DE1768814A1 - Neue Peptide mit ACTH-Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Neue, vollständige für den Druck der OffenlegungsBChritft -be-'

stimmte Anmeldungsunterlagen

Aktenzeichen: P 17 68 814.1 - 42 U. Zeichen : 21 336-BR/H - Case 6225/1+2

Anmelder : CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz) * ._; Case 6225/1+2

Deutschland 17688 H

Neue Peptide mit ACTH-Wirkung und Verfahren zu ihrer

Herstellung.

Im Hauptpatent Nr. (Anm.Nr. C36439 IVb/l2qu) Case 5503) sind Peptide beschrieben, die sich durch eine verstärkte ACTH-Wirkung auszeichnen und die sich von den bekannten Peptiden mit ACTH-Wirkung dadurch unterscheiden, dass sie am Arninoende als erste α-Aminosäure eine D-Aminosäure aufweisen.

u 4 O.

Neue Unteriagen

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Als Peptid mit sehr guter ACTH-Wirkung ist im Hauptpatent das H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hir.-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-OH (D-Ser¹·^¹"¹?-

ti

Corticotropin) beschrieben.

Es wurde nun gefunden, dass Nonadekapeptidamide, die an Stelle der Argininreste in 17-l8-Stellung Lysinreste und an Stelle des Prolinrestes in 19-Stellung den Valinrest und gegebenenfalls statt des Methionrestes den Norleucinrest enthalten, eine bessere adrenocorticotrope Wirkung aufweisen. Die neuen Peptide weisen eine C-terminale Amidgruppe auf.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher C-terminale Amide des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylgly cyl -L-lysyl -L-prolyl -L-valy 1 -gly cy 1 -L-Iy sy I -L-ly"syl -L-lysyl-L-lysyl-L-valins und der entsprechenden Verbindung, die statt des Methioninrestes den Rest des Norleucins aufweist, ihre Säureadditionnsalze und Komplexe und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, und höhere Fettsäuren, wie z.B. Stearinsäure, Palmitinsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.

Unter Komplexen sind die komplexartigen, in ihrer

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Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer

Stoffe zu adrenocorticotrop' wirksamen Feptiden entstehen und vor allem diejenigen, die ihnen eine verlängerte Wir*

* r

. kung verleihen. Solche anorganische .Stoffe sind Verbindungen,, die sioh von Metallen, wie Calcium, Magnesium,.Aluminium, /

Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwer*

lösliche Salze, wie Phosphate und Fyrpphosphate sowie.Hydroxyde dieser Metalle. Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Oxypolygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextrin, Polypheno- -len und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretlnphosphat und ·.-·. Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von \

Aminosäuren, z.B. Protarain,und insbesondere von Aminosäuren,' ■' die einen überwiegenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie aiutarainsäüre oder Asparaginsäure« aufweisen. ·

, ■■ . Die neuen Verbindungen besitzen, wie bereits er- ■ . 'wähnt, eine wesentliche stärkere ACTH-Aktivität als die ent- ,'■ sprechenden Verbindungen mit L-Konfiguration an der ersten Aminosäure. Sie sollen dementsprechend.in der Human- und ;. Veterinärmedizin verwendet werden, z.B. an Stelle des natUrv liehen·Hormons,·/:·.,·'.,,..·;.·. ' . " - ·. , ·' ' "'

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Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Peptide ist dadurch gekennzeichnet, dass man aus C-terminalen Amiden des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl L-methionyl-L-; glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-Iysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-L-lysy1-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valins oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Methioninrestes den Rest des Norleucins aufweist, in welchen Peptiden mindestens die a-Aminogruppe und die Seitenketten-aminogruppen und -carboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und, wenn erwünscht, die erhaltenen Verbindungen in ihre Säureaddibionsalze oder Komplexe überführt. · . .

