DE19633475C2

DE19633475C2 - Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten und deren Verwendung

Info

Publication number: DE19633475C2
Application number: DE1996133475
Authority: DE
Inventors: Thorsten Sembritzki; Dietmar Runkel; Klaus Metzner; Marion Sela
Original assignee: Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH
Current assignee: Dow Olefinverbund GmbH
Priority date: 1996-08-20
Filing date: 1996-08-20
Publication date: 2002-03-14
Anticipated expiration: 2016-08-21
Also published as: WO1998007879A1; DE19633475A1

Description

Das Verfahren findet Anwendung zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) in Form von Polyhydroxybuttersäure, Polyhydroxyvaleriansäure oder Copolymeren dieser Polyhydroxyalkansäuren, welche in der Zellmasse von Mikroorganismen oder pflanzlicher Biomasse, die diese Polyhydroxyalkansäuren als innerzellulären Reser vestoff akkumulieren, enthalten sind.

Zur Gewinnung von PHA aus der Zellmasse eines Mikroorganismus sind Lösungs- und Fällverfahren bekannt, bei denen die PHA in gelöster Form aus der Zellstruktur entfernt und von der Restbiomasse abgetrennt wird. So werden nach US 3044942 1.2-Dichlorethan im Gemisch mit Ethanol, nach EP 024810 Dichlormethan und nach US 3275610 Chloroform als Lösungsmittel für das PHA angewendet. Aus der von der Zellmasse abgetrennten PHA-haltigen Lösung wird durch geeignete Fällmittel das PHA in einer festen Form gewonnen. Nach DD 229 428 erfolgt das Herauslösen von Polyhydroxybuttersäure aus der Biomasse mit Essigsäureanhydrid bei erhöhten Temperaturen, hier bei 100 bis 140°C. Aus der Polymerlösung fällt die Polyhy droxybuttersäure durch Herabsetzen der Temperatur in pulverförmigem Zustand aus. Nachteilig wirkt sich dabei der Umgang mit großen Lösungsmittelmengen und der damit verbundene Recycling- bzw. Entsorgungsaufwand aus. Dies trifft insbe sondere auf chlorierte Kohlenwasserstoffe als Lösungsmittel zu. Darüber hinaus sind diese Verfahren häufig mit starkem Molekulargewichtsabbau und Bildung eines kristallinen PHA-Anteils verbunden.

In der Patentanmeldung WO 95/08620 ist ein Gewinnungsverfahren für ein in einer Zellmasse enthaltenes festes Produkt dargestellt, bei welchem die Zellmasse in eine gelöste Form überführt und zusammen mit der wäßrigen Fermentationsbrühe so ab getrennt wird, daß das unlösliche Produkt, beispielsweise in der Zellmasse enthal tenes Indigo, in fester Form vorliegt. Das Lösen der Zellsubstanzen erfolgt durch Zugabe von Alkalilauge bei einer Behandlungstemperatur zwischen 40 und 100°C. Das Gewinnungsverfahren für Zellinhaltsstoffe kann aber auch durch Lysieren der Zellsubstanzen mittels einer enzymatischen Behandlung erfolgen, insbesondere durch Einsatz von Lysozym, Proteasen, DNAsen, RNAsen oder einer Kombination dieser.

Zur Gewinnung eines Plaststoffes aus einer, einen solchen Stoff akkumulierenden, Mikroorganismenzelle, wird in der Patentanmeldung WO 94/24302 ein Verfahren dargestellt, welches mit Hilfe eines oxidierenden Mediums in Gegenwart eines Komplexbildners die Zellhüllen der Mikroorganismen auflöst. Beispielsweise wird zur Gewinnung von Polyhydroxybuttersäure ein Wasserstoffperoxid bei einer Be handlungstemperatur zwischen 60 und 180°C als oxidierendes Mittel eingesetzt. Als Vorstufe zur oxidativen Behandlung ist eine physikalische Vorbereitung des Zellma terials möglich, insbesondere durch eine Temperaturbehandlung im Bereich zwi schen 100 und 200°C.

Ein weiterer Effekt von Peroxiden, beispielsweise Wasserstoffperoxid, kommt in der Patentanmeldung WO 94/10289 für einen Prozeß zur Gewinnung von Produkten aus einer wäßrigen Zusammensetzung zur Zersetzung von Nucleinsäuren zur An wendung, wenn die Menge an Nucleinsäure ausreicht, die Viskosität derartig zu er höhen, daß nachfolgende Prozeßschritte beeinträchtigt werden. Die Konzentration der in Wasser gelösten Nucleinsäuren wird mit < 0,1 g/l angegeben, beispielsweise 0,5-20 g/l.

