DE1949314A1 - Prothrombinkomplex und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Description

DR. W. SCHALK· DIPL.-ING. P. WlRTH · DIPL.~I NC. G. DAN NENBERG DR. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEINHOLD

6 FRANKFURT AM MAIN

OR. ESCHENHEIMER STR. 39

Baxter Laboratories, Inc. I-lorton Grove, 111., USA

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Protfarombinkomplex und Verfahren zu dessen Herstellung.

Die vorliegende Erfindung "bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Prothrombinkomplexes, .welcher die folgenden Koagulierungsfaktoren enthält: Prothrombin (Faktor II), Prokonvertin (Faktor VII), .Antihämophiliefaktor B (Faktor IX) und Stuart-Prower-Faktor (Faktor X),

Der Vorgang der Blutgerinnung ist ein komplizierter physiologischer Vorgang, in dem zahlreiche, im normalen G-esarafdLut enthaltene Substanzen mitwirken. Es ist bekannt, daß bei manchen Individuen bestimmte, mit dem BlutgerInnungsmechaniamus zusammenhängende FaIc tor en nicht vorhanden oder in ernsthafter Weise unzureichend sind. Unter diese Substanzen fällt der Antihämophiliefaktor B (Faktor IX), der auch als Pla^rnathromboplastinlcomponente (PiDC) oder Chris tmas-FaIctor bekannt ist. Bei Individuen, die an angeborener Hämophilie (als Hämophilie B bekannt) leiden, fehlt dieser Faktor teilweise oder ganz im Blut.

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Hehrere andere Faktoren, die in dem Gerinnungstnechanisraus -■■"-' von Bedeutung sind, sind die Faktoren II, ViI und X. - ^; -

\Ile Faktor IX sinci auch diese" anderen Faktoren bei bestimmten Individuen nur unzulänglich oder überhaupt nicht vorhanden.

Es v/urde /bereits erkannt, daß ein Piasinakonzentrat, das eine Kombination von mehreren oder allen vorerwähnten Faktoren enthält, für die Behandlung von Patienten, die unter einet·? !•!angel an diesen Faktoren leiden, sehr nützlich ist.- So ist bereits die Herstellung eines Prothrotnbinkomplexes aus frischen Plasma durch Bäriurcsulfatadsorption in der US-Patentschrift 2 999^X 791 und durch Iricalciuiaphosphatadsorption von Soulier et al, in "La Presse Kedicale", 72,, Seite 1223-28.(1964) beschrieben worden. In Brit. J. Haefiiat. 15, Seite 568-80 (1967). wird die Herstellung eines Pro tJb.ro rnbinkoraplexes aus einer an G-lobulin reichen Fraktion, welche als G-p bezeichnet - von Bidwell et al beschrieben. Die G-O-Fraktion wird danach durch Alk ο ho laus fällung von Plasraa erhalten, v;onach diese weiter fraktioniert wird, ura einen Prothrombinkoaplex durch die Tricalciumphosphatadsorptioii und die Behandlung mit Diäthyläther bei niedrigen (Eeaperaturen zu erhalten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines", neuen Verfahrens zur Herstellung eines Prothrombinkoraplexes von hoher Wirksamkeit für intravenöse Injektionen.

Der hier verwendete Ausdruck "Prothroabinkomplex" bezieht sich auf ein Konzentrat von Blutproteinen, die in dem Gerinnungsprozess wirksam sind und. hauptsächlich die Faktoren ΪΙ, Vrr> IX" und X umfassen. ." " ·

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Brfindungsgema^ wird ein neuer Prothrombinkonplex aus der Cohn-Plasma-Praktionlll hergestellt. Colm-Plasma-Fraktion III is-t im wesentlichen eine Beta- und Gamna-Globulinfraktion des Blutpiasaas, die durch die alln&hlichenAus fällung ait kalten Xthanol erhalten v/ird. Die Cohn-Placraa-Fraktion III wird-in J.Anj.Cherc.Soc»y., €8, Seite 495-575 (1946) näher beschrieben.