Die Ausgangsstoffe werden nach den für die Herstellung von Peptiden mit grosser Kettenlänge bekannten Methoden hergestellt. . ·

Als Sohutzgruppen benutzt man vor allem die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen oder neu vorgeschlagene Gruppen, z.B. diejenigen der Anmeldung Nr. C44387 IVb/l2qu (Case 6IO6/I-3)· So verwendet man z.B. als Schutzgruppen für Aminogruppen gegebenenfalls substituiate Triphenylmetiylgruipein oder Acylgruppen wie Pormyl- Trifluoracetyl, Phthaloyl, Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl, Benzylsulfonyl, Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl oder insbesondere von der Kohlensäure oder Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls in den aromatischen Resten durch Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl-, Niederalkoxy- oder Niedercarbalkoxygruppen sub-

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stituierte araliphatlsche Oxycarbonylgruppen wie Carbobenzoxygruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, p-Methoxycarbobenzoxy, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl oder p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, oder die neuen In der Anmeldung G.Nr. IO73/67 beschriebenen araliphatischen Oxycarbonylgruppen wie 2-Phenyl-lsopropyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenyl-isopropyloxycarbonyl, ferner aromatische Oxycarbonylgruppen wie Tolyloxycarbonyl oder aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonye, tert.Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, vor allem aber tert.Butyloxycarbonyl, ferner z.B. Carbamoyl, Thiocarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl und -thiocarbamoyl. . ■ .

Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Aethanol, CyanmethyIalkohol oder Insbesondere tert.-Butanole ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.B. gegebenenfalls substituierte Benzylalkoho-Ie wie p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, Phenole und Thiophenole wie p-Nitrothiophenol, 2,4,5-Trichlorphenol, p-Cyanphenol, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B. N-Hydroxysuccinimid und N-Hydroxyphthalimid.

Die Hydroxygruppen der . Seitenketten, z^B. der Serin und/oder Tyrosinreste können z.B. durch Veräthorung,

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beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert.r Butanol geschützt werden, sie brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guan,ldinogruppierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe. und die Tosylgruppe zur Anwendung, doch braucht die GuanidJ/-..nogruppe nicht geschützt zu werden. Ebenso braucht die Imino«

gruppe des Histidine nicht unbedingt geschützt zu werden, '■' jedoch kann es vorteilhaft sein, die zu schützen,. z.B. durch" Benzyl, Trityl, Adaraantyloxycarbonyl oder die in Ber. 100 (1967), 3838 - 3849 beschriebenen a,2,2-Trifluor-l-tert,-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder -1-benzyloxycarbonylaminoäthylgrup.-pen. Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgt in bekannter Weise durch Hydrogenolyse oder Hydrolyse, vor allem saure Hydrolyse, in einer einzigen oder gegebenenfalls in mehreren Stufen.

Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe werden die Aminosäuren in der gewünschten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter ct-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier ct-Aminogruppe und freier oder geschützter, z.B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe, umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter cc-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxyl-

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gruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid, -isoxazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethyle.ster, Carboxymethylester, p-Niti<ophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentaehlorphenylesfcer, N-Hydroxysuecinimidester, N-Hydroxyphtalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N¹-Carbonyl-diimidazols aktiviert werden, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphitamid aktiviert werden; Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhy- ; dridmethode, ferner die Merrifield-Methode.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie, funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht ab- ;j

spaltbarer Reste, wie oben erwähnt.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen k önnen in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen S werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung i

mit Säuren die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze Geeignet sind. Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispiels-

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weise Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder Thiocyansäure, Schwefel- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymale;Lnsäure, Benzoesäure,-Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Salicylsäure, 4-Amino· salicylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure,' Kydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfanilsäure.

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BAD

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- 9 -■■ j- ■' ν. '■' .;·.,.

Die verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können . · in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. ,;. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem' für die

enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen« organischen oder anorganischen Trägermaterial_f Für dasselbe kommen solche Stoffe in Fr&£e, die mit den Polypeptiden ni'oht reagieren, wie z.3. .Gelatine, Milchzucker, GIu- . kose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche .'·.· OeIe, Benzylalkohole. Gummi, Polyalkylenrgiykole, Vaseline, ■.. ■ Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die ■ pharmazeutischen Präparate könnsn z.B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw; oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierung-, Stabilisier.

rungs-, Netz-oder Emulgiermittel. Sie können auoh noch andere ■ ■ ■ ' »

therapeutisoh wertvolle Stoffe enthalten. ·

So kann man sie beispielsweise auch mit den in der ACTH-Therapie üblichen Zusätzen zur Verlängerung der Wir- _: . kung, wie z.B. Oxypolygelatine, Polyphloretinphosphat, Carb- .. oxymethylceliulose, oder den oben erwähnten schwerlöslichen Metallverbindungen, insbesondere Phosphaten, Pyrophosphaten oder Hydroxyden des Zinks, oder Alkalipolyphosphaten kombi- · nieren. * .