Hinsichtlich der genannten Aufgabenstellung ergeben sich bei diesen bekannten Verfahren unterschiedliche Nachteile. Problematisch bei den Extraktionsverfahren ist der Umgang mit großen Lösungsmittelmengen. Übliche Einsatzmengen liegen, bezogen auf die Biomasse, im Bereich von 8 : 1 bis 20 : 1. Diese Lösungsmittel müs sen ordnungsgemäß entsorgt oder aufwendig aufgearbeitet werden, was erhebliche Kosten und zusätzlichen apparativen Aufwand verursacht. Lösungsmittelrückstände im Produkt, insbesondere bei Verwendung schlecht umweltverträglicher Substan zen, müssen in zusätzlichen Reinigungsschritten abgetrennt werden. Speziell bei Anwendungen im Lebensmittelbereich und bei medizinischen Applikationen sind die Anforderungen an die Produktreinheit sehr hoch.

Ein weiterer Nachteil extraktiver Verfahren ist die Bildung eines kristallinen Anteils in der Polyhydroxyalkanoatstruktur. Die in vollständig amorpher Form im Mikroorga nismus vorliegenden Polymere erfahren dabei eine Veränderung einiger physikalischer Eigenschaften. Diese können negativen Einfluß auf die Filmbildung und die Vernetzbarkeit der Moleküle beispielsweise bei Dispersionsanwendungen haben. Die übrigen Verfahren wirken sehr spezifisch, d. h. sie bewirken eine Denaturierung, Lyse oder Abtrennung einiger weniger Zellkomponenten und sind in der Regel für die Herstellung eines reinen Produktes in einem Behandlungsschritt nicht ausrei chend geeignet, so daß die sinnvolle Kombination verschiedener Aufarbeitungs schritte nötig ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Polyhydroxyalkanoat, insbesondere Polyhydroxybuttersäure, Polyhydroxyvaleriansäure oder ein Copolymerisat dieser mit einer Partikelgröße unter 1,5 µm aus einer wäßrigen Zellsuspension eines diese Polymere akkumulierenden Mikroorganismus zu gewinnen und diese zu verwenden. Dabei ist es erforderlich, daß die in den Zellen der Mikroorganismen in amorphem Zustand eingelagerten Granulen des Polymers in diesem Zustand möglichst unver ändert erhalten bleiben und ein Anteil an kristalliner Struktur des Polymers ausge schlossen bzw. vernachlässigbar gering gehalten wird.

Die Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen dargestellte Erfindung gelöst. Das vorliegende Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß, ohne Verwendung von PHA-Lösern, durch Kombination mechanischer, chemischer und enzymatischer Be handlungen der bakteriellen Biomassesuspension mit dazwischengeschalteter Ab trennung der herausgelösten Zellbestandteile eine Dispersion mit hohem Anteil an Polyhydroxyalkanoaten entsteht. Der erzielte PHA-Anteil richtet sich dabei nach dem PHA-Gehalt der Biomasse sowie der Anzahl der eingesetzten Aufarbeitungsschritte. In dem mehrstufigen Prozeß erfolgt zunächst die Zerstörung der Zellwände durch die Einwirkung von mechanischen Kräften auf die sich in der wäßrigen Phase be findlichen Mikroorganismenzellen. Solche mechanischen Kräfte können durch die Erzeugung von Stoß-, Reibungs-, Scher- oder Druckkräften in bekannten Vorrich tungen hervorgerufen werden. Dabei ist es auch möglich, solche Kräfte in ihrer rei nen Form, wie auch in überlagerter oder alternierender Form auf das Zellmaterial einwirken zu lassen.

Die bakterielle Biomasse wird im ersten Schritt einem mechanischen Zellaufschluß, beispielsweise in einer Rühwerkskugelmühle oder einem Hochdruckhomogenisator unterzogen. Der Aufschluß dient zur Zerstörung der festen Zellhülle und Freisetzung wasserlöslicher bzw. mit Wasser ausspülbarer Zellkomponenten. Weiterhin wird eine vergrößerte Oberfläche für den Angriff biologischer oder chemischer Substan zen geschaffen. Die Abtrennung zwischen den Behandlungsschritten erfolgt durch Separation, Zentrifugation oder über Dekanter. Dabei werden gelöste Substanzen, feine Zellbruchstücke und Verunreinigungen im Klarlauf abgetrennt, was jeweils zu einer Aufkonzentrierung der Polyhydroxyalkanoat-Granulen führt.

