit Perchlorsäure oder Chloroform.As soon as a sample magazine 10 is filled, it is pushed pneumatically from the toothed belt ( indicated schematically in FIG. 1 by the arrow with reference number 12 ). New magazines are also pushed in ( correspondingly indicated in FIG. 1 by the arrow with reference numeral 11 ). The sample vessels are closed manually and frozen at -60 ° C. The methanol in the sample vessel prevents the formation of ice crystals. This keeps the microorganisms intact. The analysis of cell constituents is carried out after centrifugation of the cells at -20 ° C and disruption and extraction of the cells z. B. with perchloric acid or chloroform.

Die Probenahmevorrichtung ist auf einem Probenahmetisch installiert, der aus Elementen eines Profilbaukastens aufgebaut und mit einer VA-Platte bedeckt ist und der durch fest stellbare Lenkräder verfahren werden kann. Die Motoren, die Magnetventile für den Pneumatikzylinder und die Methanoldosierung sowie die Abfrage eines PE-Wandlers zur Kontrolle des anliegenden Luftdruckes werden von einem PC angesteuert. Der gesamte Ablauf der Probenahmen ist über ein Programm frei konfigurierbar. Die Elektroinstalla tion ist in einem Schaltkasten untergebracht, in dem sich elektrische Komponenten für die Antriebssteuerung der Motoren, Not-Aus-Hauptschalter usw. befinden.The sampling device is installed on a sampling table made up of elements a profile kit is built up and covered with a VA plate and is fixed by adjustable steering wheels can be moved. The motors, the solenoid valves for the Pneumatic cylinder and the methanol metering as well as the query of a PE converter for Control of the applied air pressure are controlled by a PC. The whole The sampling sequence can be freely configured using a program. The Elektroinstalla tion is housed in a control box that contains electrical components for the drive control of the motors, emergency stop main switch etc. are located.

Im folgenden sind die im Ausführungsbeispiel verwendeten technischen Spezifikationen kurz zusammengefaßt:
The technical specifications used in the exemplary embodiment are briefly summarized below:

Zudosierung Methanol:Dosing of methanol: ≧ 10 ml, 60%, -40°C≧ 10 ml, 60%, -40 ° C Fermenterproben:Fermenter samples: ≧ 5 ml E. coli-Kultur, Kultivierungsemperatur 30°C≧ 5 ml E. coli culture, cultivation temperature 30 ° C Methanolventil:Methanol valve: 2/2-Wege-Magnetventil Typ 256 von Bürckert2/2-way solenoid valve type 256 from Bürckert Probenahmeventil:Sampling valve: Standarddefault Magazine:Magazine: 20 PA-Magazine mit je 16 Probenflaschen, kältebeständig bis -40°C, kurzzeitig bis -60°C20 PA magazines with 16 sample bottles each, cold-resistant down to -40 ° C, briefly down to -60 ° C Probenahmeventil:Sampling valve: 50 ml Corningflaschen, D 28 mm50 ml Corning bottles, D 28 mm Abstand der Flaschen im Magazin:Distance between the bottles in the magazine: 35 mm35 mm Positioniergenauigkeit:Positioning Accuracy: ≦0,015 mm je Positionierung,≦ 0.015 mm per positioning, ≦0,3 mm kumulativ@≦ 0.3 mm cumulative @ Positionierzeit bzw. Zeit einer Probenahme:Positioning time or time of sampling: ≧230 ms≧ 230 ms Wartezeit unter den Abfüllöffnungen:Waiting time under the filling openings: in 1 msec. wählbarin 1 msec. selectable Verfahrwege:Travels: Anfangsschritt 40 mm, ansonsten 35 mmInitial step 40 mm, otherwise 35 mm Takten des Magazins:Clocking the magazine: Weg 63 mm, 16 TaktePath 63 mm, 16 cycles Abmessung des Tisches:Dimensions of the table: 1650 mm × 1600 mm1650 mm × 1600 mm Spannungsversorgung:Power supply: 220 V220 V Druckversorgung:Pressure supply: 6 bar6 bar

Claims

1. Method for the rapid sampling of biological cell samples, in which to Containers arranged one after the other for holding the samples initially with a cooled alcohol / water mixture and then filled with sample be, with a first sample container with a means of transport initially below the outlet of one containing the alcohol / water mixture The container is positioned and filled with the alcohol / water mixture to the extent that that the proportion of the alcohol / water mixture is at least about 50% by volume, based on the final volume, is the proportion of alcohol in the alcohol / water mixture is 30 to 80% by volume and the temperature of the alcohol / water gladly is chosen so that after adding the sample to the mixture The rate of turnover within the cells goes directly to zero, then the one filled with the cooled alcohol / water mixture Sample container below the outlet opening of one containing the cells Container is transported, positioned and filled with sample while at the same time the downstream sample container below the outlet opening of the container containing the alcohol / water mixture transported, positioned and is filled with the alcohol / water mixture and the further transport and the positioning of the sample containers also in the further process in cycles takes place by the respective downstream container in a first cycle to Fill with alcohol / water below the outlet opening of the alcohol / water mixture contained container and at the same time the upstream, which has already passed through the first cycle and is filled with alcohol / water mixture Container in a second cycle for the purpose of sampling below the The outlet opening of the container containing the cells is transported and is positioned.

2. The method according to claim 1, characterized, that the filling of the downstream sample container with alcohol / water at the same time as the upstream sample container is filled with the cell sample he follows.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized, that methanol is used as the alcohol in the alcohol / water mixture.

4. The method according to claim 3, characterized, that the proportion of methanol in the methanol / water mixture is 60% by volume.

5. The method according to one of the preceding claims, characterized, that the sample containers with at least two parts alcohol / water mixture and a part of the cell sample can be filled.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that after adding the cell sample to the alcohol / water mixture the temperature of the total mixture does not exceed -20 ° C.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the cell sample is sprayed into the cooled alcohol / water mixture.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized, that the cell sampling takes place continuously.