Weiter kann man zur Verlängerung der Wirksamkeit"

* . ■ ■

die neuen Peptide in ihre KcmplQxe mit Polymerisaten, -oder • Copolymerisaton von Aminosäuren, insbesondere solchen, die

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• BAD OrviU

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einen überweisenden Anteil an sauren α-Aminosäuren, wie . Glutaminsäure oder Asparaginsäure der L-, D- oder D,L-Konfiguration, aufweisen, überführen. Die genannten Polymerisate und Copolymerisate weisen in den Seitenketten freie Carboxylgruppen auf, während die terminale Carboxylgruppe frei oder funktionell abgewandelt ist, z.B. als Estergruppe oder als eine unsubstituierte oder durch Kohlenwasserstoffreste, vor allem niedere Alkylgruppen, substituierte Amidgruppe vorliegen kann. Das Molekulargewicht der Polymerisate kann zwischen 10 000 und 100 000 liegen, vorzugsweise beträgt es 20 000 - 80 000. Man verwendet für die Herstellung der Präparate zweckmässig ein wasserlösliches, physiologisch verträgliches Salz, z.B. das Natrium- oder Ammoniumsalz, oder ein Salz mit einer organischen Base, wie Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, oder anderen tertiären Stickstoffbasen.

Die Konzentration des Polymeren in den pharmazeutischen Präparaten hängt von der Löslichkeit dee betreffenden Salzes und von der Viskosität ab. Das Polymere soll in den Präparaten in gelöster Form vorliegen können und injizierbar sein.

Die Konzentration des adrenocorticotrop wirksamen Peptids pro Dosis beträgt beispielsweise 0,1 bis 3 mg/ml. Diese Dosis kann,.wie bei anderen adrenocorticotrop wirksamen Peptiden üblich, beispielsweise 1 bis 7 mal pro Woche subcutan oder intramuskulär verabreicht werden.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen 109885/1910

BAD ORIGINAL

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beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Folgende Abkürzungen werden verwendet: Z = Carbobenzoxy .

BOC = tert. -Buty-loxycarbonyl
tBu a tert,-Butyl.

Die Aminosäure-Abkürzungen beziehen sich auf L-Aminosäuren, wenn die D-Konfiguration nicht besonders angegeben ist.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

System 52A : n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) System 101 : n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Wasser (38:24:8:30)

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Beispiel 1;

1. i^-Z-NS-BOC-L-lysyl-L-valinamid.

Man löst 5,0 g I^-Z-NS-BOC-L-lysin-p-nitrophenylester und 1,8 g L-Valinamld in 100 ml frisoh destilliertem Dimethylformamid iind* lässt die Lösung 5 Tage bei 27° stehen. Hierauf wird das Dimethylformamid bei 0,01 mm Hg und 40° abdestilliert, der Rückstand mit Essigester zerrleben und dann abgenutscht. Dabei werden 4,44 g des Dipeptidderlvates vom P. 201 - 202° erhalten. Bei DUnnschichtohromatographle auf Silikagelplatten 1st der Rf-Wert « 0,13 in Chloroform-Methanol (19:1).

2. N^-BOC-L-lysyl-L-valinamid.

4,4 g des unter 1. erhaltenen Dipeptidderivates werden in 300 ml Methanol suspendiert und in Gegenwart von 500 mg Palladium-Kohle hydriert. Das dabei entstehende Kohlendioxyd wird In einen zweiten mit Natronlauge gefüllten Hydrlergefäss absorbiert. Nach etwa 2 Stunden 1st die Wasserstoffaufnahme beendet und das anfänglich ungelöste Dipeptidderivat ganz in Lösung gegangen. Die. Lösung wird durch Filtration vom Katalysator befreit und zur Trockne eingedampft. Der Eindampfrückstand, N^-BOC-L-lysyl-L-valinamid ist zur weiteren Verarbeitung genügend rein.