Im folgenden Schritt schließt sich eine alkalische Behandlung, beispielsweise durch Natronlauge, in einem pH-Bereich von 8-12 an. Diese Behandlung ist begleitet durch ein Aufheizen der Suspension auf eine Temperatur über 70°C und führt zur Hydro lyse bestimmter Zellkomponenten.

Nach Neutralisation kann eine enzymatische Reinigung vorzugsweise proteolyti schen Charakters zur Lyse freigesetzter Zellbestandteile zum Einsatz kommen. Im Gegensatz zu enzymatischen Aufschlußverfahren wird hierbei ein geringerer Rest gehalt an Biomaterie und damit ein reineres Produkt, hohe Lagerstabilität wie auch die Möglichkeit der Herstellung leicht resuspendierbarer Dispersionspulver, die die stabilste Lagerform darstellen, erreicht. Bewährt haben sich beispielsweise Gemi sche zellwandlysierender Enzyme in Kombination mit reinen Proteasen. Nach Abtrennung der lysierten Zellbestandteile erfolgt eine Wasserstoffperoxidblei che bei einer Temperatur zwischen 70°C bis 95°C mit abschließender Wäsche. Dabei kommen Mischungsverhältnisse von einem Teil Polyhydroxyalkanoatgranulen mit Zellrestbestandteilen zu 5 bis 100 Teilen H₂O₂ in Konzentrationen von 1 bis 33% zum Einsatz. Durch diese Behandlung erfolgt die Denaturierung von Restproteinen, das Erreichen eines optisch reinweißen Produktes sowie eine Konservierung, die die Lagerstabilität und die Anfälligkeit gegenüber Fäulnis verbessert. Je nach Mikroorganismus und gewünschter Produktreinheit können Behandlungs stufen entfallen, dies gilt hauptsächlich für die aufwendige und teure Enzymbehand lung, die nur in Ausnahmefällen nötig ist. Für die Aufarbeitung von Polyhydroxybut tersäure hat sich die vorliegende Reihenfolge der Behandlungsschritte als optimale Behandlungsweise erwiesen. Vorwäschen mit Laugen im Sinne eines alkalischen Aufschlusses bzw. mechanische Zellzerstörung in alkalischem Medium führten zu keiner Verbesserung des Aufarbeitungsergebnisses. Werden die Aufarbeitungs schritte in anderer Reihenfolge verwendet, kann es in Abhängigkeit vom eingesetz ten Mikroorganismus zu erheblichen Verschlechterungen des Ergebnisses kommen. Eine Reduzierung der Trennschritte zwischen den Behandlungen ist zur Gewinnung eines sehr reinen Produktes selten sinnvoll.

Solche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Zellen von Mikroorganismen gewonnene Polymerpartikel eignen sich besonders zur Herstellung von Polymerdis persionen. Dies kann direkt oder durch Resuspendierung der nach dem beschriebe nen Gewinnungsverfahren in getrockneter Form vorliegenden PHA-Partikel in einem flüssigen Medium, vorzugsweisen Wasser, erfolgen. Dabei ist ein Einsatz von Dis pergierhilfsmitteln, Filmbildnern oder Antischaummitteln möglich. Der Anteil von fe ster Phase zur flüssigen Phase ist abhängig vom vorgesehenen Anwendungsfall der entsprechenden Dispersion.

Diese Dispersionen eignen sich zur Herstellung von Überzügen oder Beschichtun gen von Oberflächen. Insbesondere können dies Oberflächen eines Zellulosemate rials, wie Pappe oder Papier sein, da damit neben den Sperreigenschaften eine vollständige biologische Abbaubarkeit dieser beschichteten Materialien gewährlei stet wird. Außer durch Aufbringen auf Oberflächen kann dieser Effekt ebenfalls durch Einbringen der Dispersion in die Papierpulpe erfolgen.

