DE19607697C2 - Speicherwurzelgewebespezifisches Regulon der Zuckerrübe - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Regulon aus Pflanzen, das ein speicherwurzelgewebespezifisches Expressions­ muster zeigt.

Pflanzen sind häufig stark wechselnden Umweltbedingungen ausge­ setzt. Dabei ist es für die Pflanze von Vorteil, wenn sie rasch sich ändernden Umwelteinflüssen widerstehen kann. Die Adapta­ tion an neue veränderte Umweltbedingungen erfolgt beispiels­ weise über die veränderte Expression verschiedenster Gene. So wird beispielsweise das Sh1-Gen aus Mais unter anaeroben Bedin­ gungen induziert (Rowland et al., Mol. Gen. Genet. 218: 33-40 (1989)). Einen ähnlichen Befund gibt es für die Sucrosesyn­ thasegene der Kartoffel und von Reis (Salanoubat et al., Gene 84: 181-185 (1989) und Wang et al., Plant Mol. Biol. 18: 1191-1194 (1992)). Ein weiterer Umweltfaktor, der zur gesteigerten Expression von Sucrosesynthase führt, ist eine erniedrigte Temperatur (Marafla et al., Gene 88: 167-172 (1990) und Crespi et al., Plant Physiol. 96: 887-891 (1991)). Weiterhin ist eine beschränkte Versorgung mit Kohlenhydraten dafür verantwortlich, daß es zu einer gesteigerten Transkription des Maisgens Sh1 kommt, während das Sus1-Gen unter diesen Bedingungen mit einer verringerten Expressionsrate exprimiert wird (Maas et al., EMBO J. 9: 3447-3452 (1990) und Koch et al, Plant Cell 4: 59-69 (1992)). Für Weizen und Arabidopsis ist weiterhin bekannt, daß eine Kältebehandlung die Sucrosesynthasegene induziert (Marafla et al., Gene 88: 167-172 (1990), Crespi, et al., Plant Physiol. 96: 887-891 (1991) und Martin et al., Plant J. 4: 367-377 (1993)). Das Maisgen Sh1, das sucrosesynthasegen der Kartoffel und das Weizengen Sh1 zeigen eine gesteigerte Expression unter anaeroben Bedingungen (Rowland et al., Mol. Gen. Genet. 218: 33-40 (1989), Salanoubat et al., Gene 84: 181-185 (1989) und Marafla et al., Gene 88: 167-172 (1990)). Schließlich wird das Maisgen Sh1 auch durch eine externe Zufuhr von Sucrose beein­ flußt (Martin et al., Plant J-. 4: 367-377 (1993) und Koch et al., Plant Cell 4: 59-69 (1992)).

Der vorliegenden Erfindung lag das technische Problem zugrunde, ein neues Regulon bereitzustellen, das ein Expressionsmuster aufweist, wie es von keinem der im Stand der Technik offenbar­ ten regulatorischen Elemente bekannt ist und das für die Expression von Genen unter seiner Kontrolle in vorteilhafter Weise eingesetzt werden kann.

Dieses Problem wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Regulon, das in Speicherwurzelgewebe der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.), unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkonzentration in den Wurzel­ zellen, das unter seiner Kontrolle stehende Gen konstitutiv exprimiert, erhältlich durch Absuchen einer genomischen Pflanzen-DNA-Bank mit der Probe SEQ ID No. 1 und Isolieren von positiven Klonen.

Fig. 1 zeigt die Expression des SBSS1-Gens in verschiedenen Geweben der Zuckerrübe B. vulgaris.

Fig. 2 zeigt den Einfluß einer Kältebehandlung auf die Expression des SBSS1-Gens.

Fig. 3 zeigt den Einfluß von Anaerobiose auf die Expression des SBSS1-Gens.

Fig. 4 zeigt den Einfluß verschiedener Zuckerkonzentrationen auf die Expression des SBSS1-Gens.

Im folgenden bedeutet "Regulon" eine DNA-Sequenz, die die Expression eines Gens unter seiner Kontrolle in Abhängigkeit von endogenen und exogenen Faktoren steuert. Zu diesen Faktoren zählen beispielsweise Induktoren, Repressoren und ähnliche DNA- bindende Proteine, wie auch Umwelteinflüsse, wie Tempera­ turänderungen, Änderungen in der Konzentration des Umgebungs­ sauerstoffs, und Gewebeverletzungen oder das Nährstoffangebot. Ein Regulon kann mehrere Elemente, wie Enhancer, Silencer oder Promotoren umfassen. Ein Regulon umfaßt jedoch mindestens ein regulatorisches Element, das für die Transkription des unter seiner Kontrolle stehenden Gens zuständig ist.

