DE1593460A1 - Process for the microbiological oxidation of alkylbenzenes - Google Patents
Process for the microbiological oxidation of alkylbenzenesInfo
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Description
15 9346 G15 9346 G.
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KBQTMMW ,KBQTMMW,
zu der Patentanmeldungto the patent application
-vU ;./-:;■ /'/.'' der Firma-vU; ./- :; ■ / '/.' 'of the company
SUN OIL ÜOMPAHY 1608 Walnut Street Philadelphia, PennsylvaniaSUN OIL ÜOMPAHY 1608 Walnut Street Philadelphia, Pennsylvania
betreffendconcerning
benzolenbenzenes
Die Erfindung beaieht sich auf die Fermentlerung von methyl· substituierten Benzolkohlenwasserstoffen unter Bedingungen, die zur Bildung von einem oder von zwei Typen organischer Säuren führen« Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die mikrobiologische Oxydation von Methylbenzolen mit 7 10 Kohlenstoffatomen pro Molekül, mit Hilfe spezifisch wirkender Stämme an Mikroorganismen der Art Nooardla» Die für das erfindungsgemäSe Verfahren verwendeten Stamm· sind charakterisiert dureh Ihre Fähigkeit, aus C^ - G10-Methylben- SQl®n9 entweder ein© methylsubetituierte Muconsäure oder ein® Dihydroxybenzoesäure-oder beid® zu bildent wi® dies im folgenden besehrieben ist.The invention relates to the fermentation of methyl substituted benzene hydrocarbons under conditions which lead to the formation of one or two types of organic acids strains of microorganisms of the species Nooardla "the stock used for the erfindungsgemäSe procedures · are characterized dureh from C ^ your ability - 10 -Methylben- SQl®n to form G 9 either a © methylsubetituierte muconic or ein® dihydroxybenzoic or beid® t wi® this is described in the following.
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Die mikrobiologische Oxydation aromatischer Kohlenwasserstoffe mit Hilfe verschiedener Ülypen an Mikroorganismen ist bereits mehrfach beschrieben worden,. Zahlreiche Veröffentlichungen beschäftigen sich mit dieser Materie. Davis and Raymond berichten in einem Aufsatz in *Applied Microbiology11, Band 9* Nr0 5* September 1961» Seiten 383Hie 388 über die verschiedenen Veröffentlichungen zu diesem Verfahren. Diese Autoren beschreiben darin, sowie in der USA-Patentschrift 3 057 784 die Oxydation von Alkylbenzolen mit Hilfe bestimmter Kulturen von Nocardia. In allen Fällen scheint die Oxydation nur an der Alkylgruppe erfolgt zu sein» so daß Säureprodukte, wie Benzoesäure, Phenylessigsäure und Phenylacrylsäure in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Alkylbenzol erhalten wurden* Wenn der Alkylembetituent eine ungerade Anzahl von Kohlenstoffatomen besitzt, war das hauptsächliche Oxydationaprodukt im allgemeinen Benzoesäure« während bei einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen es Phenylessigsäure war. Die berichteten Brgebnisee gaben keinen Anlaß, daß irgend welche Stämme von Nocardia eine direkte Hydroxylierung dee Benzolringes bewirken könnten.The microbiological oxidation of aromatic hydrocarbons with the help of various Ülypen on microorganisms has already been described several times. Numerous publications deal with this matter. Davis and Raymond report in an article in * Applied Microbiology 11 , Volume 9 * No. 0 5 * September 1961 »Pages 383Hie 388 about the various publications on this process. In it and in US Pat. No. 3,057,784, these authors describe the oxidation of alkylbenzenes with the aid of certain cultures of Nocardia. In all cases the oxidation appears to have occurred only on the alkyl group "so that acid products such as benzoic acid, phenylacetic acid and phenylacrylic acid were obtained depending on the particular alkylbenzene used. * If the alkyl substituent has an odd number of carbon atoms, the main oxidation product was in general Benzoic acid «while with an even number of carbon atoms it was phenylacetic acid. The reported results did not suggest that any strains of Nocardia could cause direct hydroxylation of the benzene ring.
Ein neuerer Überblick über mikrobiologische Oxydationen ' von Kohlenwasserstoffen einschließlich Alkylbenzolen findet sich in dem Lehrbuch "Advances in Encymology", Band 27» Seiten 469 - 546 (Interseience Publishers, 1965)» Auf SeiteA recent review of microbiological oxidations' of hydrocarbons including alkylbenzenes can be found in the textbook "Advances in Encymology", Volume 27 » Pages 469-546 (Interseience Publishers, 1965) »On page
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496 der Übersicht weisen die Autoren darauf hin, daß bei der mikrobiologischen Oxydation von Alkylbenzolen im allgemeinen die meisten, wenn nicht alle Mikroorganismen den Phenylring nicht angreifen, sondern vielmehr einen Alkyleubetituenten. In einem ifell wird berichtet, daß Toluol in Katechol (1,2-Dihydroxybenzol) durch Paeudomonas aeruglnosa tiberfuhrt worden 1st, doch schloß der Herstellungsweg die anfängliche Oxydation der Methylgruppe unter Bildung von Benzoesäure ein, worauf die Decarboxylierung des Oärboxylrestes und eine 1,2-DiTiydroxylierung erfolgte. Es wird von keinem fall berichtet, bei dem die Dihydroxylierung des Phenylringes eines Alkylbenzole ohne vorherige Bildung des Carboxylrestes aus den Alkylsubstituenten mit dessen anschließender Decarboxylierung stattfand· Nur im Falle von Benzol selbst wurde gefunden, daß einige Mikroorganismen befähigt sind, den Hing direkt zu dihydroxylieren.496 of the review, the authors point out that in the microbiological oxidation of alkylbenzenes in general most, if not all, microorganisms do not attack the phenyl ring, but rather an alkyl substituent. In one case it is reported that toluene was converted into catechol (1,2-dihydroxybenzene) by Paeudomonas aeruglnosa , but the route of manufacture involved the initial oxidation of the methyl group to form benzoic acid, followed by decarboxylation of the orarboxyl radical and a 1,2- DiTiydroxylation took place. No case is reported in which the dihydroxylation of the phenyl ring of an alkylbenzenes took place without prior formation of the carboxyl radical from the alkyl substituents with its subsequent decarboxylation.Only in the case of benzene itself was it found that some microorganisms are capable of dihydroxylating the Hing directly.
