DE19701607A1

DE19701607A1 - Anitkörper, die an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE19701607A1
Application number: DE19701607A
Authority: DE
Inventors: Martin Dr Gerl
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1997-01-17
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 1998-07-23
Also published as: AU5985398A; CA2278477A1; JP2001509020A; ZA98367B; KR20000070256A; EP0954535A1; ID21895A; US20010007020A1; IL130808A0; PL334956A1; AR011074A1; CZ253899A3; TR199901648T2; HUP0001808A3; BR9714207A; HUP0001808A2; CN1244873A; WO1998031709A1

Description

Die Erfindung betrifft monoklonale und polyklonale Antikörper sowie deren Teile, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen und als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile binden bevorzugt an der γ1 III 4-Domäne des Laminins, insbesondere an wesentliche Nidogen-Bindungsstellen im hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c, und können die Assoziation von Laminin und Nidogen inhibieren.

Die Assoziation von Laminin (ein 800 kDa Glycoprotein) und Nidogen (ein 160 kDa Glycoprotein) wird als ein entscheidender biomolekularer Mechanismus bei der Synthese und Stabilisierung von Basalmembranen betrachtet (Mayer, U. & Timpl, R. (1994) in: Extracellular Matrix Assembly and Structure (Ed.: P. D. Yurchenco et al.) S. 389-416, Academic Press, Orlando, FL). Durch die Fähigkeit des Nidogens mit allen Hauptbestandteilen der Basalmembran wie z. B. γ1 enthaltenden Laminin-Isoformen (zur Nomenklatur siehe: Burgeson, R. E. et al. (1994) Matrix Biology 14: 209-211), Kollagen IV, Perlecan und Fibulin sowie deren jeweiligen Assoziationsstrukturen ternäre Komplexe auszubilden, übernimmt es die Funktion eines Bindegliedes, welches die voneinander unterschiedlichen Makrostrukturen miteinander verbindet, räumlich organisiert und stabilisiert (Fox, J. W. et al. (1991) EMBO J. 10: 3137-3146; Aumailley, M. et al. (1993) Kidney Int. 43: 7-12).

Einen deutlichen Hinweis auf die zentrale Funktion der Laminin/Nidogen-Interaktion bei der Synthese einer funktionalen Basalmembran konnten Experimente mit polyklonalen Anti-Laminin-Antikörpern liefern. Die beschriebenen Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 oder dem rekombinant erzeugten Lamininfragment γ1 III 3-5 gewonnen und über eine Affinitätschromatographie an Laminin P1 oder Laminin γ1 III 3-5-Matrices angereichert. Sie zeigten in Inhibitionstests eine komplette Hemmung der Laminin/Nidogen-Assoziation. Diese basiert aber auf einer sterischen Blockade des Nidogenzugangs zum Laminin durch die Antikörper, deren Bindungsregionen nur in der Nähe der nidogenbindenden Sequenzen des Laminins liegen (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). In embryonalen Organkulturen konnten die beschriebenen Antikörper sowohl die Genese von Nierentubuli, als auch die Ausbildung von Lungenbläschen inhibieren. Beides sind Ontogeneseprogramme die von einer ungehinderten Neusynthese einer Basalmembran abhängen (Ekblom, P. et al. (1994) Development 120: 2003-2014; Ekblom, P. (1993) in: Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes (Ed.: Rohrbach, D. H. & Timpl, R.) S. 359-383; Academic Press, San Diego, CA.).

Die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins konnte in ihrer Lokalisation, Sequenz und in ihrer räumlichen Struktur (Röntgenkristallstruktur und NMR-Struktur) eindeutig identifiziert und charakterisiert werden (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885; Baumgartner, R. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 658-668; Stetefeld, J. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257: 644-657). Sie befindet sich in einem "LE Modul" (laminin-type epidermal growth factor-like) des kurzen Arms der γ1-Kette des Laminins, in der Domäne γ1 III 4. "LE Module" sind Strukturmotive aus 50-60 Aminosäuren die ein komplexes, zum "epidermal growth factor" analoges Faltungsmuster mit 4 Disulfidbrücken aufweisen (Bairoch, A. (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310; Engel, J. (1989) FEBS Letters 251: 1-7).

Eine hochaffine Bindung des Nidogens zur komplementären Laminin-Domäne konnte für Laminin P1 aus dem EHS Tumor der Maus, Laminin-2 und Laminin-4 aus humaner Plazenta und Laminin aus Drosophila nachgewiesen werden. Ursache für diese speziesübergreifende Bindungsspezifität ist die außerordentlich hohe Aminosäuresequenzidentität, die in der Laminin γ1 III 4-Domäne bei den untersuchten Spezies vorliegt. Sie beträgt 97% zwischen Mensch und Maus und erstaunliche 61% zwischen Mensch und Drosophila, wenn das ganze Modul berücksichtigt wird. Beschränkt man den Vergleich auf den Bereich der Loops a bis c, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten, dann erhöhen sich die Werte auf 100% bzw. 75% (Pikkarinen, T. et al. (1987) J. Biol. Chem. 263: 6751-6758; Chi, H.-C. & Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1543-1550).

Neben der Abhängigkeit der Nidogen-Bindung von einer intakten dreidimensionalen Struktur, konnten eindeutige Sequenzbereiche identifiziert werden, die sich in den S-S stabilisierten Loops a und c der Laminin-Domäne γ1 III 4 befinden. Fünf essentielle Aminosäuren wurden identifiziert: Vier befinden sich innerhalb eines Abschnitts aus 7 Aminosäuren im Loop a und eine Tyrosinseitenkette im Loop c (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885; Pöschl, E. et al. (1996) EMBO J. 15: 5154-5159).

