DE19512704A1

DE19512704A1 - Dendrimere Pfropfpolymerisate

Info

Publication number: DE19512704A1
Application number: DE19512704A
Authority: DE
Inventors: Margot Dr Mack; Egbert Dr Mueller; Peter Poguntke; Dieter Lubda
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1995-04-07
Publication date: 1996-10-10
Also published as: DE4334351A1

Description

Die Erfindung betrifft dendrimere Pfropfpolymerisate und ihre Verwendung als Trennmaterialien für die Flüssigkeitschromatographie.

Aus DE 38 11 042 sind Trennmaterialien für die Chromatographie bekannt, die lineare Pfropfpolymere aufweisen. Diese Materialien weisen gegenüber Trennmaterialien, die vernetzte Polymere enthalten, deutliche Vorteile auf. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Trennmaterialien mit verbesserten Eigenschaften bereitzustellen.

Aus DE 43 10 964 sind oxiranhaltige aktivierte Trägermaterialien bekannt, bei denen Monomere der Formel I auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basisträger aufgepfropft sind,

worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten.

Es wurde gefunden, daß sich diese aktivierten Trägermaterialien zu den erfindungsgemäßen Pfropfpolymerisaten mit dendrimerer Struktur umset zen lassen. Dabei werden auf das bekannte Pfropfpolymerisat mit linearer Polymerkette (Polymerkette erster Generation) wiederum lineare Polymere aufgepfropft (Polymerkette zweiter Generation), wobei dieser Schritt mehr fach wiederholt werden kann (Polymerketten höherer Generation).

So entstehen verzweigte Pfropfpolymere, die jedoch keine Vernetzung aufweisen. Zusätzlich werden, entsprechend den vorgesehenen chroma tographischen Trennverfahren, Separationseffektoren eingeführt. Die resultierenden Trennmaterialien weisen verbesserte Eigenschaften auf.

Die für die verschiedenen chromatographischen Trennungsverfahren not wendigen Separationseffektoren sind als feste Phase an einen Basisträger gebunden und gehen unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit den Analyten der Probe ein. Für verschiedene chromatographische Tren nungsmethoden sind dem Fachmann geeignete Separationseffektoren bekannt; beispielsweise: ionische oder ionenbildende (ionogene) Gruppen für die Ionenaustauschchromatographie, Affinitätsliganden für Affinitäts chromatographie, wozu auch die Metallchelatchromatographie gehört, hydrophobe Gruppen für die hydrophobe Interaktionschromatographie oder reversed phase Chromatographie und vorwiegend netzartige poröse hydrophile Gruppen für die Gelpermeationschromatographie. Für die Abtrennung von niedermolekularen Analyten aus proteinhaltigen Matrices sind Materialien mit hydrophilen und hydrophoben Bereichen bekannt, die entweder durch ihre Porenstruktur (US 4,544,485; EP 0 173 233) oder durch hydrophile Abschirmung (US 5,277,813) die unerwünschte Bindung der Proteine an die hydrophoben Bereiche vermeiden.

Gegenstand der Erfindung sind dendrimere Pfropfpolymerisate auf der Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Ober flächen Polymere kovalent gebunden sind, wobei

a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
b) die kovalent gebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
c) die Polymeren an den Verzweigungsstellen der dendrimeren Struktur Monomereinheiten der Formel II enthalten
d) und die dendrimeren Pfropfpolymerisate Monomereinheiten der Formel III enthalten, worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
ein Rest X OH und der andere Rest X eine endständige Monomer einheit einer weiteren Polymerkette darstellt,
und
Y einen Rest, der einen Separationseffektor enthält,
bedeuten.

Die erfindungsgemäßen dendrimeren Pfropfpolymerisate sind erhältlich durch folgende Reaktionsschritte:

a) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I auf einen hydroxylgruppen haltigen Basisträger in Gegenwart von Cer-IV-Ionen, worin R¹, R², R³, R⁴ und n die bereits genannten Bedeutungen besitzen;
b) zumindestens teilweise Umsetzung der Oxirangruppen in Diolgruppen;
c) Aufpfropfung von weiteren Monomeren, beispielsweise von weiteren Monomeren der Formel I, oder auch Monomeren, die Separations effektoren enthalten, in Gegenwart von Cer-IV-Ionen;
d) optionale, auch mehrfache Wiederholung der Schritte b) und c);
e) Einführung von Resten mit Separationseffektoren, soweit diese nicht bereits durch die Aufpfropfreaktion mit Monomeren, die Separationseffektoren enthalten, eingeführt sind;
f) optionale Ringöffnung verbliebener Oxirangruppen.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen dendrimeren Pfropfpolymerisaten bei der Trennung von Gemischen min destens zweier Substanzen, insbesondere zur Trennung von Biopoly meren, mittels Flüssigkeitschromatographie, insbesondere mittels Ionen austausch- und Affinitätschromatographie. Eine weitere erfindungsgemäße Verwendung ist die Abtrennung von niedermolekularen Analyten aus proteinhaltigen Matrices.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur Herstellung von den drimeren Pfropfpolymerisaten mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I auf einen hydroxyl gruppenhaltigen Basisträger in Gegenwart von Cer-IV-Ionen, worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten, wobei aus DE 43 10 964 bekannte aktivierte Trägermate rialien entstehen,
b) zumindest teilweise Umsetzung der Oxirangruppen in Diolgruppen;
c) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I oder von Monomeren der Formel V auf die in Schritt b) entstandenen Diolgruppen in Gegenwart von Cer(IV)Ionen, worin
W OH oder NHR⁸
und
R⁸ C₁-C₁₀-Alkyl, das mit einem Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäurerest substituiert ist,
bedeuten,
wobei die Schritte b) und c) einmal oder auch mehrfach wiederholt werden können,
d) Einführung der Reste, die die Separationseffektoren enthalten, soweit diese nicht bereits durch die Aufpfropfreaktion mit Monomeren der Formel V erfolgt ist
und
e) optionale Ringöffnung verbliebener Oxirangruppen.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Trennung von Gemischen mindestens zweier Substanzen, insbesondere zur Trennung von Biopoly meren, mittels Flüssigkeitschromatographie, insbesondere mittels Ionen austausch-, hydrophober Interaktions- oder Affinitätschromatographie, unter Verwendung der erfindungsgemäßen dendrimeren Pfropfpoly merisaten. Weitere erfindungsgemäße Verfahren betreffen die Abtrennung von niedermolekularen Analyten aus proteinhaltigen Matrices mit Hilfe von erfindungsgemäßen dendrimeren Trennmaterialien.

Abb. 1 zeigt die Abhängigkeit von Selektivität α (Kurve A) und Bin dungskapazität (Kurve B) von diethylamin-substituierten (DEA) Ionen austauschern mit verschiedenem Verzweigungsgrad (Probennummer als Abzisse). Die experimentellen Einzelheiten finden sich in Anwendungs beispiel A. Es zeigt sich, daß die Selektivität von verzweigtem Material deutlich höher ist als von unverzweigtem Material. Die Bindungskapazität nimmt, verglichen mit unverzweigten Vergleichsmaterial, bei geringer Verzweigung zu, fällt aber bei starker Verzweigung deutlich ab.

Die Abb. 2 und 3 zeigen den Versuchsaufbau für die Abtrennung von Analyten aus biologischen Matrices, beispielsweise Serum oder Plasma, unter Verwendung von erfindungsgemäßen Trennmaterialien. Abb. 4 zeigt die Ergebnisse eines Wiederfindungsversuchs unter Verwendung eines nach Beispiel 9 hergestellten Trennmaterials. Nähere experimentelle Einzelheiten finden sich in Anwendungsbeispiel B.

Die erfindungsgemäßen dendrimeren Pfropfpolymerisate zeichnen sich durch eine baumartig verzweigte Struktur aus, wobei ein erstes lineares Polymer auf einen Basisträger, der aliphatische Hydroxylgruppen enthält, aufgepfropft ist. Dabei werden Monomere der Formel I, wobei die Reste R¹, R², R³ und R⁴, sowie n die bereits genannten Bedeutungen besitzen, in Gegenwart von Cer-IV-Ionen aufgepfropft, wobei ein lineares Pfropf polymerisat entsteht. Die Grundzüge dieser Reaktion sind von G. Mino und S. Kaizerman (1958) J.Polymer Science 31, 242-243, und G. Mino et al. (1959) J.Polymer Science 38, 393-401, beschrieben. Das Polymer enthält zunächst Oxiranreste, die anschließend vollständig oder teilweise zu Diolgruppen umgesetzt werden. Dazu wird eine Behandlung mit verdünnter Schwefelsäure bevorzugt.

Auf die somit entstandenen aliphatischen Hydroxylgruppen dieses Poly mers (erste Generation) können nun erneut Monomere der Formel I in Gegenwart von Cer-IV-Ionen aufpolymerisiert werden. Das resultierende Polymer (zweite Generation) ist in sich selbst linear. Die Gesamtstruktur ist jedoch verzweigt.

Um zu noch stärker verzweigten dendrimeren Pfropfpolymerisaten zu gelangen, können die genannten Arbeitsschritte wiederholt werden: Um setzung der Oxirangruppen in Diolgruppen und Polymerisation von Mono meren der Formel I in Gegenwart von Cer-IV-Ionen.

