DE19536506A1

DE19536506A1 - Neues Creatin-Amidinohydrolase-Gen, neue rekombinante DNA und Verfahren zur Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase

Info

Publication number: DE19536506A1
Application number: DE19536506A
Authority: DE
Inventors: Keisuke Furukawa; Toshio Ichikawa; Masaru Suzuki; Yasuji Koyama
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1994-09-29
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2015-09-30
Also published as: US5932466A; DE19536506B4; JP3325128B2; JPH0889255A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidino hydrolase codiert, die für den quantitativen Nachweis von Creatin nützlich ist, einen das DNA-Molekül enthaltenden Vektor und ein Verfahren zur Herstellung von Creatin- Amidinohydrolase durch Züchtung eines den Vektor enthaltenden Mikroorganismus.

Creatin-Amidinohydrolase ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Creatin zu Sarcosin und Harnstoff katalysiert. Dieses Enzym kann als diagnostisches Reagens für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Nierenkrankheiten, verwendet werden, um die Menge von Creatin in menschlichem Serum oder Urin zu bestimmen.

Die herkömmliche Creatin-Amidinohydrolase ist jedoch ungün stig, da der pH-Bereich, in dem sie stabil ist, auf pH 4,5 bis 8,5 beschränkt ist, so daß eine Reinigung bei pH-Werten, die über pH 8,5 liegen, schwierig ist. Außerdem führt ihr hoher Km-Wert dazu, daß die Messung einer Probe eine lange Zeit in Anspruch nimmt.

Unter diesen Umständen fanden die Erfinder, daß eine neue Creatin-Amidinohydrolase mit niedrigem Km-Wert, die in einem großen pH-Bereich stabil ist, aus Alcaligenes sp. KS-85 (FERM BP-4487) erhalten werden kann, der in Creatin enthal tendem Medium gezüchtet wird, und reichten eine Patentanmel dung für dieses Enzym ein (Japanische Patentanmeldung Nr. 318675/1993).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Be reitstellung eines ein Protein mit der enzymatischen Akti vität der Creatin-Amidinohydrolase codierenden DNA-Moleküls, mit dem Creatin-Amidinohydrolase gentechnisch hergestellt werden kann, eines das DNA-Molekül enthaltenden Vektors und eines Verfahrens zur Herstellung von Creatin-Amidinohydro lase unter Verwendung des Vektors.

Zur Lösung der Aufgabe isolierten die Erfinder erfolgreich ein Creatin-Amidinohydrolase-Gen aus Alcaligenes und ermit telten dessen Struktur. Außerdem erhielten die Erfinder durch Einfügen des Creatin-Amidinohydrolase-Gens in eine Vektor-DNA eine rekombinante DNA, mit der sie einen zur Gat tung Escherichia gehörenden Stamm transformierten, wobei sie zu dem Ergebnis kamen, daß die resultierende Transformante die Creatin-Amidinohydrolase effizient herstellen kann, ohne daß dem Medium Creatin zugesetzt werden muß.

Die Aufgabe wird somit durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, die Crea tin-Amidinohydrolase mit der unter Seq ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz codieren.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die eine DNA-Sequenz mit der unter Seq ID NO. 1 angegebenen Nucleotidsequenz umfassen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls DNA-Moleküle, die mit den oben genannten erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hy bridisieren. Solche DNA-Moleküle umfassen beispielsweise Fragmente, Modifikationen, Derivate und allele Varianten der vorstehend beschriebenen DNA-Moleküle. Der Begriff "Hybridi sierung" bedeutet in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugs weise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind. Diese DNA-Moleküle, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren, kön nen prinzipiell aus jedem beliebigen Organismus (d. h. Prokaryonten oder Eukaryonten, insbesondere aus Bakterien, Pilzen, Algen, Pflanzen oder tierischen Organismen) stammen, der derartige DNA-Moleküle besitzt. Sie stammen vorzugsweise aus dem Mikroorganismus Alcaligenes, insbesondere Alcali genes sp. KS-85.