Synthetische Peptide, die aus den entsprechenden Bereichen der Laminin-Domäne γ1 III 4 abgeleitet werden können, sind in der Lage die Laminin/Nidogen-Bindung in speziellen Bindungsassays komplett zu inhibieren (US 5,493,008). Allerdings zeigen derartige synthetische Peptide in Inhibitionsassays eine Aktivität, die etwa 400- bzw. 10000-fach schwächer ist als die des intakten Laminin P1 oder Laminin γ1 III 3-5 (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13: 3741-3747; US 5,493,008). Die Laminin/Nidogen-Interaktion ist durch eine starke konformationelle Komponente beeinflußt (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die schwächere inhibitorische Wirkung der synthetischen Peptide ist erklärbar, da Peptide in wäßriger Lösung eine Myriade von unterschiedlichen Konformationen einnehmen können und deshalb nur ein gewisser Prozentsatz der Peptide in der biologisch aktiven Konformation anzutreffen ist.

Die Verwendung solcher Peptide als Medikament ist daher aufgrund ihrer konformationellen Flexibilität, aber auch wegen ihrer Instabilität gegenüber Proteasen sowie ihrer schlechten Bioverfügbarkeit und Pharmakodynamik erheblich limitiert (Milner-White, E. J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10: 70-74; Hruby, V. J. (1994) in: Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium; (Ed.: Hodges, R. S. & Smith, J. A.) S. 3-17; ESCOM: Leiden, Netherlands).

Antikörper, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden und die Assoziation zwischen Laminin und Nidogen bei geringer Konzentration kompetitiv zu inhibieren vermögen, sind aufgrund ihrer höheren Affinität und Avidität, ihrer hohen Stabilität sowie ihrer guten Pharmakokinetik besser als Therapeutikum zur Behandlung von Krankheiten geeignet. Weiterhin können sie als Diagnostikum oder als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen eingesetzt werden.

Die bisher erzeugten Anti-Laminin P1- oder Anti-Laminin γ1 III 3-5-Antikörper können zwar zum Teil die Nidogen/Laminin-Bindung inhibieren. Sie erkennen jedoch die Nidogen-Bindungsstellen der Laminin γ1-Kette nicht direkt, sondern die Inhibition der Nidogen/Laminin-Bindung erfolgt über sterische Wechselwirkung (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die Nidogen-Bindungsdomäne der Laminin γ1-Kette ist speziesübergreifend außerordentlich stark konserviert.

Darüber hinaus ist Laminin ein extrazelluläres Protein, das sowohl als integrierter Bestandteil von Basalmembranen, als auch in Form einer zirkulierenden Serumkomponente (EP 0 696 597 A2) ständig mit dem Immunsystem in Kontakt steht. Aufgrund der Fähigkeit des Immunsystems "selbst" von "nicht-selbst" zu unterscheiden muß gefolgert werden, daß jede immunisierte Spezies das hoch konservierte Immunisierungsantigen als eigenen Körperbestandteil erkennt und daher keine Antikörper gegen diesen entwickelt. Die Erzeugung eines spezifischen Antikörpertiters konnte deshalb nicht erwartet werden. Bestätigung fand diese allgemein anerkannte Lehrmeinung durch die Tatsache, daß durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 und Laminin γ1 III 3-5 bisher keine Antikörper gegen die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins erzeugt werden konnten (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12: 1879-1885). Die oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die an nicht genau definierte Epitope außerhalb der Nidogen-Bin dungsdomäne des Laminins binden, sind jedoch als Therapeutikum, als Diagnostikum bzw. als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen nur sehr eingeschränkt bzw. überhaupt nicht geeignet: Die sterische Inhibition ist abhängig von der räumlichen Ausdehnung des Hemmstoffs, so daß der aus pharmakologischen Gründen bevorzugte Einsatz von Teilen dieser Antikörper als Therapeutikum kaum möglich ist. Des weiteren schränken mögliche Kreuzreaktionen mit nicht-nachzuweisenden Analyten die Verwendung dieser Antiköper in diagnostischen Testen ein.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, also die Nidogen-Bin dungsdomäne der Laminin-γ1-Kette direkt erkennen, und die als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen sowie als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen geeignet sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, durch die im folgenden beschriebenen Antikörper sowie die Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon sind dadurch gekennzeichnet, daß sie an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins, bevorzugt die Laminin γ1 III 4-Domäne, besonders bevorzugt an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c der Laminin γ1 III 4-Domäne binden. Insbesondere werden von der Erfindung Antikörper oder Teile davon miteingeschlossen, die mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1 binden.

Tabelle 1: Aminosäuresequenz der zu Immunisierung verwendeten Peptide

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch die Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin γ1 III 4 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1, als Immunisierungsantigen. Neben polyklonalen Antikörpern sind auch monoklonale Antikörper (MAK) erhältlich, wobei bei letzteren zunächst MAK-produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden. Die Antikörper sind auch in gereinigter Form erhältlich, indem die erfindungsgemäßen Antikörper aus Antikörper-enthaltendem Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zell kulturüberstand, Aszites oder Zellen, beispielsweise per Affinitätschromatographie gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können die Laminin/Nidogen-Inter aktion inhibieren und umfassen als Überbegriff auch die an anderer Stelle näher beschriebenen entsprechenden chimären, humanisierten, bi- oder oligospezifischen Antikörper sowie Antikörperanaloga.

Die Erfindung beinhaltet auch tierische, pflanzliche und prokaryontische Zellen sowie Zellinien, die die erfindungsgemäßen Antikörper und Antiköperteile produzieren.

Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Antikörper, wobei, immunkompetente Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, immunisiert werden mit wesentliche Nidogen-Bindungsstellen des Laminins enthaltenen Peptiden, bevorzugt Laminin P1, Laminin γ1 III 3-5 sowie Laminin γ1 III 4, besonders bevorzugt Peptide, die nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins enthalten, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1. Unter dem Begriff Peptide sind Oligopeptide, Polypeptide sowie Proteine und Proteinfragmente zu verstehen. Die als Immunisierungsantigen verwendeten Peptide werden bevorzugt gekoppelt an Träger wie beispielsweise Proteine, z. B. Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin, oder Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin, eingesetzt. Optional beinhaltet das Verfahren auch die Erzeugung von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile aus Antikörper-enthaltenden Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zell kulturüberstand, Aszites oder Zellen beispielsweise mit Hilfe der Affinitätschromatographie zu reinigen, wobei bevorzugt eine Laminin P1-Affinitätsmatrix verwendet wird.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können vielfältig verwendet werden, z. B. als Arzneimittel, als Diagnostikum, als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen, z. B. als Modellsubstanz zur Evaluierung der räumlichen Struktur der zur Nidogen-Bindungsstelle des Laminins komplementären Kontaktzone und deren potentieller Bindungsvalenzen, sowie zur Untersuchung der Biosynthese von Basalmembranen und des Einflusses von Basalmembranen bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie z. B. der Organentwicklung Angiogenese oder Embryogenese. Die Erfindung schließt auch Arzneimittel und Diagnostika mit ein, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthalten.

Ferner umfaßt ist die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern oder Antikörperteilen

- zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind, insbesondere von Fibrosen, vor allem die alkoholische Leberfibrose sowie die Lungenfibrose, sowie alle Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basalmembran begleitet sind - vor allem in Niere, Auge und Gefäßsystem -, sowie die Arteriosklerose und alle Krankheiten, bei denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt, z. B. Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie und Erkrankungen mit einer starken entzündlichen Komponente wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis;
- zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von γ1-enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Liquor, sowie in Geweben. Unter den Begriff Diagnostikum fallen z. B. die verschiedenen Ausführungsformen heterogener und homogener Immunoassays, Testsysteme in der Immunhistochemie sowie auch Reagenzien für in vivo Nachweisverfahren wie z. B. der Immunszintigraphie. Die die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthaltenden Zubereitungen können auch alleine oder zusammen mit weiteren Hilfsreagenzien, wie z. B. Puffer, Waschlösungen, Meßsignal-auslösenden Lösungen, und/oder anderen Hilfsmitteln, wie z. B. Küvetten, in Form von Diagnostika-Kits zusammengefaßt werden.

Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben und anhand diverser Beispiele im Detail erläutert:
Überraschenderweise konnte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden, die kein Faltungsmuster auszubilden vermögen wie es in LE-Modulen vorliegt, Antikörper gegen die hochkonservierte Aminosäuresequenz der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins erzeugt werden. Hierzu wurden die Peptide gemäß Tabelle 1 mit Hilfe von Carbodiimid an Ovalbumin gekoppelt und diese Konjugate zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörper-Titers gegen Laminin P1 und Laminin γ1 III 3-5 wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays analysiert.

Die polyklonalen Antikörper gewünschter Spezifität wurden dann per Affinitätschromatographie über eine Matrix, an die Laminin P1 aus humaner Plazenta gebunden war, und anschließender Siebgelchromatographie angereichert.

Die Methoden zur Reinigung und Charakterisierung von Laminin aus humaner Plazenta sowie dessen Verwendung zur Immunisierung von Mäusen und zur Gewinnung von Anti-Laminin P1-Antikörper synthetisierenden Hybridomen sind in EP 0 696 597 A2 beschrieben.

Die nach Laminin P1-Affinitätschromatographie des Antiserums angereicherten Antikörper zeigen eine Bindungsspezifität gegenüber Laminin P1 aus der Humanplazenta, Laminin P1 aus der Maus (EHS Tumor) und Laminin aus der Ratte (Dottersack). Die Antikörper erkennen nicht nur die spezifische Sequenz sondern auch die biologisch aktive Konformation der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins. Sie sind in der Lage, die Laminin/Nidogen-Bindung komplett zu inhibieren.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind aber auch erhältlich durch die Immunisierung anderer immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin γ1 III 4 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt die Peptide gemäß Tabelle 1. Erfindungsgemäße polyklonale Antikörper können aus dem Antiserum der immunisierten Tiere gereinigt werden.

Um entsprechende monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden nach allgemein bekannten Verfahren (siehe z. B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) die Immunzellen immunisierter Tiere, wie z. B. Mäuse, mit Myelomzellen zum Erzeugen von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen verschmolzen und anschließend geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die gewünschten MAK-produzierenden Klone wird mit Hilfe spezifischer Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die Bindungsspezifität der in den Kulturüberstand abgegebenen Antikörper z. B. an das Immunisierungsantigen an den Träger des Immunisierungsantigens, an natives wie rekombinantes Laminin bzw. an dessen Fragmente bevorzugt mittels Enzym- oder Radioimmunoassays sowie Western Blots überprüft. Ein weiteres mögliches Selektionskriterium ist die die Fähigkeit der Antikörper, die Nidogen/Laminin-Bin dung zu verhindern. Diese kann z. B. mittels der in den Beispielen näher beschriebenen Inhibitionsassays bewertet werden. Hybridome die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins bindende MAK herstellen, werden kloniert.

Sie stehen sodann für die MAK-Produktion auf Dauer zur Verfügung. Je nach gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft nur Teile der Antikörper, wie z. B. F(ab)₂, Fab' oder Fab-Fragmente, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren (siehe z. B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) erzeugt werden.

Die Antigenbindungsstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten variablen Domänen, die durch die entsprechenden V-Gene kodiert sind. Mit den bekannten gentechnischen Methoden (siehe z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd. edition; McCafferty, J. et al. (1990) Nature 348: 552-554) kann auch die entsprechende Nukleinsäuresequenz eines an die Nidogen-Bin dungsdomäne des Laminins bindenden Antikörpers ermittelt werden sowie dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für die Analysen werden Hybridoma-Zellen bzw. die Antikörper-produzierenden Immunzellen immunisierter Säugetiere eingesetzt.