Zusätzlich werden die für die chromatographischen Trennungen notwen digen Separationseffektoren eingeführt, die als feste Phase an einen Basis träger gebunden sind, und die unterschiedlich starke Wechselwirkungen mit den Analyten der Probe eingehen. Für verschiedene chromatographische Trennungsmethoden sind dem Fachmann geeignete Separationseffektoren bekannt, beispielsweise:

a) Für die Ionenaustauschchromatographie sind ionische Gruppen wie beispielsweise quaternäre Ammoniumalkylgruppen und die SO₃ _⁻-Gruppe, sowie ionogene Gruppen, die unter bestimmten pH-Bedingungen Ionen bilden, bekannt. Zu der letzten Gruppe gehören beispielsweise die alkylierten Aminogruppen, sowie die Carboxyl- und die Phosphorsäuregruppe.

b) Für die Affinitätschromatographie sind dem Fachmann sehr viele Affinitätsliganden bekannt, die jeweils mit dem Analyten eine strukturell gegebene Bindung eingehen, und die als Separationseffektoren geeignet sind, beispielsweise:

Affinitätsligand
Analyt (Beispiel)
Protein A
Immunglobuline
Concanavalin A	Glycoproteine
Biotin	Avidin/Streptavidin
Avidin	Biotin
Streptavidin	Biotin
5′-Adenosinmonophosphat	NAD-abhängige Oxidoreduktasen
2′,5′-Adenosindiphosphat	NADP-abhängige Oxidoreduktasen
Aminoacridin	RNA oder DNA
Boronsäure	Katecholamine
Boronsäure	glykosyliertes Hämoglobin
Iminodiessigsäure	Metalloproteine
"thiophile" Liganden	Immunglobuline
Cibachromblau	monoklonale Antikörper

c) Für die hydrophobe Interaktionschromatographie sind ungeladene hydrophobe Separationseffektoren üblich, beispielsweise C₁-C₂₀-Alkyl, C₆-C₂₅-Aryl, C₇-C₂₅-Alkylaryl oder C₇-C₂₅-Arylalkyl, die auch einfach oder mehrfach mit Nitril oder C₁-C₅-Alkoxy derivatisiert sein können, wobei auch eine oder mehrere nicht benachbarte CH₂-Gruppen durch NH oder O oder auch eine oder mehrere CH-Gruppen durch N ersetzt sein können, oder Polyoxyethylen- oder Polyoxypropylenderivate [(CH₂)_m-O-]_o-R⁹, worin m 2 oder 3, o eine ganze Zahl zwischen 1 und 200 und R⁹ H oder C₁-C₅-Alkyl bedeuten. Bevorzugt werden besonders Reste mit mittlerer oder geringer Hydrophobizität. Diese Reste können als Alkyl- oder Arylreste, als Alkoxy- oder Aroxyreste oder als Alkoyl- oder Aroylreste eingeführt werden.
d) Für die Gelpermeationschromatographie werden hydrophile Verbin dungen, die vorzugsweise Poren oder Netzwerke ausbilden, als Separationseffektor benutzt. Dazu gehören (Meth)acrylsäurederivate wie Acrylamid oder Methacrylamid, ferner (2,3-Dihydroxypropyl) methacrylat oder N-(2-Methoxyethyl)acrylamid oder N-(2,3-Dihy droxypropyl)-acrylamid. Außerdem gehören dazu vinylierte Hetero cyclen, wie z. B. 1-Vinylimidazol, N-Vinylpyrrolidon, 2-Vinylpyridin, 4-Vinylpyridin, 4-Vinylpyrrolidon-N-oxid.
e) Für die Abtrennung von niedermolekularen Substanzen aus biologi schen Proben (z. B. Urin oder Blut) werden sogenannte abgeschirmte Phasen verwendet. Diese Trennmaterialien weisen sowohl hydro phobe als auch hydrophile Bereiche auf. Dabei treten die hydropho ben Bereiche, deren Struktur den oben (siehe c)) erwähnten hydro phoben Trennmaterialien entspricht, in Wechselwirkung mit den niedermolekularen Analyten der Probe. Die hydrophilen Bereiche verhindern die Wechselwirkung der hochmolekularen Anteile der Probe (z. B. der Proteine) mit den hydrophoben Bereichen. Dendrimere Pfropfpolymerisate entsprechend der vorliegenden Erfindung eignen sich in hervorragender Weise als abgeschirmten Phasen für die Abtrennung von Analyten aus biologischen Matrices.

