DE19506887C2 - Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und hochreiner Total RNS - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen simultanen Isolierung von genomischer Desoxyribonu­ kleinsäure (DNS) und zellulärer Total-Ribonukleinsäure (RNS) aus unterschiedlichen Ausgangsmaterialien.

Es ist für eine Vielzahl von biologisch, molekularbio­ logisch, medizinisch-analytisch sowie biochemisch ar­ beitenden Laboratorien von großer Bedeutung. Damit sind Anwendungsgebiete der Erfindung die Molekular­ biologie, Biochemie, Gentechnik, Medizin, Veterinärme­ dizin und alle angrenzenden Gebiete.

Die simultane Isolierung von genomischer DNS wie auch zellulärer Total-RNS aus ein und demselben biolo­ gischen Ausgangsmaterial ist bis zum heutigem Zeit­ punkt an nur einige wenige praktizierbare Methoden gebunden. So beschreiben Raha, S. Merante, F., Prote­ au, G. und Reed, J. K. (GATA, 1990, 7(7): 173-177) eine Methode zur Trennung genomischer DNS und zellulä­ rer Total-RNS über selektive Präzipitationsschritte un­ ter Verwendung von Litiumchlorid. Eine weitere Mög­ lichkeit der simultanen Isolierung von DNS und RNS basiert auf Durchführung einer Ultrazentrifugation durch einen Zäsiumchloridgradienten zur Pelletierung der RNS und anschließender Dialyse der DNS aus der Guanidinium-Phase (Coombs, L. M., Pigott, D., Proctor, A., Eydmann, M., Denner, J. und Knowles, M. A.; Anal. Biochem. (1990); 188; 338-343). Ein solches Verfahren benötigt einen erheblichen zeitlichen (mindestens 48 Stunden) sowie apparativen Aufwand (Ultrazentrifu­ gationsentechnik, spezielle Spezialrotoren).

Ein z. Z. relativ häufig genutztes und auch kommer­ ziell verfügbares Verfahren beruht auf der Verwendung eines Reagenz aus Guanidinthiocyanat und Phenol. Das biologische Material wird in diesem Reagenz homoge­ nisiert, wobei sich die RNS nach Zugabe von Chloro­ form und durchzuführender Phasentrennung in der wäßrigen Phase befindet und aus dieser präzipitiert wird. Die zurückbleibende Interphase bzw. phenolische Phase enthält sowohl Proteine als auch genomische DNS. Durch Veränderung des pH Wertes und erneuter Phasentrennung soll die genomische DNS ebenfalls in die wäßrige Phase überführt werden und wird aus dieser wiederum präzipitiert. /Chomczynski, P., Biotechniques 1993, 15(3): 532-536/.

Prinzipiell muß nach dem Stand der Technik davon ausgegangen werden, daß die isolierte zelluläre Total- RNS in den meisten Fällen mit genomischer DNS kon­ taminiert ist.

So enthält die mittels dem von Chomcynski entwickel­ ten und genutzten Reagenz erhaltene wäßrige Phase neben der RNS auch genomische DNS, welche dann ebenfalls aus dieser Phase präzipitiert wird und sich damit in der finalen RNS-Präparation als kontaminie­ render Bestandteil befindet. Gerade die Kontamination isolierter zellulärer RNS mit genomischer DNS stellt für eine Vielzahl von weiteren Verwendungen der RNS ein gravierendes Problem dar.

So ist z. B. die Anwendung eines RNAse Protection Assays zwingend an eine DNS freie RNS gebunden. Ferner muß auch für eine Vielzahl von RT-PCR-Reak­ tionen die verwendete RNS frei von einer Kontamina­ tion mit genomischer DNS sein. So besteht z. B. bei Expressionsuntersuchungen von cDNS-Konstrukten in transgenen Organismen als auch bei Nachweisen der Expression intronloser Gene wie auch von noch unbe­ kannten Gensequenzen keine Möglichkeit nachzuwei­ sen, ob das resultierende PCR-Fragment aus der konta­ minierenden DNS oder aus der RNS amplifiziert wurde. Sowohl aus der genomischen DNS wie auch aus einer RNS abgeleitete Amplifikate hätten dieselbe Länge.

Dies zeigt die Bedeutung der Isolierung von genom­ ischer DNS-freier Total-RNS.

Ein weiteres Problem besteht in der Präparationsdau­ er zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total-RNS sowie in deren arbeitstechnischem Aufwand.

Das einzige z. Z. kommerziell verfügbare Isolierungs­ system benötigt für die Realisierung der simultanen Iso­ lierung beider Nukleinsäurefraktionen mindestens 3 Stunden und ist mit einem nicht unerheblichen Auf­ wand an notwendigen Reaktionsgefäßen und Feinche­ mikalien belastet. Weiterhin benötigen alle diese Me­ thoden auch eine relativ große Menge an biologischen Ausgangsmaterialien, so daß bei Vorhandensein von nur limitierter Mengen an Untersuchungsmaterialien mei­ stens eine simultane Isolierung beider Nukleinsäuren nicht mehr möglich ist.