Bei den Fällen, bei denen Benzol selbst mikrobiologisch Oxydiert wo'rden ist (vergl. Selten 506 - 510 des oben erwähnten Lehrbuches) wird Katechol gebildet. Es hat sich gezeigt, daß der StoffwechselraechanisiBue von wenigen Mikroorganismen befähigt ist, eine weitere Oxydation des Katechols su verursachen, während auch eine Hingaufspaltung zwischen benachbarten Hydroxylgruppen erfolgt. Dies hat zur Bildung von Muconsäure geführt, gewöhnlich in Form desIn cases in which benzene itself has been microbiologically oxidized (cf. Rarely 506-510 of the above-mentioned textbook), catechol is formed. It has been shown that the metabolic mechanism of a few microorganisms is able to cause further oxidation of the catechol, while also causing a breakdown occurs between adjacent hydroxyl groups. This has led to the formation of muconic acid, usually in the form of
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Die gesamte Umwandlung kann wie folgt dar gestellt werden:The entire conversion can be represented as follows:
Benzol Katechol ciSgCis-MuconsäureBenzene Catechol ciSgCis-Muconic Acid
Wenn auch wenige Mikroorganismen die Umwandlung von Benzol in dieser Weise bewirken, so ist doch keine analoge Umwandlung von Alkylbenzol bisher mitgeteilt worden. Infolgedessen dürfte die Darstellung von Alkylbenzol aus einem 1~Carboxy-293-dihydroxybenzol mit der gleichen Anzahl Kohlenstoffatome wie der Auegangskohlenwasserstoff oder aus einer alkylsubstituierten Muconsäure neu sein.Even if a few microorganisms effect the conversion of benzene in this way, no analogous conversion of alkylbenzene has so far been reported. As a result, the preparation of alkylbenzene from a 1- carboxy-2 9 3-dihydroxybenzene with the same number of carbon atoms as the starting hydrocarbon or from an alkyl-substituted muconic acid should be new.
Es hat sich nun gezeigt, daß es einige Stämme an Mikroorganismen der Art Nocardia gibt, die in einer neuen Weise methylsubstituierte Benzole oxydieren, die wenigstens 2 aufeinanderfolgende unsubstituierte Ringkohlenstoffatome besitzen. Diese Kohlenwasserstoffsubstrate, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind die Cy-C10-aethylsubetituierten Benzole mit 1-4 Methylgruppen und wenigstens 2 benachbarten lüngkohlenstoffatomen, die keine Substituenten tragen. Nach einem neuen Gesichtspunkt wird eine Methylgruppe an einem Kohlenstoffatom, das sich unmittelbar neben zwei nicht-substituierten Kohlenstoffatomen befindet, in eine Carboxylgruppe umgewandelt, während auchIt has now been shown that there are some strains of microorganisms of the species Nocardia which in a new way oxidize methyl-substituted benzenes which have at least 2 consecutive unsubstituted ring carbon atoms. These hydrocarbon substrates which are used in the present invention are the Cy-C 10 -aethyl-substituted benzenes having 1-4 methyl groups and at least 2 adjacent green carbon atoms which do not carry any substituents. In a new aspect, a methyl group on a carbon atom immediately adjacent to two unsubstituted carbon atoms is converted to a carboxyl group, while also
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eine ©rthohydroxylierung des Ringβa an den beiden benachbarten offenen Kohlenstoffatomen stattfindet. Ferner findet Reaktion, ohne Decarboxylierung statt« Das Ergebnisa thohydroxylation of the Ringβa takes place on the two adjacent open carbon atoms. Furthermore, reaction takes place without decarboxylation «The result
Sto-ffweehaelreaktionen ist die Bildung von 2 „3-ijihydroxybenaoesäure oder deren Homologen in Abhängigkeit •worn, ä®m als Ausgangsmateriial verwendeten-. Me thylbenzol« Beispielsweise körnen aus p-Xylol geeignete Stäma© von Nocardia '25,3-Bihyöroxy-p-toluolsäure (im folgenden als DHPT ) bilden» Ie solohea Fällen, scheint es9 daß p-Sto-ffweehaelreaktionen is the formation of 2,3-ijihydroxybenaoic acid or its homologues depending on the type of material used as the starting material. Me thylbenzol "For example, graining from p-xylene suitable Stäma © of Nocardia '25, 3-Bihyöroxy-p-toluic acid (hereinafter referred to as DHPT) form" Ie solohea cases, it appears that 9 p
(im folgenden-ale PTA bezeichnet)- ©in Vorläu- ■ der Stoffwechselfolge zu DHPT ist und eich deshalb wesentliche Mengen ron PTA im allgemeinen ansammeln, wenn immer JMBX gebildet -wird. Dies trifft besonders für die spaten Stufen der Fe-nsentierung. suo Analoge Ansammlungen* won anderen5, nicht-hydroxyllerten Benzoesäuren finden gew'dhnlich -.gleichzeitig mit ä.er Bildung von anderen 2,3-(ale-following in the PTA called) - © provisionally in ■ the metabolic consequence to DHPT and verifiable therefore substantial amounts ron PTA accumulate generally whenever JMBX -is formed. This is especially true for the late stages of disclosure. su o Analog accumulations * won anderen5, non-hydroxyllerten benzoic find gew'dhnlich -.gleichzeitig with ä.er formation of other 2,3-
statt,instead of,
St'MamaSt'Mama
noeh andsx»©. n©ia© ße-slchtspunkte d©r Os^dation für s©ig©a? die wenigstensnoeh andsx »©. n © ia © ße points of view of the os ^ dation for s © ig © a ? at least that
Dies© Stamm© fizad bafPiigty d©a Miag Oxydation des Methylsubstituenten usiäThis © strain © fizad bafPiigty d © a Miag Oxidation of the methyl substituent, etc.