Zur Einführung der Separationseffektoren sind verschiedene Reaktions wege möglich:

a) Die Separationseffektoren werden durch Reaktion mit den den Oxiranresten, die nach der Polymerisation mit Verbindungen der Formel I vorhanden sind, in den Träger eingebaut; z. B.:
- a1) die Reaktion mit schwefliger Säure oder ihren Salzen oder mit primären, sekundären oder tertiären Aminen, wobei Ionenaus tauscher entstehen;
- a2) die Reaktion mit Iminodiessigsäure oder die Einführung thiophiler Liganden, oder anderer Affiniätsliganden wie Protein A, wobei Träger für die Affinitätschromatographie entstehen;
- a3) die Reaktion mit Alkoholen, Phenolen oder auch primären Aminen, wobei hydrophobe Trennmaterialien entstehen.
Hydrophobe Separationseffektoren lassen sich beispielsweise auch durch Esterbindungen an Hydroxylgruppen, wie sie durch Hydrolyse der Oxiranreste entstehen, einführen.
Bei der Reaktionsfolge nach a1) entstehen beispielsweise Verbin dungen, bei denen der Rest Y aus Formel III die Bedeutung von Formel IV besitzt, worin
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
ein Rest Z OH und der andere Rest Z einen Rest, ausgewählt aus der Gruppe NR⁵R⁶, N⁺R⁵R⁶R⁷, PO₄H₂ und SO₃H,
und
R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, wobei einer oder beide Reste R⁵ oder R⁶ auch H sein kann,
bedeuten.
b) Bei der letzten Pfropfpolymerisation können statt der Monomeren der Formel I die aus DE 38 11 042 bekannten Monomeren eingesetzt werden, wobei die aus dieser Druckschrift bekannten Gruppen als Separationseffektoren eingeführt werden. Dazu gehören beispiels weise Monomeren der Formel V, worin
W OH oder NHR⁸
und
R⁸ C₁-C₁₀-Alkyl, das mit einem Amino-, Monoalkylamino-, Dialkyl amino-, Trialkylammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäurerest substituiert ist,
bedeuten.

In den nach Verfahrensvariante b) hergestellten Trägermaterialien bedeutet der Rest Y aus Formel III einen Rest nach Formel VI,

worin
W OH oder NHR⁸
und
R⁸ C₁-C₁₀-Alkyl, das mit einem Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäurerest substituiert ist,
bedeuten.

Bevorzugte Monomere der Formel V sind solche, bei denen W eine der folgenden Bedeutungen besitzt: OH, NH(CH₂)₂N(CH₃)₂, NH(CH₂)₂N(C₂H₅)₂, NH(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃, NHC(CH₃)₂CH₂SO₃H oder NH(CH₂)₂SO₃H.

Nachdem die beschriebenen Umsetzungen ausgeführt wurden, können gegebenenfalls noch verbliebene Oxiranreste hydrolysiert werden, beispielsweise durch eine abschließende Behandlung mit verdünnter Schwefelsäure.

Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fach mann die obige Beschreibung in weitesten Umfang nutzen kann. Die bevor zugten Ausführungsformen sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeine Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.

Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der deutschen Anmeldung P 43 34 351, eingereicht am 08.10.1993, sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand näher erläutern; diese Beispiele stellen keine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes dar.

Beispiele Herstellungsbeispiele

In den folgenden Herstellungsbeispielen bedeutet Raumtemperatur (RT) 15-30°C. Die Polymeriation wird in einem Dreihalskolben geeigneter Größe, der mit Rührer, Tropftrichter und Thermometer ausgerüstet ist, ausgeführt. Gewaschen wird durch Absaugen auf einer Glasfritte (G2).

Beispiel 1 Herstellung eines oxiran-aktivierten Trägers ausgehend von Fractogel®-TSK HW 65 (S)

Zu einer Suspension aus 100 ml sedimentiertem Fractogel®-TSK HW 65 (S) und 66 ml Wasser werden mit 3 g Ammoniumcer(IV)nitrat (gelöst in einer Mischung aus 180 ml Wasser und 3 g HNO₃ (65%)) bei Raumtemperatur unter starkem Rühren vermischt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 6 g (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat in 44 ml Dioxan. Es wird eine Stunde weitergerührt. Anschließend wird das Reaktionsprodukt zweimal mit je 200 ml Wasser, dreimal mit je 100 ml Aceton und dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.

Beispiel 2 Herstellung eines oxiran-aktivierten Trägers ausgehend von LiChrospher®-Diol

Die Herstellung erfolgt entsprechend Beispiel 1, LiChrospher®-DIOL (Par tikelgröße 15-25 µm, Porengröße 80 nm) wird als Basisträger anstelle von Fractogel®-TSK HW 65 (S) verwendet.

Beispiel 3 Aufpfropfung eines Polymeren auf ein diolhaltiges Polymer (Erzeugung der dendrimeren Struktur) Stufe 1 Überführung der Oxiran- in Diolgruppen

100 ml abgesaugtes oxiran-aktiviertem Trägermaterial hergestellt nach Beispiel 1 werden mit 200 ml 0,5 M Schwefelsäure (1 Stunde, 50°C) hydrolysiert und somit die Oxirangruppen in Diolgruppen überführt. An schließend wird dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.