Unter "konstitutiv" wird im folgenden verstanden, daß sich die Transkriptionsaktivität des Regulons bei sich ändernden Bedin­ gungen, beispielsweise beim Übergang von Normaltemperatur (ca. 22°C) auf Kälte (ca. 4°C) oder beim Übergang von aeroben zu anaeroben Bedingungen, um weniger als den Faktor 3 ändert. Dem­ zufolge gilt ein Regulon als "induzierbar" bzw. "reprimierbar", wenn sich dessen Transkriptionsaktivität unter Einfluß der induzierenden bzw. reprimierenden Bedingungen um mehr als den Faktor 3 ändert.

Das erfindungsgemäße Regulon zeichnet sich dadurch aus, daß es in Speicherwurzelgewebe zur konstitutiven Expression des unter seiner Kontrolle stehenden Gens führt. In seiner natürlichen Umgebung in dem Genom von Beta vulgaris L. kontrolliert es die Expression des Sucrosesynthasegens SBSS1 (vgl. H. Hesse, Dissertation, Fachbereich Chemie der Freien Universität Berlin, 1993). Dabei ist bemerkenswert, daß das Regulon durch eine Änderung der Sauerstoffkonzentration, wie beispielsweise bei Anaerobiose, nicht in seiner Transkriptionsaktivität beeinflußt wird. Weiterhin führt auch eine Änderung der Umgebungstempera­ tur, beispielsweise die Absenkung der Temperatur von 22°C auf 4°C (d. h. unter Kälteschock) nicht zu einer Veränderung der Expression des Gens unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons in Speicherwurzeln. Schließlich ist das erfindungs­ gemäße Regulon auch konstitutiv transkriptionsaktiv unter den verschiedensten Zuckerkonzentrationen. So führt beispielsweise das Zuführen von Sucrose, Glucose, Fructose, bzw. Mannose zu keiner Veränderung der Expression des durch das erfindungs­ gemäße Regulon kontrollierten Gens.

Der Befund, daß das erfindungsgemäße Regulon in Speicherwurzel­ gewebe in ständig angeschaltetem Zustand vorliegt, unabhängig von den Sauerstoff- und/oder Temperaturbedingungen, sowie der Zuckerkonzentration unterscheidet das erfindungsgemäße Regulon von sämtlich bisher bekannten Elementen, die an der Expression von Pflanzengenen, insbesondere von Sucrosesynthasegenen, beteiligt sind. So sind beispielsweise sämtliche bisher bekannten Promotoren von Sucrosesynthasegenen durch Anaerobiose oder Kälte induzierbar; d. h. diese bekannten Promotoren sind keine konstitutiven Promotoren.

Das erfindungsgemäße Regulon kann beispielsweise aus einer Pflanzen-DNA-Bank isoliert werden, wobei zur Isolierung die DNA-Probe gemäß SEQ ID No. 1 eingesetzt wird. Die zum Absuchen der Bank geeigneten Hybridisierungsbedingungen können vom Fachmann leicht anhand der einschlägigen Literatur, wie beispielsweise Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, ermittelt werden.

Die bei dem Absuchen der genomischen DNA-Bank als positiv mit der Probe identifizierten Klone lassen sich dann auf ihre Expressionseigenschaften hin nach standardverfahren unter­ suchen. So können die mit der Probe hybridisierenden Sequenzen aus den Vektoren, die für das Erstellen der DNA-Bank verwendet wurden, isoliert und in herkömmlichen Expressionskassetten auf ihre die Transkription beeinflussenden Eigenschaften hin unter­ sucht werden.