In Kenntnis der Nuklein- und Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher gentechnischer und molekularbiologischer Methoden (siehe auch Johnson, K. S. & Chiswell, D. J. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571) dann humanisierte oder chimäre, bi- oder oligospezifische Antikörper sowie Antikörperanaloga, wie z. B. von der "complementarity determining region" abgeleiteten Polypeptide ("minimal recognition units"), "single chain"-Fragmente oder funktionelle Fusionsprodukte - wie insbesondere rekombinant hergestellte Antikörper-Enzym oder -Komplement-Konstrukte - hergestellt werden, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden. Diese vom erfindungsgemäßen Antikörper bzw. Antikörpergen abgeleiteten Moleküle werden von dem in dieser Schrift verwendeten Überbegriff "Antikörper oder ein Teil desselben" mitumfaßt. Mit diesen Molekülen kann z. B. eine Verringerung der Immunogenität und/oder eine verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichung als Arzneimittel erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als Diagnostikum bzw. als Hilfsmittel für die Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen. Die Antikörper oder Teile derselben sind herstellbar in pflanzlichen (z. B. Hefe), tierischen und prokaryontischen Zellen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sowie Teile derselben können modifiziert werden, z. B. durch die Markierung mit radioaktiven Isotopen oder paramagnetischen Verbindungen zum Einsatz für die in vivo-Diagnostik oder durch die Anbindung von pharmakologisch wirksamen Substanzen zur Erzeugung eines noch wirksameren Arzneimittels.

Die im folgenden aufgeführten Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte der Erfindung.

BEISPIELE

SDS-Gelelektrophorese, Western Blotting, BCA Proteinbestimmung wurden nach Standardprotokollen oder nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt. Wenn nicht ausdrücklich angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma (München) oder Riedel de Haen (Seelze) bezogen.

Beispiel 1: Synthese von Peptiden

148 mg (0,1 mmol) eines FMOC-Amidanker-PAM Harzes wurden zur Festphasensynthese - ABI 433 Peptidsynthesizer - des Peptides eingesetzt. Nach Beendigung der Synthese beobachtete man eine Gewichtszunahme des Harzes auf 513 mg. Das Harz wurde mit einer Lösung aus 10 ml Trifluoressigsäure und 365 µl Triethylsilan für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Abfiltration des Harzes wurde die Lösung im Vakuum einrotiert und mit 50 ml 10% Essigsäure (AcOH) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhielt 145 mg (54% Ausbeute) an Rohpeptid. Das Rohpeptid wurde anschließend in 3 ml 80% AcOH gelöst und diese Lösung zu einer schnell gerührten Lösung (0,006 mmol Jod, 0,006 mmol Natriumacetat in 55 ml 80% AcOH) zugetropft. Nach 5 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 N Ascorbinsäurelösung beendet. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 2 ml eingeengt und auf eine Sephadex® G25 Säule, die mit 0,1 M AcOH entwickelt wurde, aufgetragen. Das isolierte Peptid wurde durch Reversed Phase HPLC-Chromatographie hochgereinigt.
Ausbeute: 36 mg von DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH₂ (13,5% der Theorie).

Die Struktur wurde durch Massenspektroskopie (Molmasse: 2673 Da) und Aminosäureanalyse bestätigt.
Analog wurde das Peptid DNIDPNAVGNL-NH₂ hergestellt.
Ausbeute: 268 mg (67% der Theorie); Molmasse: 1140 Da.

Beispiel 2: Kopplung der Peptide an Ovalbumin

30 mg Ovalbumin (Sigma A-2512) wurden in 1 ml Na-Phosphat Puffer, pH 7,4 gelöst und mit 200 µl einer wäßrigen Lösung aus 7 mg N-Hydroxysulfosuccinimid Na-Salz (Fluka 56485) sowie 300 µl einer wäßrigen Lösung aus 100 mg 1-Ethyl-3-(3-Dia minaminopropyl)-carbodiimid, HCI (Sigma E-6383) versetzt. Nach 5 Minuten wurde die Peptidlösung (30 mg des entsprechenden Peptids in 1 ml 10 mM Na-Phosphat Puffer, pH 7,4) zugegeben. Die Kopplungsreaktion verlief 16 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Reaktionszeit wurde die Lösung zentrifugiert, um eventuell auftretende Trübungen zu entfernen. Unreagierte Chemikalien und Salze wurden anschließend durch Chromatographie über eine NAP-25 Säule (Pharmacia) entfernt. Das Ovalbumin/Peptid Konjugat wurde dadurch in PBS +0,04% Tween-20 überführt. Die Ausbeute betrug 50-55 mg Konjugat.

Beispiel 3: Immunisierung von Kaninchen

Gemischtrassige Kaninchen mit einem Körpergewicht von ca. 3 kg wurden mit den Ovalbumin/Peptid Konjugaten immunisiert. Hierfür wurden 1 mg der entsprechenden Konjugate in 0,5 ml Phosphat-gepufferte Saline (PBS) gelöst und dann mit demselben Volumen komplettes Freund'sches Adjuvans gemischt und sorgfältig emulgiert. 1 ml der so erhaltenen Emulsion wurde einem Kaninchen intradermal injiziert; dabei wurde jeweils ein Fünftel des Volumens in fünf unterschiedliche Stellen, nahe der regionalen Lymphknoten, appliziert. Booster-Injektionen (das Antigen wurde hierfür mit unkompletten Freund'schem Adjuvans emulgiert) wurden mit halbkonzentrierter Antigenemulsion nach 21 Tagen und 53 Tagen durchgeführt.