Stufe 2 Aufpfropfen einer weiteren Polymerkette

Zu einer Suspension aus 100 ml sedimentiertem Material aus Stufe 1 und 66 ml Wasser werden mit 3 g Ammoniumcer(IV)nitrat (gelöst in einer Mischung aus 180 ml Wasser und 3 g HNO₃ (65%)) bei Raumtemperatur unter starkem Rühren vermischt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 6 g (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat in 44 ml Dioxan. Es wird eine Stunde weitergerührt. Anschließend wird das Reaktionsprodukt zwei mal mit je 200 ml Wasser, dreimal mit je 100 ml Aceton und dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.

Es resultiert ein einfach verzweigtes dendrimäres Material mit Oxiranresten.

Beispiel 4 Aufpfropfung eines Polymeren auf ein diolhaltiges Polymer (Erzeugung von mehrfach verzweigten den drimeren Strukturen)

Das Material aus Beispiel 3 wird nochmals der in Beispiel 3 beschriebenen Reaktionsfolge unterworfen. Es entsteht ein zweifach verzweigtes den drimäres Material mit Oxiranresten.

Dieses Material kann wiederum der in Beispiel 3 beschriebenen Reak tionsfolge unterworfen werden. Dabei entstehen dendrimäre Materialien mit Oxiranresten und mit höhergradiger Verzweigung.

Beispiel 5 Synthese eines mit Diethylamin substituierten dendrimeren Trennmaterials

100 ml abfiltriertes Gel hergestellt nach Beispiel 3 (einfach verzweigt) werden in 100 ml Wasser suspendiert und 100 ml Diethylamin zugegeben. Anschließend wird 20 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Danach wird das Reaktionsprodukt zweimal mit je 100 ml Wasser gewaschen.

Das gewaschene Reaktionsprodukt wird in 100 ml einer 0,5 M Schwefel säurelösung suspendiert und zwei Stunden bei 40°C langsam gerührt. Danach wird mit 0,25 M Phosphatpuffer (pH 7) bis zum Neutralpunkt, anschließend mit Wasser gewaschen. Das Gel wird in wäßriger Suspension unter Zusatz von 0,02% Natriumazid gelagert.

Beispiel 6 Synthese eines mit Diethylamin substituierten, zweifach verzweigten dendrimeren Trennmaterials

100 ml abfiltriertes Gel hergestellt nach Beispiel 4 (zweifach verzweigt) werden in wie in Beispiel 5 beschrieben mit Diethylamin umgesetzt.

In entsprechender Weise sind auch höher verzweigte mit Diethylamin substituierte dendrimere Trennmaterialien zugänglich.

Beispiel 7 Herstellung eines Affinitätsträgers für die Metall-Chelat-Chromatographie

Eine Lösung von 15 g NaOH und 25 g Iminodiessigsäure in 100 ml Wasser wird mit konzentrierter HCl auf pH 11 eingestellt und mit 1 g Aktivkohle entfärbt. Zu dieser Lösung werden 50 ml abgesaugtem oxiran-aktiviertem Trägermaterial hergestellt nach Beispiel 4 (zweifach verzweigt) gegeben. Die Lösung wird bei 45°C 20 Stunden gerührt. Das Reaktionsprodukt wird abgenutscht, mit je 250 ml 0,5 M NaOH und mit Wasser gewaschen. Die nicht umgesetzten Oxirangruppen durch Behandlung mit 100 ml 0,5 M Schwefelsäure (2 Stunden, 45°C) hydrolysiert.

Anschließend wird das Affinitätsträgermaterial einmal mit 100 ml 0,5 M Schwefelsäure, zweimal mit 100 ml Wasser, einmal mit 100 ml 0,5 M Phosphatpuffer pH 7 und einmal mit 100 ml 1 M NaCl-Lösung gewaschen. Das Gel wird in 0,02 M Phosphatpuffer pH 7 mit einem Zusatz von 1 M NaCl und 0,02% NaN₃ gelagert.

Beispiel 8 Herstellung eines sauren Ionenaustauschers Stufe 1

100 ml Gel hergestellt nach Beispiel 3 werden in 160 ml 0,5 M Schwefel säure suspendiert und eine Stunde bei 45°C gerührt. Anschließend wird dreimal mit je 500 ml Wasser gewaschen.

Stufe 2

10 g NaOH werden in 200 ml Wasser gelöst und 2-Acrylamido-2-methyl propansulfonsäure zugefügt, bis der pH 4 beträgt (ca. 45 g; Monomeren lösung). Als Starterlösung für die Polymerisation werden 8,2 g Ammonium cer(IV)nitrat in 50 ml 0,5 M Salpetersäure gelöst.