Zur Untersuchung der Expressionsaktivität der isolierten Frag­ mente können diese in Plasmide eingeführt werden, die zur Transformation von pflanzlichen Zellen geeignet sind, und die stabil in das pflanzliche Genom eingebaut werden. Hierfür kommen beispielsweise die binären Vektoren BIN19 und pBI101, pBI101.2 und pBI101.3 in Betracht. Der Vektor BIN19 wurde von Bevan (Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711-8721) beschrieben und ist kommerziell erhältlich (Clontech Laboratories, Inc., USA). Die Derivate des Vektors pBI101 wurden von Jefferson et al. (Plant Mol. Biol. Rep. 5 (1987), 387-405) beschrieben und sind ebenfalls gewerblich erhältlich (Clontech Laboratories, Inc., USA).

Es können jedoch beliebige Pflanzentransformationsvektoren ver­ wendet werden, in die eine Expressionskassette integriert werden kann, und die die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom ermöglichen. Die Transformationsverfahren für pflanzliche Zellen, beispielsweise unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes, sind dem Fachmann geläufig. Die Verwendung von T-DNA für die Trans­ formation von Pflanzenzellen ist beispielsweise in EP-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46; Ann et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287) beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in Pflan­ zenzellen können beispielsweise Pflanzenexplantate mit Agrobacterium tumefaciens oder A. rhizogenes cokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder suspen­ sionskultivierte Pflanzenzellen) können dann in geeigneten Medien, welche die gewünschten Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten, dann wieder die vollständigen Pflanzen regeneriert werden.

Die so erhaltenen Pflanzen werden auf die Anwesenheit der ein­ geführten DNA untersucht. Üblicherweise enthält die in die Pflanzen eingebrachte DNA weiterhin einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomy­ cin, Hygromycin oder Phosphinotricin, verleiht. Aus den trans­ formierten Zellen werden dann in herkömmlicher Weise die trans­ genen Pflanzen erhalten (vgl. McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die erhaltenen transgenen Pflanzen können gegebenenfalls auch mit Pflanzen eines anderen Genotyps weiter gekreuzt werden.

Schließlich können dann die verschiedenen Pflanzengewebe daraufhin untersucht werden, ob das eingebrachte DNA-Fragment das Expressionsmuster des erfindungsgemäßen Regulons aufweist. Dabei kann als Indikator für die Expressionsaktivität des ein­ gebrachten Fragments ein beliebiges Reportergen verwendet werden, das unter der Transkriptionskontrolle des zu testenden Fragments steht.

DNA-Sequenzen, die dem zu testenden Fragment in der Expres­ sionskassette nachgeschaltet sind, können beliebige codierende Sequenzen darstellen, die zu einem nachweisbaren Endprodukt führen.

Das zu testende Fragment muß nicht notwendigerweise in einer Zuckerrübenpflanze ausgetestet werden, sondern es wird bevor­ zugterweise die Kartoffel als Wirtspflanze für das zu testende Fragment verwendet. Die Transformation von Kartoffelpflanzen mit binären Plasmiden ist beispielsweise beschrieben in Deblaere et al., Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788. Der Ein­ satz von Kartoffelpflanzen zum Austesten der Fragmente auf ihre Expressionsmuster hin beruht auf dem Befund, daß ein Regulon, das ein bestimmtes Expressionsmuster in Speicherwurzelzellen der Zuckerrübe zeigt, das gleiche Muster in den Knollen von Kartoffelpflanzen zeigt. Dies bedeutet, daß das erfindungsge­ mäße Regulon auch in Zellen der Kartoffelknolle ständig gleichmäßig transkriptionsaktiv ist, unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkonzentration in den Zellen der Kartoffelknollen.

Das erfindungsgemäße Regulon steuert in seiner natürlichen Umgebung im Genom von Beta vulgaris die Expression des Sucrosesynthasegens (SBSS1).

Vorzugsweise ist das erfindungsgemäße Regulon das regulatori­ sche Element aus der 5 kb-langen Region, die sich an das 5′-Ende des Transkriptionsstarts des SBSS1-Gens in dem Genom von Beta vulgaris anschließt. Der Transkriptionsstart der protein­ codierenden Sequenz ist in SEQ ID No. 2 angegeben.

Als erfindungsgemäße Regulons kommen nicht nur natürlich vor­ kommende Regulons in Betracht, wie sie mit der Probe SEQ ID No. 1 erhalten werden können, sondern auch davon abgeleitete Derviate (beispielsweise Insertion(en), Deletion(en) und/oder Substitution(en) tragende(s) Regulon(s)), sofern diese Derivate mindestens 20% der Transkriptionsaktivität des Regulons des SBSS1-Gens der Zuckerrübe unter vergleichbaren Bedingungen zeigen. Vorzugsweise zeigen diese Derivate 100% oder mehr der Aktivität des Regulons aus Zuckerrübe.