DNA-Moleküle, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA- Bibliotheken verschiedener Organismen isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger DNA-Moleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Mole küle oder Teile dieser DNA-Moleküle bzw. der reversen Kom plemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisie rung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Als Hybridisierungsprobe können z. B. DNA-Moleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter Seq ID NO. 2 angegebene DNA-Sequenz oder Teile dieser Sequenz auf weisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten DNA- Fragmenten kann es sich auch um synthetische DNA-Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsge mäßen DNA-Sequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, deren Sequenzen aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind im Vergleich zu den Sequenzen der obengenannten DNA-Mo leküle und die Creatin-Amidinohydrolase codieren.

Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plas mide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gen technik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfin dungsgemäßen DNA-Moleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto ren enthaltenen DNA-Moleküle verknüpft mit DNA-Elementen, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryonti schen Zellen gewährleisten.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische Zellen, die ein oben beschriebenes erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder einen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Zel len der Gattung Escherichia.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase durch die Züchtung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen, die bevorzugt zur Gattung Escherichia gehören und befähigt sind, mit Hilfe der rekombinanten DNA Creatin-Amidinohydrolase herzustellen, und die anschließende Gewinnung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase aus der Kultur.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das pH-Optimum der Creatin-Amidinohydrolase, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.

Bedingungen der Messung:
Bei jedem pH-Wert wurde im entsprechenden Puffer 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten Harnstoffs wurde gemessen.
Puffer für die Reaktionslösung:

Fig. 2 zeigt das Temperatur-Optimum der Creatin-Amidinohy drolase, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.

Bedingungen der Messung:
In 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,7, wurde 10 Minuten bei den jeweiligen Temperaturen inkubiert. Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten Harnstoffs wurde gemessen.

Fig. 3 zeigt den pH-Bereich, in welchem die Creatin-Amidino hydrolase, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfin dung erhalten wurde, stabil ist.

Bedingungen der Behandlung:
Die Behandlung beim jeweiligen pH-Wert erfolgte für 17 Stun den bei 25°C:

Fig. 4 zeigt die thermische Stabilität der Creatin-Amidino hydrolase, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfin dung erhalten wurde.

Bedingungen der Behandlung:
In 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, wurde 30 Minuten bei den jeweiligen Temperaturen inkubiert.

Bedingungen der Messung:
In 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,7, wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Menge des durch die Enzymreaktion erzeugten Harnstoffs wurde gemessen.

Das erfindungsgemäße Creatin-Amidinohydrolase-Gen kann z. B. folgendermaßen erhalten werden. Alcaligenes sp. KS-85 wird gezüchtet, wie z. B. in "Current Protocols in Molecular Biology" (Wiley Interscience, 1989) beschrieben. Die auf diese Weise gezüchteten Bakterien werden einer Extraktion unterworfen, wodurch genomische DNA erhalten wird.

Alcaligenes sp. KS-85 ist ein Stamm, der aus Bodenproben in der Kyoto-Präfektur, Japan, durch Absuchverfahren erhalten wurde, seine mikrobiologischen Eigenschaften werden nachste hend beschrieben. Die meisten mikrobiologischen Eigenschaf ten wurden gemäß den Verfahren identifiziert, die von Takeharu Hasegawa in "Biseibutsu no Bunrui to Doutei" (Klas sifizierung und Identifizierung von Bakterien), Tokyo University Press (1975), beschrieben werden. Als Referenz für die Klassifizierung und Identifizierung verwendeten die Erfinder außerdem "Bergeys Manual of Determinative Bacteriology", 8. Aufl. (1974).

Mikrobiologische Eigenschaften von Alcaligenes sp. KS-85 (A) Morphologische Eigenschaften

Beobachtet unter einem Mikroskop (nach 24- bis 48-stündiger Züchtung bei 30°C auf Fleischbrühe-Agarmedium, pH 9,0)

(1) Zellform und -größe 0,5 bis 1,0 × 0,5 bis 4,0 µm, stäbchenförmiges Bakterium
(2) Beweglichkeit: beweglich durch umgebende Flagellen
(3) Spore: fehlt
(4) Gram-Färbbarkeit: negativ
(5) Säurefestigkeit: negativ.