BADBATH
Ringspaltung zwischen den hydroxyl:ierten Kohlenstoffatomen zu diorthohydroxylierenc Diese Ringspaltung ist das Ergebnis einer weiteres! Oxydation? welche die hydroxylierten Kohlenstoffatome in Carboxylgruppen überführt. So. kann Dimethy!muconsäure (im folgenden als DMMA bezeichnet) dureh biologische Oxydation hergestellt werden, wie sich di©a durch die' folgende Gleichung darstellen läßt: C G CRing cleavage between the hydroxylated carbon atoms to diorthohydroxyliertc This ring cleavage is the result of another! Oxidation ? which converts the hydroxylated carbon atoms into carboxyl groups. Thus, dimethylmuconic acid (hereinafter referred to as DMMA) can be produced by biological oxidation, as can be represented by the following equation: CGC
σ σσ σ
3,6--Dimethyl- et,et' -Dimethylmucon katechol säure (DMMA)3,6 - Dimethyl- et, et '-Dimethylmucon catecholic acid (DMMA)
Das in der Gleichung gezeigte substituierte Kateehol ist ein Übergangsswischenprodukt. bei der mikrobiologischen Reaktion und kommt im allgemeinen im Fermentierungsmedium aioht in großen Mengen vors doch können sich in manchen Fällen kieia© Mengen ansammeln und in Endprodukt anwesend B(SiMo Wie angegeben liegt das bei der Fermentierung von .p-Xylol ©Etelten© DMMA in Form seines cl8,ci3-Isoaaers vor. kanu leicht in das eisjtrane-lsomer und/oderThe substituted cateehol shown in the equation is a transitional intermediate product. comes in the microbiological reaction and generally in the fermentation medium aioht in large amounts s but can accumulate in some cases kieia © quantities and in the end product present B (SiMo As is stated that in the fermentation of .p-xylene © Etelten © DMMA in Form of its cl8, ci3-Isoaer before. Canoe easily into the Eisjtrane-Isomer and / or
Isomer unter entsprechenden Isomerisierungabeäingungen ieoaserisiert werden.Isomer under appropriate isomerization conditions be laserized.
s daß aus C^-C^Q«H@thylbens©len geeign®t© Stämme toä Mocardia9 entvfeder 293-Mliydr©xjb®iizoe- s that from C ^ -C ^ Q «H @ thylbens © len suitable © strains toä Mocardia 9 entvfeder 2 9 3-Mliydr © xjb®iizoe-
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
säuren oder ein Homologes von Muconsäure oder beides erzeugen. Jeder Säuretyp hat die gleiche Anzahl Kohlenstoffatome wie der Ausgangskohlenwasserstoff» Bas Muconsäure-Horaologe hat ebenfalls die gleiche Anzahl Methylsubstituenten wie der Stammkohlenwasiäerstoff, während die Dihydroxybenzoeeäure eine Methylgruppe weniger besitzt. Beispielsweise erzeugen aus p~Xylol einige Nocardiastämme T)HPT, aber kein DMMA s während einige sowohl DHPT als auch DMMA produzieren* Unter den letzteren Stämmen können einige dazu gebracht werden, daß sie IXlIiA unter im wesentlichen Ausschluß von DHPT unter selektiven Fermentierungsbedingungen erzeugen. Wie oben bereits erwähnt, bildet sich eine wesentliche Menge von PTA im allgemeinen, wenn immer DHPT erzeugt wird.'acids or a homologue of muconic acid or both. Each type of acid has the same number of carbon atoms as the starting hydrocarbon. Bas Muconic Acid Horaologe also has the same number of methyl substituents as the parent hydrocarbon, while the dihydroxybenzoic acid has one less methyl group. For example, generating from p ~ xylene some Nocardiastämme T) HPT, but s not produce DMMA while some both DHPT and DMMA * Among the latter strains some can be caused to produce IXlIiA the substantial exclusion of DHPT under selective fermentation. As noted above, a substantial amount of PTA is generally formed whenever DHPT is produced.