Beispiel 4: Titerentwicklung in vier immunisierten Kaninchen

Die spezifische Antikörper-Titerentwicklung wurde bei vier Tieren mit einem Enzymimmunoassay unter Verwendung von Laminin P1 bzw. Laminin γ1 III 3-5 beschichteten Kunststoffgefäßen näher untersucht. Die entsprechenden Tierseren sind mit den Bezeichnungen K2, K3, K4 und K905 spezifiziert. Die Seren K3 und K4 wurden durch Immunisierung mit Konjugat-1 erhalten, die Seren K2 und K905 durch Immunisierung mit Konjugat-2. In allen Kaninchen wurde sehr schnell eine Immunreaktion angeregt, die dann nach 21 Tagen (1. Booster) konstant blieb, bzw. langsam aber kontinuierlich abklang. Eine erneute Stimulierung der Immunantwort durch eine zweite Boosterinjektion wurde nicht beobachtet. Die gebildeten Antiköper reagierten sowohl mit Laminin P1 als auch mit der Laminin-Domäne γ1 III 3-5. Die Bindung zum Laminin P1 war allerdings etwas weniger ausgeprägt als die zum Laminin γ1 III 3-5 und schien im Prozeß der Immunreaktion stärkeren Schwankungen unterworfen zu sein. Dies kann ein Hinweis sein auf mehrere Antikörperpopulationen im polyklonalen Serum, die mit verschiedenen Affinitäten die Nidogen-bindenden Motive, bzw. deren Konformationen im Laminin P1 und im Laminin γ1 III 3-5 binden.

Beispiel 5: Affinitätsreinigung der Antikörper

Zur weiteren Charakterisierung wurden die spezifischen Antikörper von den übrigen Immunglobulinen im Tierserum, weiteren Serumbestandteilen und den gegen Ovalbumin gerichteten Antikörpern abgetrennt. Hierfür wurde eine Affinitätschromatographie an einer Laminin P1-Affinitätsmatrix durchgeführt. Als Träger (Gelmatrix) wurde Fractogel® EMD Azlacton 650(S) (Merck, Darmstadt) verwendet. 0,3 g des Materials wurden vor der Kopplung 15 Minuten in 6 ml PBS, 1 M Na₂SO₃, pH 7,4 inkubiert, anschließend wurde der flüssige Überstand abgegossen. Während der Inkubation quoll das Material auf ein Volumen von 1 ml und die Matrix konnte direkt zur kovalenten Kopplung des gewünschten Liganden eingesetzt werden.

3,4 mg humanes Laminin P1 wurden in 2 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0 gelöst und mit 1 ml aktiviertem (s. o.) Trägermaterial bei 4°C über Nacht (< 16 h) inkubiert. Anschließend wurde das Gelmaterial mit 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,0 gewaschen. Die verbliebenen aktiven Gruppen des Trägermaterials wurden durch eine 24-stündige Inkubation in 5 ml 0,2 M Glyzin, pH 8,0 bei 4°C blockiert. Schließlich wurde die Gelmatrix mit drei Waschzyklen, bestehend aus alternierenden Inkubationen in PBS, 1 M Na₂SO₃, pH 7,4, 0,1 M Na-Azetat, pH 4,0 und 0,2 M Glyzin, pH 8,0 für die Affinitätsbindung vorbereitet. Die Matrix wurde in eine HR 5/5 Säule von Pharmacia gefüllt und mit PBS/0,04% Tween-20 equilibriert.

Zur Reinigung Laminin P1-bindender Antikörper aus den Tierseren wurde das jeweilige Serum 1: 2 mit PBS/0,04% Tween-20 verdünnt und bei einer Flußrate von 2 ml/min über die Säule geleitet. Anschließend wurde mit Puffer nachgewaschen bis im UV-Signal (220 nm) des Durchflußmonitors die Grundlinie wieder erreicht wurde. Die Elution der gebundenen Antikörper erfolgte schließlich durch den Wechsel des Laufpuffers zu 0,1 M Glycin/HCl, pH 2,7.

Die Analyse der Säulendurchläufe und Säuleneluate erfolgte mit Hilfe eines Enzymimmunoassays unter Verwendung von immobilisiertem Laminin γ1 III 3-5.

Aus den vier Tierseren konnten durch die beschriebene Affinitätsreinigung Antikörper gereinigt werden. Die Ausbeute betrug durchschnittlich 0,3 mg pro 50 ml Serum (im Falle des Serums K2 betrug die Ausbeute lediglich 0,1 mg). Ein Großteil der Antikörper in allen Seren (<80%) band allerdings nicht an Laminin P1, vermutlich aufgrund einer zu langsamen Bindungskinetik oder aufgrund einer ausschließlichen Affinität zur Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Peptids.

Die Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen führt folglich zu einer selektiven Anreicherung der schnell und stabil bindenden Antikörpervarianten (der gesuchten Antikörper) aus dem Serum.

Beispiel 6: Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörper

Mittels Western Blot wurde nachgewiesen, daß die affinitätsgereinigten Antikörper ihre Bindungsspezifität zum Laminin P1 bewahrt haben und daß die verschiedenen Präparationen stärker mit dem nicht reduzierten Laminin P1 reagierten als mit den durch Reduktion der Disulfide separierbaren linearen Laminin P1-Fragmenten (Gerl, M. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 202: 167-174). Dies ist ein Indiz für eine konformationsabhängige Komponente in der Bindungsspezifität der Antikörper.