3in "besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin au sehen, daß die verwendete Cohn-Plasna-Fraktion III für den gewünschten Zweck sowohl aus altem als auch neuem .Plasma

. erhalten werden kann. Auf die.se Veise kann eine alte Plasmafraktion, welche sonst als unbrauchbar verworfen würde erfindungsgetnä3 als ein Ausgangsraaterial verwendet v/erden.

Bei dem erfindungsgenäßen Verfahren wird die Cohn-Plastna-Fraktion III in eine wässrige Suspension, vorzugsweise in norcale, physiologische Salzlösung (eine wässrige Lösung von etwa 0,85/S Salz) gebracht, der pH-Wert auf einen viert zwischen etwa 7,0 und etwa 7,4 eingestellt, die erhaltene Suspension abgetrennt und dreibasisches Calciuraphosphat mit dem überstehenden Anteil (supernatant) gründlich" vermischt, um die Koagulierungcfaktoren zu adsorbieren. Der erhaltene niederschlag aus dreibasischen CaIciunphosphat cit adsorbierten Protein v/ird dann rr.Lt etwa 0,1 ra bis etwa 0,2 tn Srinatriumcitrat gründlich vermischt, urn die Koagulierungsfaktoren su eluieren, und der erhaltene überstehende Anteil wird von der* dreibasischen CaI oiutnphosp hat teilchen abgetrennt. Der überstehende Anteil, vorzugsweise nach Verdünnung mit "".iasser auf etwa das Doppelte seines Volumens, v/ird zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen mit kalter. Äthanol zur Ausfällung, line] zwar suerst bei einen pH-VTert von etwa 6,8, einer Endkoiisentration von etwa 14$ bis etwa 16£ Äthanol ur.d etwa -5⁰C unter Retention des überstehenden Anteils, unc vlnriii bei einen pH-Y.^rcrt von etwa 5-,2 einer Sr*:: konzentrat!

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"vonetwa 25$ .Äthanol und, etwa -7⁰G "unter Retention der Aus-'•£ällii£ig.,.-"uiitei^t\yoⁱrif^l-en". Die Ausfällung, welche den aktiven ' ProthrorabinkOmplex enthält, wird dann in mit Citrat versetztem Salz auf .ein Volumen von weniger als etwa 1/200 des Volumens "des ursprünglichen Plasmas suspendiert, welche den Komplex •enthält. ;■■.- ---■""'. "-'■"" ^: ' : v. ■

Pur das 'hier beschriebene Vorfahren ist es wichtig, daß eine Peilungsstufe erfolgt^:nachdem die Paste der eingesetzten Cohn-Plasma-Fraktion III in Suspension gegangen ist. Während die ser Stuf e, v/er den üne rwüns eh te verunr e inigende Pr ο te ine, die aus dem vorangegangenen Fraktionierungsvor"gang zur Her- . stellung "der- -Gohn-Plasma-Prafction III mitgeführt worden waren, entfernt.Der ursprüngliehe- pH-Wert der suspendierten Paste der Cohn*-Pla,sma-?raktion III beträgt etwa 5,4 und die Pällungsstufe wird ^durchgeführt, indem der pH-Wert dieser Suspension ait^ einem""-alkalischen Reagenz auf einen Bereich zwischen etwa 7*0 und etwa^ 7,4erhöhtv/ird. Ein bevorzugter alkalischer Reagenz ist: eine wässrige Lösung von etwa 1 η Natriurahydroxyd» Andere übliche: alkalische Reagenzien^ z.B. eine lOprozentige wässrige Lösung von Fatriumbikarbonat, können anstelle des ITatriumhydroxyds auch'verwendet werden* ^:--'.■

!fach der Abtrennung der in. der Fällungsstufe erhaltenen Ausfällung, vorzugsvre I se durch Zentrifugieren, kann die Adsorption des überstehenden Anteils durch Zugabe einer geringen Menge an drei basisch.etn GaI ciumphosphat dur chgefuhr t werden. Das erflridungsgemäS verv/endete dreibasische CaIciumphosphat "ist ein' polymeres Material, das durch die-Formel 10CaO.5P₂O5«ft₂0 öder/auch der-Formel Ga₁₀(OH)2(PO^)₆ - V

definiert werden kann. Die Verwendung von etwa 0,5 bis etwa. ■ 2 G-ew.f$ des· dreibäsischeh Calciumphosphats ist für. die Adsorp- ■ tion der Eoagullertingsfalctoren geeignet, und eine Konzentration von etwa 1$ wird bevorzugt* Vorzugswelse mischt man das drei* '

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basische Galciumphosphat etwa 15 Ms etwa 30 Min. mit dem überstehenden Anteil, um eine praktisch maximal'e Adsorption der Koagulierungsfaktoren zu gewährleisten. .

