DE19622422A1

DE19622422A1 - Lagerungsstabile pharmazeutische Zusammensetzung mit immun - modulierenden und antiinflammatorischen Eigenschaften sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE19622422A1
Application number: DE19622422A
Authority: DE
Inventors: Susanne Dr Koch; Gerhard Dr Becker
Original assignee: Sanorell Pharma GmbH and Co KG
Current assignee: Sanorell Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1997-12-11
Also published as: JP2000515122A; WO1997046245A1; EP0910395A1; US6143331A

Description

Die Erfindung betrifft eine lagerungsstabile pharmazeu tische Zusammensetzung, die aus einem Thymusextrakt erhältlich ist und die immunmodulierende und entzündungs hemmende Eigenschaften aufweist.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate aus Thymus ist bekannt und in der Literatur vielseitig beschrieben. Derartige Extrakte enthalten sogenannte Thymusfaktoren, welche vom Thymus produzierte Peptide umfassen. Ihre Struktur und Funktion ist in vielen Fällen noch nicht vollständig geklärt. Es ist jedoch bekannt, daß die Thymusfaktoren die Reifung der T-Lymphozyten sowie deren Proliferation vom Lymphgewebe bewirken. Darüber hinaus ist es auch bekannt, daß sie bei der Abstoßung von Transplantationsgeweben sowie bei Autoimmunerkrankungen eine wesentliche Rolle spielen. Sie sind daher Gegenstand intensiver Untersuchungen.

Thymusfaktoren bzw. -Peptide werden im allgemeinen als Thymosine bezeichnet, wovon Thymostimulin und Thymo poietin, Thymosin-α-1, Thymosin-β-4 wohl am besten unter sucht sind. So ist es z. B. bekannt, daß Thymosin-α-1 und Thymosin-β-4 die Antigenpräsentation der Makrophagen verstärken, weshalb diese auch zur Behandlung von Autoim inunerkrankungen und u. a. auch bei Defekten im Immunsy stem, wie Krebs und Allergien, verwendet werden.

Die Herstellung und Extraktion von Thymuspeptiden ist bekannt und beispielsweise von T.L.K. Low und A. L. Goldstein in "Methods in Enzymology", Vol. 116, S. 213 (1985) beschrieben. Darüber hinaus sind diese ebenfalls von sanorell pharma GmbH & Co, Rechtmurgstr. 27, D-72270 Baiersbronn z. B. unter der Bezeichnung Thymosand® er hältlich.

Die Lagerung der durch Extraktion erhaltenen wäßrigen Thymus-Extrakte ist jedoch begrenzt. Es ist daher auch bereits versucht worden, pharmazeutisch aktive Teilpeptide wie z. B. das Pentapeptid der Aminosäuren 32 bis 36 des Thymopoietins sowie dessen Analoga synthetisch herzustel len (Justus Liebigs Ann. Chem. 1990, 245-247).

Der Erfindung hat daher zum Ziel, ein pharmazeutisch brauchbares Gemisch von Thymusfaktoren bereitzustellen, das lagerungsstabil ist und das neben einer immunmodulie renden Wirkung auch eine ausgeprägte antiinflammatorische Wirksamkeit aufweist.

Dieses Ziel wird nun erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß man ein auf an sich bekannte Weise homogenisiertes Thy musgewebe mittels einer wäßrigen Lösung extrahiert, die festen Bestandteile vom Extrakt abtrennt und diesen Extrakt über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußvolumen von 30 kD filtriert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene 30 kD-Ultrafiltrat mindestens einer weiteren Filtration an einem Ultrafilter mit einem Ausschlußvolumen von 3 kD unterzieht und das Retentat verwendet.

Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, daß mittels einer Ultrafiltration an einer Membran mit einem Ausschlußvolumen von 3000 Dalton ein Retentat erhalten wird, das offensichtlich von destabilisierenden Faktoren befreit ist und das seine immunmodulierenden Eigenschaften beibehält, jedoch darüber hinaus ausgeprägte antiinflammatorische bzw. entzündungshemmende Eigen schaften zeigt.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Thymus zellen werden jungen Kälbern entnommen und werden nach Entnahme rasch weiterverarbeitet. Die Herstellung von homogenisiertem Gewebe ist dem Fachmann bekannt und läßt sich beispielsweise mittels handelsüblichen Homogenisato ren und/oder Ultraschallbehandlung herstellen. Das Homogenisat wird vorzugsweise mindestens 10 Stunden, zweckmäßigerweise mindestens 20 Stunden bei 2-6°C, üblicherweise bei 3-5°C, einer Autodigestion unter zogen. Die Extraktion des Homogenisates wird mittels Wasser oder einer wäßrigen Lösung durchgeführt, die gegebenenfalls im neutralen bzw. biologisch üblichen pH-Bereich gepuffert sein kann. Der so erhaltene Extrakt enthält noch feste Bestandteile, die beispielsweise mittels Zentrifugieren oder Filtrieren über Filter mit entsprechend großen Poren (2,0 mm, 0,8 µmm, 0,2 µm) abge trennt werden. Sofern erforderlich, werden gegebenenfalls zusätzliche Trennungs- bzw. Reinigungsschritte mit Ammoniumsulfat und gegebenenfalls weitere Behandlungen, z. B. mit Phenol, durchgeführt.

Der von festen Bestandteilen befreite Extrakt wird dann einer ersten Ultrafiltration an einer Membran mit einem Ausschlußvolumen von 30 kD unterzogen, wobei vorzugsweise hydrophile Membranen, z. B. Cellulose- und Polysulfon membranen, insbesondere Spiralmembranen mit transversalem Flow verwendet werden. Derartige Membranen sind bekannt und werden beispielsweise von der Firma Amicon unter der Bezeichnung "S1Y30" vertrieben. Vorzugsweise wird dieser erste Ultrafiltrationsschritt im erfindungsgemäßen Ver fahren mehrmals, insbesondere jedoch mindestens dreimal, zweckmäßigerweise mindestens fünfmal durchgeführt. Es hat sich erfindungsgemäß als zweckmäßig erwiesen, die hierfür verwendeten Filtrationsmembranen gemäß dem in der WO 91/12027 beschriebenen Verfahren zu validieren und die Integrität der Membran gemäß WO 93/02714 zu überprüfen. Auf diese Weise wird ein erstes Ultrafiltrat erhalten, das wirksame Thymusfaktoren für medizinische und biologische Zwecke enthält.

Die mit diesem Ultrafiltrat durchgeführte zweite Ultra filtration an der Membran mit einem Ausschlußvolumen von 3 kD wird ebenfalls vorzugsweise mehrfach insbesondere jedoch mindestens dreimal, vorzugsweise mindestens fünf mal, durchgeführt. Bevorzugte Ultrafiltrationsmembranen für diese zweite Filtrationsstufe sind beispielsweise von der Firma Amicon unter der Bezeichnung S1Y3 kommerziell erhältlich. Es hat sich auch als zweckmäßig erwiesen, diesen letzten Ultrafiltrationsschritt als sogenannte Diafiltration, d. h. als wiederholte Filtration, durchzu führen, wobei analog einer Dialyse unerwünschte Bestand teile durch mehrfache Filtration mit der Filtratlösung über den Filter ausgewaschen werden. Auf diese Weise ist es ohne weiteres möglich, mit der Extraktionslösung eingeschleppte Substanzen, wie beispielsweise Puffersalze abzutrennen und durch andere Additive zu ersetzen. Erfin dungsgemäß ist es bevorzugt, das mittels der zweiten Ultrafiltration an der 3 kD-Membran eingeengte Retentat mit einer Mannitlösung zu verdünnen und die Filtration zu wiederholen. Auf diese Weise läßt sich die Extraktionslö sung auf einfache Weise umpuffern. Das derart erfindungs gemäß erhaltene Retentat läßt sich ohne weiteres unter Erhaltung seiner biologischen Aktivität lyophilisieren.

