DE19611366A1 - Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische Derivate - Google Patents
Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische DerivateInfo
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Description
Die Erfindung betrifft den neuen Naturstoff Hyphodermin A, ein Verfahren zu
seiner Herstellung aus Pilzorganismen aus der Klasse der Basidiomyceten, ins
besondere aus dem Stamm Hyphoderma radula (WP 2184), metabolische Neben
komponenten, chemische Derivate sowie deren Verwendung als Enzyminhibitoren,
insbesondere für die Inhibition der Proteinphosphatasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
in welcher
A und D gemeinsam einen Rest der Formel
A und D gemeinsam einen Rest der Formel
bilden,
worin
R⁵ und R⁶ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden,
oder
R⁵ Wasserstoff bedeutet
und
R⁶ Hydroxy, Methoxy oder Acetoxy bedeutet,
oder
A für Methoxycarbonyl steht
und
D für Carboxy steht,
R¹ für Wasserstoff oder Hydroxy steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy, Acetoxy oder Chlor steht,
oder im Fall einer Einfachbindung zwischen den Positionen CR¹/CR²
R¹ und R² gemeinsam einen Rest der Formel
R⁵ und R⁶ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden,
oder
R⁵ Wasserstoff bedeutet
und
R⁶ Hydroxy, Methoxy oder Acetoxy bedeutet,
oder
A für Methoxycarbonyl steht
und
D für Carboxy steht,
R¹ für Wasserstoff oder Hydroxy steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy, Acetoxy oder Chlor steht,
oder im Fall einer Einfachbindung zwischen den Positionen CR¹/CR²
R¹ und R² gemeinsam einen Rest der Formel
bilden,
R³ und R⁴ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden
oder
R³ für Wasserstoff steht
und
R⁴ für Hydroxy steht
und deren Isomere und Salze.
R³ und R⁴ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden
oder
R³ für Wasserstoff steht
und
R⁴ für Hydroxy steht
und deren Isomere und Salze.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, die sich
entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und
Spiegelbild (Diastereomere) verhalten, existieren. Die Erfindung betrifft sowohl die
Enantiomeren oder Diastereomeren oder deren jeweilige Mischungen. Die Racem
formen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die
stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.
Überraschenderweise zeichnet sich der neue Naturstoff Hyphodermin A, seine
Homologen und seine chemischen Derivate durch eine Inhibition der Protein
phosphatasen PP1 und PP2a aus.
Außerdem wurden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindun
gen der allgemeinen Formel (I) gefunden, wobei zunächst die Gewinnung des
Naturstoffs Hyphodermin A der Formel (Ia)
beschrieben wird.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) wird gewonnen, indem man den
Stamm Hyphoderma radula (WP 2184) in einem Nährmedium züchtet und
anschließend daraus isoliert.
Die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) wird durch die
Kultur eines Pilzorganismus in geeigneten Nährlösungen unter geeigneten physio
logischen Bedingungen erzeugt. Sie wird aus der Kulturlösung durch Extraktion
oder durch Absorption abgetrennt und durch weitere geeignete Methoden ange
reichert.
Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung Mikroorganismen der Klasse der
Basidiomyceten, die bei der Kultivierung in einem Kohlenstoff- und Stickstoff
quellen sowie Mineralsalze enthaltenden Nährmedium eine Verbindung produzie
ren, welche die bei der Substanzcharakterisierung im folgenden unter (1) bis (5)
aufgeführten Eigenschaften und Parameter aufweist.
Für das Herstellungsverfahren ist der Stamm Hyphoderma radula (WP 2184) aus
der Ordnung der Klasse der Basidiomyceten oder von ihm ab stammende Varianten
und Mutanten besonders wichtig. Der Stamm wurde von einem Zweig der
Wildkirsche in Wuppertal (Deutschland) isoliert. Eine Kultur dieses Stammes
wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen in Braunschweig am
18.07.1995 unter der Nummer DSM 10135 hinterlegt.
Der Basidiomycete Hyphoderma radula (WP 2184) wurde in Wuppertal/ Katern
berg gefunden. Die Kultur wurde aus Sporenabdrücken des Basidiomyceten
hergestellt, der die typische morphologischen Charakteristika von Hyphoderma
radula (F.R. DONK) zeigte [vgl. E. Breitenbach, F. Kränzlin, Pilze der Schweiz:
Bd. 2, S 134, Mykologische Gesellschaft Schweiz, 1986].
Der Stamm wächst in einem Temperaturbereich von +20°C bis +35°C. Bei +5°C
und +45°C ist kein Wachstum zu beobachten.
Die Isolierung des Basidiomyceten erfolgte nach K.A. Seifert, Isolation of
Filamentus Fungi, S. 21ff. in Isolation of Biotechnological Organisms from
Nature, D.L. Labeda (Editor), McGraw-Hill Publishing Company 1990.
Es wurde weiterhin gefunden, daß man die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) er
hält, wenn man geeignete Mikroorganismen der Klasse der Basidiomyceten in
einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
sowie Mineralsalze enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert und die Ver
bindung nach üblichen Methoden isoliert.
Für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) ver
wendet man Nährmedien, die die üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und
die notwendigen Salze enthalten. Als Kohlenstoffquelle können verwendet werden:
Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z. B. Stärke, Monosaccharide, wie z. B. Glucose. Weiterhin können natürlich vorkommende Gemische, wie z. B. Malzextrakt, sowie Gemische aus den erwähnten Komponenten verwendet werden.
Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, wie z. B. Stärke, Monosaccharide, wie z. B. Glucose. Weiterhin können natürlich vorkommende Gemische, wie z. B. Malzextrakt, sowie Gemische aus den erwähnten Komponenten verwendet werden.
Als N-Quelle können die üblichen stickstoffhaltigen Nährmedienbestandteile Ver
wendung finden, so z. B. Aminosäuren, Eiweißstoffe, Eiweißhydrolysate, Ammo
niumsalze, natürlich vorkommende komplexe Stoffe, wie Sojabohnenmehl, Hefe
extrakt, Milchpulver und geeignete Mischungen derselben.
Als Hilfsstoffe werden im Nährmedium Mineralsalze benötigt, z. B. Phosphate,
Sulfate oder Chloride des Kaliums, des Natriums, des Calciums, des Magnesiums,
Eisens, Zinks und Mangans. Die Konzentration dieser Stoffe kann in weiten
Grenzen schwanken, z. T. sind die notwendigen Konzentrationen der Mineralsalze
in den o.a. Kohlenstoff- oder Stickstoffquellen oder im verwendeten Wasser als
Verunreinigungen enthalten.
Weiterhin können als Hilfsstoffe noch Antischaummittel der verschiedensten Art
Verwendung finden, wie z. B. Polyole oder Silikone.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) kann mit
Hilfe üblicher fester, halbfester oder flüssiger Nährmedien durchgeführt werden.
Bevorzugt werden wäßrig flüssige Nährmedien.
Die Beimpfung der Nährmedien erfolgt dabei nach allgemein üblichen Methoden,
z. B. über Schrägröhrchen oder Kolbenkulturen.
Die Kultur erfolgt unter aeroben Bedingungen und kann gemäß den allgemein
üblichen Methoden wie unter Verwendung von Schüttelkulturen, z. B. Schüt
telkolben, von luftbewegten Kulturen oder von Submerskulturen durchgeführt wer
den. Bevorzugt erfolgt die Kultivierung in aeroben Submersverfahren in belüfteten
Fermentern, z. B. in üblichen Submersfermentationstanks. Es ist möglich, die Kul
tur kontinuierlich oder diskontinuierlich durchzuführen. Vorzugsweise wird dis
kontinuierlich gearbeitet.
Bei der Durchführung des Herstellungsverfahrens wird unter aeroben Bedingungen
gearbeitet; die Kultur kann gemäß üblicher Methoden, so z. B. unter Verwendung
von Schüttelkulturen oder von belüfteten Fermenterkulturen, durchgeführt werden.
Die Prozentverhältnisse der Nährlösungsbestandteile können in weiten Bereichen
schwanken, im allgemeinen machen die Kohlenstoffquellen 0,5 bis 8%, vor
zugsweise 0,6 bis 6%, die Stickstoffquellen 0,1 bis 5%, vorzugsweise 0,5 bis 2%
aus, die Salze liegen in üblichen Konzentrationen vor, vorzugsweise im Bereich
zwischen 0,001 bis 0,5 Gew.-%. Die Antischaummittel liegen in bis zu 0,5%iger
Konzentration vor. Die zur Sterilisation angewandten Temperaturen liegen bei
+100°C bis +140°C, bevorzugt bei +120°C bis +130°C:
Der pH-Wert der wachsenden Kultur sollte vorzugsweise zwischen etwa 5 bis etwa 8, insbesondere zwischen 5,5 und 7,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säuren, z. B. H₂SO₄, oder sterile Laugen, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt werden.
Der pH-Wert der wachsenden Kultur sollte vorzugsweise zwischen etwa 5 bis etwa 8, insbesondere zwischen 5,5 und 7,0 gehalten werden. Ein zu starker pH-Abfall in den sauren Bereich kann durch Zusätze einer organischen oder anorganischen Base, vorzugsweise von CaCO₃ vermieden werden. Wie in der Fermentationstechnologie üblich, kann auch eine automatische pH-Regulierung durchgeführt werden, bei der sterile organische oder anorganische Säuren, z. B. H₂SO₄, oder sterile Laugen, z. B. NaOH in Abständen in die Kulturlösung eingespritzt werden.
Es ist zweckmäßig sicherzustellen, daß die Mikroorganismen ausreichend mit
Sauerstoff sowie Nährstoffen in Kontakt gebracht werden. Dies kann nach den
allgemein üblichen Methoden wie Schütteln und Rühren erfolgen.
Die Züchtungstemperatur kann zwischen etwa +16°C und +42°C, vorzugsweise
zwischen +20°C und +32°C liegen, besonders bevorzugt liegt sie bei etwa +23°C.
Die Dauer der Züchtung kann stark variiert werden, wobei z. B. die Zusammen
setzung des Nährmediums und die Züchtungstemperatur eine Rolle spielen. Die
jeweiligen optimalen Bedingungen können von jedem Fachmann auf dem mikro
biellen Gebiet leicht festgelegt werden.
Es hat sich herausgestellt, daß die Menge der sich in der Kulturbrühe anrei
chernden erfindungsgemäßen Verbindung im allgemeinen ihr Maximum etwa 3 bis
20, vorzugsweise 6 bis 12 Tage nach Züchtungsbeginn erreicht.