Die Erfindung hat das Ziel, eine simultane Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total-RNS hoher Reinheit und ohne eine Kontamination mit genomischer DNS auch aus sehr kleinen Mengen (< 10⁵ Zellen; < 1 mg Gewebematerial) unterschiedlicher Ausgangsma­ terialien zu erreichen.

Das Verfahren soll sehr einfach handhabbar sein, nur geringe apparative Ausrüstung benötigen und es gestat­ ten, beide Nukleinsäurefraktionen sehr schnell wie auch aus sehr kleinen Mengen an Ausgangsmaterialien zu isolieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß An­ spruch 1 realisiert, die Unteransprüche 2-6 sind Vor­ zugsvarianten.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Total- RNS ist undegradiert und von exzellenter Qualität (OD₂₆₀ : OD₂₈₀ = 1.8-2.0). Von entscheidender Bedeu­ tung ist dabei, daß keine Kontamination genomischer DNS mehr vorliegt. Dies bedeutet einen erheblichen Vorteil gegenüber den meisten bisher Verwendung fin­ denden Präperationsmethoden. Auch die ebenfalls aus ein und derselben biologischen Probe isolierte genom­ ische DNS ist von exzellenter Qualität und für eine Vielzahl weiterer Verfahren als Substrat verwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich weiter­ hin durch seine Einfachheit aus, benötigt nur geringe Mengen an Feinchemikalien wie auch Zentrifugengefä­ ße und minimiert auch die Menge und notwendige Zeit­ dauer des Umganges mit toxischen organischen Solven­ tien (benötigt nur einen Phenol/Chloroform Extrak­ tionsschritt). Das Verfahren gestattet es, sowohl genom­ ische DNS als auch zelluläre Total-RNS innerhalb von weniger als 1,5 Stunden zu isolieren. Dies bedeutet eine drastische Reduzierung der Präparationsdauer im Ver­ gleich zu dem z. Z. kommerziell angebotenen diesbezüg­ lichen Verfahren. Die Bindung der Desoxyribonuklein­ säure erfolgt an der Oberfläche der im Anspruch 1 näher beschriebenen hochdispersen und nichtporösen Feststoffpartikel. Die Bindung der Desoxyri­ bonukleinsäure an das verwendete Trägermaterial wird durch die chaotropen Salze des Lysepuffers vermittelt. Die Lyse der Ausgangsmaterialien und die Bindung an das Trägermaterial erfolgen im selben Reaktionsgefäß.

Das sehr einfache und nur wenige experimentelle Schritte umfassende Verfahren ist in idealster Weise für eine breite Anwendung in medizinischen Diagnostik- Laboratorien geeignet und steht in diesem Zusammen­ hang such Anwendern zur Verfügung, welche nicht über spezielle molekularbiologisch-biochemische Kenntnisse verfügen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist u. a. die Voraussetzung gegeben, aus limitierten Mengen an Un­ tersuchungsmaterialien sowohl die DNS als auch die RNS zu isolieren. Dies erlaubt Untersuchungen von Ge­ nen (DNS-Untersuchung) und deren Expression (RNS- Untersuchung). Vor allem quantitative Abnormitäten von Genen und deren RNS-Expression scheinen eine wesentliche Bedeutung von Vorgängen während der Kanzerogenese und Metastasierung wie auch bei der postoperativen Progression von Tumorpatienten zu spielen. Die Möglichkeit des Findens korrelativer Zu­ sammenhänge bezüglich der Anzahl bestimmter tumo­ rassoziierter DNS-Sequenzen, deren Struktur (Se­ quenzinformation) und deren Expression (RNS) ist so­ mit von entscheidender Bedeutung für ein besseres Ver­ stehen von Zusammenhängen pathogener Mechanis­ men.

Ferner erlaubt eine Methode der simultanen Isolie­ rung von DNS und Total-RNS auch die Untersuchung unterschiedlicher Spleißing-Mechanismen (z. B. Alter­ natives Spleißen, Trans-Spleißen). Die Untersuchung von Spleißvorgängen hat sowohl im Bereich der Grund­ lagenforschung (Untersuchung von Vorgängen der Genregulation) wie auch auf medizinischen Gebiet (Aufklärung immunologischer Phänomene bei parasitä­ ren Erkrankungen; z. B. nach Infektion mit Afrikani­ schen Trypanospomen) ebenfalls eine große Bedeutung.

Die Mehrzahl solcher Studien scheitert am Fehlen eines geeigneten methodischen Instrumentariums zur simultanen Isolierung von DNS und RNS, vor allem bei Vorhandensein nur geringer Mengen an Untersu­ chungsmaterialien.

Mit den erfindungsgemäßen Verfahren besteht die Möglichkeit der simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total-RNS aus bakteriellen Lysaten, aus Zellkulturen, intakten oder gefrorenen Gewebepro­ ben, Spermien, Körperflüssigkeiten, Pflanzenzellen, He­ fezellen sowie Blutserum, Blutplasma und Vollblut.

Die erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten erlau­ ben die simultane Isolierung beider Nukleinsäuren (DNS und RNS) mit einem extrem geringen zeitlichen sowie apparativen Aufwand.