Das erfindungsgemäße Regulon kann beispielsweise vorteilhaft eingesetzt werden zur Herstellung einer rekombinanten DNA, bei der ein Gen von Interesse unter der Kontrolle des Regulons steht. Eine solche rekombinante DNA erlaubt somit die Expres­ sion des Genprodukts unter Bedingungen, bei denen bisher hohe Expressionsraten nicht erzielt wurden. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Regulon auch transkriptionsaktiv unter hohen Zuckerkonzentrationen in dem umgebenden Medium.

Durch Einbringen einer rekombinanten DNA, enthaltend das erfin­ dungsgemäße Regulon, in eine Pflanzenzelle, können der Pflan­ zenzelle neue Eigenschaften verliehen werden, indem das erfin­ dungsgemäße Regulon die Expression von Produkten in der Zelle ermöglicht, die die Pflanzenzelle ansonsten nicht oder mit anderen Expressionsraten exprimieren würde.

Somit erlaubt das erfindungsgemäße Regulon die Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften, wie gleichmäßige Expression von beliebigen Genen unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons unabhängig von Umwelteinflüssen, wie Sauerstoffmangel, Temperaturschwankungen und/oder der Versorgung mit Zucker.

Eine transgene Pflanze läßt sich herstellen, indem das erfin­ dungsgemäße Regulon auf übliche Weise in eine Pflanzenzelle eingebracht und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiele 1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung in E. coli wurden die Vektoren pBluescript SK-(Stratagene) und EMBL 3 (Frischauf et al. (1983), LT. Mol. Biol. 170, 827-842) verwendet. Zur Pflanzentransformation wurden die DNA-Fragmente in die binären Vektoren BIN 19 (Bevan (1984), Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) und pBI101-Derivate (Jefferson et al., (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die unter 1. genannten Plasmidvektoren wurde der E. coli-Stamm XL-1 Blue (Stratagene) und für den Phagenvektor der Stamm LE2392 (Stratagene) verwendet. Die Transformation der binären Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. (1985), 4777-4788) durchgeführt.

3. Transformation von Aqrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA in die Bakterien erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucl. Acids Res. 16 (1988), 9877). Die transformierte DNA konnte isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektro­ phoretisch analysiert werden.

4. Transformation von Kartoffel

10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartof­ felsterilkultur (Solanum tuberosuin L. cv. Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) mit 2% Saccharose gelegt, wobei das Medium 50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens über-Nacht-Kultur enthielt. Nach 3- bis 5-minütigem leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Callusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B und 0,8% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßexpression auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B und 0,8% Bacto Agar gelegt.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

6. Pflanzenhaltung

Die Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25 000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%.

7. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen

Die Isolierung von genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers & Bendich (1985; Plant Mol. Biol. 5, 69-76). Die Charak­ terisierung der DNA aus den transgenen Kartoffelpflanzen erfolgte durch Restriktionskartierung und Southern Blot-Ana­ lysen.

8. β-Glucuronidase-Aktivitätstest (GUS-Assay)

Die β-Glucuronidase ist ein bakterielles Enzym, das β-Glucuro­ nide hydrolysiert und sowohl eine quantitative als auch eine histochemische Aktivitätsbestimmung ermöglicht. Die Aktivitäts­ bestimmungen wurden nach Jefferson et al. (1987, EMBO LT. 6, 3901-3907) durchgeführt. Die Gewebeproben wurden in 1 mM X-Gluc, 50 mM Na-Phosphat, pH 7,0, und 0,1% Tween 20 bis zur gewünschten Blaufärbung inkubiert. Dieser Test erlaubt das Expressionsmuster einer beliebigen Sequenz in den verschiedenen Geweben einer transgenen Pflanze zu bestimmen. Die transkrip­ tionsregulierenden Eigenschaften eines ca. 4 kb langen DNA-Segments, das sich beginnend vom Startcodon des SBSS1-Gens erstreckt, wurde in verschiedene binäre Vektoren, wie pBIN19 und pBI101-Derivate kloniert. Die Vektoren enthalten die codierende Region des β-Glucuronidasegens aus Escherichia coli als Reportergen. Dieses Reportergen zeigt unter der Kontrolle des eingebrachten Fragments an, in welchen Geweben unter den jeweils gewählten Umwelteinflüssen es zu einer Transkription des Reportergens kommt.