Geeignete Typen an Nocardia, die sich für die i)urehfUhrung des erfindungsgemäBen Verfahrene eignen, werden als ortho« dihydroxylierende und nicht deoarboxylierende Stämme bezeichnet. Mit dem Ausdruck "orthodihydroxylierend" wird ausgedrückt; daß der Mikroorganismus befähigt ist, an dem Ring des Methylbenzole 2 Hydroxylgruppen zu bilden, die zueinander in ortho-Stellung stehen, wovon sich eines in ortho-Stellung zu einem substituierten Kohlenstoffatom des Benzolringes befindet. Dieser Ausdruck zeigt natürlich nicht an, daQ das letztlich bei der ?ermentierung gebildete Produkt notwendigerweise irgendwelche Hydroxylgruppen ent-■■■■■■ . BASuitable types of Nocardia that are suitable for i) introduction of the method according to the invention are suitable as ortho « denotes dihydroxylating and non-deoarboxylating strains. With the term "orthodihydroxylating" becomes expressed; that the microorganism is able to form 2 hydroxyl groups on the ring of the methylbenzenes, which are mutually exclusive stand in the ortho position, one of which is in is ortho to a substituted carbon atom of the benzene ring. This expression, of course, shows does not imply that what is ultimately formed during the ermentation Product necessarily have any hydroxyl groups ■■■■■■ . BA
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α — α -
hält, wie diea bei den Muconsäure-Homologen tatsächlich nicht der JPaIl ist, Der Ausdruck "nicht-decarboxylierend11 sagt, daß die Mikroorganismen keine Zerstörung von Carboxylgruppen verursachen, die sich während der Oxydation bilden, indem sie daraus Kohlendioxyd in Freiheit setzen. Deshalb ist es für das erfindungsgemäße Fermentationeverfahren charakteristisch, daB Irgendwelche sich bildende Carboxylgruppen während der Fermentation unangegriffen bleiben.holds, as is actually not the JPaIl in the case of the muconic acid homologues, The expression "non-decarboxylating 11 says that the microorganisms do not cause the destruction of carboxyl groups which are formed during oxidation by releasing carbon dioxide from them. Therefore It is characteristic of the fermentation process according to the invention that any carboxyl groups that form remain unaffected during the fermentation.
Nocardiastäinme, die orthodihydroxylierend und nicht decarboxylierend wirken, wurden unter vielen Spezies gefunden, die in der Natur vorkommen, einschließlich von Spezies, die nach Bergey's Manual klassifiziert sind als Nocardia coraUina, Nocardia salmonieolor und Nocardia minima« Für die Zwecke des vorliegenden Verfahrene werden im allgemeinen die Stämme von Nocardia corallina bevorzugt. Ea wurden viele Versuche unternommen, üb unter anderen bekannten Kohlenwasserstoff verbrauchenden Gattungen Stumme zu finden, die ähnliche orthodlhydroxylierende und niohtdecarboxylierende Eigenschaften besitzen. Zu den geprüften Gattungen gehören Spezies von Brevibakterium, Pseudomonas, Streptomyces, Candida und Bazillus. Bis jetzt hat jedoch keiner hiervon die gewünschten Eigenschaften gezeigt, die von geeigneten Nocardiastämmen, die für das .Nocardia strains that are orthodihydroxylating and non-decarboxylating have been found among many species that occur in nature, including species classified in Bergey's Manual as Nocardia coraUina , Nocardia salmonieolor, and Nocardia minima . For the purposes of the present method, in general preferred the strains of Nocardia corallina. Many attempts have been made to find mutes, among other known hydrocarbon-consuming genera, which have similar ortho-hydroxylating and non-decarboxylating properties. The genera tested include species of Brevibacterium, Pseudomonas, Streptomyces, Candida and Bacillus. So far, however, none of these have shown the desired properties that are found in suitable nocardia strains that are suitable for the.
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erfindüngsgeiää3e Verfahren verwendet werden, entfaltet werden.Invention methods are used, unfolded will.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Methylbenz.gI des Cv-CjQ-Bereiches in eine organische Säure mit Hilfe eines Nocardiamikroorganismus der oben beschriebenen Eigenschaften überführt= Der Ausgan^ekohlenwasserstoff kann irgend ein Mono-, Di™, Tri- oder Tetramethylbenzol sein, das wenigstens zwei aufeinanderfolgende nicht-substituierte Hingkohlenstoffatome besitzt. Insbesondere können die folgenden Methylbenzole verwendet werden: Toluol, o«, m- oder p-Xylol, Pseudocumen, Hemimellithol und Prehnitol« Das Säureprodukt ist entweder ein nie t hy 1 subs ti tuiertes höheres Homologes von Muconsäure, oder ein 2,3-Dihydroxybenzoesäure oder beides. Wenn eine 2,3-Dihydroxybenzoesäure gebildet wird, ist sie im allgemeinen von der entsprechenden nicht-hydroxylierten Benzoesäure begleitet, die -wie oben erwähnt - der Stoffweehselvorläufer für das dihydroxylierte Produkt zu sein scheint« Die Umwandlung wird bewirkt, indem man das methylsubstituierte Benzol in Gegenwart eines Nähri-iediume und unter Fermentierungsbedingungen der Einwirkung eines orthodihydroxylierenden und nichf-decarboxylierenden liocardiastammee aussetzt. Nachdem die gewünschte JPermentierungsoxydation stattgefunden hat, wird wenigstens eine Säure des obengenannten Types aus dem Permentierungamedium isoliert.In accordance with the invention, a methylbenz.gI of the Cv-CjQ range into an organic acid with Aid of a nocardia microorganism of the above described Properties transferred = The starting hydrocarbon can be any mono-, di ™, tri- or tetramethylbenzene be the at least two consecutive unsubstituted Has hanging carbon atoms. In particular, the following methylbenzenes can be used: toluene, o ", m- or p-xylene, pseudocumen, hemimellithol and prehnitol" The acid product is either never subscribed to higher homologue of muconic acid, or a 2,3-dihydroxybenzoic acid or both. When a 2,3-dihydroxybenzoic acid is formed, it is generally accompanied by the corresponding non-hydroxylated benzoic acid, which - as mentioned above - appears to be the metabolic precursor for the dihydroxylated product " The conversion is effected by adding the methyl-substituted benzene in the presence of a nutrient medium and under Fermentation conditions of the action of an orthodihydroxylating agent and non-decarboxylating liocardia strains suspends. After the desired fermentation oxidation has taken place, at least one acid of the above type is isolated from the permentation medium.