Die Erfindung betrifft auch eine mittels dem zuvor be schriebenen Verfahren erhaltene pharmazeutische Zusammen setzung sowie dessen Verwendung zur Herstellung eines lagerungsstabilen Arzneimittels mit immunmodulierender und antiinflammatorischer Wirkung.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher erläutert werden.

Beispiel 1

Im folgenden wurde ein Thymusextrakt verwendet, der von sanorell pharma GmbH & Co, Rechtmurgstraße 27, Baiers bronn, Deutschland, unter der Bezeichnung Thymosand® kommerziell erhältlich ist und der im folgenden auch als UF5 bezeichnet wird. Dieser Thymusextrakt wurde bereits vom Hersteller nach Entfernung der Feststoffe fünfmal über eine gemäß in der WO 91/12027 beschriebenen validierten Membran ultrafiltriert bzw. gereinigt (UF5). Dieses kommerziell erhältliche Präparat wurde dann mittels eines Konzentrators CH2 (erhältlich von Amicon, Postfach 1103, Witten, Deutschland), bestehend aus einem Vorratsgefäß, einer Schlauchpumpe und einer Ultrafilterhalterung über einen unter der Bezeichnung S1Y3 von Amicon erhältlichen Ultrafilter mit Delrinkopfstücken auf das 10-fache auf konzentriert (200 ml). Das so erhaltene Konzentrat wurde dann mittels einer 5%igen Mannitollösung auf das fünf fache Volumen verdünnt und anschließend wieder bis zum ursprünglichen Volumen eingeengt. Dieser Vorgang wurde insgesamt fünfmal wiederholt. Das Ultrafiltrat wurde verworfen und das die Thymuspeptide in hoher Konzentration enthaltende Retentat wurde einer Sterilfiltration (0,2 µm) unterzogen und anschließend lyophilisiert. Das so erhal tene Lyophilisat wird im folgenden als TML bezeichnet und zeigte sich im Gegensatz zum Ausgangsprodukt auch bei Raumtemperatur über mehrere Jahre hinweg als außerordent lich lagerstabil.

Beispiel 2

Aus dem in Beispiel 1 erhaltenen TML-Lyophilisat wurden Lösungen mit einer Proteinkonzentration (Lowry-Methode) von 800 µg/ml hergestellt und ihre biologische Aktivität an Blutzellen gemäß dem Verfahren von Hartung et al. gemessen (Hartung, T., A. Sauer & A. Wendel, Biochem. Pharmakol. Univ. Konstanz: W. Cytokine response of whole blood; 25. Jahrestagung d. ges. f. Immunol. September 1994; Poster). Dabei wird die Cytokinausschüttung von Lymphozyten in Vollblutkulturansätzen nach Stimulation mit Phytohämagglutinin (PHA) gemessen.

Der in diesem Bericht beschriebene Assay wurde mit PHA und TML bzw. Permeat als Costimulatoren sowie den entspre chenden Negativ- bzw. Positivkontrollen durchgeführt. Gemessen wurden die Cytokine IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10; TNF-α und IFN-gamma.

Material und Methoden Blutentnahme: Citratblut (Monovette, Sarstedt)

Kulturansätze: 4-Loch-Kulturschalen (4 × 1 ml) mit Deckel (Nunc; Art.Nr.: 176740).
Die Kulturansätze sind bis spätestens 4 Std. nach der Blutentnahme fertigzustellen
Aufarbeitung: Probengefäße (Sarstedt, Art.Nr.: 60036550) Tischzentrifuge EBA 3S (Hettich)
Cytokinmessung: Quantikine-Kits (Elisa von R & D Systems GmbH, Borsigstr. 7, 65205 Wiesbaden)
Mikroplatten-Photometer HTIII (Anthos).

