DE19642751A1

DE19642751A1 - Saccharid-Bibliothek

Info

Publication number: DE19642751A1
Application number: DE19642751A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dipl Chem Prof Wiesler; Walter Dipl Chem Mier; Christian Dipl Chem Kliem; Stefan Dipl Chem Menzler
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1996-10-16
Publication date: 1998-04-23
Also published as: WO1998016536A1; EP0934327A1; US20030119051A1; JP2001502672A

Description

Die Erfindung betrifft eine Saccharid-Bibliothek, Verfahren zur Herstellung einer solchen sowie ihre Verwendung.

Seit einiger Zeit wird daran gedacht, Wirkstoffe, z. B. Therapeutika, auf Sac charid-Basis bereitzustellen. Dies trifft insbesondere zu, wenn die Wirkstoffe Agonisten bzw. Antagonisten von Zell-Rezeptoren sein sollen. Bisher ist es allerdings äußerst schwierig, Wirkstoffe auf Saccharid-Basis bereitzustellen, d. h. solche zu finden, die exakt mit Zielproteinen, z. B. Rezeptoren, reagieren.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem Wirkstoffe auf Saccharid-Basis gefunden werden können.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Saccharid-Bibliothek mit verschiedenen Saccharid-enthaltenden Molekülen, wobei die Saccharid-enthaltenden Moleküle jeweils ein Kernmolekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen und minde stens zwei Sacchariden umfassen.

Der vorstehende Ausdruck "Saccharid-Bibliothek" bedeutet eine Vielzahl, z. B. mindestens 6, vorzugsweise mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 100, von verschiedenen Saccharid enthaltenden Molekülen. Diese Moleküle können ungebunden oder an einen Träger gebunden vorliegen. Als Träger sind alle Matrices geeignet, die in der Festphasenchemie verwendet werden, wie Festphasen auf der Basis von Poly styrol, Polyethylenglykol, Kieselgur, CPC (controlled pore ceramics), Cellulose und Glas.

Der vorstehende Ausdruck "Kernmolekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen" umfaßt aliphatische Verbindungen, die mindestens zwei, insbesondere 3, 4, 5 oder 6, funktionelle Gruppen z. B. Hydroxygruppen, Aminogruppen, Carbonsäuregruppen, Metall-organische Gruppen und/oder Halogenidgruppen, aufweisen. Die funktionellen Gruppen können gleich oder verschieden vonein ander sein. Beispiele von Kernmolekülen sind cyclische Aliphate. Vertreter dieser sind C₆-Cykloalkane, wie Trihydroxycykloalkane, z. B. 1,3,5-Trihydroxycykloalka ne, insbesondere 1,3,5-Trihydroxycyclohexan, Inosite, insbesondere myo-Inosit, und C₅-Cykloalkane, wie Tri- und Tetrahydroxycyklopentane, sowie Derivate davon. Ferner sind Kernmoleküle heterocyclische Hydroxyverbindungen. Deswei teren sind Kernmoleküle aliphatische Amine, wie Triamine, insbesondere Methy lentriamine, und Pentaerythrite. Besonders bevorzugte Kernmoleküle sind in Fig. 1 dargestellt. Keine Kernmoleküle im Sinn der Erfindung sind Steroide, Cholsäu remethylester und Saccharide.

Der vorstehende Ausdruck "Saccharid" umfaßt Saccharide jeglicher Art in allen stereoisomeren und enantiomeren Formen, insbesondere Monosaccharide, z. B. Pentosen und Hexosen, wie α- und β-D-Glukose und α- und β-D-Mannose, sowie Di-, Tri- und Oligosaccharide. Als Saccharide gelten hier auch Inosite, ganz besonders optisch aktive Derivate von myo-Inosit und Quebrachitol, z. B. aus Galactinolen, sowohl aus pflanzlichen Quellen, wie Zuckerrüben, als auch aus Milchprodukten, oder durch enzymatische Enantiomerentrennung gewonnene Derivate. Ferner sind Saccharide Glykokonjugate. Diese können Konjugate von Sacchariden mit Peptiden, Heterocyklen und anderen Kohlehydraten sein. Ein Beispiel von Glykokonjugaten ist Z1-Z10, ein Gemisch von 10 Glykokonjugaten. Bei den Verbindungen Z1-Z10 handelt es sich um in der Natur vorkommende Glycopeptide, Glycoproteine und Lipopolysaccharide. Alle diese Verbindungen sind wegen ihrer Rolle in verschiedenen immunologischen Prozessen von großem biologischen Interesse. Ein Beispiel einer solchen ist