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~ 10~ 10
Bei einigen Mikroorgani emens tämmen werden eovrohl ein Muconsaurehomologee ale auch eine 2,3-Dihydroxybenzoesäure gebildet und isoliert, während in anderen Fällen in wesentlichen nur die eine oder die andere Säure gebildet wird.In some strains of microorganisms, a muconic acid homologue is also formed and isolated, while in other cases only one or the other acid is essentially formed.
Die folgende Tabelle zeigt im einzelnen die Kohlenwasserstoff substrate, die bei der Durchführung des erfindungsgemä(3en Verfahrens verwendet werden können und die daraus gebildeten Säuren, Me Tabelle enthält die Substrate und die Säuren, sowohl hinsichtlich ihres Namens, als auch ihrer Formelo The following table shows in detail the hydrocarbon substrates which may be used in the practice of the inventive (3s method and the acids formed therefrom Me table contains the substrates and the acids, both as to its name, as well as their formula o
KohlenwasserstoffeubetratHydrocarbons
Aromatische SäureAromatic acid
Substituierte Muconsäure Substituted muconic acid
(Toluol)(Toluene)
COOHCOOH
(2,3-Dihydroxy benzoesäure)(2,3-dihydroxy benzoic acid)
HOOC-C=CHOOC-C = C
C -C=C-C -C = C-
COOHCOOH
{βς-Methy !Muconsäure){βς-Methy! Muconic acid)
(o-Xylol)(o-xylene)
COOHCOOH
(2,3-Dihydroxyo-toluolsäure) (2,3-dihydroxyo-toluic acid)
C C HOOC-C=C-C=C-COOHC C HOOC-C = C-C = C-COOH
(χ,^-Dimethylmuc.on säure)(χ, ^ - Dimethylmuc.on acid)
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Erhältliche SäurenAvailable acids
Kohlenwasserstoff substratHydrocarbon substrate
Aromatische Säure Substituierte MuconsäureAromatic acid Substituted muconic acid
(m-Xylol)(m-xylene)
0OH0OH
(2,3-Dihydroxym-toluolsäure) CC HOOU-C=C-C=C-COOH(2,3-dihydroxym-toluic acid) CC HOOU-C = C-C = C-COOH
(oc>/J«-Dimethylmuconsäure) (oc> / J «-dimethylmuconic acid)
(p-Xylol)(p-xylene)
0OH0OH
(2,3-Dihydroxyp-toluolsäure) HOOC(2,3-dihydroxyp-toluic acid) HOOC
-X=C-C=C--X = C-C = C-
COOHCOOH
(βί,βς'-Dimethylmuconsäure) (βί, βς'-dimethyl muconic acid)
0OH0OH
(Pseudocumen)(Pseudocumen)
(2,3~Dihydroxy-4,6-dimethylbenzoesäure) (2,3 ~ dihydroxy-4,6-dimethylbenzoic acid)
COOHCOOH
(2,3-Dihydroxy· 4,5-dimethylmuconsäure) CCC (2,3-dihydroxy · 4,5-dimethylmuconic acid) CCC
111111
(«c, *c· ,/5-Trimethylmuconsäure) («C, * c ·, / 5-trimethylmuconic acid)
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KohlenwaeserstoffsubstratHydrocarbon substrate
Aromatische SäureAromatic acid
Substituierte MuconsäureSubstituted muconic acid
0OH0OH
(Hemimellithol)(Hemimellithol)
(2,3-Dihydroxy-5,6~dimethylbeneoesäure)(2,3-dihydroxy-5,6 ~ dimethylbeneoic acid)
HOOC-C=HOOC-C =
J C C J-C=C-COOHJ C C J-C = C-COOH
(rf, /*, /S* -Trimethylmuconsäure)(rf, / *, / S * -trimethylmuconic acid)
(Prehnitol)(Prehnitol)
0OH0OH
(2,3-Dihydroxy-4,5,6-trin»thylbenzoesäure)(2,3-dihydroxy-4,5,6-trinethylbenzoic acid)
CCCC littAngela suffered
O*,*'t/M'-Tetramethylmuoonsäure)O *, * 't / M'-tetramethylmuoonic acid)
Aus der Tabelle kann man entnehmen, daß die dihydroxyIierenden und nicht-decarboxylierenden Nocardiastämme, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedes angegebene Methylbenxol in eine aromatische Säure überführen können, die eine 2,3-Bihydroxybenzoesäure und/ oder in ein Hueoneäurehomologee ist, die nur einen Methylsubstituenten in der alpha-Stellung hat und die in Abhängigkeit von den verwendeten Kohlenwasseretoffsubstraten keine anderen Methylgruppen oder andere Methylgruppen haben kann. PUr alle Substrate - mit Ausnahme von Fseudocumen - resultiert nur eine dihydroxylierte aromatische Säure und/oderFrom the table it can be seen that the dihydroxylating and non-decarboxylating nocardia strains which are used for the purposes of the present invention can convert any given methylbenxol into an aromatic acid which is a 2,3-bihydroxybenzoic acid and / or a hueonic acid homologue which has only one methyl substituent in the alpha position and which, depending on the hydrocarbon substrates used, cannot have any other methyl groups or other methyl groups. For all substrates - with the exception of fseudocumen - only a dihydroxylated aromatic acid and / or result
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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
ein Huconsäurehomologes aus den Stoffwecheelreaktionen, die von diesen N-oeardiaetänmen gezeigt werden. Im Falle von Pseudocumen gibt es zwei dihydroxylierte, aromatische Säureisomere, die auftreten können; diese Isomere unterscheiden sich nur in der Stellung einer Methylgruppe. Es 1st zu erkennen, daß alle Säureprodukte die gleiche Ansah! Kohlenstoffatome haben, wie der Ausgangskohlenwasserstoff, daß die Muconsäure die gleiche Anzahl Methylsubetituenten wie das Substrat hat und daß die aromatische Säure nur einen Methylsubstituenten weniger hat» wobei letzterer in eine Carboxylgruppe überführt worden ist.a huconic acid homologue from the metabolic reactions, shown by these N-oeardiaetänmen. In the event of of pseudocumen there are two dihydroxylated, aromatic ones Acid isomers that may occur; distinguish between these isomers only in the position of a methyl group. It can be seen that all acid products have the same appearance! Have carbon atoms, like the starting hydrocarbon, that the muconic acid has the same number of methyl substituents how the substrate has and that the aromatic acid has only one less methyl substituent »where the latter has been converted into a carboxyl group.
