DE19613606C1 - Gen für Hypertonie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das Hypertonie bedingt, und seine Ver­ wendung.

Hypertonie, d. h. Bluthochdruck, ist eine der häufigsten Ursachen für kardiovasku­ läre Erkrankungen, insbesondere für Schlaganfälle. Obwohl aus Zwillingsunter­ suchungen schon lange bekannt ist, daß Hypertonie auf genetische Faktoren zurückzuführen ist, sind die ethiologischen und pathogenetischen Faktoren derzeit noch weitgehend unbekannt. Molekulare Methoden haben zwar die Erforschung von Hypertonie, insbesondere mit transgenen Tieren, vorangetrieben, aber auch deutlich gemacht, daß Hypertonie eine heterogene und komplexe Erkrankung ist, die durch Gen-Gen und Gen-Umwelt Interaktionen verursacht wird. Die Suche nach Genen, die mit Hypertonie in Verbindung stehen, hat bisher keine zufrieden­ stellenden Ergebnisse gebracht.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem die genetische Ursache von Hypertonie untersucht werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Gen, das auf Chromosom 12p im Genombereich zwischen den Genommarkern AFM338WH5 und D1251057 liegt.

Der Anmelder hat erkannt, daß die Erkrankungen, Hypertonie, Brachydaktylie, d. h. Verkürzung von Gliedmaßen, und Störung des Wachstums von Fibroblasten in Form eines verkürzten Zellzyklus, zusammen autosomal dominant vererbt werden können. Er hat gefunden, daß hierfür ein Gen verantwortlich ist, da auf Chromo­ som 12p im Genombereich zwischen den Genommarkern AFM338WH5 und D1251057 liegt. Der Anmelder hat diese Erkenntnisse bei Untersuchungen einer türkischen Familie gewonnen, von der 50% der Mitglieder an vorstehenden Erkrankungen leiden. Hierzu hat der Anmelder eine Ausschluß-Analyse durch­ geführt, in der er übliche Genommarker verwendete, die polymorphe Bereiche des menschlichen Genoms umfassen.

Das erfindungsgemäße Gen liegt, wie vorstehend angegeben, auf Chromosom 12p im Genombereich zwischen den Genommarkern AFM 338WH5 und D12S1057. Diese Genommarker sind unter Database ID: AFM 338WH5, Quelle: J. Weissen­ bach, Genethon bzw. Database ID: GATA-D1251057, Quelle CHLC (Cooperative Human Linkage Center) erhältlich.

Der Genombereich zwischen den genannten Genommarkern umfaßt Sequenzen, die in den nachstehenden, sich überlappenden YAC-Klonen vorliegen. Diese YAC-Klone werden wie folgt beschrieben:

Die YAC-Klone wurden bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter den angegebenen DSM-Nummern am 29. März 1996 hinterlegt. Ferner wird auf Albertsen et al., PNAS, USA, 87 (1990), 4256-4260, verwiesen.

Das erfindungsgemäße Gen kann weiter charakterisiert werden. Hierzu können übliche Verfahren durchgeführt werden. Es ist günstig, die genomische DNA von Personen zu isolieren, die an der Kombination aus Hypertonie und Brachydaktylie leiden und einen verkürzten Zellzyklus der Fibroblasten aufweisen. Besonders günstig ist es, wenn diese Personen von einer Familie stammen, die auch gesunde Mitglieder umfaßt. Ein Beispiel einer solchen Familie ist in Bilginturan N. et al., J. med. Genet. 10, (1973), 253-259) beschrieben. Die genomische DNA kann dann mit dem Restriktionsenzym Sau3AI gespalten werden und die erhaltenen Fragmen­ te können zur Erstellung einer Bibliothek, z. B. unter Verwendung des Bakteriopha­ gen P1 als Vektor, eingesetzt werden. Klone der Bibliothek können zur Hybridi­ sierung mit den vorstehenden YAC-Klonen verwendet werden. Positive Klone der Bibliothek können durch weitere Hybridisierung mit anderen, ebenfalls im angege­ benen Genombereich liegenden YAC-Klonen (vgl. Albrechtsen, supra) bestätigt und charakterisiert werden.

Ferner können die positiven Klone der Bibliothek zur Transfektion von Fibroblasten­ zellen verwendet werden. Solche Zellen werden gesunden Personen, d. h. solchen ohne Hypertonie und Brachydaktylie sowie mit normalem Zellzyklus der Fibrobla­ sten, entnommen. Günstig ist es, wenn diese Personen von der gleichen Familie stammen, von der erkrankte Personen als Spender für die genomische DNA verwendet worden sind. Durch die Transfektion der Fibroblastenzellen mit den positiven Klonen kann untersucht werden, welche der Klone den Zellzyklus der Fibroblastenzellen verkürzen, und sich somit als erfindungsgemäßes Gen auswei­ sen. Diese Untersuchung kann durch ein übliches Verfahren erfolgen (vgl. 5-Bromo-2′-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit III, Cat. No. 1444611, Boehrin­ ger Mannheim). Die identifizierten Klone können sequenziert und in ihrer Struktur aufgeklärt werden. Damit ist es möglich, das erfindungsgemäße Gen zu isolieren.

Das erfindungsgemäße Gen kann kloniert werden, insbesondere in Expressions­ vektoren. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expres­ sionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um das erfindungsgemäße, in Expressions­ vektoren vorliegende Gen zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM 109, BL21 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise das erfindungsgemäße Gen in Expressions­ vektoren inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß das erfindungsgemäße Gen in Verbindung mit anderen für weitere Proteine kodierenden DNAs inseriert werden kann, so daß das Gen in Form von Fusionsproteinen exprimiert werden kann.

Desweiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. transfizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch das erfindungs­ gemäße Gen exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen.

Darüberhinaus kennt der Fachmann Verfahren, Antikörper gegen das vorstehende Protein herzustellen. Solche Antikörper können polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu ihrer Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner, für polyklonale und Mäuse für monoklonale Antikörper, mit vorstehendem Protein oder Fragmenten davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen Protein oder Fragmenten davon erfolgen. Polyklonale Antikörper können dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Für monoklonale Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die genetischen Ursachen von Hypertonie zu untersuchen. Ferner wird die Möglichkeit gegeben, Mittel zu ent­ wickeln, die für diagnostische und/oder therapeutische Maßnahmen bei Hypertonie eingesetzt werden können.

Claims (4)

1. Gen für Hypertonie, wobei das Gen auf Chromosom 12p im Genombereich zwischen den Genommarkern AFM338WH5 und D12S1057 liegt.

2. Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Genombereich von der Gesamtheit der bei der DSM hinterlegten YAC-Klone DSM 10619, DSM 10620, DSM 10621, DSM 10622, DSM 10623, DSM 10624, DSM 10625, DSM 10626, DSM 10627, DSM 10628, DSM 10629, DSM 10630 umfaßt wird.

3. Verwendung des Gens nach Anspruch 1 oder 2 zur Untersuchung der genetischen Ursachen von Hypertonie.

4. Verwendung des Gens nach Anspruch 1 oder 2 als diagnostisches Mittel bei Hypertonie.