wobei R Aminosäuren, z. B. Asparaginsäure, Lysin, Glycin, Alanin, etc. oder Fettsäuren bedeutet. Als Saccharide werden auch Derivate vorstehender Sac charide, wie mit Schutzgruppen, z. B. Benzyl, geschützte Saccharide und/oder mit funktionellen Gruppen, wie Aminogruppen, Phosphatgruppen oder Haloge nidgruppen, modifizierte Saccharide, verstanden. Vorstehende Saccharide können natürlich vorkommen oder synthetisch hergestellt werden. Vorzugsweise weist ein Saccharid-enthaltendes Molekül 3, 4, 5 oder 6 Saccharide auf. Die Saccharide können gleich oder verschieden voneinander sein. Auch können im Saccharid-enthaltenden Molekül mehrere der Saccharide gleich sein und eines oder mehrere der restlichen Saccharide sich davon unterscheiden. Beispiels weise kann ein Saccharid ein Di-, Tri-, oder Oligosaccharid sein und die restli chen sind z. B. ein Monosaccharid. Dies wird als Saccharid-Hintergrundbibliothek bezeichnet (vgl. Fig. 3). Die Bindung der Saccharide an das Kernmolekül kann an dessen funktionelle Gruppen erfolgen. Vorzugsweise geschieht dies unter Aus bildung einer O-glykosidischen Bindung.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt zwischen dem Kernmolekül und einem bis maximal allen der Saccharide ein Spacer vor. Beispiele eines solchen sind aliphatische Verbindungen, wie Alkane. Auch kann der Spacer eine ungesät tigte aliphatische Verbindung sein. Der Spacer weist vorzugsweise 3 bis 10 C-Atome auf. Ferner kann der Spacer an die funktionellen Gruppen des Kernmole küls und/oder der Saccharide gebunden sein. Liegen mehrere Spacer vor, dann können diese gleich oder verschieden voneinander sein.

Vorzugsweise weist ein in der erfindungsgemäßen Bibliothek vorliegendes Saccharid-enthaltendes Molekül eine organische Verbindung auf. Diese kann an das Kernmolekül und/oder an eines oder mehrere der Saccharide gebunden sein. Beispiele von organischen Verbindungen sind Alkane mit einer funktionellen Gruppe, z. B. einem Halogen, wie Brom, einer Hydroxy-, Azido- und/oder Amino- Gruppe, oder Alkene, insbesondere mit endständiger Doppelbindung. Die Alkene können auch vorstehende funktionelle Gruppen aufweisen. Vorzugsweise hat vorstehende organische Verbindung 3 bis 10 C-Atome. Ferner können von der organischen Verbindung eine oder mehrere vorliegen. Bei mehreren können diese gleich oder verschieden voneinander sein. Mit den organischen Verbindungen ist es z. B. möglich, das Saccharid-enthaltende Molekül an einen Träger zu binden und/oder Farbstoffe, magnetische Partikel und/oder andere Komponenten an das Saccharid-enthaltende Molekül zu binden.

Die Komponenten der Saccharid-enthaltenden Moleküle sind als Edukte darge stellt. In den Saccharid-enthaltenden Molekülen liegen sie jedoch in derivati sierter Form vor.

Erfindungsgemäß wird auch ein Verfahren zur Herstellung vorstehender Sac charid-Bibliotheken bereitgestellt. In diesem Verfahren werden die einzelnen Komponenten, d. h. Kernmoleküle, Saccharide, ggf. Linker, ggf. organische Verbindung und ggf. Träger kovalent miteinander verbunden.

Beispielsweise wird ein an einen Träger gebundenes Kernmolekül bereitgestellt, bei dem die funktionellen Gruppen Schutzgruppen aufweisen. Die Schutzgruppen können orthogonale Schutzgruppen sein. Diese Schutzgruppen zeichnen sich dadurch aus, daß sie einzeln (selektiv), d. h. nacheinander, von einem Molekül bei Anwesenheit anderer Schutzgruppen abgespalten werden können, ohne daß diese anderen Schutzgruppen durch die Abspaltungsbedingungen beeinflußt werden. Beispiele solcher Schutzgruppen sind Acyl-Gruppen, wie Benzoyl, Acetyl und Chloracetyl, Benzyl-Gruppen und Silyl-Gruppen. Der Fachmann weiß, wie sie selektiv abgespalten werden können. Von diesen Schutzgruppen wird eine abgespalten. Anschließend wird mit einem Saccharid oder einem Gemisch von Sacchariden umgesetzt, so daß die Saccharide an die funktionelle Gruppe gebunden werden. Dann wird die nächste Schutzgruppe selektiv abgespalten, und die Umsetzung wird wiederholt. Dabei kann ein neues Saccharid, ein neues Gemisch von Sacchariden oder das in vorstehendem Schritt verwendete Sac charid oder Gemisch von Sacchariden verwendet werden. Diese Reaktionen können wiederholt werden, bis alle gewünschten funktionellen Gruppen des Kernmoleküls ein Saccharid aufweisen. Schließlich können die erhaltenen Sac charid-enthaltenden Moleküle vom Träger und, wenn es gewünscht wird, die ggf. an den Sacchariden vorliegenden Schutzgruppen abgespalten werden. Auf diese Weise werden erfindungsgemäße Saccharid-Bibliotheken erhalten. Werden als Saccharide in den einzelnen Schritten nur eine Art von Sacchariden einge setzt, dann wird auch nur eine Art von Saccharid-enthaltenden Molekülen erhal ten. Diese können mit davon verschiedenen Saccharid-enthaltenden Molekülen zu einer Saccharid-Bibliothek gemischt werden. Werden in vorstehender Reaktion Gemische von Sacchariden eingesetzt, so erhält man eine Kombination von verschiedenen Saccharid-enthaltenden Molekülen (= Sacharid-Bibliothek). Dies kann am Beispiel eines festphasengekoppelten Inositols wie folgt dargestellt werden:

Festphase, an welches Inositol gebunden ist: R₁-R₅: orthogonale Schutzgruppen
A, B, C: 3 verschiedene Saccharide, die an die Festphase gekoppelt werden können

Die Zahl der unterschiedlichen Bibliotheksbausteine nach 5 Kopplungen (wie oben dargestellt) ergibt sich dann nach der allgemein gültigen Formel:

Z = M^F

Z = Zahl der unterschiedlichen Bibliotheksbausteine; M = Zahl der unterschiedlichen Saccharidspezies, die als Gemisch zur Kopplung an den Zentralbaustein eingesetzt werden (hier: 2 unterschiedliche Monosaccharide); F = Zahl der Funktionalitäten des Zentralbausteins (OH-, NH₂-Gruppen . . ., hier: 5 OH-Gruppen).

Z = 3⁵ = 243.

Wie vorstehend beschrieben können an das Kernmolekül z. B. Monosaccharide gebunden werden. Diese können gleich oder verschieden voneinander sein. Eines dieser Monosaccharide weist eine zur Bindung mit einem anderen Saccharid fähige Gruppe auf, z. B. eine Acetyl-Gruppe. An diese Stelle wird dann ein von den bereits gebundenen Sacchariden verschiedenes Saccharid gebunden. Schließ lich können die erhaltenen Saccharid-enthaltenden Moleküle vom Träger und, denn es gewünscht wird, die ggf. an den Sacchariden vorliegenden Schutz gruppen abgespalten werden. Auf diese Weise kann eine Saccharid-Hintergrund bibliothek erhalten werden.

Die Glycosidierung eines Kernmoleküls, wie es in den Fig. 2-4 beschrieben ist, kann chemisch und enzymatisch erfolgen. Bei der letzteren wird ausgenutzt, daß Glycosidasen Monosaccharide von aktivierten Donorsacchariden (Nitrophe nylglycoside, Glycale, Glycosylfluoride, Disaccharide etc.) auf geeignete Akzep toren übertragen können (Transglycosidierung). Die dabei erhaltenen Glycoside sind anomerenrein. Durch ein Kreislaufverfahren, in dem das Kernmolekül kon tinuierlich mit einer Lösung von Glycosidase und Donorzucker behandelt wird, kann annähernd quantitativer Umsatz erreicht werden. Glycosidasen mit breiter Donorspezifität sind in Form der kombinatorischen Batch-Synthese einsetzbar. Ein Kernmolekül wird z. B. mit einer Glycosidase und einem Gemisch verschiede ner Donorzucker umgesetzt. Man erhält dabei eine Saccharid-Bibliothek, deren Zusammensetzung u. a. von der Spezifität des Enzyms und der Reaktivität der Donorzucker bestimmt wird. Die zur enzymatischen Bindung von Sacchariden an Kernmoleküle geeignete Verfahren und hierzu notwendige Materialien sind dem Fachmann bekannt.

Erfindungsgemäße Saccharid-Bibliotheken zeichnen sich dadurch aus, daß sie eine Vielzahl unterschiedlicher Saccharid-enthaltender Moleküle bereitstellen. Ferner sind erfindungsgemäße Saccharid-Bibliotheken, insbesondere deren Kernmoleküle, gegen Abbau durch Glukosidase stabil.