Herstellung von RPMI-Medium (unter laminar flow):
900 ml Wasser f. Inj. werden in einen sterilisierten 2 l-Erlenmeyerkolben gegeben und unter Rühren eine Packung pulverförmiges RPMI-1640 (AutoMod, Sigma; Art.Nr.: R7755) eingetragen. Dann werden 10 ml einer 200 mM L-Glutamin lösung (Sigma Art.Nr.: 6-7513) zugegeben.

In ein sterilisiertes Bechergläschen werden 238,3 mg HEPES (Sigma; Art.Nr.: H-0878) eingewogen, in etwas Wasser gelöst und zur RPMI-Lösung gegeben. Die klare RPMI-Lösung wird in einen sterilisierten Meßzylinder gegeben und mit Wasser f. Inj. unter Ausspülen des RPMI-Gefäßes, des Bechergläschens und des Erlenmeyerkolbens auf 1000 ml aufgefüllt. Die fertige Lösung wird in einer sterilen 1 l-Flasche bei +4°C (: aufbewahrt und ist 1 Monat haltbar.

Herstellung von RPMI-Medium + PHA (unter laminar flow):
In einen sterilisierten 100 ml Meßkolben werden 1,875 mg PHA (Sigma; Art.Nr.: L9132) eingewogen und mit RPMI-Medium bis zur Eichmarke aufgefüllt. Die Lösung wird kurz durch gerührt, zu 30 ml in sterilisierte 30 ml-Vials aliquo tiert, mit sterilen Stopfen versehen und gebördelt. Die Entnahme erfolgt mit sterilen Einmal-Spritzen bzw. -Kanü len.

Durchführung der Vollblutansätze unter laminar flow:
Es werden 4-Loch-Kulturschalen verwendet. Hierbei betragen die Endkonzentrationen von PHA 15 µg/ml, von TML 806 µg/ml, und von UF5/Thymosand 50 µg/ml. Die Kulturansätze bestehen im einzelnen aus folgenden Komponenten (bezogen auf 1 Loch der Kulturschale), die direkt in die Löcher der Kulturschalen einpipettiert werden:
Negativkontrolle - 200 µl Blut, 522 µl Medium, 278 µl PBS oder Mannit
Positivkontrolle - 200 µl Blut, 522 µl Medium + PHA, 278 µl Mannitlösung ("stimuliert/Man nit-Volumenausgleich")
TML-Probe - 200 µl Blut, 522 µl Medium + PHA, 278 µl TML ("stimuliert + TML")
Thymosandprobe - 200 µl Blut, 522 µl Medium + PHA, 278 µl Thymosand® (Ch. B 4019550).

Die Ansätze werden in den Kulturschalen mit geschlossenem Deckel im Brutschrank bei +37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ 24 h inkubiert.

Aufarbeitung der Kulturansätze:
Zur Gewinnung der Serumüberstände werden die Blutproben abzentrifugiert (10 min; 5600 U/min), in gekennzeichnete Probengefäße zu je 410 µl aliquotiert und bei -70°C gelagert.

Durchführung der Cytokinbestimmung

Aus den Serumüberständen wurden die Cytokine IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α und IFN-gamma gemäß der Testvorschrift des Herstellers R & D Systems bestimmt. Bei jeder Messung wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Um die Werte statistisch abzusichern wurden für jedes Cytokin 3 Be stimmungen mit jeweils neuer Standardreihe angefertigt, so daß für jede Probe pro Cytokin (mit Ausnahme von IL-2) 6 Meßwerte resultierten.

Die Ergebnisse sind den beiliegenden Fig. 1-10 zu entnehmen.