(B) Wachstumszustand in verschiedenen Medien (pH 8,0)

(1) Fleischbrühe-Agarplattenkultur:
Blaßgelbe und weißliche runde Kolonien von 2 bis 3 mm Durchmesser erscheinen nach fünf Tagen Züchtung bei 30°C. Die Oberfläche ist glatt und fettartig glänzend mit einem transparenten Rand.
(2) Fleischbrühe-Agarschrägkultur:
Der Mikroorganismus wächst in neun Tagen stationärer Kultur bei 30°C, wobei er sich auf dem Medium ausbrei tet. Der Mikroorganismus ist beige und erzeugt kein Pig ment.
(3) Fleischbrühe-Flüssigkultur:
Der Mikroorganismus wächst in neun Tagen stationärer Kultur bei 30°C, wobei an der Oberfläche des Flüssigme diums eine Membran entsteht und am Boden Niederschläge erzeugt werden.
(4) Fleischbrühe-Gelatine-Kultur:
Der Mikroorganismus wächst in 30 Tagen stationärer Kul tur bei 20°C nur oben auf dem Medium, wobei die Gelatine nicht verflüssigt wird.
(5) Lackmus-Milch:
Lackmus-Milch wird in neun Tagen stationärer Kultur bei 30°C nicht verfestigt oder verflüssigt, während im Me dium Alkali produziert wird, wodurch der ursprüngliche pH-Wert des Mediums ansteigt.

(C) Physiologische Eigenschaften

Die meisten der folgenden Tests wurden in Medien durchge führt, deren pH-Wert auf 6,5 eingestellt war.

(1) Nitratreduktion: nicht reduziert
(2) Denitrifikation: fehlt (Nitrit wird unter aeroben Be dingungen erzeugt.)
(3) MR-Test: negativ
(4) VP-Test: negativ
(5) Indolbildung: nicht gebildet
(6) Hydrogensulfidbildung: nicht gebildet
(7) Stärkehydrolyse: nicht hydrolysiert
(8) Citronensäureverwertung: nicht verwertet
(9) Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: nicht ver wertet (Nitrat und Ammoniumsalz)
(10) Pigmentbildung: nicht gebildet
(11) Urease: negativ
(12) Oxidase: positiv
(13) Katalase: positiv
(14) Temperatur- und pH-Bereich für das Wachstum: 15 bis 45°C und pH 6,0 bis 9,0
(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
(16) O-F-Test (Hugh-Leifson-Verfahren): weder Oxidation noch Fermentation finden statt.
(17) Bildung von Säure und Gas aus Zucker: keine.

(Die getesteten Zucker sind: L-Arabinose, D-Xylose, D-Glu cose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccha rose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glyce rin und Stärke.)

Der vorliegende Stamm wurde nach den vorstehend beschriebe nen mikrobiologischen Eigenschaften identifiziert, er wurde der Gattung Alcaligenes zugeordnet und mit Alcaligenes sp. KS-85 bezeichnet. Dieser Stamm wurden als FERM BP-4487 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinter legt.

Die wie vorstehend beschrieben hergestellte genomische DNA wird sodann mit einem Restriktionsenzym, wie z. B. EcoRI, partiell gespalten und durch Agarosegelelektrophorese aufge trennt, wodurch DNA-Fragmente als EcoRI-Spaltprodukte erhal ten werden, die vorzugsweise eine Länge von 2 bis 5 kb auf weisen. Diese können gegebenenfalls, z. B. mit alkalischer Phosphatase, weiter behandelt werden, ferner können sie nach Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. Phenolex traktion, gereinigt werden und außerdem nach bestimmten Ver fahren, einschließlich Ethanolfällung, eingeengt werden, wo durch gereinigte DNA-Fragmente erhalten werden, die das ge wünschte Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthalten.