3. ^-Z-N^-BOG-L-lysyl-iN^-BOCj-L-lysyl-L-valinamid.

c Man löst 3*¹ 6 des unter 2. erhaltenen N^C-BOC-L-

. lysyl-L-valinamids in 6o ml frisch"'destilliertem' '

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Dimethylformamid und versetzt die Lösung mit ^,65·^ N^a-Z-N²-BOC-L-lysin-p-nitrophenylester. Die klare Lösung wird 24 Stunden bei 28° belassen. Hierauf wird das Dimethylformamid bei und 0,01 mm Hg abdestilliert und der Rückstand zur Reinigung mit viel Essigester zerrieben, abgenutscht und getrocknet. Hierbei wird das Tripeptidderivat N⁰*-Z-N⁶-BOC-L-lysyl-(N*-BOC)-L-lysyl-L-valinamid als gallertiges Pulver vom P. I92 - ί·95° erhalten. Bei DünnschichtChromatographie auf Silikagelplatte ist der R -Wert β 0,36 im System Chloroform-Methanol (9:1) und 0,14 im System Chloroform-Methanol (19:1). A. N*-B0C-L-lysy1-(N⁶-BOC)-L-lysy1-L-valinamid.

1,0 g des unter 3. erhaltenen Tripeptidderivates werden gelöst in 120 ml Methanol und in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10 % PD) hydriert, wobei das entstehende Kohlendioxyd in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hy- | driergefäss absorbiert wird. Nach Beendigung der Wasserstoff- | aufnahme wird vom Katalysator abgenutscht und eingedampft. Dabei wird das Tripeptidderivat N*-BOC-L-lysy1-(N^-BOC)-L-lysyl-L-yallnamid als farbloses Harz erhalten. Es zeigt bei Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten den Rf-Wert « 0,09 im System Chloroform-Methanol (9il) und erweist sich als ' frei von unhydriertem Tripeptidderivat.

5. ^-Z-^-BOC-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-iN^BOCj-L-lysyl-(N^-BOC)-L-IySyI-(N*-BOC)-L-lysyl-(N^e-BOC)-L^lysyl-L-valinamid

1#71 ß ^-Z-N^-BOC-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-

(N*-BOC)-L-lysin-hydrazid (Herstellung vgl.

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deutsches Patent 1 214 242) wird bei -20 unter Rühren in 30 ml frisch destilliertem Dimethylformamid enthaltend 3,1 ml 2,5-n. wässrige Salzsäure gelöst. Hierauf werden 1,55 ml 1,0-m. Nay triumnitrit zugetropft; man lässt atf -10° erwärmen und bei dieser Temperatur 20 Minuten reagieren, gibt dann eine auf -»10° vorgekühlte Lösung von 805 mg (N^-BOC)-L-IySyI-(I^-BOC )-L-lysyl-L-valinamid und 625 mg Triäthylamin in 5 al Dimethylformamid und lässt die Lösung über Nacht bei 2° stehen. Hierauf wird im Hochvakuum bei 40° Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das rohe Nonapeptldderivat durch Zugabe von 200 ml Wasser ausgefällt. Nach Zerreiben, Abnutschen und Waschen mit Wasser erhält man 2,3 g Rohprodukt. Zur Reinigung wird das rohe Nonapeptidderivat einer Gegenstromvertellung in Lösungsmittelsystem Chloroform-Toluol-Methanol-Wasser (5:5:8:2) über 120 Verteilungssohritte unterworfen. Nach Kontrolle der einzelnen Fraktionen mittels DünnschichtChromatographie auf Silikagelplatte (Rf-Wert » 0,26 im System Chlorofore-Hethanol ■ 9*1) werden die eiheitlichen Fraktionen des geschützten Nonapeptidderivates vereinigt. Statt durch Gegenatromverteilung kann das rohe geschützte Nonapeptid auch durch Kristallisation aus Methanol gereinigt werden. Zu diesen Zweck löst nan das Rohprodukt in Methanol und lässt die Lösung langsam abkühlen« Dabei scheidet sich das Nonapeptidderivat in reiner Form als festes Pulver aus. F. 248 - 250°; [a] ²J * -46° (in 90#iger Essigsäure),

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6. N*-BOC-L-lyßys-L-prolyl-L-valyl-ßlycyl-(N^-BOC)-L-lysyl-(N^-BOC)-L-IyByI-(N^-BOC)-L-IySyI-(N^-BOC)-L-lysyl-L-valinamid.