Gleichfalls kann eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Disper sion als Hilfsmittel für die Verarbeitung von Polymeren, insbesondere bei der Verar beitung von PVC, eingesetzt werden. Dabei wirkt sich der Gehalt an Stickstoff im Polyhydroxyalkanoat stabilisierend auf das zu bearbeitende Polymer aus. Speziell wegen der ausgesprochen guten Human- oder Veterinärverträglichkeit der Polyhydroxyalkansäuren eignen sich daraus hergestellte Dispersionen als Träger material zur Einbringung von medizinischen Kontrastmitteln und Wirkstoffen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an folgenden Beispielen näher erläutert:

Durch einen Fermentationsprozeß im batch-Verfahren werden Mikroorganismen durch eine entsprechende Wachstumsphase mit anschließend initiierter Akkumula tion zur Einlagerung von Polyhydroxybuttersäure in der Zelle kultiviert. Die erziel bare Polymerkonzentration hängt sehr stark von der Art des Mikroorganismus und den Fermentationsbedingungen ab. Für technisch relevante Prozesse wird von ei nem Polymeranteil größer 50% der Zelltrockenmasse ausgegangen.

1. Beispiel

Durch Kultivierung des Mikroorganismus Methylobacterium rhodesianum wurde nach Beendigung des Fermentationsprozesses ein PHB-Gehalt von 52% erzielt. Die Ausgangsbiomassekonzentration bezogen auf die Trockensubstanz betrug 50 g/l.
1. Schritt: Zellaufschluß in einem Hochdruckhomogenisator (850 bar, 2 Passagen) und Abtrennung von Zellbruchstücken über Tellerseparator (5000 g)
2. Schritt: Natronlaugebehandlung 2 h bei 85°C und pH 11
3. Schritt: Wasserstoffperoxidbleiche mit H₂O₂ (33%) im Verhältnis 1 : 10, 2 h bei 85°C
4. Schritt: Waschen und Eindicken über Tellerseparator

Dispersion:
mittl. Partikeldurchmesser: 1,34 µm
Feststoffanteil: 38 g/l
PHB-Gehalt des Feststoffes: 78%
Stickstoffgehalt: 0,7%

Der angestrebte Zielkornbereich wird deutlich erreicht. Die Angabe des Stickstoffge haltes im Produkt spiegelt den Restbiomassegehalt wieder und dient als Maß für die Produktreinheit.

2. Beispiel

gemäß Beispiel 1, aber:
1. Schritt: mechanischer Zellaufschluß in einer Rühwerkskugelmühle (2 Passagen) und Abtrennung von Zellbruchstücken über Tellerseparator (5000 g)
2. Schritt: Natronlaugebehandlung 3 h bei 85°C und pH 9, Waschen über Tellerseparator
3. Schritt: Wasserstoffperoxidbleiche mit H₂

O₂

(33%) im Verhältnis 1 : 10, 4 h bei 75°C
4. Schritt: Waschen und Eindicken über Tellerseparator

Dispersion:
mittl. Partikeldurchmesser: 1,22 µm
Feststoffanteil: 39 g/l
PHB-Gehalt des Feststoffes: 82%
Stickstoffgehalt: 0,4%

3. Beispiel

gemäß Beispiel 1, aber
1. Schritt: mechanischer Zellaufschluß in einer Rühwerkskugelmühle (2 Passagen) und Abtrennung von Zellbruchstücken über Tellerseparator (5000 g)
2. Schritt: Natronlaugebehandlung 4 h bei 85°C und pH 8, Waschen über Tellerseparator
3. Schritt: Enzymbehandlung durch Streptomyces-Spezies in Verbindung mit Proteasen
4. Schritt: 3fach Waschen und Eindicken über Tellerseparator

Dispersion:
mittl. Partikeldurchmesser: 1,12 µm
Feststoffanteil: 38 g/l
PHB-Gehalt des Feststoffes: 92%
Stickstoffgehalt: 0,3%

4. Beispiel

Im 4. Beispiel wurde die Möglichkeit der Herstellung eines Dispersionspulvers mit anschließender Resuspendierung untersucht. Dazu wurde die in Beispiel 2 herge stellte Roh-Dispersion verwendet.
gemäß Beispiel 2, aber:
5. Schritt: Sprühtrocknung der Dispersion zur Erzeugung eines Dipersionspulvers (erreichter mittl. Partikeldurchmesser 5,2 µm)
6. Schritt: Resuspendierung in Wasser mittel Ultraturrax

Dispersion:
mittl. Partikeldurchmesser: 1,43 µm
Feststoffanteil. 35 g/l
PHB-Gehalt des Feststoffes: 82%
Stickstoffgehalt: 0,7%