Daher eignen sich erfindungsgemäße Saccharid-Bibliotheken bestens für ein Screening-Verfahren, mit dem aus der Saccharid-Bibliothek spezifische Wirk stoffe herausgefischt werden können. Dabei kann wie folgt vorgegangen wer den: Bei der Entwicklung eines Wirkstoffs auf Saccharid-Basis, welcher z. B. spezifisch mit einem bekannten Rezeptor reagiert, wird man z. B. die Affinität schromatographie anwenden. Dazu wird der bekannte Rezeptor immobilisiert, z. B. an einer Festphase. Durch Auftragen der Sacharid-Bibliothek auf diese Festphase werden nur jene Saccharid-enthaltenden Moleküle zurückgehalten, die an den Rezeptor binden. Alle anderen Saccharid-enthaltenden Moleküle werden abgetrennt. Anschließend werden alle bindenden Saccharid-enthaltenden Mole küle eluiert, z. B. durch Erhöhung der Salzkonzentration des Lösungsmittels, und dann analysiert. Günstig kann es sein, die Analyse schon bei der Bibliothekssyn these zu berücksichtigen. Dies kann z. B. dadurch erfolgen, daß nicht, wie vorstehend beschrieben, eine vollständige Bibliothek eingesetzt wird, sondern durch geschickte Aufteilung des Syntheseschemas eine Gruppierung unter schiedlicher Teilbibliotheken erhalten wird, die dann eingesetzt wird. Teilbiblio theken können z. B. auf folgende Weise erhalten werden: Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird nach der selektiven Abspaltung einer Schutz gruppe (R₁) die Kopplung mit den Komponenten A, B und C getrennt durch geführt. Es ergeben sich somit drei Töpfe, die sich jeweils durch das erste Sacharid unterscheiden. Jeder dieser drei Töpfe wird nun weiter, jedoch getrennt bearbeitet. Am Ende liegen dann drei verschiedene Teilbibliotheken vor, die getrennt für das Screening eingesetzt werden können. Je nachdem, in welchem Topf der aktivste Wirkstoff ist, kann die entsprechende Teilbibliothek erneut aber weiter differenziert dargestellt werden. Auf diese Weise kann der Strukturbeweis für den aktivsten Wirkstoff geführt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt bevorzugte Kernmoleküle,

Fig. 2 zeigt die Herstellung einer Saccharid-Bibliothek mit einem Triamin als Kernmolekül,

Fig. 3 zeigt die Herstellung einer Saccharid-Hintergrundbibliothek und

Fig. 4 zeigt die Herstellung einer Saccharid-Bibliothek mit einem Inosit als Kernmolekül.

Claims

1. Saccharid-Bibliothek mit verschiedenen Saccharid-enthaltenden Molekü len, wobei die Moleküle jeweils ein Kernmolekül mit mindestens zwei funktionellen Gruppen und mindestens zwei Sacchariden umfassen.

2. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kernmolekül ein cyclischer Aliphat ist.

3. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der cyclische Aliphat ein C₆- oder C₅-Cykloalkan ist.

4. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das C₆-Cykloalkan ein Trihydroxycyklohexan, ein Inosit oder ein Derivat von diesen ist.

5. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekenn zeichnet, daß die funktionellen Gruppen Hydroxygruppen, Aminogruppen, Carbonsäuregruppen, Metall-organische Gruppen und/oder Halogenid gruppen sind.

6. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Saccharide ein Mono-, Di-, Tri- und/oder Oligosaccharid, ein Inosit und/oder ein Derivat von diesen sind.

7. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Monosaccharid Glukose oder Mannose ist.

8. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekenn zeichnet, daß das Saccharid-aufweisende Molekül 3, 4, 5 oder 6 Sac charide aufweist.

9. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Saccharide gleich oder verschieden voneinander sind.

10. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekenn zeichnet, daß zwischen dem Kernmolekül und einem bis maximal allen Sacchariden ein Spacer vorliegt.

11. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer eine aliphatische Verbindung ist.

12. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer 3 bis 10 C-Atome aufweist,

13. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekenn zeichnet, daß das Saccharid-enthaltende Molekül eine organische Ver bindung aufweist.

14. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Verbindung ein Alkan mit einer funktionellen Gruppe und/oder ein Alken ist.

15. Saccharid-Bibliothek nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppe ein Halogen, eine Hydroxy-, eine Azido- und/oder eine Amino-Gruppe ist.

16. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 13-15, dadurch gekenn zeichnet, daß die organische Verbindung 3 bis 10 C-Atome aufweist.

17. Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 13-16, dadurch gekenn zeichnet, daß mehrere organische Verbindungen vorliegen.

18. Verfahren zur Herstellung einer Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß das Kernmolekül, die Sac charide, ggf. der Linker und ggf. die organische Verbindung kovalent miteinander verbunden werden.

19. Verwendung einer Saccharid-Bibliothek nach einem der Ansprüche 1-18 zum Ermitteln von Wirkstoffen gegen Zielproteine.

20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Zielproteine Rezeptoren sind.