Als Vektor-DNA, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann eine Bakteriophagenvektor-DNA, Plasmidvektor-DNA und dergleichen erwähnt werden, wobei vorzugsweise insbeson dere Plasmid pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) und dergleichen eingesetzt werden. Zur Ligierung des vorstehend hergestell ten EcoRI-Spaltproduktes ist die Spaltung des Plasmidvektors mit EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) erforderlich, gegebenen falls kann das Spaltprodukt mit Ethanol gefällt werden.

Anschließend wird das vorstehende genomische DNA-Fragment, das das aus Alcaligenes stammende, gewünschte Gen enthält, in Gegenwart einer Ligase, wie z. B. T4-DNA-Ligase (Boehringer Mannheim), an den vorstehenden, mit EcoRI ge spaltenen Plasmidvektor ligiert, wodurch eine rekombinante Plasmid-DNA erhalten wird.

Diese rekombinante DNA kann verwendet werden, um Wirte, wie z. B. E. coli K12, vorzugsweise E. coli JM109 (erhältlich von Toyobo), XL-Blue (erhältlich von Funakoshi) und dgl., zu transformieren, wodurch Kolonien erhalten werden können, die rekombinante DNAs mit verschiedenen Genfragmenten umfassen.

Die resultierenden Kolonien können nach solchen Kolonien ab gesucht werden, die eine rekombinante DNA mit dem gewünsch ten Creatin-Amidinohydrolase-Gen enthalten, hierfür wird eine Koloniehybridisierung eingesetzt, die in den vorstehend erwähnten "Current Protocols in Molecular Biology" (Wiley Interscience, 1989) beschrieben wird, wobei ein Oligonucleo tid, das durch Endmarkierung des in Beispiel 1, Punkt (3), erhaltenen Genfragmentes mit Digoxigenin (Boehringer Mann heim) hergestellt wird, als Sonde eingesetzt werden kann.

Die resultierende rekombinante DNA, die das gewünschte Crea tin-Amidinohydrolase-Gen enthält, kann durch Techniken, wie z. B. CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation und derglei chen, gereinigt werden.

Die auf diese Weise gereinigte Plasmid-DNA wird für die Se quenzierung des Creatin-Amidinohydrolase-Gens verwendet, wie in Beispiel 1, Punkt (4), beschrieben, und die durch diese Nucleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz bestimmt. Diese Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NR. 2 gezeigt. Das Gen, das diese ermittelte Aminosäuresequenz codiert, ist das Creatin- Amidinohydrolase-Gen der vorliegenden Erfindung.

Da die das Gen enthaltende rekombinante DNA, die wie vorste hend erhalten wurde, keinen Promotor für die Expression in E. coli umfaßte, erzeugten Bakterien, die mit dieser rekom binanten DNA transformiert waren, keine Creatin-Amidinohy drolase. Aus diesem Grund müssen Transformanten, die die Creatin-Amidinohydrolase auch tatsächlich produzieren, gemäß der nachstehenden Beschreibung hergestellt werden.

Eine DNA, die ausschließlich aus einem Bereich besteht, der Creatin-Amidinohydrolase codiert, wird in der Polymeraseket tenreaktion ("Polymerase Chain Reaction", nachstehend abge kürzt PCR) erhalten, wobei das vorstehend gereinigte rekom binante Plasmid als Matrize eingesetzt wird und zwei synthe tische Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die aus 30 Nucleotiden bestehen, welche 10 Aminosäuren im N- bzw. C- Terminus des Creatin-Amidinohydrolase-Gens codieren (die C- terminale Seite ist die komplementäre Kette). Die auf diese Weise erhaltene DNA wird in eine Vektor-DNA eingefügt, die eine DNA-Sequenz enthält, die einen Promotor, Operator, eine Ribosomenbindungsstelle und dgl. umfaßt, hergeleitet vom E. coli-Lactose-Operon und dgl. (vgl. "The Operon", S. 227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Die verwendete Vektor- DNA umfaßt z. B. Plasmid-DNA, Bakteriophagen-DNA und derglei chen. Die auf diese Weise konstruierte rekombinante DNA wird zur Transformation oder Transduktion von Wirten, wie z. B. E. coli K12, vorzugsweise JM109 (Toyobo), XL-Blue (Funakoshi) und dgl., eingesetzt, wodurch jeweils eine Transformante er halten wird.