5. Beispiel

Im letzten Beispiel wurde der Versuch auf Grundlage einer Biomasse mit erheblich höherem Ausgangs-PHB-Gehalt durchgeführt. Durch Kultivierung des Mikroorga nismus Alcaligenes eutrophus wurde nach Beendigung des Fermentationsprozesses ein PHB-Gehalt von 76% erzielt. Die Ausgangsbiomassekonzentration bezogen auf die Trockensubstanz betrug 52 g/l. Im Gegensatz zu den vorherigen Beispielen wurde hier bereits die Fermenterbrühe über Tellerseparator aufkonzentriert und auf einen Biotrockenmassegehalt von 137 g/l gebracht.
1. Schritt: Zellaufschluß in einem Hochdruckhomogenisator (1000 bar, 1 Passage) und Abtrennung von Zellbruchstücken über Tellerseparator (5000 g)
2. Schritt: Natronlaugebehandlung 2 h bei 75°C und pH 10, Waschen über Tellerseparator
3. Schritt: Wasserstoffperoxidbleiche mit H₂O₂ (33%) im Verhältnis 1 : 10, 2 h bei 80°C
4. Schritt: Waschen und Eindicken

Dispersion:
mittl. Partikeldurchmesser: 0,95 µm
Feststoffanteil: 42 g/l
PHB-Gehalt des Feststoffes: 95%
Stickstoffgehalt: 0,02%

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten, die als Granulen im Verlauf eines Fermentationsverfahrens in den Zellen eines Mikroorganismus akkumuliert werden, aus einer in einer wäßrigen Phase enthaltenen Zellmasse durch ein- oder mehrmaligen Aufschluß der Zellen und Abtrennung von Zellbestandteilen dadurch gekennzeichnet, daß

a) in der wäßrigen Phase die Zellwände der Mikroorganismen zunächst Reibungs-, Stoß-, Scher- und/oder Druckkräften ausgesetzt werden,
b) die in der Suspension verbleibenden Teile der Zellmasse und Po lyhydroxyalkanoatgranulen einer alkalischen Behandlung mit einem pH-Wert von 8-12 bei einer Temperatur über 70°C in einer Zeitdauer von 1 bis 4 h unterzogen und anschließend die wäßrige Phase neutralisiert wird,
c) gegebenenfalls die aus b) erhaltene Suspension einer enzymatischen Lyse der zerkleinerten und freigesetzten Zellbestandteile unterzogen wird,
d) die Polyhydroxyalkanoatgranulen mit Restbestandteilen der Zellmasse in Suspension in einem Verhältnis von 1 : 100 bis 1 : 5 mit Wasserstoffperoxid der Konzentration 1% bis 33% bei einer Temperatur von 70°C bis 95°C, behandelt werden und
e) die Polyhydroxyalkanoatdispersion gewaschen und
f) gegebenenfalls in an sich bekannter Weise getrocknet werden,

wobei zwischen den Prozeßstufen a) und/oder b) und/oder d) und/oder e) ein Teil oder die gesamten erzielten Zellbruchstücke und die in flüssige Phase überführten, löslichen Substanzen der Zellmasse aus der Fermenterbrühe separiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyhydroxy alkanoat eine Polyhydroxybuttersäure, eine Polyhydroxyvaleriansäure oder ein Copolymeres dieser ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mechani schen Zellzerstörung in einer Rührwerkskugelmühle erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mechani schen Zellzerstörung in einem Hochdruckhomogenisator erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Behandlung der in der wäßrigen Phase enthaltenen Zellmasse mit Natron lauge bei einer Temperatur größer 70°C erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lyse der zerkleinerten und freigesetzten Zellbestandteile durch Behandlung mit Enzy men von Streptomyces-Spezien erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die getrockneten Polyhydroxyalkanoatpartikel gegebenenfalls unter Hinzufügen von Dispergier hilfsmitteln redispergiert werden.

8. Verwendung einer nach Anspruch 1 bis 7 hergestellten Dispersion aus Po lyhydroxyalkanoaten zur Herstellung von Überzügen oder Beschichtungen von Oberflächen.

9. Verwendung einer nach Anspruch 1 bis 7 hergestellten Dispersion aus Po lyhydroxyalkanoaten als biologisch abbaubarer Füllstoff.

10. Verwendung einer nach Anspruch 1 bis 7 hergestellten Dispersion aus Po lyhydroxyalkanoaten zum Einsatz als Verarbeitungshilfsmittel für Polymere.

11. Verwendung einer nach Anspruch 1 bis 7 hergestellten Dispersion aus Po lyhydroxyalkanoaten als Trägermaterial zur Einbringung von Kontrastmitteln oder pharmazeutischen Wirkstoffen im medizinischen Bereich.