100 ml Gel aus Stufe 1 werden in der Monomerenlösung suspendiert und in einen Dreihalskolben gefüllt, die Starterlösung wird in den daran ange schlossenen Tropftrichter gefüllt. Die Apparatur wird dreimal evakuiert und mit Argon begast. Unter Rühren (150 UpM) wird nun die Starterlösung zulaufen lassen und anschließend bei 40°C vier Stunden weitergerührt. Anschließend wird das Produkt mit 200 ml 1 M Natriumsulfit in 1 M Schwefelsäure, mit 1 l Wasser, mit 3 l 0,1 M NaOH, mit 500 ml 1 M Natriumacetatpuffer pH 7 und mit 500 ml Wasser gewaschen. Das Produkt wird in 20 mM Phosphatpuffer pH 7 mit einem Zusatz von 0,02% NaN₃ gelagert.

Beispiel 9 Herstellung eines Trägermaterials für die Bestimmung von niedermolekularen Substanzen in biologischen Matrices Stufe 1 Herstellung eines Glycidyloxypropyl-Trägers

10 g eines LiChrospher® Si 60, Partikelgröße 25 µm, mit einer spezifischen Oberfläche von 380 m²/g und einem mittleren Porendurchmesser von 9 nm (E. Merck, Darmstadt) werden in 50 ml Toluol suspendiert und nach Zugabe von 3,8 ml (4 mmol/m²) Gycidyloxypropyl-methyl-dimethoxysilan 5 Stunden unter Rühren am Rückfluß gekocht. Nach dem Absaugen des Materials wird es Toluol und Methanol nachgewaschen und getrocknet.

Stufe 2 Ringöffnung des Glycidyloxypropyl-Trägers zur Diol-Phase

Das erhaltene Produkt aus Stufe 1, wird in 50 ml einer 5%igen Schwefel säure-Lösung suspendiert und zur Öffnung des Epoxyringes 3 Stunden unter langsamen Rühren am Rückfluß gekocht. Nach dem Absaugen der Reaktionssuspension, wird mit Wasser sulfatfrei gewaschen und nach nochmaligem Auswaschen mit Methanol getrocknet. Man erhält einen Diol- Träger (Kohlenstoffgehalt 7,6%; entsprechend 2,81 mmol/m² Diol- Gruppen).

Stufe 3 Erste Pfropfpolymerisation

Zu einer Suspension aus 40 ml sedimentiertem LiChrospher®-Diol aus Stufe 2 und 60 ml Wasser werden mit 0,8 g Ammoniumcer(IV)nitrat (gelöst in einer Mischung aus 40 ml Wasser und 1,2 g HNO₃ (65%)) bei Raum temperatur unter starkem Rühren vermischt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 1,2 g (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat in 15 ml Dioxan. Es wird eine Stunde weitergerührt. Anschließend wird das Reak tionsprodukt zweimal mit je 200 ml Wasser, dreimal mit je 100 ml Aceton und dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.

Stufe 4 Schwefelsäurehydrolyse

40 ml Gel aus Stufe 3 werden in 160 ml 0,5 M Schwefelsäure suspendiert und eine Stunde bei 45°C gerührt. Anschließend wird dreimal mit je 500 ml Wasser gewaschen.

Stufe 5 Zweite Pfropfpolymerisation

0,8 g Ammoniumcer(IV)nitrat werden in einer Mischung aus 40 ml Wasser und 1,2 g HNO₃ (65%) gelöst. Diese Lösung wird zu einer Suspension aus 40 ml sedimentiertem gepfropften LiChrospher®-Diol aus Stufe 4 und 60 ml Wasser bei Raumtemperatur unter starkem Rühren zugefügt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 1,2 g (2,3-Epoxypropyl)- methacrylat in 15 ml Dioxan. Es wird eine Stunde weitergerührt. Anschlie ßend wird das Reaktionsprodukt zweimal mit je 200 ml Wasser, dreimal mit je 100 ml Aceton und dreimal mit je 200 ml Wasser gewaschen.

Stufe 6 Umsetzung des dendrimeren Pfropfpolymeren mit hydrophoben Liganden

5 g des getrockneten Trägermaterials aus Stufe 5 werden bei 0°C in trockenem Chloroform suspendiert. Zu dieser Lösung werden 60 ml ge trocknetes Triethylamin zugegeben. Anschließend wird eine Lösung von 2 g Stearoylchlorid in 25 ml Chloroform, bei Kühlung auf 4°C, innerhalb von 3 Stunden zugegeben.

Nach der Zugabe des Säurechlorids wird 48 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt und das Gel anschließend mit jeweils 50 ml Chloroform, Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und getrocknet.

Stufe 7 Schwefelsäurehydrolyse

40 ml Gel aus Stufe 6 werden in 160 ml 0,5 M Schwefelsäure suspendiert und eine Stunde bei 45°C gerührt. Anschließend wird dreimal mit je 500 ml Wasser gewaschen.