Spezifische Mikroorganismen, die für das erfindungsgemäß· Verfahren verwendet worden sind, sind s. Bo folgende:Specific microorganisms that are responsible for the Procedures have been used, see Bo the following:
- ο- ο
(1) Ein wildgewachsener Stamm, erhalten aus Erdboden in Alabama, mit Eigenschaften, die ungefähr denjenigen entsprechen, die für Nocardia coralline in Sergey's Manual angegeben und infolgedessen als derartige Spezies klassifiziert sind. Eine Kultur dieses Stammes wurde bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, unter der Nummer ATCC 19 070 hinterlegt. Kolonien dieses Mikroorganismus haben eine orange Farbe.(1) A wild-grown strain obtained from soil in Alabama with properties approximately equivalent to those given for Nocardia coralline in Sergey's Manual and consequently classified as such a species. A culture of this strain has been deposited with the American Type Culture Collection in Washington, D.C. under number ATCC 19 070. Colonies of this microorganism are orange in color.
(2) Ein rötlich gefärbter Mutant, erhalten durch U.VO Bestrahlung von ATCC Nummer 19 070. Der Mutant wurde eben-(2) A reddish colored mutant, obtained by U.VO irradiation from ATCC number 19 070. The mutant was also
BAD ORlGhMALBAD ORlGhMAL
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falle bei der American Type Culture Collection hinterlegi und trägt die Nummer ATCC 19 071«fall on deposit with the American Type Culture Collection and bears the number ATCC 19 071 «
(3) Ein Stamm.aus Pennsylvania-Brdboden isoliert, und in gleicher Weise als Nocardia corallina klassifiziert. Dieser MikroOrganismus*ist orangefarben, ähnlich wie 4i· zuerst erwähnte wilde Spezies« doch zeigt er deutliche Unterschiede .Tia enzymatisch-oxydativen Verhalten, wie dies im folgenden beschrieben ist. Üine Kultur hiervon wurde als Stamm hinterlegt; er trägt die Nummer ATCC 19 148.(3) A strain isolated from Pennsylvania soil and classified in the same way as Nocardia coralli na. This microorganism * is orange in color, similar to 4i "wild species mentioned first" but it shows clear differences, including enzymatic-oxidative behavior, as described below. A culture of this was deposited as a tribe; it bears the number ATCC 19 148.
(4) Ein aus Erdboden isoliertes Material mit Eigenschaften, die ungefähr denjenigen entsprechen, die in Bergey's Manual als Nocardia salmonicolor angegeben sind und infolgedessen als solche klassifiziert werden, üine Kultur hiervon wurde unter der Nummer ATCC 19 H9 niedergelegt.(4) A material isolated from soil with properties approximately corresponding to those specified in Bergey's Manual as Nocardia salmonicolor and consequently classified as such, a culture thereof has been deposited under the number ATCC 19 H9.
(5) Ein anderes aus Erdboden isoliertes Material, klassi fiziert nach Bergey's Manual als Nocardia minima mit der Nummer ATCC 19 150.(5) Another material isolated from the ground, classified according to Bergey's Manual as Nocardia minima with the number ATCC 19 150.