500 mg des unter 5· erhaltenen Nonapeptldderivates weden In. 50 ml Methanol suspendiert und unter Intensivem Rühren In Gegenwart von 200 mg Palladiumkohle (10 # Pd) hydriert. Das dabei entstehende Kohlendloxyd wird In einem zweiten Hydrlergefäss absorbiert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird auf 50° erwärmt und vom Katalysator abgenutscht. Dann dampft man zur Trockne ein und erhalt das Nonapeptldderivat N^€-BOC-L-lysy1-L-proly1-L-valy1-glycy1-(N^-BOC)-L-lysyl-iN^-BOCj-L-lysyl-iN^-BOC)-L-IySyI-(N^-BOC)-L-lysyl-L-vallnamld als farbloses Harz. Das Produkt erweist sich bei DUnnschlchtchromatographle auf Slllkagelplatten (System Chloroform-Methanol «85 J 15) als frei von unhydriertem Ausgangsmaterial.

· tiP-BOC-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-(7-t-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-(N^e-BOC)-L-lysyl-L-proly1-L-valyl-glycy1-(N^g-BOC)-L-lysyl-(N^£-BOC)-L-lysyl-(N^e-B0C)-L-IySyI-(N^-BOC)-L-IySyI-L-valinamld.

I65 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(0tBu)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (vgl. französisches Patent 1 512 3^2) und 150 mg , H-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-VaI-NHp werden mit 4 ml frisch destilliertem Dimethylformamid und 0,018 ml 6,0-n. wässriger Salzsäure versetzt. Nach

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BAD OfIiGINAL

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1-stUndigem Rühren bei 50° gibt man 23 mg N-Hydroxysuccinimid und 3^ mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 3 Stunden bei 50 . Hierauf werden weitere 3²^ mß Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und weitere 15 Stunden bei 50° gerührt. Dann wird vom Unlöslichen abgenutscht und das Filtrat.in 100 ml peroxydfreien Aether gegossen. Das sich dabei als feinflockiger Niederschlag abscheidende, rohe geschützte Nonadecapeptidderivat wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung werden 150 mg des Produkts einer Gegenstromverteilung im Lösungsmittelsystem Chloroform-Tetrachlor- " kohlenstoff-^Methanol -Puffer (14:8:20:6) unterworfen (Puffer: 29 ml Eisessig und 20 g Ammoniumacetat in 1 Liter Wasser gelöst, pH = 4,5). Das Produkt wird in Je 50 ml Ober- und Unterphase des Lösungsmittelgemisches gelöst, und je 10 ml dieser Lösungen werden in die ersten 5 Rohre der Verteilungsapparatur gefüllt (Phasenvolumen je 10 ml). Hierauf werden 120 Verteilungsschritte eines Craig-.Grundprozesses durchgeführt. Die Einheitlichkeit des in den einzelnen Rohren vorhandenen Materials wird mittels Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatte im Lösungsmittelsystem Chloroform-Methanol (75*25) geprüft; das geschützte Nonadecapeptidamld weist im genannten System einen Rf-Wert von 0,28 auf. Die einheitlichen Fraktionen werden vereinigt. Das Maximum der Gewichtsr kurve befindet sich im Rohr 20 (Verteilungszahl K - 0,20).

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, , 17688H

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8. D-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Prq-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-NHp ' .

Man löst 100 mg des unter 7· erhaltenen geschützten Nonadekapeptldderivates In 3 ml 90 #iger Trifluoressigsäure und lässt die Lösung 1 Stunde bei 26 stehen. Hierauf wird sie In 100 mlperoxydfrelen Aether eingegossen, die feinflockig abgeschiedene Fällung abgenutscht, mit Aether gewaschen und im Exsikkator über Aetznatron getrocknet. Zur Ueberführung in das essigsaure Salz wird das Produkt in 3 ml 5 #iger Essigsäure gelöst und über eine Säule von 10'ml Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform) filtriert. Hierauf wird solange mit 5 % Essigsäure nachgewaschen, bis das Eluat im U.V.-Spektrum keine Absorption bei 280 πιμ mehr zeigt. Dann wird die Waschlösung lyophilisiert. Dabei wird das essigsaure Salz des Nonadekapeptids H-D-Ser-Tyr-Ser-Met-GIu -Hi s -Phe - Ar g-Trp -GIy -Ly s -Pro -VaI -GIy -Ly s -Ly s -Ly s -Ly s -VaI NH₂ ^a3·⁵ schwach gelbliches, leichtes Pulver erhalten. Es zeigt bei Totalhydrolyse mit 6-n. HCL (24 Stunden bei 110°) und quantitativer Aminosäureanalyse das erwartete molare Aminosäureverhältnis. Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxidplatten (der Fa. Camag) zeigt das Nonadekapeptidamid Rf₁₀₁ = 0,50; Rf_52A » 0,25.