Auf die vorbeschriebene Weise wird ein dendrimeres shielded phase Trennmaterial bereitgestellt, dessen hydrophobe Reste durch hydrophile Diolgruppierungen abgeschirmt sind.

Das folgende Anwendungsbeispiel zeigt den Einfluß des Verzweigungs grades auf Bindungskapazität und Trennvermögen des Trennmaterials.

Anwendungsbeispiel A Einfluß des Verzweigungsgrades

Einfach bis siebenfach verzweigte DEA-derivierte Trennmaterialien (Proben 2-7) werden entsprechend den Beispielen 5 und 6 hergestellt, unverzweigtes Vergleichsmaterial (Probe 1) wird in Analogie zu Beispiel 5 hergestellt, wobei statt des dendrimeren oxiranhaltigen Polymers das lineare Polymer aus Beispiel 1 benutzt wird.

Diese Trennmaterialien werden jeweils in eine SuperFormance® Glassäule (50 × 10 mm) gefüllt und mit dem Auftragepuffer (50 mM TRIS-Puffer, pH 8,3) äquilibriert. Eine Lösung von Rinderserumalbumin (10 mg/ml) in diesem Puffer wird kontinuierlich aufgetragen (Fluß: 0,5 ml/min) und das Elutionsdiagramm durch Photometrie bei 280 nm gemessen. Aus der Durchbruchskurve wird die Kapazität bestimmt. Das Trennverhalten für Rinderserumalbumin wird ebenfalls bestimmt und als Selektivitätsfaktor α ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 zusammengestellt.

Es zeigt sich, daß die Selektivität α (Kurve A) von verzweigtem Material deutlich höher ist als von unverzweigtem Material. Die Bindungskapazität (Kurve B) nimmt, verglichen mit unverzweigten Vergleichsmaterial, bei geringer Verzweigung zu, fällt aber bei starker Verzweigung deutlich ab.

Anwendungsbeispiel B Wiederfindung von Carbamazepin in Plasma a) Apparatur

Fig. 2 zeigt den apparativen Aufbau, darin bedeuten:
1 Vorsäulen-Puffer
2 Analysen-Puffer
3 HPLC-Pumpe (L-6000)
4 HPLC-Pumpe (L-6200)
5 automatischer Probengeber (AS-4000)
6 automatisches Umschaltventil (ELV-7000)
7 Vorsäule
8 analytische Säule
9 Detektor
10 Integrator (D-2500)
11 Abfallbehälter
(Geräte von Fa. E.Merck, Darmstadt, Deutschland).

In Fig. 3 sind die Leitungsverbindungen zwischen den Modulen in Abhängigkeit von der Stellung des Umschaltventils (6) dargestellt:

Fig. 3a: Stellung "L" (LOAD)

Fig. 3b: Stellung "I" (INJECT)

b) Chromatographische Bedingungen

Vorsäule ((8); 25 × 4 mm): Trennmaterial, hergestellt nach Beispiel 9; Vorsäulen-Puffer (1): 0,05 M Na-Phosphat (pH 5,0); analytische Säule ((8); LiChrospher® 60 RP-select B, 5 µm, 125 × 4 mm); Analysen-Puffer (2): 0,05 M Na-Phosphat (pH 4,0)/Acetonitril (80 : 20; V:V); Detektion UV 210 nm.

c) Analysenzyklus

Nach Injektion der Plasmaprobe (100 µl) durch den automatischen Probengeber (5) in Stellung "L" des Umschaltventils (6) gelangt die Probe mit Hilfe des durch die HPLC-Pumpe (3) geförderten Vorsäulen-Puffers ((1); Flußrate 0,5 ml/min) auf die Vorsäule (7). Der Analyt (Carbamazepin) wird von dem Trennmaterial der Vorsäule selektiv retiniert, während Matrix bestandteile, insbesondere Proteine, innerhalb von 12 Minuten in den Abfallbehälter (11) eluiert werden.

Nach Umschalten des Ventils (6) in Stellung "I" wird der Analyt mit Hilfe von der HPLC-Pumpe (4) geförderten Analysen-Puffers ((2); Flußrate 0,8 ml/min) innerhalb von 5 Minuten vollständig von der Vorsäule (7) eluiert und auf die nachgeschaltete analytische Säule (8) transferiert.

Nach Umschalten des Ventils (6) in die Stellung "L" erfolgt die analytische Trennung unter isokratischen Bedingungen (Flußrate 0,8 ml/min). Die eluierten Verbindungen werden im Detektor (9) gemessen und im Integrator (10) ausgewertet. Gleichzeitig wird die Vorsäule mit Hilfe der HPLC-Pumpe (3) für einen neuen Analysenzyklus konditioniert.

d) Ergebnis

In Fig. 4 sind die Elutionsdiagramme für
A: einen Kalibrator, der 0,5 µg Carbamazepin enthält, und
B: eine Plasmaprobe (Humanplasma), die ebenfalls 0,5 µg Carbamazepin enthält.