Die Fusionsprodukte aus Regulon und GUS wurden über einen Gen­ transfer mit Hilfe von Agrobakterien in Kartoffelpflanzen ein­ gebracht. Von unabhängig voneinander erhaltenen Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht-umgelagerten chimären Fusionsprodukts mit Hilfe von Southern Blot-Analysen nachgewie­ sen worden war, wurden Blatt, Stamm, Knolle und Wurzeln auf die Aktivität der β-Glucuronidase hin untersucht.

9. Isolierung von Klonen, enthaltend DNA-Fragmente, die die transkriptionsregulierenden Eigenschaften des Regulons des SBSS1-Gens von Beta vulgaris L. zeigen

Der 5′-Bereich einer cDNA-Sequenz, die für das Saccharose­ synthasegen aus Beta vulgaris codiert, diente als Probe, Klone aus einer genomischen DNA-Bank von Beta vulgaris Zuchtlinie 5S 0026 (Kleinwanzlebener Saatzucht AG) zu isolieren. Die ver­ wendete DNA-Probe besitzt die Sequenz SEQ ID No. 1.

Zunächst wurde eine genomische DNA-Bank wie folgt hergestellt. DNA wurde aus Blättern von 3 bis 4 Monate alten Zuckerrüben­ pflanzen der Zuchtlinie 5S 0026 im wesentlichen nach der Methode von Dellaporta et al. (1983; Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21) isoliert. Die genomische DNA wurde mit zehn verschiedenen Konzentrationen des Enzyms Sau3A bei 37°C für 15 Minuten partiell verdaut. Anschließend erfolgte eine Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms für 30 Minuten bei 70°C. Aliquots der verschiedenen Restriktionsansätze wurden auf einem 0,7%igen Agarosegel aufgetrennt. Fraktionen mit geschnittener, aber noch hochmolekularer DNA wurden vereinigt und für 30 Minuten mit alkalischer Phosphatase behandelt. Im Anschluß wurde die DNA durch phenolische Extraktion gereinigt, durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat und 2 Volumen 96% Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde abzentrifugiert und der Niederschlag mit 70% Ethanol gewaschen. Die DNA wurde kurz getrocknet und in Wasser gelöst. Zur Klonierung dieser so vorbereiteten DNA wurden mit BamHI vorgeschnittene Lambda EMBL 3 Arme verwendet (Strategene GmbH, Heidelberg, Deutschland). Das Verpacken in Phagenköpfe erfolgte unter Verwendung des Gigapack II-Gold Kits (Stratagene GmbH, Heidelberg, Deutschland) nach Angaben des Herstellers.

Ca. 200 000 Plaques dieser genomischen DNA-Bibliothek wurden auf die gewünschten Sequenzen hin durchmustert, wobei stringente Bedingungen eingesetzt wurden (Hybridisierungspuffer mit 50% Formamid für 14 Stunden bei 42°C nach Sharrock et al., 1988, Mol. Gen. Genet. 213, 9-14; Waschen der Hybridisierungsfilter nach der Hybridisierung in 2 × SSC/0,1% SDS für 20 Minuten und 0,1 × SSC/0,1% SDS für 15 Minuten, jeweils bei 65°C). Von den mit der Probe hybridisierenden Phagenklonen wurden nach deren Aufreinigung drei Klone bei der DSM, Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, unter der Bezeichnung SBSS1-λ271, SBSS1-λ321 und SBSS1-λ351 hinterlegt.

10. Analyse der transkriptionsregulierenden Eigenschaften des Regulons des SBSS1-Gens von Beta vulgaris L.

Es wurden diploide Zuckerrüben von der KWS (Kleinwanzlebener Saatzucht AG, Einbeck, Deutschland) verwendet. Die Pflanzen wurden im Gewächshaus in Erde kultiviert unter einem hell/dunkel-Rhythmus von 12,5 Stunden Licht (20°C) und 11,5 Stunden Dunkelheit (13°C).

