DE1642676A1

DE1642676A1 - Verfahren zur Reinigung von Lipopolysacchariden

Info

Publication number: DE1642676A1
Application number: DE19671642676
Authority: DE
Inventors: Dr-Chem Marsh David George; Dr-Chem Crutchley Micha Joseph
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1966-10-27
Filing date: 1967-10-24
Publication date: 1971-05-27
Also published as: SE325995B; CH480436A; US3600378A; GB1188519A; ES346460A1; DK119627B; NL6714552A; BE705790A; FR1583622A

Description

DR. EULE DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 2. HILBLESTRASSE 2O

Dr. EuIa Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 MOnchen 2. Hilblesfraße 20 · Ihr Zeichen Un.er Zeichen Datum 24, OHt, t387

Anwalta-Akte 16 715
Be/Be

The Welloome Foundation Limited 183 - 193 Euston Road, london NW 1 /England

"Verfahren zur Reinigung von Lipopolysacohariden"

Diese Erfindung betrifft ein verbesaertea Verfahren zur Reinigung von "bakteriellen Lipopolyaaoohariden und im beaonderen nioht-toxiaohe Fraktionen, die von der über der Kultur stehenden Flüasigkeit intenaiv belüfteter Gram-negativer Bakterienkulturen abgetrennt werden.

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Lipopolysaccharide von Gram-negativen Bakterien, die nachfolgend aus Gründen der Vereinfachung LPS genannt v/erden, ' sind antigene Substanzen, die Polysacoharid, Lipid und in der nativen Form begleitende Proteinbestandteile umfassen. Bestimmte toxische Lipopolysaccharide wurden als "Indotoxine" bezeichnet, während die anderen nicht-toxischen Fraktionen als "native Haptene" bezeichnet werden. Diese Materialien werden gewöhnlich durch Extrahieren der Bakterien mit einer Flüssigkeit, die ein chemisches Mittel oder Lösungsmittel, wie Phenol, Irichloressigsäure oder Äther enthält, erhalten. Es wurde jedoch schon immer darauf hingewiesen, daß die Anfangskomplexe durch diese Mittel etwas modifiziert oder abgebaut werden. Beispielsweise kann wenigstens ein Teil der Protein- und Lipidkomponenten mit einem Phenol-enthaltenden Extrahierungsmittel abgespalten werden, oder der Lipidgehalt kann durch Verwendung von Äther oder Aceton reduziert werden. Fraktionen mit hoher und geringer Toxizität wurden von Anacker und Mitarbeiter J. of Bacteriology, 1964, 88 1705-1720 und Ibid, 1966, 91 1427-1433 oder naoh einem Verfahren, das in der Britischen Patentschrift 1 005 193 (U.S.-Patent 3 132 995) beschrieben ist, isoliert. Alle diese Verfahren leiden jedoch an dem Nachteil, daß die vorausbezeichneten, chemischen Mittel verwendet werden zum ersten Freimachen der LPS-Gemische von den Zellen mit den sich ergebenden Änderungen in der Struktur dieser Komplexe und schaffen keine einheit-

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lichen Produkte geringer oder unbedeutender Toxizität in ausreichend hoher Ausbeute und Reinheit.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine nicht-toxische LPS-Fraktion mit zufriedenstellender Ausbeute hergestellt werden kann, v^eiui man als Ausgangsmaterial die überstehende Flüssigkeit von Gram-negativen Bakterienkulturen verwendet, wie einer Kultur von Escherichia coli, die unter den Be- j dingungen kräftiger Belüftung gezüchtet wurde. Weiterhin kann die Reinigung und Abtrennung der nicht-toxischen LPS in wirksamer Weise erreicht werden, wenn man die endotoxine Fraktion auf einem anionischen Austauscher adsorbiert, der in dieser Hinsicht selektiv wirkt, bis die Toxizität nicht mehr feststellbar ist, vorausgesetzt, daß der Fraktionierung das Isolieren einer vorherrschend LPS-aufweisenden Fraktion aus dem flüssigen Medium durch Salzausfällung und nachfolgenden Dialyse vorausgeht.

Nach der vorliegenden Erfindung wird daher in einer Hinsicht ein Verfahren zur Herstellung eine» gereinigten, nicht-toxischen Lipopolysaccharide geschaffen, wobei dieses Verfahren umfaßt das Ausfällen der Lipopolysaccharide aus dem Überstehenden der Kultur von Gram-negativen Bakterien, wie E.coli,.die unter den Bedingungen kräftiger Belüftung gezüchtet wurden, Dialysieren der wiedergelösten Ausfällung, Behan-

dein der Lösung der Lipopolysaccharide an einem anionischen Austauscher, vorzugsweise unter Zurückhalten des ιοί 09822/ 1822 -4-

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xischen Lipopolysaccharide (endotoxine) bis das eluierte •und isolierte Produkt im wesentlichen homogen und nichttoxisch ist.

Die Erfindung schafft in anderer Hinsicht eine antigene Zubereitung, die ein gereinigtes, nicht-toxisches LPS umfaßt, das von den kulturüberstehenden Flüssigkeiten von Gran-negativen Bakterien, wie E.coli, frei von Endotoxinen, isoliert wird. Das Verfahren, wie vorausgehend erläutert, kann eine weitere Stufe der Gefriertrocknung oder des Verdampf ens bei Niedertemperatur einschließen, um das gereinigte, nicht-toxische LPS in einer trockenen Form, frei von Lösungsmittel, zu erhalten.

Die Lipopolysaccharide werden in die Kulturflüssigkeit durch die Gram-negativen Bakterienkulturen unter den Bedingungen kräftiger Belüftung in einem Medium freigegeben, das mit den gesamte, notwendigen Wuchsnährstoffen ausgestattet ist. Um die besten Ergebnisse zu erhalten wird der pH des Wuchsmediums um pH 6 bis 8, in gewißem Ausmaß abhängig von der Art des verwendeten Organismus, gehalten. Die meisten Stämme von Escherichia coli, Serratia marcescens, Salmonella typhosa aus der Familie Enterobacteriaceae und die Stämme von Pastenrella multosida und Vibrio oholerae sekretieren LPS unter diesen Bedingungen. Es wurde gefunden, daß Nährstoffe, die sowohl Saccharose als auch säurehydrolysiertes Casein, zusätzlich zu anderen Bestandteilen und Wuchsfaktoren ent-109822/1822

halten, für die Zweoke der vorliegenden Erfindung geeignet sind.

Auf die Wuchsstufe folgend, wird die Kulturflüssigkeit des Mediums von den Bakterienzellen mittels Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und die nicht-toxischen IPS, zusammen mit Endotoxin durch ein Salz, wie Ammoniumsulfat, bei niederen Temperaturen ausgefällt. Die Ausfällung wird dann gesammelt, in destilliertem Wasser wiedersuspendiert und zur Entfernung diffusionsfähiger Verunreinigungen niederen Molekulargewichts dialysiert und zum Beispiel durch Zentrifugieren geklärt. Um beste Ergebnisse zu erhalten wird diese Anfangsreinigung wiederholt und die lösung duroh Gefriertrocknung konzentriert, bevor das Gelöste weiter gereinigt und fraktioniert wird.

Der für die zweoke der vorliegenden Erfindung bevorzugte, anionisohe Austauscher ist Diäthylaminoäthyloellulose, und das bevorzugte, zusammen mit diesem besonderen Austauscher verwendete Eluierungsmittel ist ein wäßriger Puffer von geringer ionischer Stärke (< 0,01M) bei pH 8, um nicht-toxische Fraktionen zu erhalten. Nachfolgend eluiert ein Puffer höherer ionischer Stärke (ungefähr 1,0M) bei einem pH zwischen 5,5 und 8,5, vorzugsweise bei pH 7 bis 8,5, die Endotoxine. Ee wurde gefunden, daß ein flüchtiger Puffer, wie Ammoniumhydrogenoarbonat in dieser Hinsicht zufriedenstellend arbeitet.

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Diäthylaminoäthylcellulose trennt das nicht-toxische LPS

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von dem öehr wirksam TSndotoxin. Sie kann ge eignet erweise mit der Lösung, die sowohl die nicht-toxischen als auch die toxischen Komponenten enthält, gemischt, nach Irreichen des Gleichgewichts durch Filtrieren abgetrennt und einfacherweise über ein PiIter oder eine Zentrifuge eluiert werden. Wahlweise kann der Austauscher als chromatographische Kolonne verwendet werden. Abhängig von der Menge des Endotoxins oder anderer Verunreinigungen im Ausgangsmaterial kann es notwendig werden die LPS-Lösung mehr als einmal, gewöhnlioh zweimal, dem Austauscher zuzuführen, um ein homogenes, das heißt einheitliches Produkt zu erhalten.

Zusätzlich zur Abtrennung mit dem anionischen Austauscher können rückständige, nicht-toxische Verunreinigungen unter Verwendung von Xerogelen, wie einem Dextran, vernetzt mit Glycerylbrücken, oder Acrylamidgelzubereitungen, die als Bio-Gele bekannt sind, entfernt werden. Es kann daher eine Stufe unter Verwendung eines solchen Materials, gewöhnlich ala chromatographisohe Kolonne, in das Reinigungsverfahren eingeschoben werden.

Das Xerogel-Adsorbens, wie eine Dextranzubereitung, die als Sephadex G100 bekannt ist, wird vorteilhafter nach der duroh den anionisohen Austauscher bewirkten Abtrennung verwendet. Obgleioh vernetzte Materialien bereits zur Reinigung roher LPS-Gemische verwendet wurde, erfolgt die bevor-

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zugte Verwendung derselben naoh der vorliegenden Erfindung, zusammen mit und nachfolgend auf eine Abtrennungsstufe mit- ' tels einem Anionenaustauseher, wobei die Wirksamkeit des vernetzten Materials wesentlich erhöht wird und das gewünschte Produkt in einer bisher nicht erreichten Reinheit und Ausbeute liefert. Die Bezeichnung "vernetzt" wird in diesem Zusammenhang in dem Sinne verwendet, daß nicht nur makromolekulare Materialien eingeschlossen werden, die in geeigneter Weise verbunden sind unter Bildung Sieb-ähnlicher Strukturen, die geeignet sind Moleküle geeigneter Größe zurückzuhalten, sondern umfassen ebenso andere Materialien, die innewohnende chemische Bindungen mit Strukturen aufweisen, die den oben angegebenen, vernetzten Makromolekülen im Hinblick auf ihre Fähigkeit unerwünschte Verunreinigungen zurückzuhalten, äquivalent sind. Manche dieser Materialien sind dem Fachmann als Molekularsiebe bekannt.

yör der Verwendung werden die vernetzten Materialien in geeigneter weise mit einem Puffer, wie Ammoniumhydrogencarbonat, ins Gleichgewicht gebracht, und können für diesen Zweck als chromatographische Kolonne hergestellt werden. Die, ebenso die nicht-toxischen LPS enthaltende Lösung wird dann durch die Kolonne filtriert. Die erste größere Spitze wird von den nachfolgenden Spitzen oder Fraktionen abgetrennt und enthält das gewünschte, nicht-toxische Material in ausreichend gereinigter Form. Das so erhaltene Material kann dann aus der Lösung, beispielsweise durch Gefriertrocknen oder Verdampfen bei Niedertemperatur gewonnen werden.

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Die chemischen, physikalischen und Mοchemischen Eigenschaften der nach der vorliegenden Erfindung erhaltenen, nicht-toxischen LPS können nach den Species oder dem Serotyp der Bakterien wechseln. So zeigt ein von E.coli erhaltenes Material eine erhöhte Menge Glucosamin im Vergleich zu Endotoxin. In diesem besonderen Falle ist der Glucosamingehalt ungefähr 2ψ/ο. Sowohl der Aminosäuregehalt als auch die höheren Fettsäuregehalte waren geringer als die des entsprechenden Endotoxins.

Obgleich die nach der Erfindung geschaffenen LPS als nichttoxisches Material gekennzeichnet sind, darf dies nicht im absoluten Sinn, sondern nur relativ zu Endotoxin verstanden werden. Die Toxizität der Fraktionen kann bei den unterschiedlichen Beinigungsstufen in geeigneter Weise durch interperitoneale Injektion bei Gruppen von Mäusen mit abgestuften Dosen der Fraktionen bestimmt werden, wodurch die LD-Q-Werte berechnet und in Vergleich gestellt werden können (Haskins und Mitarbeiter, 1961).

Obgleioh die nach der vorliegenden Erfindung geschaffenen, nicht-toxischen LPS keine durch Gel-Diffusionsanalyse erkennbaren Antikörper stimulieren, induzieren sie eine kurzzeitige, nicht-spezifische Widerstandsfähigkeit gegenüber Infektionen mit heterologen Gram-negativen Organismen. Beispielsw. schützt die Anwendung nicht-toxischer LPS von E.ooli Mäuse gegen nachfolgenden lethalen Befall von S.typho3a.

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In weiterer Hinsicht schafft daher die vorliegende Erfindung ein Yakzin, das eine wirksame Dosis eines gereinigten, nicht-toxischen LPS, das von dem Überstehenden der Kultur Gram-negativer Bakterien isoliert wurde, zusammen mit eineia pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfaßt.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern diese Erfindung.

Beispiel 1

E.ooli 078K80 Stamm Shaw wurde in Tanks 42 Stunden lang bei 35°C in einem kräftig belüfteten, wäßrigen Medium gezüchtet, das säurehydrolysiertes Casein (5$ GeWo/Vol,), Saccharose (3$ Gew./Vol.) und Hefeextrakt (10$ Gew./Vol.) enthielt und auf pH 6,5 eingestellt war. Vor der Impfung wurde das Medium geklärt, auf 85⁰O erhitzt und duroh Seitz-Filtrieren sterilisiert.

Die Bakterien wurden von der Suspension mittels einer "de Laval" Zentrifugentreibvorrichtung entfernt und das Überstehende duroh Filtrieren duroh einen Seitz-Filter sterilisiert. Ammoniumsulfat (ungefähr 700 g/Liter) wurden in dem Überstehenden der Kultur gelöst und die Lösung bei 4°0 6 Tage lang stehen gelassen. Die braune, flockige Ausfällung wurde duroh Zentrifugieren gewonnen, in destilliertem Wasser wiedersuspendiert und zur Entfernung des Salzes dialysiert. Das LFS wurde bei 4⁰O duroh Zugabe von Ammoniumeulfat (65 g/100 ml Lösung) wiederausgefällt· Das wiederaus-

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gefällte Material wurde nochmals gelöst und wie oben behandelt, um Salz zu entfernen, dann durch Zentrifugieren ge-• reinigt und gefriergetrocknet unter Bildung eines braunen Pulvers.

Eine Lösung von rohem LPS, das so aus den Salz-Ausfällungsstufen (600 mg in 30 ml 0,005 M KH. HGO₅) erhalten 'wurde, wurde einer Büchner Kolonne (8 cm χ 10 cm Durchmesser) zugeführt, die Diäthylaminoäthylcelluloae (Whatman DE 11, Leistungsfähigkeit 1 Milliäqüivalent OH~/g) enthielt auf pH 8 eingestellt und in 0,005 M KH. HGO, suspendiert. Das Eluieren wurde nacheinander mit (1.) 0,01 M NH₄HCO₅ (1250 ml) und (2.) mit 1 M Ammoniumacetat-Essigsäurepuffer bei pH 5»5 (500 ml) durchgeführt. Eine einzige Spitze von schwach ultraviolett-absorbierendem Material (bei 230, 260 und 275 mji) wurde mit Puffer (1.) eluiert, wobei man feststellte, daß sie im wesentlichen (95$) reines, nicht-toxisches LPS war. Die Masse des zurückbleibenden Materials wurde mit Puffer (2) eluiert, wobei man festatellte, daß sie Endotoxin enthielt. Beide Fraktionen schützten Mäuse gegen einen nachfolgenden Befall von S.typhosa 24 Stunden nach Injektion.

Beide Fraktionen wurden weiterhin getrennt gereinigt, durch Gelfiltrieren über eine Sephadex G100 Kolonne (167,5 om χ 1,2 cm Durohmesser). Die ersten größeren Spitzen dea ultraviolett-absorbierenden Materials enthielten bei jedem Versuch das entsprechende gereinigte nicht-toxische LFS und Endotoxin, -11-

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Es wurde gefunden, daß die nicht-toxische Fraktion durch Gelfiltrierung, Elektrophorese und ultrazentrifugale Analyse frei von bedeutenden Mengen von Verunreinigungen war. Das von dieser Fraktion isolierte Material war nicht-toxisch bei 0,6 mg/20 g Mäusen oder 25 mg/kg Meerschweinchen, tiber diese Höhen hinaus wurden keine weiteren Untersuchungen vorgenommen.

Dieses nicht-toxische LPS enthielt bei Analyse 4»32$ N, 8,89$ P_} ^6 bis 27$ Glucosamin, 1,2 bis 1,4$ Aminosäure und 0,1$ Fettsäure (>C,). Es waren keine wesentlichen Mengen von Pentose oder 2-keto-3-Deoxyoctulonsäure feststellbar. Das Produkt war von den nativen Haptenen, die durch das phenoliache Extraktionsverfahren erhalten wurde, das bei Anacker und Mitarbeiter J. of Bacteriology, 1964, 88, 1705 beschrieben ist, dadurch zu unterscheiden, daß es einen bedeutenden Pnosphorgehalt und kein Absorptionsmaximum bei 260 mu hatte. ([

Eine Lösung von 0,007 ug nicht-toxischer LPS in 0,85$iger Salzlösung schützte 50$ von Mäusen in einer Gruppe gegen einen lethalen Befall von S.typhosa (Stamm TX2), der 3 LD enthielt.

Beispiel 2

Bei einem anderen Versuch wurde eine nicht-toxische Endotoxinfraktion, nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfah-

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reu, erhalten mit dem einzigen Unterschied, daß die Sephadex G100 Kolonne vor dem Chromatographieren über Diäthylaminoäthylcellulose verwendet wurde und nicht danach. Das Produkt wurde mit einer geringeren Ausbeute isoliert, hatte aber im wesentlichen identische Eigenschaften gegenüber dem in Beispiel 1 erhaltenen Produkt»

Beispiel 3

Bei einem anderen Versuch wurde eine wäßrige Lösung von rohem LPS, das von der Salzausfällung und den Dialysenstufen, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten wurde, mit einer entlüfteten, wäßrigen Schlämme von DEAE-CeHuIöse gemischt, die vorausgehend auf den pH 7 bis 8 eingestellt wurde. Es wurde ausreichend Diäthylaminoäthylcellulose zugegeben, um die Endotoxinmenge und andere Komponenten als das nichttoxische LPS (30 bis 40 g Whatman DE 11 DEAE-Celluloae pro Gramm gelöstes, rohes LPS) zu adsorbieren. Man ließ die Schlämme bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang unter gelegentlichem Rühren stehen. Eine Schicht von ungefähr 1 cm DEAE-Cellulose, eingestellt auf pH 7 bis 8 und suspendiert in destilliertem Wasser wurde über eine Büchnerkolonne (10 cm Durchmesser) geleitet und mit einem runden Whatman Nr. 1 Filterpapier (10 om Durohmesser) abgedeckt. Die das LPS enthaltende Schlämme wurde sorgfältig in den Trichter gegossen und das Eluens gesammelt. Weiteres Eluieren, zum Entfernen des rückständigen nicht-toxischen LPS wurde unter

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Verwendung von 0,01 M HH. HOO₅ durchgeführt bis die ültraviolettabaorption dea Eluena (bei 230 mji) zeigte, daß tataächlioh daa gesamte, nioht-toxische LPS aus der Kolonne entfernt worden war. Daa nicht-toxische IPS im Eluena wurde weiterhin in ähnlicher Weiae, aofern erforderlich, zur Entfernung rückständiger Verunreinigungen gereinigt.

Das gereinigte, nicht-toxische LPS hatte einen ähnlich hohen Grad von Reinheit und identische Eigenachaften wie die in Beispiel 1 beschriebenen Zubereitungen.

Die rohe Zubereitung von Endo#toxin wurde von der Büchnerkolonne bei der ersten Reinigungsstufe entfernt, durch EIuieren mit 1M Ammoniumacetatpuffer bei pH 5,5 bis 8, nachdem das nicht-toxiache LPS aus der Kolonne eluiert wurde. Das Endotoxin wurde weiter durch Gelfiltrieren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt.

Die nach diesem Verfahren erhaltenen hohen Ausbeuten und die leichte Handhabung machen es in besonderer Weise für die Herstellung nicht-toxischer LPS in technischem ömfang geeignet.

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Claims

P at entansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten, nicht-toxischen lipopolysaecharids dadurch gekennzeichnet, daß
es das Ausfällen der Lipopolysaccharide aus dem Überstehenden der Kultur von Gram-negativen Bakterien, die unter den Bedingungen kräftiger Belüftung gezüchtet wurden, Dialysieren des wiedergelösten Niederschlags, Behandlung der Lipopolysacoharidlösung mit einem anionischen Austauscher und vorzugsweise Zurückhalten des toxischen Lipopolysaccharids (Endotoxin) bis das eluierte und isolierte Produkt im wesentlichen homogen und nicht-toxisch ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zu der Familie Enterobacteriaceae gehören.

^ 3. Verfahren gemäß Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zum Stamm Escherichia coli gehören.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß der anionische Austauscher Diäthylaminoäthylcellulose ist.

5 ο Verfahren gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß das Eluens ein wäßriger Puffer mit einem pH von 8 und einer Ionenkonzentration unter 0,01M ist.

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6. Verfahren gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Aimnoniumhydrogencarbonat enthält.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß nicht-toxische Verunreinigungen unter
Verwendung von Xerogelen entfernt werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß das Xerogel ein vernetztes Material ist»

9. Verfahren gemäß Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzte Material eine Dextranzubereitung, vernetzt
mitmit Glyeery!brücken, ist«

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 dadurch gekennzeichnet, daß das Xerogel nach der durch den anionischen Austauscher bewirkten Abtrennung verwendet wird.

11. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das Wuchsmedium für die Bakterien auf einem pH von ungefähr 6 bis 8 gehalten wird«,

12. verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-toxische Lipopolysaocharid mit Ammoniumsulfat bei Niedertemperaturen ausgefällt wird.

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13. Verfahren gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß es weiterhin die Stufe der Gefriertrocknung der Eluensfraktion, die das gereinigte, nicht-toxische Lipopolysaccharid enthält, umfaßt.

14« Verfahren im wesentlichen wie vorausgehend in einem der Beispiele 1 bis 3 "beschrieben.

15. Gereinigtes, nicht-toxisches Lipopolysaccharid, wie vorausgehend erläutert, sofern es nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 14 hergestellt wurde.

16. Gereinigtes, nicht-toxisehes, wie zuvor definiertes, aus dem Überstehenden der Kultur von Escherichia coli isoliertes Lipopolysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält wenigstens 20$, vorzugsweise ungefähr 27$ Glucosamin, einen niedrigeren Aminosäure- und Fettsäuregehalt mit mehr als 4 Kohlenstoffatomen hat als das vom gleichen Stamm erhaltene Endotoxin und im wesentlichen von 2-keto-3-Deoxyoctulonsäure oder Pentose frei ist.

17. Gereinigtes, nicht-toxisches, wie zuvor definiertes, aus dem Überstehenden der Kultur von Escherichia coli isoliertes LipopolysaxjhjzOiiarid, dadurch gekennzeichnet, daß es ungefähr 26 bis 27$ Glucosamin, 1,2 bis 1,4$ Aminosäure, ungefähr 8 bis 9$ Phosphor und 0,1$ Fettsäure mit mehr als

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4 Kohlenstoffatomen enthält und im wesentlichen von 2-keto-3-Deoxyoctulonsäure oder Pentose frei ist.

18. Vakzin dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Dosis eines gereinigten, nicht-toxischen Lipopolysaccharide, wie in einem der Ansprüche 15 bis 17 erläutert, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfaßt.

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