Die Transformation kann auch nach dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68 (1979), 326-331), die Transduktion nach dem Verfahren von B. Hohn (Methods in En zymology 68 (1979), 299-309) durchgeführt werden.

Der zur Gattung Escherichia gehörende Stamm, auf den die Be fähigung zur Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase über tragen wurde, wie vorstehend beschrieben, kann eingesetzt werden, um die Creatin-Amidinohydrolase folgendermaßen zu produzieren.

Die Bakterien können nach herkömmlichen Züchtungsverfahren in festem Medium, vorzugsweise in flüssigem Medium, gezüch tet werden.

Zur Züchtung der Bakterien wird ein Medium verwendet, ent haltend eine oder mehrere Stickstoffquellen, wie z. B. Hefe extrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser und ein Soja- oder Weizenkleie-Exsudat, ein oder mehrere anorgani sche Salze, wie z. B. Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhy drogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(III)-chlorid, Eisen(III)-sulfat und Mangansulfat, gegebenenfalls Zucker oder Kohlenhydrate und Vitamine.

Der anfängliche pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf einen Wert im Bereich von pH 7 bis 9 eingestellt, sodann werden die Bakterien 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 42°C, vor zugsweise bei etwa 37°C, in Submerskultur unter Belüftung mit Rühren, in Schüttelkultur, in stationärer Kultur und dergleichen gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung können herkömmliche Verfahren zur Gewinnung eingesetzt werden, um die Creatin-Amidinohydrolase aus der Kultur zu erhalten.

Die Bakterien werden aus der Kultur durch Filtration, Zen trifugation oder dergleichen abgetrennt. Die Bakterien kön nen zwar auch nach dem Waschen direkt anstelle des Enzyms verwendet werden, vorzugsweise wird jedoch die Creatin-Ami dinohydrolase gewonnen, indem z. B. die Bakterien in einer Ultraschallapparatur, French Press, Mühle oder dergleichen aufgeschlossen werden, die Zellwand mit lytischen Enzymen, wie z. B. Lysozym, lysiert wird oder das Enzym mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. Triton X-100, extrahiert wird.

Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung kann sodann herkömmlichen Verfahren unterworfen werden, vorzugsweise einer geeigneten Kombination aus Aussalzen mit Ammoniumsul fat, Fällung mit organischem Lösungsmittel, Ionenaustausch- Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, Adsorpti ons-Chromatographie, Elektrophorese und dergleichen, wodurch die Creatin-Amidinohydrolase isoliert wird.

Die physikalisch-chemischen, enzymatischen Eigenschaften der resultierenden Creatin-Amidinohydrolase sehen folgendermaßen aus:

(1) Wirkung:
1 Mol Creatin wird hydrolysiert, wobei 1 Mol Sarcosin und 1 Mol Harnstoff erzeugt werden.
(2) Substratspezifität:
Spezifisch für Creatin
(3) pH-Optimum:
Die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurde bei ver schiedenen pH-Werten in 50 mM Natriumacetat-Salzsäure- Puffer (pH 4,0 bis 6,0), 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0 bis 7,5) und 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5 bis 9,0) be stimmt. Das Ergebnis zeigte, wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, daß das pH-Optimum des vorliegenden Enzyms im Be reich von pH 7,0 bis 9,0 liegt.
(4) Temperatur-Optimum:
Die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurde bei ver schiedenen Temperaturen in den gleichen Reaktionslösun gen wie im nachstehenden Punkt (7) bestimmt. Das Ergeb nis zeigte, wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, daß das Tem peratur-Optimum des vorliegenden Enzyms im Bereich von 35 bis 45°C liegt.
(5) pH-Bereich, in dem das Enzym stabil ist:
Die Aktivität des vorliegenden Enzyms wurde nach einer 17-stündigen Behandlung bei 25°C mit verschiedenen pH- Werten von 4,0 bis 11,0 in 50 mM Natriumacetat-Salz säure-Puffer (pH 4,0 bis 6,0), 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0 bis 8,0), 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0 bis 9,0), 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0 bis 10,0) und 50 mM CAPS- Puffer (pH 10,0 bis 11,0) ermittelt. Das Ergebnis zeigte, wie aus Fig. 3 ersichtlich ist, daß der pH-Be reich, in welchem das vorliegende Enzym stabil ist, der Bereich von pH 5,0 bis 10,5 ist.
(6) Hitzestabilität:
Das Enzym wurde 30 Minuten bei den vorher ermittelten Temperaturen in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, behan delt. Das Ergebnis zeigte, wie aus Fig. 4 ersichtlich ist, daß das Enzym bei Temperaturen bis zu etwa 45°C stabil ist.
(7) Verfahren zur Messung der Enzymaktivität:
Die Messung der Enzymaktivität wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. 1 U Enzymaktivität ist als die Menge definiert, die die Erzeugung von 1 MMol Harnstoff pro Minute bewirkt.