Um den Einfluß von Kälte und einer anaeroben Behandlung zu untersuchen, wurden 3 Monate alte Zuckerrübenpflanzen entweder für 48 Stunden in 4°C unter Licht (12,5 Stunden) eingebracht (Kältebehandlung) oder für 24 Stunden unter normalen Gewächs­ hausbedingungen in Wasser eingetaucht (anaerobe Behandlung). Kontrollpflanzen wurden für die gleiche Zeit unter den Bedin­ gungen des Gewächshauses gehalten. Jedes Experiment wurde drei­ fach durchgeführt.

Für die Expressionsuntersuchungen wurde Gesamt-RNA isoliert gemäß dem Verfahren von Logemann et al., Anal. Biochem. 163: 21-26 (1987), aus 3 bis 4 Monate alten Beta vulgaris Pflanzen, die im Gewächshaus kultiviert worden waren. Die RNA wurde auf einem 1,2% Agarose/Formaldehydgel fraktioniert und auf Nylon­ membranen (Hybond N, Amersham) übertragen. Die Hybridisierung wurde in 50% Formamid-Hybridisierungspuffer gemäß Sharrock et al., Mol. Gen. Genet. 213: 9-14 (1988), durchgeführt. Das Waschen wurde in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C durchgeführt.

Zur Untersuchung des Einflusses der Zuckerkonzentration auf die Expression wurden Speicherwurzeln von 3 bis 4 Monate alten Zuckerrübenpflanzen geerntet. In jedem Experiment wurden 20 Scheiben mit 1,5 mm Dicke mit einer Fläche von 1 cm² zufäl­ lig ausgewählt und zusammen in dem Inkubationsmedium inkubiert. Die Inkubation wurde in Dunkelheit bei 25°C durchgeführt. Das Experiment wurde jeweils dreifach durchgeführt.

Die Expression des Sucrosesynthasegens unter der Kontrolle des erfindungsgemäßen Regulons wurde verfolgt, indem die Probe SEQ ID No. 1 in den RNA-Blot-Experimenten verwendet wurde, um das Muster der m-RNA-Expression der Sucrosesynthase in den verschiedenen Geweben, wie Blättern, Speicherwurzeln und Wurzeln von B. vulgaris zu bestimmen. Das erfindungsgemäße Regulon führt zu einer starken Expression des SBSS1-Gens in den Speicherwurzeln, während nur eine äußerst geringe Menge Expres­ sion in anderen Geweben beobachtet wird. Bei dieser Analyse wurde Gesamt-RNA von Beta vulgaris mit der Probe SEQ ID No. 1 analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. In der gezeigten Figur wurden 50 µg an gesamter RNA aus "Sink"-Blättern und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln oder Seiten­ wurzeln durch Gelelektrophorese auf einem Formaldehydgel aufge­ trennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert. Unter "Sink"-Blättern werden kleine Blätter verstanden, die in ihrem Energiestoffwechsel noch nicht selbständig sind und auf Energiezufuhr aus anderen Pflanzenteilen angewiesen sind; "Source"-Blätter sind ausgewachsene Blätter mit ausreichender eigener Energieversorgung.

Einfluß eines Kälteschocks auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons

Um den Einfluß eines Kälteschocks auf die transkriptionsregu­ lierende Aktivität des erfindungsgemäßen Regulons zu unter­ suchen, wurde die Expression des SBSS1-Gens während einer Kältebehandlung untersucht. Hierzu wurde RNA aus den "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln und Seitenwurzeln von Pflanzen hergestellt, die 48 Stunden bei 4°C aufbewahrt wurden. Die Analayse der RNA-Blots durch Hybridisieren mit der Probe SEQ ID No. 1 zeigte, daß die Kältebehandlung keinen Einfluß auf das Expressionsmuster zeigte. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Es wurde gesamte RNA der Zuckerrübe (50 µg) auf einem Formaldehydgel aufgetrennt, die auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert wurde. Die Spuren 1 bis 4 zeigen RNA aus Pflanzen nach 48 Stunden der Kältebehandlung aus "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicher­ wurzeln und Seitenwurzeln; Spuren 5 bis 8 zeigen RNA der Kontrollpflanzen, die im Gewächshaus kultiviert wurden.