Die an dreibasischera Galciumphosphat adsorbierte Protein- ausfällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und dann in Trinatriumcitrat, vorzugsweise auf ein Volumen von etwa Ί/50 des Volumens des ursprünglichen Plasmas, suspendiert«' Eine wässrige Lösung aus 0,1 Mol Trinatriumeitrat wird für dio Eluierung der Koagulierungsfaktoren aus dem dreibasischen CaIeiuraphosphatadsorbens bevorzugt. Die Ausfällung wird in dem Irinatriumeitrat, vorzug.swe.ise unter ständigem Rühren von etwa 15 bis etwa 30 Minuten,suspendiert, damit eine praktisch maximale Eluierung der Koagulierungsfaktoren erreicht wird. Die Trennung der eluierten Kagulierungsfaktoren von den Tricalciumphosphatteilchen wird vorzugsweise durch Zentrifugation unter konstantem Rühren während des Zentrifugieren? durchgeführt.

Fach der· Entfernung der Ausfällung von dreibasischem Galciumphosphat wird vorzugsweise ein Antikoagulierungsmittel, zum Beispiel Heparin, der Lösung zugesetzt. Es werden etwa zwei bis drei Einheiten (US-Pharmacopoeia) von Heparin auf 1 ml verwendet. Zusätzliche Mengen an Koagulierungsmittel von etwa 1 bis etwa. 10 Einheiten per ml werden dann der erneut suspendierten Ausfällung im Anschluß an die zweite. Alkoholausfällung zugesetzt.

ITach der Durchführung von zwei Alkoholaus fällung en wird die erneut suspendierte Alkoholausfällung, welche den aktiven Prothrombinkomplex enthält, nach der Einstellung des pH-^T;.^rertes auf etwa 6,3, vorzugsweise Xyophilisiert und filtriert, um irgendwelche unerwünschten Teilchen zu entfernen und gleichzeitig ein steriles Produkt ohne

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Erhitzen au erhalten. Das trockene, lyophilisierte Produkt ist staMl und kann mit Wasser vor der Verwendung zur intravenösen Verabreichung-neu formuliert werden. Die Anwendung der intravenösen Verabreichung des Prothrorabinkomplexes erfolgt zur "temporären Einstellung der "Faktoren II, VII, JX und X in Personen, bei denen diese Faktoren unzureichend sind, ura Blutungen zu beheben und/oder zu erwartende Blutungen zu verhindern, z.B. bei mit Leber erkrankungen verbundenen Blutung sstörungen und Harnοrrhagieerkrankungen bei Heugeborenen.

Die folgenden Beispiele dienen zur v/eiteren Erläuterung der Erfindung. Die angegebenen Mengen, und Prozentangaben beziehen sieh, wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

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ine Paste aus Cohn-Plasaa-Praktion III aus frischem Plasma wird in 0,85^iger Salzlösung auf ein Volumen suspendiert, das 1/5 des ursprünglichen Plasaavolumens ent spricht, und dann gerührt, um eine homogene Suspension zu bilden. Der pE-V/ert der Suspension wird dann· mit einer .'"!Obigen wässrigen Lösung von Natriumkarbonat auf 7,2 eingestellt. Die Suspension wird zentrifugiert und zu dem überstehenden Anteil wird dreiba-, sisches Caleiumphosphat bis zu einer Konzentration von 15» zugefügt. ITach 30 Minuten langem Mischen wird die Suspension zentrifugiert. Die erhaltene CaIciuiaphosphatausfallying wird dann in 0,1.. τη Trinatriumzitratyjund zwar in einem Volumen, das 1/45 des ursprünglichen Piasmavolumens entspricht, suspen diert, lach 30minütigem Mischen bei 5°C wird die Suspension zentrifugiert, um die Teilchen aus dreibasisehern Calciumphosphat zu entfernen. Dem überstehenden Anteil wird nun Heparin bis zu einer Konzentration von drei Einheiten pro ml zugefügt. Gleiche Volumen teile Wasser v/erden dann zugefügt und der pH-Wert mit 2 η Essigsäure auf 6,3 eingestellt.