Das für die Zwecke der Erfindung zu verwendende Nährmedium für die Kultur von Nocardiastämmen sollte Quellen für verfügbaren Stickstoff, Phosphor, Schwefel und Magnesium sowie für verschiedene Spurenelemente enthalten, wie dies üblicher- f weise verwendet wird» Gebräuchliche Mineralsalze zum Zuführen solcher Elemente bei der biologischen FermentationThis is for the purpose of the invention to be used in the nutrient medium for the culture of Nocardiastämmen should sources of available nitrogen, phosphorus, sulfur and magnesium and contain various trace elements, as f customarily employed "Common mineral salts for feeding such elements in the biological fermentation
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können verwendet werden. Beispiele für geeignete Stickstoff quellen sind Ammoniumsalze, wie (NH4J2SO4 .oder NH+Cl9 Nitratsalze, wie NH4NO5 oder NaNO,, Harnstoff, Sojabohnenmehl oder andere organische Stickstoffquellen. Die folgenden Angaben erläutern eine geeignete Mineralsalzmischung für das erfindungsgemäße Verfahren,,can be used. Examples of suitable nitrogen sources are ammonium salts, such as (NH 4 I 2 SO 4 .or NH + Cl 9 nitrate salts, such as NH 4 NO 5 or NaNO ,, urea, soybean meal or other organic nitrogen sources. The following information explains a suitable mineral salt mixture for the method according to the invention ,,
Konz,, g/1 H2OConc ,, g / 1 H 2 O
Diese Mineralsalzmiechung würde normalerweise einen pH von etwa 7,1 haben. Wenn nan die Fermentation bei einem pH unterhalb 7 ausführen will, wie dies der Pail ist, wenn man die Produktion des Muconsäurehomologes einem maximalen Wert zuführen will, so kann die Menge an KH2PO4 im Verhältnis zu Na2HPO4 erhöht werden, um den pH auf einen niedrigeren Wert zu bringen»This mineral salt smell would normally have a pH of about 7.1. If the fermentation is to be carried out at a pH below 7, as is the case, if the production of the muconic acid homologue is to be maximized, the amount of KH 2 PO 4 in relation to Na 2 HPO 4 can be increased by bring the pH to a lower value »
Das erfindungsgemäSe Verfahren wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 - 40°C und vorzugsweise bei 28 -320C unter aeroben Bedingungen unter Rühren durchgeführt.The erfindungsgemäSe process is generally conducted at a temperature of 20 - 40 ° C and preferably at 28 - 32 0 C performed under aerobic conditions with stirring.
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Das Nährmedium sollte einen pH von 4-9 und insbesondere von 6-8 haben. Wenn der Nocardiaatamm zu einer Hingspaltung unter Bildung eines Mueoneäurehomologes befähigt ist, kann die Bildung einer derartigen Säure zu einem Maximum geführt werden, indem man den pH im Bereich von 6-7 hält, wobei ein pH von etwa 6,8 - 7,0 gewöhnlich die besten Ergebnisse bringt. Wenn eine Dihydroxybenzoesäure das bevorzugte Produkt ist, kann seine Bildung durch Arbeiten bei einem pH in dem.Bereich von 7-8 begünstigt werden, wobei ein Wert von 7»8 im allgemeinen bevorzugt wird.The nutrient medium should have a pH of 4-9 and in particular from 6-8 have. When the nocardia strain enables a cleavage with the formation of a mueanic acid homologue is, the formation of such an acid can be maximized by keeping the pH in the range of 6-7 holds, with a pH of around 6.8-7.0 usually giving the best results. When a dihydroxybenzoic acid is the preferred product, its formation can be promoted by operating at a pH in the range of 7-8, with a value of 7 »8 being generally preferred.
Bei der Herstellung einer für die Zwecke der Erfindung geeigneten Nocardiakulturen wird eine Probe eines geeigneten Noeardiastamraes von einer Reagensglasagarkultur in einen SchUttelkolben überführt, der die MineralsalzlÖeung und eine geeignete Kohlenstoffquelle für das Wachstum enthält. Die Kohlenstoffquelle kann ein geeigneter Kohlenwasserstoff, wie Hexadecan, gesättigte, vom Kerosen oder Toluol abgeleitete Derivate oder ein Kohlehydrat oder ein hydrolyeiertee Protein sein. Vorzugsweise wird die Kohlenstoff quelle periodisch in kleinen Mengen während der Inkubation zugegeben. In manchen Fallen mag es erwünscht sein, daß auch Wachstum stimulierendes Material, wie Fep-'ton, ?leischbrüh~Extrakt oder Hefeextrakt anwesend ist, doch ist dies oft nicht notwendig. Im ifelle des oben er-In the preparation of a Nocardia culture suitable for the purposes of the invention, a sample of a suitable Noeardiastamraes from a test tube agar culture into one Shake flask transferred to the mineral salt solution and contains a suitable source of carbon for growth. The carbon source can be a suitable hydrocarbon such as hexadecane, saturated, derived from kerosene or Toluene derived derivatives or a carbohydrate or a hydrolyzed protein. Preferably, the carbon source is added periodically in small amounts during the incubation. In some cases it may be desirable that growth-stimulating material such as Fep-'ton, beef brew extract or yeast extract is also present, but this is often not necessary. In the case of the above
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wäkaten Mutanten ATCC Hr* 19 071 sollte ein solches Material zugegeben werden, da dieser Organisarus im Gegensatz zu dem wilden Stammtyp ATCC Nr. 19 070 eine Quelle des Vitamins, p-Aminobenzoesäure, wenigstens für das Anfangswachstum benötigt. Ein solches Material kann diesen Wache- -tums faktor darstellen«. Die Mischung wird bei 300C inkubiert und es wird Hexadecan (oder eine andere Kohlenstoffquelle) von Zeit zu Zeit zugegeben, wenn das Zellwachetun stattfindet; vorzugsweise wird es in zunehmenden Mengen sugefügt. Nach einer Inkubationsperiode, die typischerweise 24 Stunden beträgt, können die Zellen für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.To select mutants ATCC Hr * 19 071 such a material should be added, as this organus, in contrast to the wild strain type ATCC No. 19 070, requires a source of the vitamin, p-aminobenzoic acid, at least for initial growth. Such material can represent this wakefulness factor ”. The mixture is incubated at 30 ° C. and hexadecane (or another carbon source) is added from time to time when the cell wakes up; it is preferably added in increasing amounts. After an incubation period, which is typically 24 hours, the cells can be used for the purposes of the invention.