Weiterhin zeigte sich, daß sich die vier Antikörperpräparationen in ihren Bindungspräferenzen voneinander unterschieden. Die beiden durch Immunisierung mit Konjugat-1 gewonnenen Antikörperpräparationen K3 und K4 erkannten identische Laminin P1-Banden nach SDS (Sodiumdodecylsulfat) Gelelektrophorese der nicht reduzierten Probe. Die beiden Antikörperpräparationen K2 und K905 (Anti-Konjugat-2) zeigten ebenfalls ein zueinander identisches Reaktionsmuster, allerdings wurden weniger Laminin P1-Banden erkannt als bei den beiden Anti-Konjugat-1-Antikörperpräparationen.

Beim immunchemischen Nachweis der durch Reduktion und SDS-Gelelektrophorese separierten Laminin P1-Banden fällt auf daß alle vier Antikörperpräparationen unterschiedliche Bindungspräferenzen zu Laminin γ1 III 4 enthaltenden Fragmenten aufwiesen.

Beispiel 7: Inhibitionsassays - Hemmung der Laminin/Nidogen-Bindung mit affinitätsgereinigten Antikörpern

Die inhibitorische Aktivität der affinitätsgereinigten Antikörper kann mit einem "coated tube assay" identifiziert werden, in dem die Bindung von radioaktiv markiertem Nidogen an Laminin P1 (aus humaner Plazenta) beschichtete Röhrchen in Anwesenheit der Antikörper gemessen wird.

Radioaktive Markierung von Nidogen mit ¹²⁵Jod

Rekombinant produziertes humanes Nidogen (35 µg, Beschreibung des Klons, Kultur- und Reinigungsbedingungen, siehe Mayer, U. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 227: 681-686) wurde in 250 µl PBS gelöst und mit 0,405 mCi (= 15 MBq) Na-Jodid (¹²⁵I)Lösung (= 1,55 µl, Nordion Europe), 10 µl 0,5 M Na-Phosphat, pH 7,4 sowie 40 µg Chloramin T (N-Chlor-t-Toluolsulfonsäureamid Natriumsalz, Merck) in 100 µl 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 versetzt. Die Reaktion erfolgte 60 Sekunden bei Raumtemperatur und wurde durch Zugabe einer Lösung von 40 µg Na-Meta-Bisulfit (Riedel-de-Haën) in 100 µl 0,05 M Na-Phosphat, pH 7,4 gestoppt. Dies erfolgte in maximal 30 Sekunden, dann wurde der Ansatz mit 900 µl 1% BSA (Sigma) in PBS versetzt. Die Abtrennung freier Radioaktivität und überschüssiger Salze erfolgte durch Siebgelchromatographie mit Hilfe einer PD 10 Säule (Pharmacia). Das in PBS eluierte jodierte Nidogen wurde gepoolt und so mit 1% BSA/0,05 M Na-Phosphat/0,01% Na-Azid, pH 7,4 verdünnt, daß eine Konzentration von 50 ng/ml resultierte.

Beschichtung von Reaktionsröhrchen

Reaktionsröhrchen (Greiner, 75×12, No. 115 061) werden mit einer Laminin P1 Lösung, 4 µg/ml in Carbonat Puffer (0,159 g Na₂CO₃; 0,293 g NaHCO₃; 0,02 g NaN₃ in 1 Liter destilliertem Wasser), 20 µg/ml BSA (Rinderserumalbumin, Serva) pH 9,2 über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen werden anschließend durch 2-stündige Inkubation mit 0,5 ml 0,5% BSA in PBS/0,04% Tween-20 blockiert.

Inhibitionsassay mit "lamininmimetischen" Strukturen (sequentielle Inhibition)

In einem Reaktionsgefäß wurden 200 µl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) und 200 µl des Inhibitors (z. B. Peptide, die aus der Domäne γ1 III 4 des Laminins abgeleitet werden können) oder Standards (Laminin γ1 III 3-5) bei Raumtemperatur geschüttelt. Sowohl der Inhibitor als auch der Standard waren in PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden 150 µl aus diesem Ansatz in die gecoateten Röhrchen überführt und weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem Nidogen in den Lösungen mit Inhibitor wurde mit der des Nidogens ohne Inhibitorzusatz in Beziehung gesetzt.

Inhibitionsassay mit "nidogenmimetischen" Strukturen (sequentielle Inhibition)

In den mit Laminin P1 beschichteten Reaktionsgefäßen wurden 150 µl des Inhibitors (z. B. ein an die Domäne γ1 III 4 des Laminins bindender Antikörper oder ein Peptid, welches aus der Sequenz des Nidogens abgeleitet werden kann) oder Standards (rekombinantes Nidogen) für 3 Stunden geschüttelt. Sowohl Inhibitor als auch Standard waren in PBS/0,04% Tween-20 gelöst. Nach dem Absaugen der Probe wurde für 2 Stunden 150 µl jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) zugegeben, um den gebundenen Inhibitor zu verdrängen. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0,04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem radioaktiven Nidogen wurde mit der Inhibitor- bzw. Standardkonzentration in Beziehung gesetzt.

Inhibitionsassay (simultane Inhibition)

Bei dieser Assayvariante erfolgte keine Vorinkubation. Es wurden vielmehr 75 P1 jodiertes Nidogen (10 ng) mit 75 µl Inhibitor oder Standard direkt in die gecoateten Röhrchen pipettiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, ansonsten wurde analog zu den sequentiellen Assayvarianten verfahren.

Ergebnis

Für den Standard Laminin γ1 III 3-5 wurde aus zehn unabhängig durchgeführten Assays eine IC_50% von 0,22 nM mit einer Standardabweichung von ±15% ermittelt. Die IC_50% ist als die Stoffkonzentration definiert, die für eine 50%ige Hemmung der Nidogen-Bindung an Laminin P1 benötigt wird. Mit dem in US 5,493,008 beschriebenen (Equilibrium-)Inhibitionsassay wurde vergleichsweise ein IC_50% von 0,05 nM mit einer Standardabweichung von ±52% erhalten.