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Uo eine Enckonzentration von 16$ herzustellen, v/ird Äthylalkohol zugesetzt, während die' Temperatur allmählich auf -5⁰C herabgesetzt v/ird. Die sich bildende Ausfällung wird verworfen. Der überstehende Anteil wird dann auf einen pH-Wert von 5, 2 eingestellt und Äthylalkohol in ausreichender Menge zugefügt, um eine Sndkonzeiitration von 25^f/> bei Herabsetzung der Temperatur auf -7⁰C zu schaffen. Diese Suspension wird zentrifugiert und die neu gewonnene Ausfällung in mit Zitrat versetzter Salzlösung (ein Teil 0,1 m ITatriumzitrat auf 9 Teile einer 5$igen ITatriurachloridlÖsung) in einero Volumen, das etwa 1/225 des ursprünglichen Plasraavolumens ' \

entspricht, gelöst. Der pH-Wert v/ird Mt 1 η JTatriurahydroxyd -. auf 6,8 eingestellt. Heparin wird in einer Menge- von 3 Sinhei- ! ten pro ral zugefügt und die Lösung durch eine Serie oder \.

Kombination von ililliporon-Pil tern mit abgestuften PorengrÖ !Ben . \ filtriert. Unter aseptischen Bedingungen wird die Lösung j

in sterile G-lasflasche:i( 100 ml) in Einheiten von 20 :.:1 Lösung ϊ pro Plasche gefüllt. ITach Gefrieren ("she 11 -freezing") und Trocknen im gefrorenen Zustand unter aseptischen Bedingungen werden die Flaschen mit sterilen Stopfen unter Vakuum verschlossen und mit einer Kappe versehen. Das nach diesem Beispiel hergestellte Trockenprodukt kann zur intravenösen Injektion verwendet v/erden, nachdem es mit 20 ral sterilem Wasser pro Einheit Trockenprodukt neu formuliert wurde.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß die Paste aus Cohn-PlasDa-Praktion III aus altem Plasma anstelle von frischem Plasma gewonnen v/ird. Das Plasma wird aus einem . _;

Plasmavorrat, der zwischen etwa zwei Wochen und etwa zwei Ilona ten alt ist und bei -25⁰C für verschiedene Zeitdauer V bis zu neun Wochen vor der Verarbeitung nach dem Verfahren von Beispiel 1 gelagert worden war, entnommen. Der auf diese Weii;c hergestellte Protnrombinkcraplex wird nach erneuter Por:.ralierurLg mit sterilem Wasser wie folgt untersucht:

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a) Faktor-II-Gehalt. Die Lösung wird auf Prothrombinwirksaakeit nach den'Methoden von Ware und Seegers (Am. J. Clin». Pathol.., 19, Seiten 471-82,(1949) und Wagner et al (in "Blood Coagulation, Hemorrhage and Thrombosis" ,herausgegeben von Tocantins und Kazal, Verlag Grüne and Stratton, New York, Seiten 159-165) untersucht* - _: . .

b) Falctor-IX-Gehält. Die Lösung v/ird auf. PlC-V/irksatakeit nach dem Verfahren der "kaolin-activated partial thromboplastin time correction", beschrieben, in "Hyländ Reference I'Ianual of Coagulation Procedures",(Herausgeber Hyland Laboratories, Los Angeles, California, Seiten 19-21, ^ 1964) untersucht.

c) Throrabinwirksarakeit. Das Vorhandensein von Thrombin wird untersucht, indem die Fällungszei t des erneut mit CaIcium versetzten normalen Plasmas bei verschiedenen Verdünnungen nach dem Verfahren von Biswell and Dike, beschrieben in "Treatment of Hemophilia and Other Coagulation Disoaders" (herausgegeben von Biggs und MacFarlane, Verlag F.A. Davis & Co., Philadelphia, Seiten 62-69, 1966), bestirarat wird.

d) Gesaratproteingehalt. Der Ge sam tprö te ingehalt wird durch UV-Absorption^ bei einer'Wellenlänge von 280 mv. bestiramt.