Herstellung der Reagentien Lösung 1 (Substratlösung)

6,63 g Creatin werden in 500 ml 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,7, gelöst.

Lösung 2 (Lösung, die eine Färbung erzeugt)

10 g ρ-Dimethylaminobenzaldehyd werden in 500 ml Ethanol (Reagens mit garantierter Qualität) gelöst und anschließend mit einem Gemisch aus 575 ml entionisiertem Wasser und 75 ml konzentrierter Salzsäure gemischt.

Meßverfahren

1) 0,9 ml von Lösung 1 werden als Substrat 5 Minuten bei 37°C vorinkubiert.
2) 0,1 ml Enzymlösung (eingestellt auf etwa 1 bis 2 U/ml) werden mit dem Substrat gemischt und 10 Minuten bei 37°C umgesetzt.
3) Sodann werden 2 ml von Lösung 2 mit der Reaktionslösung gemischt.
4) Anschließend wird das Gemisch 20 Minuten bei 25°C ste hengelassen und die Absorption bei 435 nm gemessen (OD Probe).
5) Als Blindprobe werden 0,9 ml von Lösung 1 10 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend 2 ml von Lösung 2 und 0,1 ml Enzymlösung mit der Lösung 1 gemischt und das Gemisch 20 Minuten bei 25°C stehengelassen, sodann wird die Ab sorption bei 435 nm gemessen (OD Blindwert).

Berechnung der Aktivität

U/ml = Δ OD × 18,06* × Verdünnungsstufe (18,06* ist ein Koeffizient, der aus einer Harnstoff-Eich kurve errechnet wurde.)

(8) Inhibitoren:
Die Wirkung der Metallsalze in Tabelle 1 wurde unter sucht, indem das jeweilige Salz zur Reaktionslösung im vorstehenden Punkt (7) zugesetzt wurde. Das Ergebnis zeigte, wie aus Tabelle 1 ersichtlich ist, daß das vor liegende Enzym durch AgNO₃, HgCl₂ und CuSO₄ stark ge hemmt wurde.
Tabelle 1

Ergebnis der Hemmung
(9) Km-Wert:
Der Km-Wert wurde aus Lineweaver-Burk-Diagrammen ermit telt, er betrug 1,3 × 10^-2 M (für Creatin).
(10) Molekulargewicht:
Die Gelfiltration durch eine TSK Gel G3000SWXL-Säule ergab ein Molekulargewicht von 80 000 ± 5000.

Wirkung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Creatin-Amidinohydro lase effizient hergestellt werden, ohne daß dem Medium Crea tin zugesetzt werden muß.

Beispiel

Die vorliegende Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels genauer beschrieben, dieses Beispiel soll jedoch den Umfang der Patentansprüche in keiner Weise einschränken.