Phytohämagglutinin wird als künstliches Agens verwendet, das in Zellkulturen eine Fieberreaktion simuliert. Wie aus den Figuren ersichtlich ist, bewirkt die Anwesenheit von Phytohämagglutinin in allen Fällen einen Anstieg der Cytokinspiegel. Das erfindungsgemäß erhaltene Retentat TML ruft an der PHA-stimulierten Zellkultur eine ausgespro chene Steigerung der Interleukin-10-Produktion (IL-10) an Lymphozyten hervor (Fig. 2), was einer entzündungshemmen den Wirkung entspricht, da IL-10 die Prostaglandian-E2-Synthese hemmt. Im Gegensatz dazu wird die Bildung von proinflammatorischem Interleukin-2 (IL-2) (Fig. 4) sowie von ebenfalls proinflammatorischem IFN-gamma (Fig. 3) an PHA-stimulierten Leukozyten vermindert. Die nur über eine 30 kD-Membran, nicht jedoch über eine 3 kD-Membran filtrierte Zusammensetzung (UF5/ThymosandR) bewirkt eine Verringerung der Interleukin-10-Produktion (Fig. 1). Die Sekretion von TNF-α wird durch die TML-Fraktion noch weiter auf annähernd 130% (Fig. 6) gesteigert, während die nicht von ihren niedermolekularen Bestandteilen befreite Thymosand-Fraktion eine Verringerung der TNF-α-Sekretion an PHA-stimulierten Zellen auf etwa 45% bewirkt (Fig. 5).

Die Sekretion von IL-6 wird durch TML auf etwa 230% gesteigert, wohingegen Thymosand (UF5) eine Abnahme auf etwa 75% bewirkt (Fig. 7 und 8).

Die Sekretion von Interleukin-1β wird durch die TML-Fraktion (TML-Retentat) auf etwa 230% gesteigert (Fig. 10), wogegen mit dem UF5-Präparat (Thymosand®) die IL-1β-Sekretion auf 60% abnimmt (Fig. 9).

Dieses Ergebnis ist umso überraschender als sich die Mengenverhältnisse der einzelnen Peptidfraktionen bzw. Thymusfaktoren im TML im Vergleich zum Thymosand-Aus gangsprodukt nicht unterscheiden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Zusammen setzung erhalten, die auch noch bei Raumtemperatur über Jahre hinweg stabil bleibt, und mit der hohe Konzentrati onen (bis zum 100fachen von Thymosand®) hergestellt werden können.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer lagerstabilen phar mazeutischen Zusammensetzung von Thymusfaktoren mit immunmodulierenden und entzündungshemmenden Eigen schaften, umfassend die Extraktion eines homogeni sierten Thymusgewebes mittels einer wäßrigen Lösung, Abtrennen der festen Bestandteile des Extraktes und mindestens einer ersten Ultrafiltration des Extraktes über eine Filtermembran mit einem Ausschlußvolumen von 30 kD zur Gewinnung eines ersten Ultrafiltrates, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Ultrafil trat mindestens einer weiteren zweiten Filtration über einen Ultrafilter mit einem Ausschlußvolumen von 3 kD unterzieht und das Retentat verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Retentat mit einer wäßrigen Mannitlösung versetzt und an einem Ultrafilter mit einem Aus schlußvolumen von 3 kD nochmals mindestens einmal diafiltriert wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Ultrafil tration an dem Filter mit dem Ausschlußvolumen von 30 kD drei- bis siebenmal durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Diafiltration mit Mannit drei- bis siebenmal durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnete daß man feste Teilchen mittels einem Filter einer Porengröße von 1 bis 3 µm entfernt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den Filter der ersten Ultrafiltration mittels Leviviridae-Viren validiert.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei der zweiten Ultrafiltration gewonnene Retentat lyophilisiert.

8. Pharmazeutische Zubereitung, erhältlich nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 7.

9. Verwendung einer Zusammensetzung, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 7, zur Herstellung eines lagerstabilen pharmazeutischen Mittels mit immunmo dulierenden und antiinflammatorischen Eigenschaften.