Wie allgemein bei mikrobiologischen Verfahren sollten Fremdinfektionen der Kul
turmedien vermieden werden. Hierzu werden die üblichen Vorkehrungen getroffen,
wie Sterilisation der Nährmedien, der Kulturgefäße sowie der für die Belüftung
notwendigen Luft. Zur Sterilisation der Vorrichtung können z. B. Dampf- oder
Trockensterilisation verwendet werden.
Falls bei der Kultivierung in unerwünschter Menge Schaum entsteht, können die
üblichen chemischen Schaumdämpfungsmittel, z. B. flüssige Fette und Öle, Öl-
Wasser-Emulsionen, Paraffine, höhere Alkohole, wie Octadecanol, Siliconöle,
Polyoxyethlyen- bzw. Polyoxypropylenverbindungen zugesetzt werden. Schaum
kann auch mit Hilfe der üblichen mechanischen Vorrichtungen (welche z. B. Zen
trifugalkräfte benutzen) gedämpft oder beseitigt werden.
Die neue Verbindung (Ia) ist sowohl im Kulturüberstand als auch im Mycel zu
finden und kann mit Hilfe von üblichen Extraktions- und/oder Chromatographie
verfahren aus dem Fermentationsansatz isoliert und gegebenenfalls gereinigt wer
den. Die Chromatographie kann in Form der Säulenchromatographie durchgeführt
werden. Mit Erfolg läßt sich auch die Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) einsetzen. Als Absorptionsmittel können die üblichen anorganischen oder
organischen Adsorptionsmittel eingesetzt werden, wie z. B. Kieselgel, modifizierte
Kieselgele, Magnesiumsilikat, Aktivkohle, Cellulose, Cellulosederivate, Kunstharze
wie Polyamide, z. B. acetyliertes Polyamid, Dextrangele oder modifizierte
Dextrangele. Als Laufmittel können die verschiedensten Lösemittel oder
Lösemittelgemische verwendet werden, in welchen die erfindungsgemäße
Verbindung löslich ist. Bevorzugt werden Essigsäureethylester, Chloroform,
Acetonitril und Methanol oder ihre Gemische (beispielsweise Gemische aus
Chloroform und Methanol, aus Essigsäureethylester und Chloroform oder
Acetonitril und Wasser) eingesetzt.
Bevorzugt werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindung (Ia) Chro
matographie-Verfahren verwendet, z. B. unspezifische Adsorption an Sorbentien
wie Kieselgel, modifizierte Kieselgele (z. B. RP-18) oder Geldiffusionschromato
graphie. Dies sind die von der Reinigung schlecht wasserlöslicher Naturstoffe her
bekannten Methoden.
Aus ihren Lösungen kann die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) nach den
üblichen Methoden, z. B. Verdampfen des Lösemittels, Gefriertrocknung usw.
erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Mycelium aus der Kulturbrühe,
vorzugsweise durch Zentrifugation abgetrennt und mit einem weniger polaren
Lösemittel mehrfach, vorzugsweise zweimal extrahiert. Als Lösemittel können
C₁-C₄-Alkohole, C₁-C₄-Ketone oder halogenierte Kohlenwasserstoffe verwendet
werden. Die wäßrig-organische Lösung wird im Vakuum, z. B. etwa auf 1/20 des
Volumens der Kulturbrühe konzentriert und weiter verarbeitet. Die Kulturbrühe
wird nach Abtrennen des Mycels mehrfach mit einem nicht mit Wasser misch
baren Lösemittel, bevorzugt Essigsäureethylester extrahiert und nach Konzentration
auf etwa 1/10 des Ausgangsvolumens weiter verarbeitet.
Aus diesen beiden Rohextrakten kann die erfindungsgemäße Verbindung (Ia)
durch übliche chromatographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an
Kieselgel oder modifizierten Kieselgelen (z. B. RP-18) isoliert werden.
Sie kann außerdem an unspezifischen Adsorberharzen auf Polystyrolbasis (z. B.
Amberlite XAD der Firma Roehm und Haas oder Lewapol CA 9221 der Firma
Bayer) gebunden werden. Die Desorption wird fraktioniert, durch Mischungen aus
Wasser und den oben angegebenen organischen Lösemitteln, insbesondere
Wasser/Methanol vorgenommen.
Die durch Test ermittelten aktiven Fraktionen werden unter reduziertem Druck bis
zur vollständigen Entfernung des organischen Lösemittels bei +30°C bis +35°C
konzentriert und gefriergetrocknet.
Das Lyophilisat wird erneut in Wasser suspendiert und vorzugsweise mit Essig
säureethylester oder anderen nicht mit Wasser mischbaren Lösemitteln extrahiert.
Aus dem Extrakt wird die erfindungsgemäße Verbindung durch übliche chroma
tographische Methoden, vorzugsweise Chromatographie an Kieselgel oder
RP-Kieselgel, gewonnen.
Die erfindungsgemäße Verbindung (Ia) wird durch folgende Eigenschaften charak
terisiert:
- 1) Der Naturstoff ist ein farbloser bis blaßgelber Feststoff. Er sintert beim Erwärmen und zersetzt sich <150°C.Der optische Drehwert beträgt sofort nach dem Lösen [α] = 338 (c = 0,5, 20°C in CH₃OH).
- 2) UV-Spektrum
Die Aufnahme erfolgt in Acetonitril. - 3) CD (CH₃OH)
- 4) Das ¹H-Kernresonanzspektrum gibt die Signallage in Teilen pro Million
(ppm) und Schwingungen pro Sekunde gemäß Tabelle 3 an. Es wurde in
einer Dimethylsulfoxid-d₆-, CDCl₃ oder CD₃OD-Lösung der Verbindung
mit TMS als Standard (intern) mit einem Kernresonanz-Spektrometer der
Firma Bruker bei einer Feldstärke von 200, 300 und 400 MHz aufge
nommen.