Es ist keine zeitaufwendige Proteinase-Verdauung notwendig. Der geringe zeitliche Aufwand der simultan­ en Isolierung von DNS und RNS aus ein und demselben Ausgangsmaterial stellt für eine Vielzahl von potentiel­ len Anwendern eine enorm wichtige Größe dar und bedeutet damit einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Verfahren. Die Eigenschaft des verwendeten Lysepuffers, sowohl die zelluläre Integrität zu zerstören wie auch endogene wie exogene DNasen und vor allem RNasen hochpotent zu inaktivieren, gestattet es dar­ über hinaus, DNS und RNS aus Frischpräparaten unter Feldbedingungen (z. B. bei Expeditionen, nach Opera­ tionen) zu isolieren, ohne zusätzliche Kühlbedingungen unter Lysepuffer zu lagern und zu transportieren und die Ribonukleinsäuren ohne Verlust ihrer biologischen Aktivität einer weiteren Verwendung zuzuführen.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Simultane Isolierung genomischer DNS und zellulärer Total RNS aus einer eukaryontischen Monolayer-Zellkultur (25 cm² Flasche; ca. 5 × 10⁶ Zellen)

Lyse der Zellen durch Zugabe von Lysepuffer (Gua­ nidiniumthiocyanat; N-Lauroyl-Sarcosin; DTT; Natriumci­ trat) und Überführung der Zell-Lyse-Suspension in ein 1.5 ml Eppendorf-Zentrifugengefäß. Zugabe des Trä­ germaterials zur Zell-Lyse-Suspension, kurzes Vorte­ xen, Inkubation für 5 Minuten in einem Eisbad und an­ schließende Pelletierung des Trägermaterials durch kurze Zentrifugation in einer Tuchzentrifuge (30 Se­ kunden).

Überführung des Überstandes in ein neues Eppen­ dorf-Zentrifugengefäß und Zugabe von Phenol (wasser­ gesättigt oder Tris-gepuffert), Chloroform und Natri­ umacetat und 5 minütige Inkubation auf Eis. Nach er­ folgter Phasentrennung durch Zentrifugation wird die obere wäßrige Phase in ein neues Eppendorf-Zentrifu­ gengefäß überführt, mit einem gleichem Volumen Iso­ propanol versetzt und zur Präzipitation der RNS für 20-30 Minuten bei -20°C inkubiert. Die am Träger­ pellet gebundene genomische DNS wird während der Isopropanolfällung der RNS mit Waschpuffer (50 mM NaCl; 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; 70% v/v Ethanol) versetzt und gewaschen und anschließend die genom­ ische DNS durch Zugabe eines Elutionspuffers (Tris; EDTA) bei 52°C vom Trägermaterial abgelöst, der Trä­ ger durch kurze Zentrifugation von der eluierten ge­ nomischen DNS abgetrennt und diese in ein neues Reak­ tionsgefäß überführt.

Das nach Inkubation bei -20°C und anschließender Zentrifugation erhaltene RNS-Pellet wird zweimal mit 70%igem Ethanol gewaschen und nach erfolgter voll­ ständiger Entfernung des Ethanols das Pellet in RNase freiem TE-Puffer oder DEPC-behandeltem Aqua Bidest aufgenommen.

Claims (6)

1. Verfahren zur simultanen Isolierung von genomischer DNS und zellulärer Total- RNS durch

• 1. Lyse von diese Nukleinsäuren enthaltenden Materialien mittels chaotroper Salze, aus der Gruppe Guanidiniumthiocyanat und Guanidinhydrochlorid, mit Ionenstärken größer als 4-molar
• 2. Inkubation des Lysates mit einem mineralischen Träger, wobei als Trägermaterialien zur Bindung der genomischen DNS hochdisperse, nichtporöse SiO₂-Partikeln mit einer Korngröße von 7-40 nm, vorzugsweise 40 nm, bei einer spezifischen Oberfläche von 50-300 m²/g, vorzugsweise 50 m²/g eingesetzt werden, sowie
• 3. einerseits Separation des Trägers mit der gebundenen genomischen DNS von dem RNS enthaltenden Lysat durch Zentrifugation, Waschung des Trägers mit einem Waschpuffer und Ablösung der trägerfixierten genomischen DNS vom Trägermaterial mit einem Puffer geringer Salzkonzentration,
• 4. andererseits Zugabe definierter Anteile von Phenol, Chloroform und Natriumacetat zum Lysat und Präzipitation der Total-RNS nach Phasentrennung aus der wäßrigen Phase durch Zugabe von Isopropanol.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit der fixierten genomischen DNS vom Lysat durch einen kurzen Zentrifugationsschritt abgetrennt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die am Träger gebundene genomische DNS mit einem Waschpuffer, bestehend aus 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA sowie 70% v/v Ethanol, gewaschen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die trägerfixierte genomische DNS mit einem Puffer niedriger Salzkonzentration bestehend aus 10 mM Tris HCl und 1 mM EDTA bei einer Temperatur von 48-56°C, vorzugsweise 52°C, eluiert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Batch-Verfahren durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als chromatographisches Verfahren durchgeführt wird.