DE1598752A1 - Zubereitung zum Nachweis chemischer Substanzen - Google Patents
Zubereitung zum Nachweis chemischer SubstanzenInfo
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Description
"Zubereitung zum Nachweis chemischer Substanzen."
Die Erfindung betrifft Zubereitungen und Vorrichtungen zum Nachweis und zur Bestimmung chemischer Verbindungen.
Genauer betrifft die Erfindung verbesserte diagnostische Zubereitungen und Vorrichtungen zum Nachweis und zur
Bestimmung chemischer Verbindungen in Flüssigkeiten, die den Nachweis und die Bestimmung dieser Verbindungen störende
Substanzen enthalten.
Bei chemischen Routineanalysen ist es wünschenswert, daß das Verfahren einfach durchführbar und gleichzeitig
unter verschiedenen Versuchsbedingungen genau und verläßlich sei. Dies ist insbesondere für Ärzte wichtig, die zur
Bestätigung einer Diagnose rasohe und genaue Nachweis-
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verfahren benötigen. Solche diagnostische Nachweisverfahren sind ferner "bei Massenuntersuchungen zur Auffindung
gewisser physiologischer Störungen und für die anschließende Behandlung und Kontrolle erforderlich. Z.B. sind genaue
und verläßliche diagnostische Verfahren zum Nachweis von Glukose in Körperflüssigkeiten wesentlich für das Auffinden
von Diabetes und für spätere Kontrolluntersuchungen.
Die gegenwärtig zur Verfügung stehenden diagnostischen Verfahren zum spezifischen Nachweis von Zucker in Körperflüssigkeiten
trugen wesentlich zum Fortschritt der Diagnose bei. Jedoch weisen diese Verfahren gewisse Mängel
auf, wodurch ihre Verwendung auf Körperflüssigkeiten, die keine störenden Substanzen, wie Ascorbinsäure und
Methampyrone (Pyralgin) enthalten, beschränkt ist.
Störende Menge Ascorbinsäure finden sich manchmal in den Körperflüssigkeiten von Personen, die mit großen Dosen
Ascorbinsäure (Vitamin C) oder mit Ascorbinsäure als Antioxydans enthaltenden Antibioticis behandelt wurden.
Gewisse Heilmittel, wie Methampyrone, wirken bei ihrer Verabreichung an Patienten ähnlich wie Ascorbinsäure. Diese
störenden Substanzen werden durch die Nieren leicht ausgeschieden und finden sich daher in hohen Konzentrationen
im Harn.
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Ein Ziel der Erfindung ist daher eine verbesserte diagnostische Zubereitung zum raschen und genauen Nach- ·
weis und der Bestimmung chemischer Substanzen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist eine verbesserte und verläßliche diagnostische Zubereitung zum Nachweis und
zur Bestimmung chemischer Substanzen in Flüssigkeiten, die störende Substanzen enthalten.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren z.ur genauen und reproduzierbaren Bestimmung
bestimmter chemischer Substanzen in flüssigen Gemischen.
Andere Ziele der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor.
Diese Ziele können mit Hilfe der verbesserten diagnostischen Zubereitung und des Verfahrens nach der Erfindung
erreicht und die früheren Mangel überwunden werden. Die erfindungsgemäße Zubereitung umfaßt ein Redoxsystem
zum Nachweis und ein Abfangsystem, um verschiedene, die Bestimmung störende, reduzierende, in der zu prüfenden
Probe vorhandene Substanzen weitgehend zu inaktivieren oder zu entfernen. Genauer enthält die erfindungsgemäße
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Zubereitung zwei Systeme:
1. eine enzymatische oxydierende Substanz, die die nachzuweisende chemische Substanz zu einem oxydierten
Derivat, unter gleichzeitiger Bildung von Peroxyden, oxydiert,
2. eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Peroxyden eine Farbänderung erleidet und
3. einen Katalysator zur Katalyse dieser Farbänderung und
ein Abfangsystem, enthaltend
1. ein Abfangmittel, das störende reduzierende, gegebenenfalls in der geprüften Körperflüssigkeit anwesende,
Substanzen inaktiviert oder entfernt.
Der erste wesentliche Bestandteile der erfindungsgemäßen Zubereitung ist ein oxydierendes Enzym, z.B. ein aerobes
Enzym, das eine bestimmte chemische Substanz in Gegenwart von Sauerstoff zu einem oxydierten Derivat, unter gleichzeitiger
Bildung von Peroxyden, oxydieren kann. So kann z.B. ein spezifisches aerobes Enzym, wie Glukoseoxydase,
Glukose zu Glukonsäure unter gleichzeitiger Bildung von Peroxyden oxydieren und dieses Enzym ist zum Nachweis und
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zur Bestimmung in Körperflüssigkeiten anwesender Glukose besonders wirksam.
Außer Glukose können viele andere chemische Substanzen, wie L-Aminosäuren, D-Aminosäuren, Hypoxanthin, Xanthin,
Glycin, Monoamine, Diamine, Harnsäure, luciferin, D-Asparaginsäure, aliphatisch^ Aldehyde, aromatische
Aldehyde, Milchsäure und zahlreiche andere Substanzen in ähnlicher Weise nachgewiesen werden. Allgemein erfordert
jeder derartige Nachweis ein modifiziertes Nachweissystem
zur Durchführung der gewünschten Oxydationsreaktion. Andere Beispiele in den erfindungsgemäßen diagnostischen
Zubereitungen verwendbarer, spezifischer liachweissysteme
finden sich in den nachstehenden Beispielen.
Der zweite Bestandteile der erfindungsgemäßen diagnostischen
Zubereitung ist eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Peroxyden eine erkennbare farbänderung
erleidet. Besonders geeignete chromogene Substanzen sind Redox-Indikatorfarbstoffe, die innerhalb eines bestimmten
pH-Bereiches eine maximale ]?arbe entwickeln. Ein besonders bevorzugter Indikatorfarbstoff ist o-Tolidindihydrochlorid.
Auch andere Indikatorfarbstoffe, z.B. Anilin- und Phenolderivate, können verwendet werden. Z.B. kann man
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m-Toluidin, Benzidin, Guaiacol, 2,7-Diaminofluoren,
o-Dianisidin und ähnliche oder Gemische derselben verwenden.
Der dritte Bestandteil der erfindungsgemäßen Zubereitung ist ein Katalysator zur Katalyse der erwähnten
Farbbildung. Allgemein ist dieser Katalysator eine Substanz,
die zur Entstehung von Peroxyden führt. Geeignete derartige organische Substanzen sind z.B. Hemin, rote Blutzellen
und Peroxydase. Zur Katalyse der I&rbbildung geeignete
anorganische Substanzen sind z.B. Gemische aus Natriummolybdat und Kaliumiodid. Peroxydase wird als
Katalysator bevorzugt und kann aus Meerrettich, Feigenblättern oder Kartoffeln gewonnen werden.
Zusätzlich zu den oben genannten Bestandteilen des diagnostischen Nachweissystems ist erfindungsgemäß ein
weiterer wesentlicher, in dem Abfangsystem enthaltener Bestandteil erforderlich, der als Abfangmittel (trapping
agent) bezeichnet werden kann. Ein Abfangmittel kann allgemein als ein Material bezeichnet werden, das wirkungsvoll
Störungen einer gewünschten enzymatischen Reaktion durch eine reduzierende, in der zu prüfenden !Flüssigkeit gegebenenfalls
anwesende, Substanz verhindern kann. Im allgemeinen ist ein geeignetes Abfangmittel eine ionisierbare
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Schwermetallverbindung, die im ionisierten Zustand ein
Redoxpotential zwischen dem des in der diagnostischen Zubereitung anwesenden Redoxindikatorfarbstoffes und dem
der störenden Substanz besitzt. Als allgemeine Regel sind die Redoxpotentiale der in der erfindungsgemäßen diagnostischen
Zubereitung anwesenden Indikatorfarbstoffe wesentlich höher, als die der gegebenenfalls anwesenden störenden
Substanz.
Liegt das Redoxpotential des Abfangmittels außerhalb dieses Bereiches, so erhält man eine völlig unbefriedigende
Zubereitung. Besitzt zum Beispiel das Abfangemittel ein höheres Redoxpotential, als der vorhandene Indikatorfarbstoff,
so kann eine unregelmäßige oder falsche Farbreaktion erfolgen. Besitzt andererseits das Abfangmittel
ein niedrigeres Redoxpotential, ale das der störenden Substanz, so kann die störende Substanz nicht wirksam entfernt
werden und man beobachtet unrichtige positive Ergebnisse.
Außer der wesentlichen Anforderung, daß das Abfangmittel ein Redoxpotential innerhalb eines bestimmten
Bereiches aufweist, besitzt das Abfangmittel vorzugsweise noch gewisse andere erwünschte .Eigenschaften, die nach-
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stehend aufgeführt sind, um die Auswahl der am besten geeigneten ionisierbaren Schwermetallverbindung für eine
bestimmte diagnostische Zubereitung zu erleichtern.
Bevorzugte Abfangmittel sind ionisierbare Schwermetallverbindungen,
die die größte Zahl nachstehender Eigenschaften aufweisenj
1. Das Abfangmittel dar die Reaktionsfähigkeit der
aktiven Bestandteile.in dem Testsystem nicht verändern,
2. es darf das Nachweissystem nicht färben oder in
anderer Weise die gewünschte ]?arbbildung stören,
3. es soll die störenden Substanzen so leicht als möglich verbrauchen oder entfernen,
4. es darf das Nachweissystem nicht hemmen und nicht
Produkte erzeugen, die an dem reagierenden System teilnehmen und dieses verändern können und
5. es muß ebenso stabil sein, wie die in dem Nachweissystem
enthaltenen Bestandteile.
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Zwar besitzt eine große Anzahl iorisierbarer Schwermetallverbindungen
einige der oben angeführten Eigenschaften, gewisse metallionenbildende Verbindungen weisen Jedoch
fast alle geforderten Eigenschaften auf. Die Elemente der Gruppen VIII, IB, HB und IVA des periodischen Systems
der ElemeriB werden insbesondere bevorzugt. Eine Tafel des periodischen Systems findet sich auf Seiten 448 und 449
des Handbook of Chemistry and Physics; 42. Auflage, Chemical Rubber Publishing Company, Cleveland, Ohio. In
dieser Tafel ist die Gruppe VIII die Eisen-ÜTebengruppe,
die Gruppe IB die Kupf er-ETebengruppe, die Gruppe HB die
Zink-Nebengruppe und die Gruppe IVA die Kohlenstoff ·
gruppe. Bevorzugte Metalle sind daher Eisen, Kadmium, Kobalt, Nickel, Zinn, Blei, Kupfer, Quecksilber, Silber,
Palladium, Platin, Gold und ähnliche. Man kann Verbindungen dieser Metalle als solche oder aber Gemische aus zwei
oder mehreren solcher Verbindungen verwenden.
Diese Metalle werden zweckmäßig der diagnostischen Zubereitung als Schwermetallsalze zugefügt. Ausgezeichnete
Ergebnisse wurden mit den wasserlöslichen Eisen-(III)-
und Quecksilber-(II)-salzen, wie Eisen-(III)-Chlorid,
Eisen-(HI)-oxalat, Quecksilber-(II)-chlorid, Quecksilber-(H)-acetat,
Quecksilber-(II)-nltrat und ähnlichen erzielt.
_» -— -— ■»
BADOBiOINAt
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Andere, besonders geeignete Metallsalze sind Palladiumchlorid, Platinchlorid und Silbernitrat. Unter allen untersuchten
Metallsalzen werden Quecksilber-(Il)-acetat und Quecksilber-(II)-chlorid bevorzugt. Werden Eisen-(III)-salze
verwendet, so empfiehlt sich die Mitverwendung kleiner Mengen chelatbildender Mittel, wie #,o( -Dipyridyl
oder Phenothalein, um eine mögliche Störung durch Eisen-(II)-ionen zu verhindern.
Die-Konzentrationen der Bestandteile der erfindungsgemäßen
diagnostischen Zubereitung können in einem weiten Bereich schwanken, Z.B. kann in einer diagnostischen Zubereitung
zum Nachweis von Glukose der (xlukoseoxydasegehalt etwa 1/1O bis zum 100-fachen des Peroxydasegehalts betragen
und noch immer eine brauchbare Testzubereitung ergeben. Das wesentliche Erfordernis ist, daß eine ausreichende
Katalysatorkonzentration vorhanden ist, um die Oxydation und die Farbbildungsreaktion innerhalb eines brauchbaren
Zeitraumes bis zu ihrer Vollendung zu katalysaieren.
Die der erfindungsgemäßen Zubereitung zuzufügende Menge Indikatorfarbstoff ist nicht besonders kritisch.
Im allgemeinen ändert sich die Menge, die eine richtige und leicht zu unterscheidende Farbveränderung ergibt, von
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Zubereitung zu Zubereitung. Die erforderliche minimale Menge wird am besten experimentell festgestellt.
Die zum wirksamen Abfangen störender Substanzen erforderliche Konzentration des Abfangmittels hängt im
wesentlichen Maße von der Konzentration der störenden Substanz in der zu prüfenden Körperflüssigkeit ab. Mit zu~
nehmender Konzentration der störenden Substanz ist die Konzentration des AbfangmitteLs proportional zu erhöhen.
Pur die meisten Flüssigkeiten und insbesondere Körperflüssigkeiten,
wie Harn, kann das Abfangmittel in dem Abfangsystem sogar in der hohen Konzentration von etwa
15 Gew.-$ anwesend sein. Konzentrationen des Abfangmittels zwischen etwa 1 bis etwa 8 Gew.-^ und vorzugsweise zwischen
etwa 3 und etwa 5 Gew.-^ sind zum Abfangen störender Substanzen
im Urin am wirksamsten.
Neben der Wahl der Bestandteile der erfindungsgemäßen
diagnostischen Zubereitungen ist es auch wichtig, das Abfangsystem mit dem Nachweissystem in solcher Weise zu vereinigen,
daß das Abfangmittel weitgehend mit allen störenden, in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesenden,
Substanzen in Berührung kommt und diese entfernt oder
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inaktiviert, bevor die flüssigkeit mit dem Nachweissystem
der diagnostischen Zubereitung in Berührung kommt. Ein geeignetes Verfahren kann an dem Beispiel der Verwendung
einer saugfähigen Substanz als Träger für die erfindungsgemäße diagnostische Zubereitung erläutert werden. Hierbei
werden die Bestandteile auf den Träger in zwei Stufen aufgebracht; zunächst wird der saugfähige Träger mit den
Bestandteilen des Nachweissystems imprägniert und getrocknet
und anschließend mit einer Lösung des Abfangsystems, die das Abfangmittel enthält, überzogen. Geeignete
saugfähige Träger sind z.B. Holz, Papier, Stoff, poröse Plaste und ähnliche.
Nach obigem Verfahren kann man z.B. eine ausgezeichnete diagnostische Zubereitung zum Nachweis von Glukose
in Harn erhalten. In diesem Falle wird ein saugfähiger Träger zunächst mit einem Nachweissystem, das Glukoseoxydase,
o-Tolidindihydrochlorid und Peroxydase enthält, imprägniert,
der imprägnierte Träger gut getrocknet und anschließend mit einem Abfangsystem überzogen, das eine Lösunge von
Quecksilber-(II)-acetat in Dimethylsulfoxyd enthält und schließlich getrocknet.
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Dem erfindungsgemäßen Abfangsystem fügt man häufig
Verdickungsmittel, Netzmittel, den Hintergrund liefernde Farbstoffe (background dyes), Puffer und organische Lösungsmittel
zu. Der Zusatz solcher Substanzen ist besonders nützlich, wenn das Abfangsystea auf einem saugfähigen
Träger abgeschieden werden soll. Geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische sind z.B.
Äthanol, Ithanol-Benzol, Dimethylsulfoxyd, Benzol-Dimethylsulfoxyd,
Bengol-Äthanol-Dimethylsulfoxyd, Chloroform-Dimethylsulfoxyd,
Chloroform-lthanol-Dimethylsulfoxyd, Tetrachlorkohlenstoff-Dimethylsulfoxyd, Tetrachlorkohlenstoff-Äthanol-DiÄethyisulfoxyd,
Gyclohexan-Äthanol-Dimethylsulfoxyd lind ähnliche. Unter allen untersuchten Lösungsmitteln
und Lösungsmittelgemischen erwies sich Dimethylsulfoxyd
als wirksamstes Lösungsmittel für Quecksilber-(II)-salze.
Bei den meisten enzymatischen Seaktionen wird die
Eeaktiomsfähigkeit durch Änderungen des pH-Wertes beeinflußt.
Es ist wesentlich, daß der pH-Wert des Prüfmediums innerhalb eines "optimalen Bereiches für die Aktivität sowohl
des Abfangsystems, als auch des Nachweissystems bleibt.
Allgemein ist ein pH-Wert von über 3 erforderlich. Z.B. ist bei des Bestimmung van Glukose ein bevorzugter pH-Bereioh
BAD 0F*3!NAL
-H- 1A-30 084
von 4 bis 6 optimal, sowohl für das Nachweis-, als auch für das Abiangsystem, wenn das Abfangsystem als Abfangmittel
z.B. Quecksilber-(II)-acetat enthält.
Der optimale pH-Bereich kann am leichtesten durch Verwendung eines Puffers aufrechterhalten werden. Gemäß
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird
als Puffer Natriumacetat verwendet. Jedoch können auch andere Puffer, z.B. Zitrat-, Oxalat-, Salicylat-, Malatpuffer
und ähnliche verwendet werden. Gewisse Puffer, z.B. Phosphatpuffer, haben eine schädliche Wirkung auf
diagnostische Zubereitungen zum Nachweis und zur Bestimmung von Ii-Aminosäuren. In solchen Fällen werden andere Puffersubstanzen
verwendet.
Die Konzentration des verwendeten Puffermaterials ist nicht besonders kritisch. Eb ist lediglich erforderlich,
daß der Puffer am Ort der Reaktion einen optimalen pH-Wert für das Nachweis- und das Abfangsystem herstellt. Bei der
Bestimmung von Glukose kann z.B. durch ein Gewichtsverhältnis Quecksilber-(II)-acetat zu Natriumacetat von etwa
4 : 1 dieser optimale Bereich eingestellt werden. Durch dieses Gewichtsverhältnis wird ein pH-Wert von etwa 5
eingestellt und werden die meisten pH-Veränderungen, die
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beim Zusammenbringen des Abfangsystems mit dem Nachweissystem
auftreten können, verhindert. Jedoch können auch Gewichtsverhältnisse Natriumacetat zu Quecksilber-(II)-acetat
von 1 : 1 bis 10 : 1 gegebenenfalls verwendet werden,
Zur Erhöhung der Viskosität der diagnostischen Zubereitung können gegebenenfalls Verdickungsmittel, wie
Algin, Polyvinylalkohol, Stärke, Gummi arabicum oder hochmolekulares Polyäthylenglykol verwendet werden. Bei dem
Auftragen der Testzubereitung auf einem saugfähigen Träger
kann man auf diese Weise ein homogeneres Aufbringen der Testzubereitung erzielen.
Zur Erleichterung eines raschen und innigen Kontaktes zwischen den Körperflüssigkeiten oder anderen zu untersuchenden
Proben und den aktiven Bestandteilen nach der Erfindung und'zur Erzielung einer diffusen Farbreaktion
können gegebenenfalls gewisse Netzmittel zugefügt werden. Im Handel erhältliche Netzmittel, z.B. das unter dem
Handelsnamen Aerosol OT bekannte Natrium-Laurylsulfat, das
unter dem Handelsnamen Tween 81 bekannte, durch Polyoxyäthylen substituierte Sorbitanmonooleat, die unter dem
Handelsnahmen Renex bekannten Polyoxyäthylenester gemischter Fett- und Harzsäuren und ähnliche erwiesen sich
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für diese Zwecke als äußerst nützlich.
Die Konzentration der Verdickungs- oder Netzmittel in der erfindungsgemäßen diagnostischen Zubereitung soll
die Viskosität der diagnostischen Zubereitung so weit erhöhen, daß diese homogen aufgetragen werden kann, bzw. daß
der Kontakt der Bestandteile der Zubereitung mit der zu untersuchenden Flüssigkeit verbessert wird, ohne Schaden für
die Aktivität der Zubereitung. Diese Konzentrationen können recht verschieden sein; die wirksamste Konzentration kann
leicht experimentell bestimmt werden. Zweckmäßig werden die oben genannten Zusätze dem Abfangsystem zugefügt, jedoch
können gegebenenfalls alle oder ein Teil dieser Zusätze dem Nachweissystem zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäße diagnostische Zubereitung kann außer in Form eines imprägnierten saugfähigen Trägers in
verschiedenen feuchten oder trockenen Formen hergestellt werden. Z.B. können die aktiven Bestandteile in Form einer
Lösung, eines Pulvers, von Tabletten oder Pellets hergestellt und verwendet werden, wobei diese gegebenenfalls
einen Füllstoff enthalten. Gegebenenfalls können auch Kombinationen der nassen oder trockenen Formen verwendet
werden ader kann man einen die aktiven Bestandteile ent-
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haltenden Schlamm auf einer nicht-porösen Substanz, wie Glas, Metall oder ähnlichem abscheiden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand nachstehender Beispiele näher erläutert:
Zur Herstellung dieser diagnostischen Zubereitung wurden 2 Gemische hergestellt. Das 1, Gemisch enthielt die
wirksamen Bestandteile des Nachweissystems und das 2. Gemisch
die Bestandteile des Abfangsystems.
Das Nachweissystem enthielt?
250 mg o-Tolidindihydrochlorid
1,9 g Glukoseoxydase
40 mg Peroxydase
1,2g Gelatine
60 mg "F.D. und C. Soluble Red No. 3"
30 ml Puffer, enthaltend ein Gemisch aus
55,5 g wasserfreier Zitronensäure und 244,5 g Trinatriumzitrat, die miteinander
verrieben und in 750 ml Wasser gelöst wurden.
BAD ORDINAL
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Das Nacnweissystem wurde in folgender Reihenfolge
hergestellt: Die Peroxydase wurde in 5 ml Wasser gelöst und mit 5 ml einer wässrigen Suspension von G-lukoseoxydase
vermengt. Die Gelatine und der F.D. und C.-Farbstoff wurden in 25 ml kochendem Wasser gelöst und auf Raumtemperatur
abgekühlt. Das o-Tolidindihydrochlorid wurde
in 12,6 ml 2B-Alkohol suspendiert und mit der Pufferlösung vereinigt. Alle obigen Gemische und Lösungen wurden in
einem Behälter vereinigt und gründlich vermengt.
Papierstreifen der Maße 5 x 0,64 cm (2 inches by 1/4 inch) wurden in die so vorbereitete Lösung getaucht
und 9 Minuten bei 1000C an der Luft getrocknet.
Das Abfangsystem enthielt:
| 65 ml | PVP/VA E535" |
| 7 ml | GAFAC RE610 (10 $ in 2B-Alkohol) |
| 4 ml | Aerosol OT (25 ^ in 2B- Alkohol) |
| 80 g | Quecksilber-(II)-acetat |
| 20 g | Natriumacetat |
| 915 ml | Dimethylsulfoxyd |
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Dae als Abfangmittel verwendete Quecksilber-(II).-acetat
wurde in Dimethylsulefoxyd gelöst und mit einer Lösung, die das Verdickungsmittel, das Netzmittel und den
Puffer enthielt, vereinigt. Diese Bestandteile wurden anschließend bis zur Entstehung einer homogenen Lösung
gründlich vermengt. Etwa die Hälfte der imprägnierten Streifen wurde hierauf mit dem homogenen, das Abfangsystem
enthaltenden, Gemisch überzogen, indem man die Streifen.in das Gemisch eintauchte. Anschließend wurden die Streifen
an der Luft bei 80 C etwa 9 Minuten getrocknet.
Es wurden drei Harnlösungen, die verschiedene Mengen Glukose enthielten und eine Lösung ohne Glukose hergestellt,
jede dieser Lösungen in 5 gleiche Volumina aufgeteilt und 16 dieser Lösungen verschiedene Mengen Ascorbinsäure hinzugefügt.
Die restlichen 4 Harnlösungen, die nur verschiedene Mengen Glukose enthielten, dienten als Vergleichslösungen.
Von den wie oben hergestellten zwei Arten saugfähiger Probestreifen tauchten 6 verschiedene Testpersonen je einen
in je eine der vorbereiteten Harnlösungen ein. Die hierbei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
009818/1488 bad original
lA-30
Harnlösung %
Glukose
Ascorbin- Diagnostische Zubereitung t
säure mit Abfangmittel
mg/1 OHM D
Diagnostische Zubereitung t ohne Abfangmittel OHMD
2 3
200
500
1000
2000
6 6 6 6 6
O
<D
OO
6 7 8 9 10
ο,Ι
200
500
1000
2000
6·
1 3
11 12 13 14 15
0,5
200
500
1000
2000
1 1 1
2 3 3 3
2 2 2 2 2
1 5
6 1
16 17 18 19 20
1,0
200
500
1000
2000
1 1 I-
2 2 2 2 2
4 4 3 3 3
1 5
Eine Null in obiger Tabelle zeigt an, daß keine Farbveränderung beobachtet wurde. Die Buchstaben
H, M und D geben an, daß eine helle, mittlere, bzw. dunkle Farbe entwickelt wurde. """*
- 21 - ' 1A-30 084
In der Lösung, die weder Glukose noch Ascorbinsäure
enthielt (Lösung 1) behielten alle 12 Probestreifen ihre ursprüngliche !Farbe und die Testpersonen vermerkten eine Ablesung
Null. Pur eine Lösung, die 1,0·% Glukose und 1,000 mg/l
Ascorbinsäure enthielt (Lösung 19), vermerkten alle 6 !Testpersonen eine Ablesung Null mit diagnostischen
Streifen, die kein Abfangmittel entheilten. Jedoch vermerkten die 6 Testpersonen eine helle, 2 mittlere und 3 dunkle
Färbungen mit diagnostischen Streifen, die ein Abfangmittel enthielten. Diese Ergebnisse können mit den Ergebnissen
an Lösung 11 verglichen werden. Diese Harnlösung enthielt 0,5 g-% Glukose und keine Ascorbinsäure. Die Testpersonen
vermerkten 4 mittlere und 2 dunkle Ablesungen mit dieser Harnlösung und 6 dunkle ohne Abfangmittel. Diagnostische
Zubereitungen, die nicht mit einem Abfangmittel überzogen waren, ergaben daher unregelmäßige Ablesungen, insbesondere ·
bei zunehmender Glukosekonzentration.
Die Tabelle 1 zeigt die schädliche Wirkung von Ascorbinsäure auf Glukosebestimmungen und wie diese Wirkung duroh
die neue und verbesserte erfindungsgemäße Zubereitung beseitigt wird.
bad
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Zum Nachweis von L-Aminosäuren wurde eine diagnostische
Zubereitung hergestellt, indem man L-Aminosäureoxydase mit einem Gemisch aus o-Tolidindihydroehlorid, Peroxydase
und einem Zitratpuffer, letzteren zur Aufrechterhaltung
eines pH-Wertes von über 3, zusammenbrachte. Mit dieser Zubereitung wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und
dieser anschließend mit einem silbernitrathaltigen Abfangsystem nach dem Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde
der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mit einer
Lösung, die etwa 0,5 $ L-Aminosäuren und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt, befeuchtet, so entwickelte sich
eine purpurfarben-blaue Farbe. Die anderen vorbereiteten, nicht mit einem silbernitrathaltigen Abfangsystem überzogenen
Streifen gaben unregelmäßige oder keine Parbänderungen, wenn sie mit der Lösung zusammengebracht wurden.
. Zum Nachweis von D-Aminosäuren wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man D-Aminosäureoxydase mit
einem Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und einem Oxalatpuffer vereinigte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung
eines pH-Wertes von über 3 diente. Mit dieser
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- 23 - ■ 1A-30 084
Zubereitung wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und
dieser anschließend mit einem palladiumchloridhaltigen Abfangsyatem
nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen
mit einer Versuchslösung befeuchtet, die etwa 0,5 % D-Aminosäure und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt,
so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit einem palladiumchloridhaltigen
Abfangsystem überzogene Streifen gaben unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung
zusammengebracht wurden.
Zum Nachweis von Xanthin wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man Xanthinoxydase mit
einem Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und
einem Zitratpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung
eines pH-Wertes von über 3 diente. Mit dieser Zubereitung wurde hierauf ein saugfähiger Träger
imprägniert und dieser anschließend mit einem eisen-(III)-chloridhaltigen
Abfangsystem nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren überzogen. Wurde diese diagnostische
Zubereitung mit einer Versuchslösung befeuchtet, die etwa
1,0 ^S Xanthin und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt,
BAD OFJiG.'NAL
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- 24 - 1A-30 084
so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit dem eisen-(III)-chloridhaltigen
Abfangsystem überzogene Streifen ergaben unregelmäßige oder keine Parbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung
zusammengebracht wurden.
Zum Nachweis von Glycin wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man Glycinoxydase mit
einem Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und
einem Zitratpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung
eine» pH-Wertes von über 3 diente. Mit dieser Zubereitung wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und
anschließend mit einem eisen-(III)-oxalathaltigen Abfangsystem
nach dem Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mit einer
Versuchslösung befeuchtet, die etwa 1,0 Gew.-i» Glycin und
etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt, so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht
mit einem eisen-(lll)-oxalathaltigen Abfangsystem überzogene
Streifen ergaben unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung zusammengebracht wurden.
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Zum Nachweis von Monoaminen wurde eine diagnostische
Zubereitung hergestellt, indem man Monoaminoxydase mit
einem Gemisch aua o-TolidindihydBchlorid, Peroxydase und
einem Zitratpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung
eines pH-Wertes von über 2 diente. Mit dieser Zubereitung wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und
anschließend mit einem queci:eilber-(ll)-chloridhaltigen
Abfangsystem nach dem Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mit
einer Versuchslösung befeuchtet, die etwa o,1 $ Monoamine und etwa 500 mg/l Ascorbinsäure enthielt, so entwickelte
sich eine purpurfarben-blaue Parbe. Andere vorbereitete, nicht mit einem quecksilber-(II)-chloridhaltigen Abfangsystem
überzogene Streifen, ergaben irrtümliche oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung zusammengebracht
wurden.
Zum Ifachwe.is von Biaminen wurde eine diagnostische
Zubereitung hergestellt, indem man Diaminoxydase mit einem
Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und einem
Oxalatpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung
BAD 0RK3INAL
16/14BS
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eines pH-Wertes von über 3 diente. Mit dieser Zubereitung wurde einsaugfähiger Träger imprägniert und anschließend
mit einem quecksilber-(II)-nitrathaltigen Abfangsystem
nach dem Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mit einer Versuchslösung
befeuchtet, die etwa 0,5 $ Diamine und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt, so entwickelte sich eine
purpurfarben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit einem quecksilber-(II)-nitrathaltigen Abfangsystem überzogene
Streifen ergaben unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung zusammengebracht wurden.
Zum Nachweis von Harnsäure v/urde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man Uricase mit einem Gemisch
aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und einem Zitratpuffer
vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von über 3 diente. Mit dieser Zubereitung
wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und anschließend mit einem platinchloridhaltigen Abfangsystem nach dem Verfahren
von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mit einer Värsuchslösung
befeuchtet, die etwa 0,1 i» Harnsäure und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt, so entwickelte sich eine purpur-
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farben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit einem
platinchloridhaltigen Abfangsystem überzogene Streifen ergaben unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie
mit der Versuchslösung zusammengebracht wurden.
Zum Nachweis von Luciferin wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man Luciferase mit einem
Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid, Peroxydase und einem
Phosphatpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von über 5 diente. Mit dieser Zubereitung
wurde ein saugfähiger Träger imprägniert und anschließend mit einem kobalthaltigen Abfangsystem nach dem
Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen mi^t einer Versuchslösung
angefeuchtet, die etwa 0,5 $ Luciferin und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure 'enthielt, so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue
Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit einem kobaltnitrathaltigen Abfangsystem überzogene Streifen ergaben
unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung zusammengebracht wurden.
BAD OFMGiNAL
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Zum Nachweis von D-Asparaginsäure wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man D-Asparaginsäureoxydape
mit einem Gemisch aus o-Tolidindihydrochlorid,
Peroxydase und einem Zitratpuffer vermengte, wobei letzterer zur Aufrechterhaltung eines pH-Wertes von über 3 diente.
Mit dieser Zubereitung wurde ein aaugfähiger Träger imprägniert und anschließend mit einem kupfer-(II)-chloridhaltigen
Abfangsystem nach dem Verfahren von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene Papierstreifen
mit einer Versuchslösung befeuchtet, die etwa 0,5 °i° D-Asparaginsäure und etwa 500 mg/1 Ascorbinsäure enthielt,
so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit dem kupfer-(II)-chloridhaltigen
Abfangsystem überzogene Streifen ergaben unregelmäßige oder keine Farbänderungen, wenn sie mit der Versuchslösung
zusammengebracht wurden.
Zum, Nachweis verschiedener aliphatischer oder aromatischer
Aldehyde wurde eine diagnostische Zubereitung hergestellt, indem man eine aus Säugetierleber hergestellte
Leber-Aldehydoxydase mit einem Gemisch aus o-Tolidin-
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dihydrochlorid, Peroxydase und einem Phosphatpuffer vermengte,
wobei letzterer zur Aufrechterhaltung eines pH-Y/ertes von über 3 diente. Mit dieser Zubereitung wurde ein
saugfähiger Sräger imprägniert und anschließend mit einem zinn-(IV)-chloridhaltigen Abfangsystem nach (fern Verfahren
von Beispiel 1 überzogen. Wurde der imprägnierte und überzogene
Papierstreifen mit einer Versuchslösung befeuchtet, die etwa 0,5 # eines Gemisches aus Acetaldehyd, Butyraldehyd
und Benzaldehyd und etwa 500 mg/l Ascorbinsäure enthielt, so entwickelte sich eine purpurfarben-blaue
Farbe. Andere vorbereitete, nicht mit dem zinn-(IV)-chloridhaltigen
Abfangsystem überzogene Streifen ergaben unregelmäßige oder keine !Farbänderung en, wenn sie mit der Versuchslösung zusammengebracht wurden.
Zusammenfassend betrifft die Erfindung eine diagnostische Zubereitung, bestehend aus einem zum Nachweis dienenden
Kedox-System und einem Abfangsystem. Das Nachweissystem
dient zum Nachweis und zur Bestimmung einer chemischen Substanz durch Oxydation derselben zu einem oxydierten
Derivat und zu Peroxyden in einer Körperflüssigkeit, die eine die Reaktion störende reduzierende Substanz enthält.
Die Peroxyde werden mittels eines chromogenen Nachweissystems nachgewiesen, das in Gegenwart verschiedener Mengen
.' . . BAD 0R4GINÄL
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- 30 - 1A-30 084
von Peroxyden verschiedene larbänderungen ergibt. Das
Abfangsystem "besteht aus einer ionisierbaren Schwermetallverbindung,
die weitgehend alle, in der Körperflüssigkeit anwesenden störenden Substanzen abfangen kann, bevor die
störenden Substanzen mit dem Machweissystem in Kontakt
kommen. Hierdurch wird die störende Substanz daran gehindert, eine genaue ißestimmung der chemischen Substanz zu stören
und zu verhindern.
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Claims (18)
1. Zubereitung zum Nachweis chemischer Substanzen
in den Nachweis störende Substanzen enthaltenden Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet , daß die
Zubereitung ein Nächweissystem zum Nachweis der bestimmten
chemischen Substanz und ein Abfangsystem zur Inaktivierung oder Entfernung in der Flüssigkeit enthaltener Substanzen,
die den Nachweis der bestimmten chemischen Substanz durch das Nachweissystem stören, enthält.
2. Zubereitung zum Nachweis chemischer Substanzen in den Nachweis störende Substanzen enthaltenden Flüssigkeiten,
enthaltend
(a) eine enzymatisch^, oxydierend wirkende Substanz, die die
chemische Substanz zu einem oxydierten Derivat derselben und Peroxyden oxydiert,
(b) eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Peroxyden eine Farbänderung erleidet,
(c) einen peroxydischen Katalysator zur Katalyse der Farbänderung
und
(d) ein Abfangmittel, das in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesende und den Nachweis der chemischen Substanz
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störende Substanzen inaktiviert oder entfernt.
3. Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η ζ
e i c h η et , daß das Abfangsystem eine ionisierbare Schwermetallverbindung enthält, die in ionisiertem Zustand
ein Redoxpotential zwischen dem der chromogenen Substanz und dem der in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesenden
störenden Substanz besitzt.
4. Prüfvorrichtung zum Nachweis einer chemischen Substanz in einer zu untersuchenden Flüssigkeit, die eine
den Nachweis der chemischen Substanz durch die Prüfvorrichtung störende reduzierende Substanz enthält, dadurch
gekennzeichnet , daß die Testvorrichtung einen saugfähigen Träger enthält, der mit einem Nachweissystem
imprägniert ist, enthaltend
(a) eine enzymatische, oxydierend wirkende Substanz zur
Oxydation einer bestimmten chemischen Substanz in Gegenwart von Sauerstoff zu einem oxydieifsn Derivat derselben
und Peroxyden,
(b) eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Peroxyden eine Farbänderung erleidet und
(c) einen peroxydischen Katalysator zur Katalyse der Farbänderung,
0098 16/1 488
- 55 - 1A-50 084
und daß der imprägnierte saugfähige Träger mit einem Abfangsystem überzogen ist, das eine ionisierbare Schwermetallverbindung
enthält, die in ionisiertem Zustand ein Redoxpotential zwischen dem der chromogenen Substanz und
dem der störenden, in der zu untersuchenden !Flüssigkeit
anwesenden, Substanz aufweist.
5. Prüfvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die ionisierbare Schwermet
allver bindung ein Metall der Gruppen VIII, IB, HB oder IVA des periodischen Systems der Elemente enthält.
6. Prüfvorrichtung zum Nachweis von Glukose in einer Flüssigkeit, die eine den Nachweis von Glukose durch die
Prüfvorrichtung störende reduzierende Substanz enthält, enthaltend einen saugfähigen Träger, cfer mit einer Zubereitung
imprägniert ist, die
(a) Glukoseoxydase,
(b) eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Peroxyden eine farbänderung erleidet und
(c) einen peroxydischen Katalysator zur Katalyse der Parbänderung
enthält, wobei der imprägnierte saugfähige Träger mit einem
Abfangsystem überzogen ist, das eine ionisierbare Schwer-
BAD OR*G!NAL
000816/1488
- 34 - 1A-30 084
metallverbindung enthält, die in ionisiertem Zustand ein Redoxpotential zwischen dem der chromogenen Substanz und
dem der störenden, in der zu untersuchenden Flüssigkeit anwesenden, Substanz besitzt.
7. Prüfvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die ionisierbare Schwermetallverbindung
ein Metall der Gruppen VIII, IB, HB oder IVA des periodischen Systems der Elemente enthält.
8. Prüfvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die ionisierbare Schwermetallverbindung
ein Quecksilber-(II)-salz ist.
9. Prüfvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die ionisierbare Schwermetallverbindung
Queeksilber-(Il)-chlorid ist.
10. Prüfvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die ionisierbare Schwermetallverbindung
Quecksilber-(II)-acetat ist.
11. Abfangsystem zur Entfernung störender reduzierender Substanzen aus einer Flüssigkeit, enthaltend
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- 35 -. 1A-30 084
(a) eine ionisierbare' Schwermetallverbindung eines Metalls
der Gruppen VIII, IB, HB oder IVA des periodischen Systems der Elemente,
(b) ein Netzmittel,
(c) ein Verdickungsmittel,
(d) ein organisches Lösungsmittel und
(e) einen Puffer, der den pH-Wert auf über 3 hält.
12. Verfahren zum Nachweis einer chemischen Substanz in einer Flüssigkeit, die eine den Nachweis störende Substanz
enthält, dadurch gekennzeichnet , daß ' man die Flüssigkeit mit einem Nachweissystem zusammenbringt,
das zum Nachweis der chemischen Substanz dient und das ein Abfangsystem enthält, welches weitgehend alle
den Nachweis der chemischen Substanz störende Substanzen aus der Flüssigkeit entfernen oder inaktivieren kann, bevor
die Flüssigkeit mit dem Nachweissystem in Kontakt kommt.
13. Verfahren zum Nachweis einer chemischen Substanz
in einer Flüssigkeit, die den Nachweis der chemischen Substanz störende Substanzen enthält, dadurch gekennzeichnet , daß man die Flüssigkeit mit einem Nachweissystem,
das ein Abfangsystem enthält, zusammenbringt,
'bad original
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- 36 - 1A-30 084
wobei das Nachweissystem
(a) eine enzymatisch^, oxydierend wirkende Substanz zur
Oxydation der bestimmten chemischen Substanz in Gegenwart von Sauerstoff zu einem oxydierten Derivat derselben
und Peroxyden,
(b) eine chromogene Substanz zum Nachweis der entstandenen PeroKyde und
(c) einen peroxydischen Katalysator zur Katalyse der chromogenen Nachweisreaktion
enthält und das Abfangsystem eine ionisierbare Schwermetallverbindung
enthält, die in ionisiertem Zustand ein Redoxpotential zwischem dem der chromogenen Substanz und dem der
störenden Substanz besitzt und weitgehend alle störenden Substanzen aus der Flüssigkeit entfernen oder inaktivieren
kann, bevor die Flüssigkeit mit dem Nachweissystem in Kontakt gelangt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man eine ionisierbare Schwermetallverbindung
eines Metalles der Gruppen VIII, IB, HB oder IVA des periodischen Systems der Elemente verwendet.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man als ionisierbare Schwermetall-
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verbindung ein Quecksilber-(H)-BaIz verwendet.
16. Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung zum Nachweis einer chemischen Substanz in einer Körperflüssigkeit,
die den Nachweis der chemischen Substanz störende Substanzen enthält, dadurch gekennzeichnet ,
daß man einen saugfähigen Träger mit einem Nachweissystem
imprägniert, das
(a) eine enzymatische oxydierend wirkende Substanz zur
Oxydation einer bestimmten chemischen Substanz in Gegenwart von Sauerstoff zu einem oxydierten Derivat dieser
Substanz und Peroxyden,
(b) eine chromogene Substanz, die in Gegenwart von Perosyden
eine !Farbänderung erleidet und
(c) einen peroxydischen Katalysator zur Katalyse dieser Farbänderung
enthält, worauf man den imprägnierten saugfähigen Träger trocknet und mit einem Abfangsystem überzieht, das'eine
ionisierbare Schwermetallverbindung enthält, die in ionisiertem Zustand ein Redoxpotential zwischen dem der chromogenen
Substanz und dem der in der Körperflüssigkeit anwesenden störenden Substanz besitzt und daß man die überzogene
Imprägnierung trocknet.
BAD ORIGINAL 009816/1488
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17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch g e Ic e η η
zeichnet , daß man als ionisierbare Schwermetallverbindung die Verbindung eines Metalles der Gruppen
VIII, IB, HB oder IVA des periodischen Systems der Elemente verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch g e k e η η
zeichnet , daß man als ionisierbare Schwermetallverbindung ein Quecksilber-(II)-salz verwendet.
840
009816/U88
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