Durch ¹¹H/¹³C-Heteroatom-Korrelationsspektroskopie konnten den Kohlen stoffatomen die an sie gebundenen Wasserstoffatome zugeordnet sowie Fernverknüpfungen ermittelt werden: - 5) Die Verbindung (Ia) zeigt bei der Massenspektroskopie unter chemischer Ionisation einen Molpeak bei m/z = 278 [M+NH₄]⁺. Das Massenspektrum im EI-Modus ergibt für den Molpeak nach Hochauflösung eine Summenformel von C₁₄H₁₂O₅.
Die Verbindungen der Formeln (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig) und (Ih)
wurden wie der Naturstoff der Formel (Ia) aus der Kulturbrühe isoliert.
Die im folgenden aufgeführten charakteristischen Daten wurden unter den
Bedingungen, wie sie bereits für die Verbindung (Ia) oben aufgezeigt wurden,
gemessen.
UVmax (nm): 227, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 246 (M⁺; C₁₄H₁₄O₄), 200 (C₁₃H₁₄O₄), 159 (C₁₁H₁₁O)
DCI-MS: m/z 264 [M+NH₄]⁺, 247 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₅O₄], 231 (C₁₄H₁₅O₃).
EI-MS: m/z 246 (M⁺; C₁₄H₁₄O₄), 200 (C₁₃H₁₄O₄), 159 (C₁₁H₁₁O)
DCI-MS: m/z 264 [M+NH₄]⁺, 247 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₅O₄], 231 (C₁₄H₁₅O₃).
UVmax: 227, 250 (sh), 295
CD (MeOH) λmax nm([θ]²⁰): 216 (-7.810), 221 (1.960), 224 (-7.920), 228 (9.300),
235 (-30.770), 240 (-26.400), 246 (-28.700), 274 (-2.490), 289 (-5.100), 341 (19.900)
EI-MS: m/z 243 ([M-OCH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₄), 169 (C₁₂H₉O)
DCI-MS: m/z 292 [M+NH₄]⁺, 275 [M+H]⁺, 259 [M-CH₃]⁺.
CD (MeOH) λmax nm([θ]²⁰): 216 (-7.810), 221 (1.960), 224 (-7.920), 228 (9.300),
235 (-30.770), 240 (-26.400), 246 (-28.700), 274 (-2.490), 289 (-5.100), 341 (19.900)
EI-MS: m/z 243 ([M-OCH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₄), 169 (C₁₂H₉O)
DCI-MS: m/z 292 [M+NH₄]⁺, 275 [M+H]⁺, 259 [M-CH₃]⁺.
UVmax: 227, 250 (sh), 295
EI-MS m/z (M⁺, C₁₅H₁₄O₅), 259 ([M-CH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₅), 243
([M-OCH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₄).
EI-MS m/z (M⁺, C₁₅H₁₄O₅), 259 ([M-CH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₅), 243
([M-OCH₃]⁺, C₁₄H₁₁O₄).
UV λmax (nm): 227, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 262 (M⁺; C₁₄H₁₄O₅), 244 [(M-H₂O)⁺, C₁₄H₁₂O₄], 229 (C₁₃H₁₁O₄)
DCI-MS: m/z 245 (C₁₄H₁₃O₄), 229 (C₁₃H₁₁O₄).
EI-MS: m/z 262 (M⁺; C₁₄H₁₄O₅), 244 [(M-H₂O)⁺, C₁₄H₁₂O₄], 229 (C₁₃H₁₁O₄)
DCI-MS: m/z 245 (C₁₄H₁₃O₄), 229 (C₁₃H₁₁O₄).
UVmax (nm): 227, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 244 ([M-H₂O]⁺; C₁₄H₁₂O₄), 229 (C₁₃H₉O₄)
DCI-MS: m/z 280 [M+NH₄]⁺, 263 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₅O₅].
EI-MS: m/z 244 ([M-H₂O]⁺; C₁₄H₁₂O₄), 229 (C₁₃H₉O₄)
DCI-MS: m/z 280 [M+NH₄]⁺, 263 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₅O₅].
UVmax (nm): 205, 242, 274, 284
EI-MS: m/z 244 ([M-H₂O]⁺; C₁₄H₁₂O₄), 229 (C₁₃H₉O₄)
DCI-MS: m/z 280 [M+NH₄]⁺, 262 [M⁺, C₁₄H₁₄O₅], 245.
EI-MS: m/z 244 ([M-H₂O]⁺; C₁₄H₁₂O₄), 229 (C₁₃H₉O₄)
DCI-MS: m/z 280 [M+NH₄]⁺, 262 [M⁺, C₁₄H₁₄O₅], 245.
UVmax (nm): 232, 273, 305 (sh)
EI-MS m/z 278 (M⁺; C₁₄H₁₁ClO₄), 263 ([M-CH₃]⁺, C₁₃H₉ClO₄),
DCI-MS: m/z 296 [M+NH₄]⁺, 279 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₂ClO₄], 264, 247.
EI-MS m/z 278 (M⁺; C₁₄H₁₁ClO₄), 263 ([M-CH₃]⁺, C₁₃H₉ClO₄),
DCI-MS: m/z 296 [M+NH₄]⁺, 279 [(M+H)⁺, C₁₄H₁₂ClO₄], 264, 247.
Die übrigen erfindungsgemäßen Verbindungen, die unter der allgemeinen Formel
(I) erfaßt sind, können durch chemische Derivatisierung des Naturstoffs der
allgemeinen Formel (Ia) hergestellt werden, wobei diese dann wiederum einen
Beweis für dessen Konstitution darstellen.
Die chemischen Derivate der allgemeinen Formel (Ii)-(Io)
können hergestellt werden, indem man ausgehend von dem neuen Naturstoff der
Formel (Ia)
- a) Umsetzungen mit Carbonsäureanhydriden, vorzugsweise Acetanhydrid, und in Anwesenheit einer Base wie Dimethylaminopyridin durchführt, oder
- b) eine Chlorierung mit methanolischer Salzsäure oder
- c) eine Oxidation mit Dess-Martin-Reagenz in Methylenchlorid durchführt.
Die Temperaturbereiche liegen im Fall a) zwischen 0°C bis 30°C, vorzugsweise
zwischen 15°C bis 25°C, im Fall b) zwischen 0°C bis 50°C, vorzugsweise
zwischen 15°C bis 25°C und im Fall c) zwischen -20°C bis 50°C, vorzugsweise
zwischen -5°C und 20°C.
Charakteristische Daten der Verbindungen der Formeln (Ii)-(Io):
UVmax (nm): 227, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 259 ([M-Ac]⁺; C₁₄H₁₁O₅), 243 ([M-OAc]⁺; C₁₄H₁₁O₄)
DCI-MS: m/z 320 [M+NH₄]⁺, 287, 229.
EI-MS: m/z 259 ([M-Ac]⁺; C₁₄H₁₁O₅), 243 ([M-OAc]⁺; C₁₄H₁₁O₄)
DCI-MS: m/z 320 [M+NH₄]⁺, 287, 229.
UVmax (nm): 230, 273 (sh), 300
EI-MS: m/z 243 ([M-OAc]⁺, C₁₄H₁₁O₄), 214, 199
DCI-MS: m/z 320 [M+NH₄]⁺, 303 ([M+H]⁺; C₁₆H₁₅O₆).
EI-MS: m/z 243 ([M-OAc]⁺, C₁₄H₁₁O₄), 214, 199
DCI-MS: m/z 320 [M+NH₄]⁺, 303 ([M+H]⁺; C₁₆H₁₅O₆).
UVmax (nm): 230, 273 (sh), 300
EI-MS: m/z 302 ([M+H-Ac]⁺, C₁₆H₁₄O₆), 214
DCI-MS m/z 362 [M+NH₄]⁺, 345 ([M+H]⁺; C₁₈H₁₇O₇), 320, 304, 287.
EI-MS: m/z 302 ([M+H-Ac]⁺, C₁₆H₁₄O₆), 214
DCI-MS m/z 362 [M+NH₄]⁺, 345 ([M+H]⁺; C₁₈H₁₇O₇), 320, 304, 287.
UV λmax (nm): 230, 274, 295 (sh)
EI-MS: m/z 277 ([M-CH₃]⁺; C₁₄H₁₀ClO₄), 218, 203
DCI-MS: m/z 310 [M+NH₄]⁺, 293 ([M+H]⁺; C₁₅H₁₄ClO₄), 261
¹³C-NMR: 177 (s, C-1); 169 (s, C-9); 156 (s, C-4a); 153 (s, C-3); 146 (s, C-8); 132 (d, C-2); 130 (d, C-5); 128 (d, C-6); 128 (s, C-7); 127 (s, C-8a); 105 (d, C-10); 59 (q, -OCH₃); 41 (s, C-4); 30 (q, 4-CH₃); 30 (q, 4-CH₃) ppm.
EI-MS: m/z 277 ([M-CH₃]⁺; C₁₄H₁₀ClO₄), 218, 203
DCI-MS: m/z 310 [M+NH₄]⁺, 293 ([M+H]⁺; C₁₅H₁₄ClO₄), 261
¹³C-NMR: 177 (s, C-1); 169 (s, C-9); 156 (s, C-4a); 153 (s, C-3); 146 (s, C-8); 132 (d, C-2); 130 (d, C-5); 128 (d, C-6); 128 (s, C-7); 127 (s, C-8a); 105 (d, C-10); 59 (q, -OCH₃); 41 (s, C-4); 30 (q, 4-CH₃); 30 (q, 4-CH₃) ppm.
UVmax (nm): 227, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 277 ([M-CH₃]⁺; C₁₄H₁₀ClO₄), 218, 203
DCI-MS: m/z 310 (M⁺; C₁₅H₁₅ClO₅), 293 ([M-H₂O+H]⁺; C1₁₅H₁₄ClO₄), 261.
EI-MS: m/z 277 ([M-CH₃]⁺; C₁₄H₁₀ClO₄), 218, 203
DCI-MS: m/z 310 (M⁺; C₁₅H₁₅ClO₅), 293 ([M-H₂O+H]⁺; C1₁₅H₁₄ClO₄), 261.
UVmax (nm): 225, 250 (sh), 295
EI-MS: m/z 258 (M⁺; C₁₄H₁₀O₅), 214 ([M-CO₂]⁺; C₁₃H₁₀O₃)
DCI-MS: m/z 276 [M+NH₄]⁺, 259 ([M+H]⁺, C₁₄H₁₁O₅), 245.
EI-MS: m/z 258 (M⁺; C₁₄H₁₀O₅), 214 ([M-CO₂]⁺; C₁₃H₁₀O₃)
DCI-MS: m/z 276 [M+NH₄]⁺, 259 ([M+H]⁺, C₁₄H₁₁O₅), 245.
UVmax (nm): 224, 250 (sh), 295
EI-MS m/z 258 ([M-H-OCH₃]⁺; C₁₄H₁₀O₅), 214 (C₁₃H₁₀O₃)
DCI-MS: m/z 308 [M+NH₄]⁺, 291 [(M+H)⁺, C₁₅H₁₅O₆], 276.
EI-MS m/z 258 ([M-H-OCH₃]⁺; C₁₄H₁₀O₅), 214 (C₁₃H₁₀O₃)
DCI-MS: m/z 308 [M+NH₄]⁺, 291 [(M+H)⁺, C₁₅H₁₅O₆], 276.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I)/(Ia)-(Io)
können als Wirkstoffe in Arzneimitteln eingesetzt werden. Ihre Wirkung besteht
in der Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A. Sie sind somit geeignet zur
Behandlung und Prophylaxe von Erkrankungen, die durch Phosphorylierungs
prozesse hervorgerufen werden. Bevorzugt ist die Behandlung und Prophylaxe
von Atemwegserkrankungen, insbesondere von Asthma und chronischer Bron
chitis, sowie von Herz-/Kreislauf-Erkrankungen und Erkrankungen des ZNS.
Proteinphosphatasen aus Kaninchenmuskel wurden nach der Vorschrift von A. de
Guzman et al. (Methods Enzymmology 159, (1988) 356 ff.) isoliert. Zum
Screening wurde die CI-Fraktion nach der DEAE-Säulentrennung verwendet. Als
Substrat diente Phosphorylase a (Sigma). Gemessen wurde die Inaktivierung von
Phosphorylase a durch PP infolge Dephosphorylierung zur (enzymatisch in
aktiven) Phosphorylase b. Die (verbleibende) Phosphorylase a-Aktivität wird in
einer nachgeschalteten Reaktion (Glycogenspaltung zu Glucose-6-Phosphat, Er
fassung des Glucose-6-Phosphats über Oxidation mit NADP, Messung des dabei
entstehenden NADPH) erfaßt. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden
in diesem Test IC₅₀-Werte von etwa 5 bis 50 µM gefunden.
Zur vorliegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen, die
neben inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und Träger
stoffen eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formeln (I)/(Ia)-(Io)
enthalten, oder die aus einem oder mehreren Wirkstoffen der Formeln (I)/(Ia)-(Io)
bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen.
Die Wirkstoffe der Formeln (I)/(Ia)-(Io) sollen in diesen Zubereitungen in einer
Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 95 Gew.-%, der
Gesamtmischung vorhanden sein.
Neben den Wirkstoffen der Formeln (I)/(Ia)-(Io) können die pharmazeutischen
Zubereitungen auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können in üblicher Weise
nach bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise mit dem oder den
Hilfs- oder Trägerstoffen.
Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den oder die Wirkstoffe der
Formeln (I)/(Ia)-(Io) in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg,
bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 1 mg/kg bis 50 mg/kg Körpergewicht je 24
Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung des
gewünschten Ergebnisses zu verabreichen.
Es kann aber gegebenenfalls vorteilhaft sein, von den genannten Mengen
abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und vom Körpergewicht des
behandelten Objekts, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament
der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und Applikation,
sowie dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichung erfolgt.
150 ml sterile Nährlösung (10 g Malzextrakt (Merck 11929), 4 g D-Glucose
(Merck 15633), 4 g Hefeextrakt (Merck 11926); ad 1000 ml Leitungswasser, (20
Minuten bei 121°C autoklaviert) in 1000 ml Erlenmeyerkolben werden mit 2
Impfösen einer gut gewachsenen Kultur des Stammes Hyphoderma radula DSM
10135 beimpft. Bei einer Schüttelfrequenz von 145 UPm auf der rotierenden
Schüttelmaschine wird bei 23°C 384 Stunden fermentiert.
3-mal werden 10 l Nährlösung wie in Beispiel 1, der vor Sterilisation 10 ml
Antischaummittel SAG 5693 (Union Carbide) zugesetzt wurden, in einem
Rührkessel 60 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach Temperieren auf 23°C wird
mit je 150 ml einer wie in Beispiel I hergestellten Vorkultur beimpft. Bei einer
Temperatur von 23°C, einer Rührdrehzahl von 400 Upm und einer Belüftung von
4 l Luft/Minute wird 282 Stunden fermentiert, anschließend wird die Kulturbrühe
der drei 10 l-Ansätze vereinigt.
Die gemäß Beispiel II erhaltene Kulturbrühe der drei 10 l-Fermentationen wird
durch Zentrifugation (2000 KPm) in Mycel und Überstand separiert.
30 l Überstand werden in drei 10 l-Portionen über eine Säule (Lewapol CA 9221;
10 × 50 cm) mit einer Flußrate von 10 ml/min. filtriert und mit 10 l Wasser und
10 l 50% Methanol nachgewaschen. Der Wirkstoff wird mit 10 l 100% Metha
nol desorbiert, die Lösung im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.
Das Mycel von 30 l-Kulturbrühe wird in 3 l Aceton/Wasser 9 : 1 aufgenommen
und für 2 min. in Ultraturax behandelt. Anschließend wird unter Zugabe von
Celite gefiltert. Dieser Arbeitsgang wird 2 × wiederholt. Das Filtrat wird im
Vakuum eingeengt und das Restwasser 3 × mit je 2 l Ethylacetat extrahiert. Die
org. Phase wird eingeengt zur Trockne. Insgesamt wird 250 g Rohprodukt
erhalten mit ca. 1% Wirkstoffgehalt.
10 g Rohprodukt aus dem vorangehenden Schritt werden in 50 ml Wasser gelöst
und an einer Säule 15 × 80 cm mit Pharmacia-Gel LH 20 chromatographiert mit
einer Flußrate von 3 l/h. Die Wirkstoff enthaltenden Fraktionen werden
gesammelt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt
insgesamt 2,5 g Feststoff mit 4% Wirkstoffgehalt, wobei sich die homologen
Substanzen in verschiedenen Fraktionen anreichern lassen.
100 mg Rohprodukt aus dem vorangehenden Schritt werden in 1 ml Methanol
gelöst und mittels präp. HPLC weiter aufgetrennt. Die Trennung erfolgt mit einer
Stahlsäule 250/6 mm, gefüllt mit C 18-modifiziertem Kieselgel Nucleosil 7 µm
(Firma Machery Nagel). Die Elution erfolgt mit einem Acetonitril-Gradient
(ACN) gegen 0,05% Trifluoressigsäure in Wasser mit folgendem Programm: 3
min isokratisch 10% ACN, in 18 min Gradient auf 75% ACN, 5 min isokratisch
75% ACN, in 1 min Gradient auf 100% ACN bei einer Flußrate von 12 ml/min.
Die Detektion erfolgt bei 210 nm mit einer präp. Durchflußzelle von 0,4 mm
Schichtdicke.
Die Trennung wird mit analytischer HPLC verfolgt, die einheitlichen
Wirkstoffraktionen werden vereinigt und die Substanzen am Rotationsverdampfer
eingeengt und gefriergetrocknet.
Die Ausbeute beträgt 4 mg Feststoff der Verbindung (Ia) mit 95%
Wirkstoffgehalt. Es schließen sich weitere HPLC-Reinigungsschritte mit den
entsprechenden Vor- und Nachfraktionen in analoger Weise an.
Die Ausbeute an Nebenkomponenten beträgt:
0,5 mg Feststoff (Ib)
0,08 mg Feststoff (Ic)
0,03 mg Feststoff (Id)
0,2 mg Feststoff (Ie)
0,4 mg Feststoff (If)
0,5 mg Feststoff (Ig)
0,03 mg Feststoff (Ih).
0,08 mg Feststoff (Ic)
0,03 mg Feststoff (Id)
0,2 mg Feststoff (Ie)
0,4 mg Feststoff (If)
0,5 mg Feststoff (Ig)
0,03 mg Feststoff (Ih).
Das Mycel (ca. 15 l) wird mit 20 l Aceton/Wasser (4 : 1) versetzt, 1 h gerührt und
anschließend über Celite abgefiltert. Nach Abdampfen des Acetons unter
verringertem Druck wird der wäßrige Rückstand mit Ethylacetat extrahiert (2 × 20 l).
Nach Eindampfen des organischen Lösemittels erhält man einen öligen
Rückstand (90 g).
wäßrige Proben:
Die Kulturbrühe wird 15 min bei 13000 U/min zentrifugiert, 10 ml des Überstandes abgenommen, über eine SPE-Säule C18 1 ml filtriert und mit 1 ml Wasser nachgewaschen. Die Säule darf dabei nicht trocken werden. Der Wirkstoff wird mit 1 ml Acetonitril/Puffer 1 : 1 desorbiert, und das Desorbat mittels HPLC analysiert.
Puffer: 0. 1 M Na-Perchlorat und 0.1% Phosphorsäure in Wasser;
lösemittelhaltige Proben:
Lösemittelhaltige Proben werden zum Abtrennen des Lösemittelanteils im Vakuum eingeengt, im ursprünglichen Volumen wieder aufgenommen und die wäßrige Proben analysiert.
Die Kulturbrühe wird 15 min bei 13000 U/min zentrifugiert, 10 ml des Überstandes abgenommen, über eine SPE-Säule C18 1 ml filtriert und mit 1 ml Wasser nachgewaschen. Die Säule darf dabei nicht trocken werden. Der Wirkstoff wird mit 1 ml Acetonitril/Puffer 1 : 1 desorbiert, und das Desorbat mittels HPLC analysiert.
Puffer: 0. 1 M Na-Perchlorat und 0.1% Phosphorsäure in Wasser;
lösemittelhaltige Proben:
Lösemittelhaltige Proben werden zum Abtrennen des Lösemittelanteils im Vakuum eingeengt, im ursprünglichen Volumen wieder aufgenommen und die wäßrige Proben analysiert.
Rohprodukte aus Zwischenstufen der Aufarbeitung werden 5 mg/ml in Methanol
gelöst und in dem gleichen System analysiert.
Die Trennung erfolgt mit einer Säule 250 × 3,9 mm, gefüllt mit
C18-modifiziertem Kieselgel Nucleosil 100 C18 5 µ (Macherey Nagel). Die Elution
erfolgt mit einem Acetonitril-Gradient gegen 0,05% Phosphorsäure in Wasser mit
folgendem Programm: 1 min isokratisch 10% Acetonitril, in 8 min. Gradient auf
100% Acetonitril, bei einer Flußrate von 0,75 ml/min. Die Detektion erfolgt bei
210 nm. Das Injektionsvolumen beträgt 5 µl.
Umsetzung mit Carbonsäureanhydriden:
Zu einer Lösung von Ia in Acetanhydrid gibt man Dimethylaminopyridin (DMAP) umrührt bei Raumtemperatur über Nacht. Anschließend wird Eiswasser zugegeben und nach 3 h Rühren mit CH₂Cl₂ extruhiert. Nach Eindampfen der org. Phase zur Trockne werden mittels HPLC (RP-18, CH₃CN/0.05% TFA), sukzessive die Verbindungen Ii, Ij und Ik isoliert.
Zu einer Lösung von Ia in Acetanhydrid gibt man Dimethylaminopyridin (DMAP) umrührt bei Raumtemperatur über Nacht. Anschließend wird Eiswasser zugegeben und nach 3 h Rühren mit CH₂Cl₂ extruhiert. Nach Eindampfen der org. Phase zur Trockne werden mittels HPLC (RP-18, CH₃CN/0.05% TFA), sukzessive die Verbindungen Ii, Ij und Ik isoliert.
Umsetzung mit Salzsäure:
Zu einer Lösung von Ia in Methanol setzt man bei Raumtemperatur wenig konzentrierte Salzsäure zu. Nach Rühren über Nacht wird zur Trockne eingedampft und mit Hilfe der HPLC (RP-18, CH₃CN/0.05% TFA) zwei Reaktionsprodukte, Il und Im, abgetrennt.
Zu einer Lösung von Ia in Methanol setzt man bei Raumtemperatur wenig konzentrierte Salzsäure zu. Nach Rühren über Nacht wird zur Trockne eingedampft und mit Hilfe der HPLC (RP-18, CH₃CN/0.05% TFA) zwei Reaktionsprodukte, Il und Im, abgetrennt.
Eine Lösung von Ia in CH₂Cl₂ wird nach Kühlung im Eisbad mit einem
Überschuß an Dess-Martin-Reagenz versetzt. Nach 5 h Rühren bei 0°C wird eine
zweite Portion Oxidationsreagenz zugeführt und 15 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Eindampfen zur Trockne löst man in CH₃CN an und filtriert. Das
Filtrat wird im Vakuum aufkonzentriert und über HPLC aufgetrennt.
Neben zwei Produkten In, Io erhält man auch Edukt Ia zurück.
Claims (6)
1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
in welcher
A und D gemeinsam einen Rest der Formel bilden, worin
R⁵ und R⁶ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden,
oder
R⁵ Wasserstoff bedeutet
und
R⁶ Hydroxy, Methoxy oder Acetoxy bedeutet,
oder
A für Methoxycarbonyl steht
und
D für Carboxy steht,
R¹ für Wasserstoff oder Hydroxy steht,
R² für Wasserstoff; Hydroxy, Acetoxy oder Chlor steht,
oder im Fall einer Einfachbindung zwischen den Positionen CR¹/CR²
R¹ und R² gemeinsam einen Rest der Formel bilden,
R³ und R⁴ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden
oder
R³ für Wasserstoff steht
und
R⁴ für Hydroxy steht
und deren Isomere und Salze.
A und D gemeinsam einen Rest der Formel bilden, worin
R⁵ und R⁶ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden,
oder
R⁵ Wasserstoff bedeutet
und
R⁶ Hydroxy, Methoxy oder Acetoxy bedeutet,
oder
A für Methoxycarbonyl steht
und
D für Carboxy steht,
R¹ für Wasserstoff oder Hydroxy steht,
R² für Wasserstoff; Hydroxy, Acetoxy oder Chlor steht,
oder im Fall einer Einfachbindung zwischen den Positionen CR¹/CR²
R¹ und R² gemeinsam einen Rest der Formel bilden,
R³ und R⁴ gemeinsam eine Oxogruppe (=O) bilden
oder
R³ für Wasserstoff steht
und
R⁴ für Hydroxy steht
und deren Isomere und Salze.
2. Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Verwendung bei der Bekämpfung
von Krankheiten.
3. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von
Arzneimitteln.
4. Arzneimittel enthaltend eine oder mehrere Verbindungen gemäß Anspruch
1.
5. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Klasse der Basidiomyceten
oder deren Mutanten oder Varianten, die die angestrebten Verbindungen
produzieren, kultiviert, die Verbindung(en) aus der Kultur gewinnt und
gegebenenfalls derivatisiert.
6. Mikroorganismen des Stammes Hyphoderma radula (WP 2184) mit der
Hinterlegungsnummer DSM 10135.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19611366A DE19611366A1 (de) | 1996-03-22 | 1996-03-22 | Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische Derivate |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19611366A DE19611366A1 (de) | 1996-03-22 | 1996-03-22 | Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische Derivate |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19611366A1 true DE19611366A1 (de) | 1997-09-25 |
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ID=7789116
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19611366A Withdrawn DE19611366A1 (de) | 1996-03-22 | 1996-03-22 | Neue Naturstoffe der Hyphodermine und chemische Derivate |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19611366A1 (de) |
-
1996
- 1996-03-22 DE DE19611366A patent/DE19611366A1/de not_active Withdrawn
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| 8130 | Withdrawal |