(1) Herstellung von genomischer DNA aus Alcaligenes sp. KS-85

Alcaligenes sp. KS-85 (FERM BP-4487) wurde in 200 ml TY-Me dium (1% Bacto-Pepton, 0,5% Pepton, 0,25% NaCl) geimpft und 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Die Bak terien wurden geerntet, indem die Kultur 10 Minuten bei 6000 UpM zentrifugiert wurde, und anschließend in 25 ml Sorbitlö sung (0,9 M Sorbit, 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 0,1 M EDTA) suspendiert. Gemäß "Current Protocols in Molecular Biology" (Wiley Interscience, 1989) wurden 500 µg genomische DNA aus der Suspension erhalten.

(2) Herstellung einer DNA-Genbank

100 µg der vorstehenden genomischen DNA wurden mit EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) partiell gespalten und durch Agaro segelelektrophorese aufgetrennt, wobei 10 µg Fragmente mit einer Größe von 2 bis 5 kb als EcoRI-Spaltprodukte erhalten wurden. 1 µg der Plasmidvektor-pUC118-DNA (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde mit EcoRI gespalten und durch 1 Einheit T4-DNA- Ligase (Boehringer Mannheim) mit 2 µg des vorstehenden EcoRI-Spaltproduktes der genomischen DNA ligiert. Das resul tierende Plasmid wurde gemäß dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68 (1979), 326-331) in E. coli JM109 transformiert, wodurch 600 Kolonien erhalten wur den, die sodann auf ein Nylon-Membranfilter Hybond-N⁺ (Pro dukt von Amersham) geblottet wurden, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden.

(3) Isolierung des Creatin-Amidinohydrolase-Gens mittels Ko loniehybridisierung

Der Plasmidvektor pLK501, der ein Creatin-Amidinohydrolase- Gen enthielt, hergeleitet aus der Gattung Flavobacterium (Japanische offengelegte Patentveröffentlichung Nr. 205786/1987), wurde mit den zwei Restriktionsenzymen SplI und SmaI partiell gespalten und durch Agarosegelelektropho rese aufgetrennt. Ein Teil des Creatin-Amidinohydrolase-Gens mit einer Länge von 1,2 kb wurde aus dem Gel eluiert und mit "GENECLEAN II" (Funakoshi) weiter gereinigt. Dieses Genfrag ment wurde mit Digoxigenin endmarkiert, wobei ein "DIG Labeling Kit" (Boehringer Mannheim) verwendet wurde, und als Sonde für die Koloniehybridisierung eingesetzt. Durch die Koloniehybridisierung gemäß "Current Protocols in Molecular Biology" (Wiley Interscience, 1989) wurden zwei positive Ko lonien nachgewiesen.

(4) Analyse des Creatin-Amidinohydrolase-Gens

Eine Plasmid-DNA, die das gewünschte Creatin-Amidinohydro lase-Gen enthielt, wurde aus einer der vorstehenden zwei po sitiven Kolonien durch Ultrazentrifugation abgetrennt und anschließend mit EcoRI gespalten. Es wurde gefunden, daß dieses EcoRI-Spaltprodukt ein genomisches DNA-Fragment mit einer Länge von etwa 2,5 kb enthielt, das aus Alcaligenes stammte. Sodann wurde die Nucleotidsequenz dieser Plasmid- DNA mit einem "Kilo Sequence Deletion Kit" (Takara Shuzo Co., Ltd.) und "370 DNA Sequencing System" (Applied Biosystems) ermittelt. Die auf diese Weise ermittelte Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NR. 1 dargestellt, die hier durch codierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR. 2 wieder gegeben. Das Creatin-Amidinohydrolase-Gen besitzt eine co dierende Region, die aus 1215 Nucleotiden besteht, welche 404 Aminosäuren codieren.