Einfluß von anaeroben Bedingungen auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons

Der Einfluß von Anaerobiose wurde untersucht, indem Zucker­ rübenpflanzen in Wasser für 24 Stunden eingetaucht wurden. Der Spiegel an Transkript nimmt unter diesen anaeroben Bedingungen in den "Sink"- und "Source"-Blättern, sowie in den Seiten­ wurzeln zu, während in den Speicherwurzeln die Transkription unverändert bleibt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Es wurden 50 µg Gesamt-RNA auf einem Formaldehydgel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen und mit der Probe SEQ ID No. 1 hybridisiert. Die Spuren 1 bis 4 zeigen RNA von Pflanzen nach 24 Stunden unter anaeroben Bedingungen von "Sink"- und "Source"-Blättern, Speicherwurzeln und Seitenwurzeln; Spuren 5 bis 8 zeigen RNA aus den Kontrollpflanzen.

Einfluß von Zuckern auf die Transkriptionsaktivität des erfindungsgemäßen Regulons

Speicherwurzelscheiben von Pflanzen, die unter Gewächshaus­ bedingungen kultiviert worden waren, wurden für 24 Stunden in der Dunkelheit bei Raumtemperatur verschiedenen Sucrosekonzen­ trationen ausgesetzt: 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8 und 10% (Gew./Vol.) Sucrose. Es wurde ferner mit verschiedenen Zuckern, wie Glucose, Fructose und Mannose, bei den Konzentrationen 1, 5 und 10% (Gew./Vol.) getestet. Die Fig. 4 zeigt die Hybridi­ sierung von gleichen Mengen an Gesamt-RNA aus den verschiedenen Speicherwurzelproben. Die Transkripte wurden bei sämtlichen Sucrose-, Glucose-, Fructose- und Mannosekonzentrationen gefunden. Es zeigte sich keine Steigerung in der Sucrose­ synthasetranskriptrate unter den Bedingungen. Die Fig. 4 zeigt das Ergebnis der RNA-Blots, bei denen gleiche Mengen (50 µg) Gesamt-RNA, die von Speicherwurzeln nach einer 24-stündigen Inkubation in den jeweiligen Lösungen erhalten wurden, einge­ setzt worden waren. Der Blot (b) wurde für 24 Stunden expo­ niert, während der Blot (a) nur für 4 Stunden exponiert wurde.

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Regulon in Speicherwurzeln der Zuckerrübe zur konstitutiven Expression führt, wobei sich die Transkriptionsaktivtät des Regulons weder bei Kälteeinwirkung noch unter anaeroben Bedingungen noch unter sich ändernden Zuckerbedingungen verändert.

Sequenzprotokoll

Claims (11)

1. Regulon, das in Speicherwurzelgewebe der Zuckerrübe (Beta vulgaris L.), unabhängig von der Sauerstoffkonzentration der Umgebung, der Umgebungstemperatur und der Zuckerkon­ zentration in den Wurzelzellen das unter seiner Kontrolle stehende Gen konstitutiv exprimiert, erhältlich durch Absu­ chen einer genomischen Pflanzen-DNA-Bank mit der Probe SEQ ID No. 1 und Isolieren von positiven Klonen, wobei SEQ ID No. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist.

2. Regulon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in seiner natürlichen Umgebung im Genom der Zuckerrübe die Ex­ pression des Sucrosesynthasegens (SBSS1) steuert.

3. Regulon nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in seiner natürlichen Umgebung innerhalb von 5 kb 5′ des Transkriptionsstarts des SBSS1-Gens vorliegt.

4. Regulon nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer genomischen Pflanzen-DNA-Bank von Beta vulgaris stammt.

5. Rekombinante DNA, enthaltend ein Regulon nach einem der An­ sprüche 1 bis 4.

6. Pflanzenzelle, enthaltend eine rekombinante DNA nach An­ spruch 5.

7. Transgene Pflanze, enthaltend ein Regulon nach einem der An­ sprüche 1 bis 4 und/oder eine rekombinante DNA nach An­ spruch 5.

8. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, dadurch gekennzeichnet, daß ein Regulon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Pflanzenzelle eingebracht und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird.

9. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, da­ durch gekennzeichnet, daß das Gen, welches für das rekombi­ nante Protein codiert, unter der Kontrolle des Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 steht.

10. Verwendung eines Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung einer Pflanzenzelle und/oder einer Pflanze.

11. Verwendung eines Regulons nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Expression von Genen.