Der Tabelle 2 sind die IC_50%-Werte der Antikörperpräparationen K3, K905, K1.2, K2.2 und K3.2 sowie verschiedener freier Peptide zu entnehmen. Die Antikörperpräparationen K1.2, K2.2 und K3.2 stammen aus einer zweiten Immunisierungskampagne von Kaninchen mit neuem Konjugat-2 und vergleichbarer Aufreinigung. Die Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens.

Tabelle 2: Inhibition der Laminin/Nidogen-Bindung durch die erfindungsgemäßen Antikörper

In US 5,493,008 werden für inhibitorische Peptide, die aus der Nidogen-Bindungsdomäne abgeleitet werden können, IC_50%-Werte zwischen 22 nM und 1000 nM angegeben. Diese Werte konnten mit dem gewählten Assay - auf grund der drastisch verkürzten Inkubationszeiten - nicht erreicht werden; Das Peptid DNIDPNAVGNL erreichte im hier beschriebenen Assay z. B. nur einen IC_50% = 60000 nM.

Beispiel 8: Charakterisierung der Bindungskinetiken mit dem BIAcore® System

Mit dem BIAcore® System der Firma Pharmacia Biosensor können biospezifische Interaktionen on-line verfolgt werden. Das Prinzip der Messung beruht auf einem optischen Phänomen (surface plasmon resonance), das durch die auf einem Goldfilm gebundene Masse beeinflußt wird. Vereinfacht ausgedrückt handelt es sich um eine miniaturisierte Affinitätschromatographie auf einer Gold-Sensoroberfläche. Die Menge des spezifisch gebundenen Liganden kann in Form eines Resonanzsignals bildlich dargestellt werden (Chaiken, I. et al. (1992) Anal. Biochem. 201: 197-201; Karlsson, R. et al. (1992) in: Structure of Antigens; (Ed.: van Regenmortel). S. 127-148; CRC Press, Boca Raton, Fl.)
Laminin P1 wurde gemäß den Instruktionen des User-Manuals bei einer Konzentration von 200 µg/ml in 10 mnM Na-Acetat, pH 4,0 auf dem Sensorchip immobilisiert. Es resultiert eine Matrix mit 4000 RU gebundenem Laminin P1. Zur Regeneration der Affinitätsmatrix kann ein Doppelimpuls à 4 µl 100 mM HCl durchgeführt werden.

Bei einer Flußrate von 2 µl/min in HBS Puffer (10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005% BIAsurfactant P20; pH = 7,4) band Nidogen (20 µg/ml) mit einer parabolischen Sättigungskinetik an Laminin P1, die affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K905 und K3 in einer linearen Abhängigkeit zum Antigen. Die Tatsache, daß nach 1400 Sekunden noch kein Übergang zur Gleichgewichtseinstellung zu beobachten war, kann Ausdruck dafür sein, daß die spezifische Peptidsequenz des Laminin P1, welche für die Nidogen-Bindung verantwortlich ist, für die Antikörper gut zugänglich war. Die Antikörper banden an diese Sequenz unabhängig davon, ob sie in der biologisch aktiven oder in einer davon unterschiedlichen Konformation vorlag. Beleg dafür ist die Beobachtung, daß das Nidogen bereits nach einer Bindung von 600 RU einen deutlichen Übergang in die Sättigungsphase aufwies. Es lagen also offensichtlich nicht alle immobilisierten Laminin P1 Moleküle in einer für das Nidogen erkennbaren Struktur vor, da die theoretische Maximalsättigung der Schicht von 2500 RU nicht erreicht wurde. Diese wäre aber von den beiden Antikörpern nach langer Kontaktzeit erreicht worden.

Auffallend ist, daß die Probe K905 zehnfach höher konzentriert eingesetzt werden (320 µg/ml) mußte, um eine mit K3 (33 µg/ml) vergleichbare Bindungsrate zu erreichen. Die Bindung von K905 zum Laminin P1 war hingegen stabiler als die von K3, denn die Dissoziationsrate von K905 (erkennbar ab dem Zeitpunkt des Wechsels zum HBS Puffer: 1500 Sekunden) war erheblich langsamer als die der Präparation K3.

Diese Befunde erklären die in den Inhibitionsassays festgestellten Unterschiede zwischen K3 und K905:

- Die Antikörperpräparation K3 inhibiert die Laminin-Nidogen-Bindung besser als K905, weil sie durch eine schnellere Assoziationskinetik charakterisiert ist.
- Die Antikörperpräparation K3 inhibiert auch dann, wenn sie simultan mit dem Nidogen in den mit Laminin P1 beschichteten Röhrchen inkubiert wird, weil sie bei einer zum Nidogen vergleichbaren Konzentration eine gute Assoziationskinetik hat.
- Die Antikörperpräparation K905 kann nur in der Assayvariante "sequentielle Inhibition" inhibieren, weil sie durch eine langsame Dissoziationsrate charakterisiert ist und deshalb von dem später zugesetzten Nidogen nicht mehr so gut vom Antigen verdrängt werden kann. Bei einer gleichzeitigen Konkurrenz um die Bindungsstelle ist K905 aufgrund der sehr langsamen Assoziationskinetik dem Nidogen unterlegen.

Beispiel 9: Nachweis der Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K3 und K905 mittels Western Blot

In Westen Blot-Analysen wurde die Interaktion der Antikörperpräparationen K3 und K905 mit dem Konjugat-2 und dem Ovalbumin untersucht. Hierzu wurden die Antigene mit Hilfe von 4-12%NuPAGE™ Gelen (NOVEX™, San Diego, CA) unter Zuhilfenahme eines MOPS-Puffers gemäß Instruktionsanleitung von NOVEX™ aufgetrennt und anschließend unter Verwendung von NuPAGE™ Transferpuffer (NOVEX™) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit 1 µg/ml Polyvinylalkohol (1 min) wurden die Antigene mit den Testantikörpern inkubiert. Der Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgte dann mit Hilfe von Anti-Kaninchen IgG-Antikörpern, an die das Enzym alkalische Phosphatase kovalent gebunden war.