Auf grund der oben genannten Versuche vnarde festgestellt, da(3 der Prothrombinkomplex in diesem Beispiel ohne Thrombinv/irksaskeit ist und etwa 7,84 rag an Protein pro ml (Durchschnitt von vielen Ansätzen) enthält. Die durchschnittliche Wirksaakeit des Faktors IX dieser Ansätze betrug etwa das Zehnfache derjenigen einer gleichen Volumenraenge von normalem Gesaratplasina. Die durchschnittliche Wirksamkeit des Faktors ΪΙ die ser Mengen betrug etwa das Fünffache der jenigen einer

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gleichen Volumenraenge von normalem Gesamtplasma. Da normales Gesamtpia sin a etwa 70 mg an Protein pro ml enthält, ist die Wirksamkeit des Palet or "s "IX "in dem ProthromMnkomplex dieses Beispiels nur in etwa 1/90 der im Plasma anwesenden Menge ■an Protein enthalten, die eine gleiche Wirksamkeit hinsiehtlieh des Faktors IX aufweist ..Die Wirksamkeit des Faktors II ist in nur 1/45 der im Plasma anwesenden Menge an Protein, die die gleiche Wirksamkeit hinsichtlich des Faktors II aufweist, enthalten« ."■..-."■■

Der ProthromMnkomplex des oMgen Beispiels zeigt ebenfalls ein hohes Wirkungsniveau in Bezug auf die Faktoren YII und X verglichen mit. den im normalen Gesamtplasma festgestellten Werten. Diese Faktoren werden gewöhnlich zusammen "bei der Bestimmung des Prokonvertin-Stuart-Prower-iCoraplexes gemessen.

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Claims (6)

1. Patentansprüche

   Verfahren zur Herstellung eines Prothrombinkomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert einer wässrigen Suspension der Cohn-Plasma-Fraktion III auf einen Bereich zwischen etwa 7,0 und etv/a 7,4 einstellt, die erhaltene Suspension abtrennt und den überstehenden Anteil mit dreibasischem Calciumphosphat zur Adsorption der Koagulierungsfaktoren gründlich vermischt, worauf man den erhaltenen Niederschlag aus dreibasischem Calciumphosphat mit adsorbiertem Protein mit Trinatriumzitrat gründlich vermischt, um die Koagulierun^sfaktoren zu eluiere^, die erhaltene Suspension abcrennt und den überstehenden Anteil zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen nit kaltem Äthanol zur Ausfällung unterwirft, und zwar zuerst bei einem phV<7ert von etwa 6,8, einer Sndkonzentration von etwa 14 $ bis etwa 16 fo Äthanol und etwa -5⁰C. unter Bentention des Überstehanden Anteils, und dann bei einem pH-V/ert von etwa 5,2, einer Sndkonzentration von etwa 25 i° Äthanol und etv/a -7 C unter Betention der Ausfällung.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet", da'.; die \Cohn-Plasma-Fraktion-III aus altem Plasma gewonnen //erden ist.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Cohn-Plasma-Jraktion III aus frischem Plasma gewonnen worden ist. ■ "■ ' ■
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 — 3, dadurch '-gekennzeichnet,; da;3 der aktive Prothrombinkomplex zusätzlich in nit Zitrat versetzter Salzlösung' auf ein Volumen von weniger als etwa

   " I/200 des Volumens des ursprünglichen Plasmas, welches den Komplex enthält, suspendiert wird.

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5. 5· Verfahren nach Anspruch 1 - 4 , dadurch gekennzeichnet, da3 eine zusätzliche Lyophilisierungastufe angewendet v/ird.
6. 6. Prothrombinkomplex hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1-5.

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