(5) Herstellung des transformierten E. coli JM109 (pUCE100)

Der Expressionsvektor pUTE100 wurde folgendermaßen konstru iert, wie in der Japanischen offengelegten Patentveröffent lichung Nr. 317055/1993 beschrieben. Die DNA des Plasmidvek tors pBR322 wurde mit EcoRI und NruI gespalten, sodann unter Verwendung eines "DNA Blunting Kits" (Takara Shuzo Co., Ltd.) mit glatten Enden versehen, durch Agarosegelelektro phorese aufgetrennt und mit "GENECLEAN II" (Funakoshi) gereinigt, wodurch ein etwa 3,4 kb großes DNA-Fragment er halten wurde, das einen Replikationsursprung enthielt. Die ses DNA-Fragment wurde durch die T4-DNA-Ligase cyclisiert und mit EcoRI gespalten, wodurch ein lineares Fragment als EcoRI-Spaltprodukt erhalten wurde. Unabhängig davon wurde eine DNA-Sequenz, welche die folgende Expressions-Regula tions-Region, umfassend einen Promotor, Operator, eine Ribo somenbindungsstelle und dgl., hergeleitet vom E. coli-Lac tose-Operon und dgl., und eine HpaI-Restriktionsstelle (vgl. "The Operon", S. 227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980) enthielt,

im DNA-Synthesizer Modell 392 (Applied Biosystems) syntheti siert und sodann an das vorstehende EcoRI-Spaltprodukt li giert, wodurch der Expressionsvektor pUTE100 erhalten wurde.

Anschließend wurde durch PCR eine Region synthetisiert, die ausschließlich die Creatin-Amidinohydrolase codiert, wobei das "Geneamp DNA Amplification Reagent Kit" mit AmpliTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, hierfür wurden die Oligonucleotide SEQ ID NR. 3 und 4, die die N- bzw. C-termi nalen Aminosäuresequenzen der Creatin-Amidinohydrolase co dieren und die im DNA Synthesizer Modell 392 (Applied Biosystems) synthetisiert wurden, als Primer eingesetzt und das im vorstehenden Punkt (4) erhaltene EcoRI-Spaltprodukt als Matrize verwendet. Das resultierende Fragment wurde in eine HpaI-Stelle der vorstehend erhaltenen Expressionsplas midvektor-pUTE100-DNA eingefügt, wodurch die rekombinante Plasmid-DNA pUCE100 erhalten wurde.

Die Transformation von E. coli JM109 (Toyobo) mit der rekom binanten Plasmid-DNA pUCE100 nach dem Verfahren von D. M. Morrison (Methods in Enzymology 68 (1979), 326-331) ergab eine Transformante (pUCE100) von E. coli JM109. Diese Trans formante wurde als FERM BP-4803 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt. Dieser transfor mierte E. coli JM109 (pUCE100) wurde unter Schütteln 16 Stunden in TY-Medium (1% Bacto-Pepton, 0,5% Bacto-Hefeex trakt, 0,5% NaCl, pH 7,0), das 1 mM Isopropyl-β-D-galacto sid enthielt, gezüchtet. Die Aktivität der Creatin-Amidino hydrolase, die gemäß dem vorstehend beschriebenen Meßverfah ren unter Verwendung einer Harnstoff-Eichkurve bestimmt wurde, betrug 1,1 U/ml.

Sequenzprotokoll

Claims

1. DNA-Molekül, das ein Protein mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase codiert, aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) DNA-Molekülen, die Creatin-Amidinohydrolase mit der unter SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz co dieren;
(b) DNA-Molekülen mit der unter SEQ ID NO. 1 angegebenen Nucleotidsequenz;
(c) DNA-Molekülen, deren Sequenz aufgrund des genetischen Codes degeneriert ist im Vergleich zu den in (a) oder (b) definierten Molekülen; und
(d) DNA-Molekülen, die mit den unter (a), (b) oder (c) genannten DNA-Molekülen hybridisieren.

2. Vektor, umfassend ein DNA-Molekül nach Anspruch 1.

3. Vektor nach Anspruch 2, in dem das DNA-Molekül verknüpft ist mit regulatorischen DNA-Elementen, die die Expres sion der Creatin-Amidinohydrolase in prokaryontischen Wirtszellen erlauben.

4. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 2 oder 3.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die ein Mikroorganismus ist, der zur Gattung Escherichia gehört.

6. Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 4 oder 5 in einem Medium und die Gewinnung des Proteins mit der enzymatischen Aktivität der Amidinohydrolase aus der Kultur.