Wie ersichtlich, wird der Analyt in der Plasmaprobe vollständig wieder gefunden.

Claims

1. Dendrimere Pfropfpolymerisate auf der Grundlage von hydroxyl gruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß

a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
c) die Polymeren an den Verzweigungsstellen der dendrimeren Struktur Monomereinheiten der Formel II enthalten
d) die dendrimeren Polymeren Monomereinheiten der Formel III enthalten, worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
ein Rest X OH und der andere Rest X eine endständige Monomer einheit einer weiteren Polymerkette darstellt,
und
Y einen Rest, der einen Separationseffektor enthält,
bedeuten.

2. Dendrimere Pfropfpolymerisate erhältlich durch folgende Reaktions schritte:

a) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I auf einen hydroxyl gruppenhaltigen Basisträger in Gegenwart von Cer-IV-Ionen, worin
R¹, R² und R³, unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten,
b) zumindestens teilweise Umsetzung der Oxirangruppen in Diolgruppen;
c) Aufpfropfung von weiteren Monomeren, beispielsweise von weiteren Monomeren der Formel I, oder auch Monomeren, die Separationseffektoren enthalten, in Gegenwart von Cer-IV-Ionen;
d) optionale, auch mehrfache Wiederholung der Schritte b) und c);
e) Einführung von Resten mit Separationseffektoren, soweit diese nicht bereits durch die Aufpfropfreaktion mit Monomeren, die Separationseffektoren enthalten, eingeführt sind;
f) optionale Ringöffnung verbliebener Oxirangruppen.

3. Dendrimere Pfropfpolymerisate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Separationseffektor einen ionischen oder ionogenen Rest enthält.

4. Dendrimere Pfropfpolymerisate nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Rest Y nach Formel IV enthalten ist, worin
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5,
ein Rest Z OH und der andere Rest Z einen Rest, ausgewählt aus der Gruppe NR⁵R⁶, N⁺R⁵R⁶R⁷, PO₄H₂ und SO₃H,
und
R⁵, R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl, wobei einer oder beide Reste R⁵ oder R⁶ auch H sein kann,
bedeuten.

5. Dendrimere Pfropfpolymerisate nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Rest Y nach Formel VI enthalten ist, worin
W OH oder NHR⁸ und
R⁸ C₁-C₁₀-Alkyl, das mit einem Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäurerest substituiert ist,
bedeuten.

6. Dendrimere Pfropfpolymerisate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest Y einen Affinitätsliganden enthält.

7. Dendrimere Pfropfpolymerisate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest Y einen hydrophoben Rest enthält.

8. Verwendung von dendrimeren Pfropfpolymerisaten mit den Merk malen von Anspruch 1 oder 2 bei der Trennung von Gemischen mindestens zweier Substanzen, insbesondere zur Trennung von Biopolymeren, mittels Flüssigkeitschromatographie, insbesondere mittels Ionenaustausch-, hydrophober Interaktions- oder Affinitäts chromatographie.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei Analyte aus biologischen Matrices abgetrennt werden.

10. Verfahren zur Herstellung von dendrimeren Pfropfpolymerisaten, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

a) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I auf einen hydroxyl gruppenhaltigen Basisträger in Gegenwart von Cer-IV-Ionen, worin
R¹, R² und R3 unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten,
b) zumindest teilweise Umsetzung der Oxirangruppen in Diol gruppen;
c) Aufpfropfung von Monomeren der Formel I oder von Monomeren der Formel V auf die in Schritt b) entstandenen Diolgruppen in Gegenwart von Cer(IV)Ionen, worin
W OH oder NHR⁸
und
R⁸ C₁-C₁₀-Alkyl, das mit einem Amino-, Monoalkylamino-, Dialkylamino-, Trialkylammonium-, Carboxyl- oder Sulfonsäurerest substituiert ist,
bedeuten,
wobei die Schritte b) und c) einmal oder auch mehrfach wiederholt werden können,
und
d) Einführung der Reste, die die Separationseffektoren enthalten, soweit diese nicht bereits durch die Aufpfropfreaktion mit Monomeren der Formel V erfolgt ist.

11. Verfahren zur Trennung von Gemischen mindestens zweier Substan zen, insbesondere zur Trennung von Biopolymeren, mittels Flüssig keitschromatographie, insbesondere mittels Ionenaustausch-, hydrophober Interaktions- oder Affinitätschromatographie, unter Verwendung von dendrimeren Pfropfpolymerisaten mit den Merk malen von Anspruch 1 oder 2.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei Analyte aus biologischen Matrices abgetrennt werden.