Es zeigte sich, daß die affinitätsgereinigten Antikörper ausschließlich an das Peptid binden, denn eine Interaktion mit dem Trägerprotein Ovalbumin ist nicht nachweisbar. Eine Reaktion mit den blaugefärbten Markern des "See Blue" Standards (NOVEX™) konnte ebenfalls nicht beobachtet werden.

Weiterhin wurde nachgewiesen, daß sowohl K3 als auch K905 mit Laminin und Lamininderivaten unterschiedlicher Spezies (Laminin aus der humanen Plazenta sowie aus dem Dottersack der Ratte (Calbiochem), Laminin P1 aus der humanen Plazenta sowie dem EHS Tumor der Maus, rekombinant hergestelltes Maus-Laminin γ1 III 3-5) reagieren. Dies belegt die Bindung der Antikörper an die konservierte Sequenz innerhalb der Nidogen-Bindungsdomäne. Beide Antikörperpräparationen zeigten keine Kreuzreaktivität zum humanen Nidogen und zum humanen Kollagen Typ IV. Dies ist die Voraussetzung für die eindeutige Verwendung der beschriebenen Antikörper als Nidogen-Antagonisten.

Beispiel 10: Herstellung monoklonaler Antikörper

Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper werden geeignete Wirbeltiere, bevorzugt Mäuse oder Ratten, nach Standardverfahren z. B. mit Laminin, Laminin P1, Laminin γ1 III 3-5, Laminin γ1 III 4 oder mit den im Beispiel 2 aufgeführten Konjugaten immunisiert. Im Falle einer spezifischen Immunreaktion des Antiserums werden gemäß Standardverfahren MAK-produzierende Hybridome gewonnen.

Das Screening nach den gewünschten Antikörpern bzw. den entsprechenden Hybridoma-Klonen ermöglichen u. a. Bindungsassays (z. B. Dot Blot oder Western Blot mit Laminin γ1 III 3-5 und/oder Laminin γ1 III 4) sowie vor allem auch die im Beispiel 7 beschriebenen Inhibitionsassays. Die selektierten Klone stellen eine Quelle für die Synthese großer Mengen der erfindungsgemäßen Antikörper dar.

Zur Reinigung der gewünschten Antikörper können übliche Verfahren eingesetzt werden, wie z. B. die Bindung an Protein G oder A. Bevorzugt erfolgt jedoch eine Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen. Dieser Reinigungsschritt erlaubt, wie im Falle der weiter oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die Auswahl und selektive Anreicherung der monoklonalen Antikörper mit den besten Bindungskonstanten.

Claims

1. Antikörper oder Teil desselben, dadurch gekennzeichnet, daß er an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins bindet.

2. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er an die Laminin γ1 III 4-Domäne bindet.

3. Antikörper oder Teil desselben nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c der Laminin γ1 III 4-Domäne bindet.

4. Antikörper oder Teil desselben nach mindestens einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1 bindet.

5. Antikörper nach einem der Ansprüche 1-4 erhältlich durch die Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, mit Laminin γ1 III 4 und/oder mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, als Immunisierungs antigen.

6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen verwendet werden.

7. Antikörper nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.

8. Antikörper nach mindestens einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß er aus Antikörper-enthaltendem Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen, gereinigt wird, z. B. per Affinitätschromatographie.

9. Antikörper oder Teil desselben nach mindestens einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß er die Laminin/Nidogen-Interaktion inhibiert.

10. Antikörper oder Teil desselben nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich hierbei um einen chimären, humanisierten, bi- oder oligospezifischen Antikörper bzw. um ein Antikörperanalogon handelt.

11. Zelle oder Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß diese Antikörper oder Antikörperteile gemäß einem der Ansprüche 1-10 produziert.

12. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gemäß einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß immunkompetente Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen des Laminins enthalten, als Immunisierungsantigen immunisiert werden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Laminin P1 und/oder Laminin γ1 III 3-5 und/oder Laminin γ1 III 4 als Immunisierungsantigen benutzt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Peptide, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der γ1 III 4-Domäne des Laminins, als Immunisierungs antigen benutzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen verwendet werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-15, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunisierungsantigen an Träger wie z. B. Proteine oder Polymere gekoppelt ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-16, dadurch gekennzeichnet, daß monoklonale Antikörper produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12-17, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper aus Antikörner-enthaltendem Material, wie z. B. Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturüberstand, Aszites oder Zellen, gereinigt wird, z. B. per Affinitätschromatographie.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine Laminin P1-Affinitätsmatrix eingesetzt wird.

20. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur Verwendung als Arzneimittel.

21. Arzneimittel enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10.

22. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind.

23. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach Anspruch 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Fibrosen, allen Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basalmembran begleitet sind, der Arteriosklerose sowie alle Krankheiten, bei denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt.

24. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach Anspruch 22 oder 23 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der alkoholischen Leberfibrose, der Lungenfibrose, von Krebserkrankungen, der diabetischen Retinopathie sowie Erkrankungen mit einer starken entzündlichen Komponente wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis.

25. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur Verwendung als Diagnostikum.

26. Diagnostikum enthaltend einen oder mehrere Antikörper oder Antikörperteile gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-10.

27. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach mindestens einem der Ansprüche 1-10 zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von γ1-enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Liquor, sowie in Geweben.

28. Antikörper oder Teil desselben gemäß einem der Ansprüche 1-10 zur Verwendung als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen.

29. Verwendung von einem oder mehrerer Antikörper oder Antikörperteile nach mindestens einem der Ansprüche 1-10 in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen.