DE19607202A1

DE19607202A1 - Reagenzienkit zur Präparation von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE19607202A1
Application number: DE19607202A
Authority: DE
Inventors: Uwe Dr Michel; Andreas Rau; Peter Dr Rieckmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1996-02-26
Publication date: 1997-08-28

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolie rung von DNA enthaltenden und RNA enthaltenden Fraktionen aus Zellen sowie einen Reagenzienkit zur Gewinnung und Auftrennung von RNA enthaltenden und DNA enthaltenden Fraktionen aus Zel len und Zellen enthaltenden biologischen Proben.

Die Entwicklung von Radioimmunoassays und ELISAs hat in den letzten Jahren eine umfangreiche Diagnostik auf Blutbasis ermöglicht. So konnten beispielsweise aus Blut von Patienten und Versuchstieren auf Proteinebene der Hormonstatus und Mar kermoleküle von Erkrankungen bestimmt werden. Da jedoch bei auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen basierenden Bestim mungsverfahren für jedes Antigen ein individuell abgestimmter Assay und zudem oftmals ein antigenspezifisches Extraktions verfahren erforderlich ist, ist die Entwicklung von Radio immunoassays (RIAs) und ELISAs aufwendig. Weiterhin können die antigenen Eigenschaften eines Analyten Ähnlichkeiten mit denen verwandter Antigene aufweisen, wodurch es zu unerwünschten Kreuzreaktionen kommen kann, die die Zuverlässigkeit und Sen sitivität von solchen Tests begrenzen. Zudem sind diese Nach weisverfahren zumeist nicht in der Lage, kurzzeitige Verände rungen oder frühe Stadien einer Entwicklung, in denen nur marginale Veränderungen gegenüber dem Ausgangszustand auftre ten, zu erfassen.

Aufgrund der eingeschränkten Einsatzmöglichkeiten von Nach weisverfahren auf Peptidbasis wurden sowohl für die Diagnostik als auch für die klinische und grundlagenorientierte Forschung Diagnoseverfahren auf RNA-Basis entwickelt, die herkömmlichen Peptidnachweisverfahren an Sensitivität und Spezifität weit überlegen sind.

Solche auf RNA basierende Diagnoseverfahren beruhen im allge meinen auf der Verwendung von markierten sequenzspezifischen Sonden und setzen die Extraktion quantitativ und qualitativ bestimmbarer RNA aus einer Probe voraus. Aufgrund dieser not wendigen Voraussetzung konnte jedoch bisher die RNA-Diagnostik nicht routinemäßig für periphere mononukleäre Blutzellen (PMNB) angewendet werden, da kein ausreichend zuverlässiges, routinemäßig einsetzbares RNA-Extraktionsverfahren aus Voll blut bekannt war.

Die Diagnostik mittels RNA aus peripheren mononukleären Blut zellen wäre aber interessant, da damit u. a. hämatologische Erkrankungen, endogene Retroviren, Viren oder die Zytokinex pression von Blutzellen bei entzündlichen/immunologischen Erkrankungen nachgewiesen werden könnten.

Schwierigkeiten bei der Extraktion von RNA aus PMNB bereitet vor allem die Tatsache, daß der überwiegende Anteil (50-70%) der PMNB Granulozyten sind, die einen hohen RNAse-Gehalt und einen niedrigen RNA/DNA-Quotienten aufweisen. Die Verwen dung von herkömmlichen Extraktionsverfahren, in denen stark chaotrope Reagenzien wie z. B. Guanidiniumisothiocyanat einge setzt werden, führt bei der Extraktion von RNA aus PMNB zu unakzeptabel hohen DNA-Anteilen in der extrahierten RNA. Für Routineverfahren ist jedoch eine aufwendige Reinigung der mit DNA verunreinigten extrahierten RNA, beispielsweise über einen Cäsiumchloridgradienten, nicht praktikabel.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Bereitstel lung eines Verfahrens, das es ermöglicht, RNA und DNA weitge hend getrennt voneinander aus biologischen Proben und insbe sondere aus Blut zu extrahieren.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Trennung und Isolierung von DNA enthaltenden und RNA ent haltenden Fraktionen aus in biologischen Proben enthaltenen Zellen, worin man die Zellen mit einer Lösung I behandelt, die eine Lyse der Zellen bewirkt, wobei die Zellkerne jedoch intakt bleiben und durch Zentrifugation die DNA enthaltenden Zellkerne von der überstehenden, RNA enthaltenden Lösung trennt. Bevorzugt umfaßt die Lösung I ein Detergenz, ein Reduktionsmittel, dazu optional einen RNAse-Inhibitor und einen Vanadylribonukleosidkomplex neben weiteren, gegebenen falls vorhandenen üblichen Puffersubstanzen und Hilfsstoffen. Zur Lyse wird bevorzugt eine Lösung I verwendet, die 5 bis 50 mM TRIS-HCl pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40 (NP-40), 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibitor und 0 bis 50 mM Vana dylribonucleosidkomplex umfaßt. Besonders bevorzugt enthält die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 M bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren können Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe extrahiert und in eine RNA- und eine DNA-Fraktion aufgetrennt werden. Es wird eine ausreichende Trennung von DNA und RNA auch ohne den Einsatz zusätzlicher arbeitsintensiver Reinigungsschritte erreicht. Es ist möglich, die RNA im wesentlichen frei von DNA-Verunreinigungen zu er halten. Mittels an den getrennten Fraktionen durchgeführter Konzentrationsbestimmungen, z. B. mittels optischer Dichtemes sungen, können die in einer biologischen Probe vorliegenden Mengen der jeweiligen Nukleinsäuren genau bestimmt werden. Dadurch wird eine quantitative Nukleinsäurediagnostik ermög licht.

Weiterhin ist die Qualität sowie die Quantität der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen RNA gegenüber RNA aus herkömmlichen Verfahren mit ähnlichem Zeit- und Arbeitsaufwand deutlich verbessert.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht zudem die Extraktion und Trennung und Isolierung von RNA und DNA in kurzer Zeit und schafft somit die Voraussetzungen für eine routinemäßige Nukleinsäurediagnostik.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Gewinnung von Nu kleinsäuren aus Zellen biologischer Proben. Die Zellen können dabei aus Körperflüssigkeiten isoliert werden, oder es werden Zellen aus Zellkulturen oder Zellsuspensionen verwendet. Be vorzugt werden als Proben Blut, Blutzellen oder Zellkulturen und besonders bevorzugt Vollblut verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die zellulären Bestandteile einer biologischen Probe, z. B. die Zellen von Vollblut, aus der Probe abgetrennt. Man geht dabei von Blut aus oder verwendet die Blutzellen nach einer Plasma separation, die nach an sich bekannten Methoden ausgeführt werden kann. Die Abtrennung kann beispielsweise durch Zentri fugation in einer gekühlten Zentrifuge bei 1000 bis 2000 × g für 1 bis 5 Minuten erfolgen. Der Überstand wird dann abge trennt, und die zellulären Bestandteile werden vorzugsweise in einer Pufferlösung gewaschen. Dazu werden die zellulären Be standteile zunächst in einer Pufferlösung, die bevorzugt 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM Na-EDTA umfaßt, resuspendiert. Besonders bevorzugt enthält die Puffer lösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 mM Na-EDTA. Diese Lösung bewirkt, daß rote Blutkörperchen, die für die RNA-Isolierung unbrauchbar sind, lysiert werden und nach erneuter Zentrifugation lediglich die weißen Blutzellen für die weiteren Verfahrensschritte verbleiben. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, kleine Blut mengen (bis ca. 500 µl) direkt mit dieser Pufferlösung (Ver hältnis ca. 1 : 2 bis 1 : 50) zu versetzen, wobei ebenfalls der Effekt erzielt wird, daß rote Blutzellen lysieren und bei einer nachfolgenden Zentrifugation lediglich die RNA- und DNA-haltigen weißen Blutzellen als Pellet erhalten werden.

Anschließend werden die zellulären Bestandteile abgetrennt. Dies geschieht bevorzugt dadurch, daß die Suspension für 1 bis 10 Minuten auf Eis gelagert wird und anschließend bei 1000 bis 2000 × g zentrifugiert wird. Der wäßrige Überstand wird daraufhin entfernt, ohne das Zellpellet zu zerstören.

Die auf diese Weise aus Blut erhaltenen Zellen oder Zellen aus Zellkulturen werden dann mit einer Lösung behandelt, die eine Lyse der Zellen bewirkt, bei der die Zellkerne intakt bleiben. Anschließend können DNA und RNA getrennt werden, da sich die DNA in den bei der Lyse intakt gebliebenen Zellkernen befin det, während die RNA in der Lösung vorliegt. Die Abtrennung erfolgt bevorzugt in einer gekühlten Zentrifuge bei 500 bis 3000 × g, vorzugsweise 1000-1500 × g für 3 bis 5 Minuten. Das Pellet der Zentrifugation, das die Zellkerne der Zellen (z. B. Blutzellen) und somit die DNA enthält, kann direkt wei terverarbeitet werden oder bei 20°C oder -80°C gelagert wer den.

Erfindungsgemäß bevorzugt wird nach der Trennung von DNA ent haltenden Zellkernen und RNA enthaltender Lösung die letztere mit einer Lösung II versetzt, welche ein Denaturierungsmittel, ein Detergens und weitere übliche Pufferkomponenten umfaßt. Der die RNA enthaltende Überstand wird bevorzugt mit etwa dem gleichen Volumen an Lösung II versetzt. Die Lösung II kann beispielsweise 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdo decylsulfat (SDS), 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 10 mM TRIS-HCl pH 7 bis 8 umfassen. Bevorzugt enthält die Lösung II 6 bis 8 M Harnstoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na-EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8.

Aus dem gegebenenfalls mit Lösung II versetzten Überstand kann die RNA nach an sich bekannten Methoden gewonnen werden. Dazu wird beispielsweise das gesamte Flüssigkeitsvolumen mit einer geeigneten RNA-bindenden Matrix zusammengebracht, von der die RNA dann selektiv wieder abgewaschen werden kann. Es ist auch möglich, die RNA auf herkömmliche Weise mit einem etwa glei chen Volumen eines Lösungsmittels, bestehend aus Phenol/Chlo roform/Isoamylalkohol, beispielsweise mit einem Volumenver hältnis von etwa 25/24/1, und anschließend mit einem etwa gleichen Volumen Chloroform/Isoamylalkohol, beispielsweise mit einem Volumenverhältnis von etwa 24/1 zu extrahieren. Die RNA kann dann in einem 2- bis 2½fachen Volumen 100%igen Ethanol oder in einem etwa gleichen Volumen Isopropanol gefällt wer den. Die Konzentrierung des Präzipitats kann durch Zentrifuga tion bei 10 000 bis 100 000 × g für 5 bis 30 Minuten erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Gewinnung von Nukleinsäuren aus Probenvolumen zwischen 10 µl und 10 ml, ohne daß ihre Integrität beeinträchtigt wird, und ermöglicht eine anschließende enzymatische biochemische und molekularbiolo gische Verarbeitung der extrahierten Moleküle. Bevorzugt wird ein Probevolumen zwischen 50 µl und 5 ml verwendet.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung einen Reagenzienkit zur Auftrennung von DNA enthaltenden und RNA enthaltenden Fraktion aus Zellen oder Zellen enthaltenden biologischen Proben, wobei der Reagenzienkit eine Lösung I enthält, umfas send ein Detergens, ein Reduktionsmittel, optional einen RNAse-Inhibitor und einen Vanadylribonucleosidkomplex. Bevor zugt umfaßt die Lösung I 5 bis 20 mM TRIS-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse- Inhibitor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosidkomplex. Beson ders bevorzugt enthält die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 M bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40.

Bevorzugt enthält der Reagenzienkit zusätzlich eine Lösung II, umfassend 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecyl sulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, mit der die abgetrennte RNA behandelt werden kann. Bevorzugt enthält die Lösung II 6 bis 8 M Harn stoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na- EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8. Weiterhin kann eine Pufferlösung, die bei der Gewinnung von Zellen aus Blut vor teilhaft verwendet werden kann, umfassend 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA enthalten sein. Diese Pufferlösung bewirkt eine Lyse von roten Blutzellen, weiße Blutzellen bleiben intakt. Besonders bevorzugt enthält die Pufferlösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 mM Na-EDTA.

Weiterhin kann der Reagenzienkit Mittel zur Extraktion von RNA aus wäßrigen Flüssigkeiten, z. B. eine RNA-bindende Matrix oder geeignete Lösungsmittelgemische, wie beispielsweise ein Ge misch aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumen verhältnis von 25/24/1 und ein Gemisch aus Chloroform/Iso amylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 24/1 enthalten.

Die Erfindung umfaßt weiterhin die Verwendung eines solchen Reagenzienkits in einem wie oben beschriebenen Verfahren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläu tert:

Beispiel 1 Gewinnung von Plasma, Zellkernpellets mit genomischer DNA und cytoplasmatischer RNA aus 5 ml Vollblut

5 ml EDTA-Vollblut wurden für 3 min bei 1200 × g bei 4°C in 15 ml-Röhrchen zentrifugiert und der plasmatische Überstand entfernt. Dieser kann bei -20°C zur weiteren Verarbeitung, z. B. zur Proteinbestimmung, gelagert werden.

Das das Pellet enthaltende Röhrchen wurde auf 14 ml mit einer Pufferlösung, umfassend 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA, aufgefüllt, gut durchmischt und für 5 min auf Eis gestellt. Der Überstand wurde vollständig abdekan tiert und das verbleibende Zellpellet wurde in 1 ml einer Lösung I, umfassend 5 bis 20 mM TRIS-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet-P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibi tor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosidkomplex resuspendiert. Die Suspension wurde für 5 min bei 1700 × g zentrifugiert. Das Zellkernpellet und der Überstand wurden getrennt. Das Zell kernpellet enthält die genomische DNA und kann bis zur weite ren Verarbeitung, z. B. für DNA-Analysen, bei -20°C gelagert werden.

Der Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben, das 1 ml Lösung II, umfassend 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecylsulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, enthielt. Die so entstandene Lösung wurde zur RNA-Gewinnung den üblichen Extraktions- und Fällungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln unterzogen.

Alternativ dazu kann der Überstand von Lösung I, gegebenen falls zusammen mit Lösung II zur RNA-Gewinnung auch mit einer geeigneten RNA-bindenden Matrix zusammengebracht werden, von der die RNA durch Waschschritte wieder eluiert wird.

Beispiel 2 Gewinnung von Zellkernpellets mit genomischer DNA und cyto plasmatischer RNA aus 100 µl Vollblut und Isolierung der RNA hieraus

Durch dieses Beispiel soll gezeigt werden, daß das erfindungs gemäße Verfahren auch die Verwendung von Mikromengen an Blut als Ausgangsmaterial erlaubt.

Es wurden die gleichen Lösungen I, II und Pufferlösung wie in Beispiel 1 verwendet.

In ein geeignetes Reaktionsgefäß auf Eis oder bei Raumtempera tur wurden 1,5 ml Pufferlösung eingebracht, zu der 100 µl EDTA-Vollblut pipettiert wurden. Das Blut wurde sorgfältig mit der Lösung durchmischt und das Gemisch 5 Minuten auf Eis gela gert. Die Zellsuspension wurde anschließend für 3 min 1000 × g bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde abgetrennt und in 700 µl Lösung I (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,65% NP-40) resuspendiert. Die Suspension wurde bei 1700 × g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand und das Zell kernpellet wurden getrennt und das Zellkernpellet bei -80°C zur weiteren Verarbeitung, z. B. für DNA-Analyse, gelagert. Der Überstand wurde in ein Reaktionsgefäß mit dem gleichen Volumen wassergesättigtes Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 25/24/1 gegeben, 1 Minute geschüttelt (Vortex) und für 3 Minuten bei 12 000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde anschließend mit dem gleichen Volu men Chloroform/Isoamylalkohol mit einem Volumenverhältnis von 24/1 zusammengegeben, 30 Sekunden geschüttelt und 5 Minuten bei 15 000 × g zentrifugiert. Der wäßrige Überstand wurde mit gleichem Volumen Lösung II (7 M Harnstoff, 1% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) versetzt, gevortext und sofort nach Zugabe des 2½fachen Volumens an 100%igem Ethanol 20 Minuten lang bei 15 000 × g und 4°C zentrifugiert.

Beispiel 3 Gewinnung von cytoplasmatischer RNA aus Zellkulturen

Eine in 6-Well-Platten wachsende Zellkultur wurde mit einer geeigneten Waschlösung gewaschen, von der gesamten Flüssigkeit befreit und anschließend mit 200 µl Lösung I überschichtet. Die Zellkulturplatten wurden für 10 Minuten auf einem Rota tionsschüttler geschüttelt und die Flüssigkeit anschließend vollständig abpipettiert. Die weitere Verarbeitung erfolgte, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur Trennung und Isolierung von DNA enthalten den und RNA enthaltenden Fraktionen aus in biologischen Proben enthaltenen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einer Lösung I behandelt, die eine Lyse der Zellen bewirkt, wobei die Zellkerne jedoch in takt bleiben, und durch Zentrifugation die DNA enthalten den Zellkerne von der überstehenden, RNA enthaltenden Lösung trennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung I ein Detergens und ein Reduktionsmittel neben weiteren gegebenenfalls vorhandenen üblichen Puf fersubstanzen und Hilfsstoffen und optional einen RNAse- Inhibitor und einen Vanadylribonucleosidkomplex enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung I 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1 & Nonidet- P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibitor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosid komplex enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40 enthält.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Trennung von DNA enthaltenden Zellkernen und RNA enthaltender Lösung die letztere mit einer Lösung II versetzt, welche ein Denaturierungsmittel, ein Deter gens und weitere übliche Pufferkomponenten enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung II, enthaltend 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecylsulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM TRIS-HCl, pH 7 bis 8 verwen det.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung II 6 bis 8 M Harnstoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na-EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8 enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die RNA enthaltende überstehende Lösung mit etwa dem gleichen Volumen an Lösung II versetzt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur RNA-Abtrennung die überstehende Lösung bzw. die überstehende Lösung, welche mit Lösung II vermischt wurde, mit einer RNA-bindenden Matrix zusammenbringt, von der RNA selektiv wieder abgewaschen werden kann, und auf diese Weise die RNA isoliert.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur RNA-Abtrennung die überstehende Lösung bzw. die überstehende Lösung, welche mit Lösung II vermischt wurde, in an sich bekannter Weise extrahiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und an schließend mit Chloroform/Isoamylalkohol, und zwar jeweils mit etwa gleichem Volumen, extrahiert.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen, welche aus Körperflüssigkeiten isoliert wurden, oder Zellen aus Zellkulturen oder Zellsuspensio nen verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man von Blut ausgeht und nach an sich bekannten Me thoden eine Plasmaseparation durchführt und die Blutzel len verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Plasmaabtrennung die Blutzellen mit einer Pufferlösung wäscht.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man von Vollblut ausgeht und dieses mit einer Puf ferlösung, enthaltend 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA, versetzt und danach durch Zentrifugation die weißen Blutzellen isoliert und weiter verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 Na-EDTA enthält.

18. Reagenzienkit zur Gewinnung und Auftrennung von DNA ent haltenden und RNA enthaltenden Fraktionen aus aus biolo gischen Proben erhaltenen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung I, umfassend ein Detergens, ein Reduk tionsmittel und optional einen RNAse-Inhibitor und/oder einen Vanadylribonucleosidkomplex, enthalten ist.

19. Reagenzienkit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung I 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 9, 0,1 bis 1 M NaCl, 0,5 bis 4 mM MgCl₂, 0,3 bis 1% Nonidet- P-40, 0 bis 200 mM Dithiothreitol, 0 bis 3000 U placentären RNAse-Inhibitor und 0 bis 50 mM Vanadylribonucleosid komplex enthält.

20. Reagenzienkit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung I 6 bis 14 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8, 0,12 bis 0,18 M NaCl, 1 bis 2 mM MgCl₂ und 0,3 bis 1% NP-40 enthält.

21. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß er des weiteren eine Lösung II umfaßt, welche 5 bis 8,5 M Harnstoff, 0,1 bis 3% Natriumdodecylsulfat, 0,2 bis 1 M NaCl, 2 bis 20 mM EDTA und 5 bis 20 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8 enthält.

22. Reagenzienkit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung II 6 bis 8 M Harnstoff, 0,5 bis 2% SDS, 0,3 bis 0,5 M NaCl, 5 bis 15 mM Na-EDTA und 5 bis 10 mM Tris-HCl, pH 7 bis 8 enthält.

23. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine Pufferlösung umfaßt, welche 100 bis 200 mM NH₄Cl, 5 bis 20 mM KHCO₃ und 0,5 bis 2 mM EDTA enthält.

24. Reagenzienkit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung 135 bis 175 mM NH₄Cl, 8 bis 14 mM KHCO₃ und 0,8 bis 1,3 Na-EDTA enthält.

25. Reagenzienkit nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine RNA-bindende Matrix enthält.

26. Verwendung eines Reagenzienkits nach den Ansprüchen 18 bis 25 in einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 17.