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*· Beispiel 2:

1. BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-GlufatBuJ-His-Phe-Ärg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BDC)-Lys-(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-VaI-NH₂.

. S3

Man suspendiert 500 mg BOC-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glif!

(OtBu)-His-Phe-Arg-Trp-GIy-OH (Herstellung vgl. belgisches Patent 709 454)und 420 mg H-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS C)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Val-NH₂ in 20 ml frisch destilliertem

iv Dimethylformamid und gibt 0,3 ml 1,0-n. wässrige Salzsäure^ unter Rühren zu. Nach 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur ;■"*.. werden 75 mg N-Hydroxysuccinimid und 100 mg Dicyclohexyl- L carbodiimid zugegeben. Hierauf wird auf 45° erwärmt und 2 1/2 Stunden gerührt. Sodann gibt man weitere 50 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 12 Stunden bei 45°· Hierauf wird vom Unlöslichen abfiltriert, das Filtrat im Hochvakuum bei 40° Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das geschützte Nonadekapeptidderivat durch Zugabe von viel Aether ausgefällt. Die pulverige Fällung wird zerrieben, abgenutscht und getrocknet. Ausbeute 950 mg Rohprodukt, welches noch etwas Dicyclohexylhamstoff enthält. Das Produkt wird direkt weiter verarbeitet.

2. H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-GIy-Ly s-Ly s-Ly s-Ly s-VaI-iiH 2 · ,·...-,.>■-.■'.

Man löst 500 mg des unter 1. erhaltenen Rohprodukts

geschützten Nonadekapeptidamids unter Eiskühlung in 10 ml

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BAD 0R"3'M*,L

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90 #iger Trifluoressigsäure und lässt die Lösung hierauf 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Hierauf wird die schwach violettblau gefärbte Lösung in 200 ml Aether eingegossen, die flockige Fällung zerrieben, abgenutscht, mit Aether gewaschen und im Exsikkator über Aetznatrom getrocknet. Dabei werden h60 mg rohes Trifluoracetat des Nonadekapeptidamids erhalten. Zur Entfernung der Trifluoressigsäureionen versetzt man das Produkt mit 10 ml 5 #iger wässriger Essigsäurel ösung, filtriert und lässt die klare Lösung über eine Säule von 20 ml Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform) laufen. Die Säule wird mit 5 % wässriger Essigsäure (40 ml) nachgewaschen. Die vereinigten Eluate werden bei Badtemperatur im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand hierauf in wenig Wasser gelöst und lyophilisiert. Zur Reinigung wird das Produkt in 10 ml Ammoniumacetatlösung (0,3 m. pH = 6,5) gelöst und auf eine im gleichen Lösungsmittel bereitete Säule (2,5 χ 40 cm) von "CM-Sephadex" C-25 (der Firma Pharmacia, Uppsala) gegeben. Sodann wird mit einem linearen Gradienten von je 500 ml 0,3 m und 5,0 m Ammoniumacetatlösung (pH 6,5) eluiert. Die Eluation wird mittels eines registrierenden Durchlauf-U.V.-Spektröphotometers^:(Unvicord der Fa. LKB, Stockholm) verfolgt. Es werden Fraktionen von je 5 ml Lösung aufgefangen. Die bei einer Ammoniumacetatkonzentration von etwa 3-m. eluierten Fraktionen der Hauptbande werden einzeln eingedampft und das darin enthaltene Amrnoniumncetat durch Sublimation bei 40° Badteinpsratur und 0,01 mm Hg entfernt.

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BAD üriiüiNAL

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Die Reinheit der Peptidrückstände wird mittels Dünnschicht-Chromatographie auf Aluminiumoxidplatten (der Fa. Camag) im System 101 kontrolliert, die einheitlichen Fraktionen in
wenig Wasser gelöst, vereinigt und lyophilisiert. Dabei wird das essigsaure Salz des Nonadekapeptidamids H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-VaI-NH₂ als ganz schwach gelbliches, leiphtes Pulver erhalten.

Beispiel 3:

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponen

ten her:	Beispiel 4}
1 4 1'
Val19-amid
ZnCl2
Na0HPOi1.2 H0O 2 4 2
NaCl
Benzylalkohol
NaOH ad pH 8,3
Dest. Wasser ad
•

Corticotropin-

1,0 mg 5*25 mg 1,05 mg 2,0 mg 10,0 mg

1,0 ml

Man stellt eine Suspension aus folgenden Komponenten her: 10988 5/1910

BAD ORIGINAL

Ί7688Η

D-W-Lys¹⁷'¹⁸

Val¹⁹-amid 1,0 mg

ZnCl₂ 6,30 mg

Na₂HPO₄.2 H₂O 1,26 mg

NaCl 1,5 mg

Benzylalkohol 10,0 mg

NaOH ad pH 8,3

Dest. Wasser ad 1,0 ml

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Claims (1)

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Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide mit ACTH-Wirkung gemäss Hauptpatent, dadurch gekennzeichnet, dass man-aus· C-terminalen Amiden des D-Seryl-Lrtyrosyl-L-seryl-lime thionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycy1-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valins oder der entsprechenden Verbindung, die statt des Methioninrestes den Rest des Norleueins aufweist, in welchen Peptiden mindestens die α-Aminogruppe und die Seltenketten-aminogruppen und -carboxylgruppe geschützt sind, die Schutzgruppen abspaltet und» wenn erwUnscht_# die erhaltenen Verbindungen in ihre' Säureadditionsalze oder Komplexe überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von einem N-unsubstitulerten C-terminalen Amid ausgeht .

3· Verfahren nach Anspruch!, dadurch gekennzeichnet,

dass man von geschütztem D-SeP«^l-Lys¹^'¹°^Val¹^-$¹"¹?-Cortico-

• IO tropin-Cal -amid ausgeht.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man von einem Peptid ausgeht, in dem die Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbo-„ 1.0.9885/1910

Νθ\ΐθ UnferU^n IArI7II AfM₁2 Nr. 1 Sats 3 dMXmlNUIM»l· ν 4.'τ.

.₂₃. 17688H

nylgruppe und die Carboxylgruppe durch die tert.-Butylestergruppe geschützt sind.

5. Verfahren nach Anspruch k_t dadurch gekennzeichnet, dass man sämtliche Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

6. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide wie in den Beispielen beschrieben.

7· D-Seryl-L-tyrosyl-L-eeryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl^L-tryptophyl-glycyl-L-, lysyl-L-prolyl-L-valyl -glycyl -L?-lysyl-L-lysyl-L-lysyl -L-Iysyl-L-vallnamid, seine therapeutisch anwendbaren Säureadditions- · salze und Komplexe. . · ·

8. D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-fiorleucyl-L-glutamyl- f L-histidyl-L-pheny^alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-Iy- ι syl-L-proly1-L-valyl-glycy1-L-lysyl-L-Iysy1-L-Iysy1-L-lysyl- | L-valinamid, seine therapeutisch anwendbaren Säureadditionssalze und Komplexe.

9. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-proly1-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-vallnamids mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder

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10. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamy1-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-proly1-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valinamids mit Zinkphosphat, Zinkpyrophosphat und/oder Zinkhydroxyd.

11. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyoyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valinamids mit Oelatine, Polyphlöretinphosphat oder Polyglutaminsäure.

12. Komplexe des D-Seryl-L-tyrosyl-L-sefyl-L-horleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysy1-L-prolyl-L-valyl-glyoyl-L-lysyl*t-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-valinamids mit Oelatine, Polyphoretinphosphat oder Polyglutaminsäure. ' ■■·.·'.

13. Die in den Beispielen beschriebenen Verbindungen»

14. Pharmazeutische Präparate, die als aktiven Bestandteil D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-giutämyi-L^ histidyl-L-pheny lalanyl-L-arginyl-L-tryptöphyi-giyöyi-ii-iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-Iy syl-L-lysyl-L^lysyl-L-lyayl-l:^ valinamid oder die entsprechende Verbindung, die statt des Methioninrestes den Rest des Norleucins aufweist, ihre thera-

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peutisch anwendbaren Säureadditionssalze oder Komplexe enthalten«

15. Pharmazeutische Präparate wie in den Beispielen be schrieben.

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