Die Fermentation kann ausgeführt werden, indem man das Methylbenzolsubstrat in Gegenwart des Nährmediums der KLnwirkung von Nocardiaorganismen unter Wachstums- oder Nicht-Wachstumsbedingungen aussetzt. Venn Wachstumsbedingungen angewendet werden, wird eine Probe des nach obigen Angaben hergestellten Impfmaterials einem Mlneralsalsmediuin in einem FermentierungsgefäB zugegeben und die Zellen werden zuerst bei 300C auf Hexadecara gezüchtet, s. B. etwa 24 Stunden, ohne Zugabe des Methylbenzolsubstrates. Nach gutes Wachstum erfolgen periodische Zugaben des Methylbenzole susaimaen mit zusätzlichen Mengen Hesadeoan, um das Wachstum aufrechtzuerhalten und die Hermentierung wird fortgesetst» bis eine The fermentation can be carried out by exposing the methylbenzene substrate in the presence of the nutrient medium to the action of nocardial organisms under growth or non-growth conditions. Venn growth conditions are employed, a sample of the seed material produced according to the above specifications is a Mlneralsalsmediuin in a FermentierungsgefäB added and the cells are first grown at 30 0 C on Hexadecara, s., About 24 hours without addition of methylbenzene substrate. After good growth, periodic additions of the methylbenzenes are made with additional amounts of hesadeoan to maintain growth and the hermentation is continued until one
BAD ORiGiNALBAD ORiGiNAL
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maximale Ausbeute der gewünschten Dihydroxybenzoesäure und/oder des Mueonsäurehomologen erhalten vdrd. Eine Gesamtfermentierungszeit von 96 Stunden iet gewöhnlich typisch, um eine maximale Ausbeute zu erhalten.maximum yield of the desired dihydroxybenzoic acid and / or the mueonic acid homologue obtained vdrd. A total fermentation time 96 hours is usually typical for maximum yield.
Wenn der Nocardiaorganismus zur Durchführung des erfindungsgemäflen Verfahrens unter Nicht-Wachstumsbedingungen verwendet wird, werden die gewachsenen Zellen, wie oben erwähnt, von der Brühe durch Zentrifugieren abgetrennt und mit Phosphat-Puffer-Lösung gewaschen und dann in einer Phosphat-Pufferlösung erneut suspendiert. Die Suspension wird z. B. bei 3O°C gehalten und das Methylbenzolsubstrat wird periodisch in zunehmenden Mengen oder kontinuierlich zugegeben, während die Mischung belüftet und gerührt wirdc Die Zugabe des Substrates wird fortgesetzt, bis die Fermentation eine optimale Auebeute des gewünschten Säureproduktes ergeben hat.If the nocardia organism to carry out the inventive If the method under non-growth conditions is used, the grown cells are separated from the broth by centrifugation, as mentioned above washed with phosphate buffer solution and then in a Phosphate buffer solution resuspended. The suspension is z. B. held at 3O ° C and the methylbenzene substrate is added periodically in increasing amounts or continuously while the mixture is aerated and agitated c The addition of the substrate is continued until the fermentation yields an optimal yield of the desired acid product has revealed.
Nach Beendigung der Fermentation werden die Zellen von der Brühe durch Zentrifugieren abgetrennt und die klare Brühe kanu dann in irgend einer geeigneten Weise behandelt werden, um die Säureprodukte zu isolieren. In den Fällen, bei denen ein Kuconsäure-Homologes (z. B. DMMA) gebildet wird, kann es gesondert durch Ansäuern der Brühe mit einer Mineralsäure (ζ» B. HCl) auf einer pH von s. B. 2 isoliert werden, worauf das DMMA selektiv aus der Lösung ausfällt, dannAfter the fermentation is complete, the cells are separated from the broth by centrifugation and the clear broth can then be treated in any suitable manner to isolate the acid products. In those cases in which a kuconic acid homolog (e.g. DMMA) is formed, it can be isolated separately by acidifying the broth with a mineral acid (ζ »B. HCl) to a pH of s. B. 2 , whereupon then the DMMA selectively precipitates out of solution
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abfiltriert und durch Waschen mit Wasser gereinigt werden kann. Irgend ein in der Brühe vorhandenes DHPT und PTA verbleibt in der wäßrigen Lösung und kann daraus durch Extrahieren mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äther, Dioxan oder Amylazetat isoliert werden. Das DHPT und PTA können anschließend voneinander unter Verwendung eines Anlonaustauscherharzes chromatographisch getrennt werden. Hach einem anderen Verfahren kann die angesäuerte wässrige Lösung, die beim Abfiltrieren des ausgefällten BMMA erhalten worden ist, eingedampft werden, wobei man ein Konsentrat von DHPT und PTA erhält; diese Produkte können voneinander durch Extraktion des !Concentrates mit einem geeigneten selektiven Lösungsmittel abgetrennt werden.filtered off and purified by washing with water can. Any DHPT and PTA present in the broth Remains in the aqueous solution and can be extracted from it with a suitable solvent, such as ether, Dioxane or amyl acetate can be isolated. The DHPT and PTA can then be chromatographically separated from one another using an ion exchange resin. In another method, the acidified aqueous solution obtained by filtering off the precipitated BMMA can be evaporated to give a consume of DHPT and PTA; these products can be separated from one another by extracting the concentrate with a suitable selective solvent.
,Ein für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugter Mikroorganismus zur Herstellung der Derivate vom Muconsäuretyp ist das oben erwähnte Mooardla oorallina ATCO Rr. 19 070. Die physiologischen und Kultureigenschaften, welche diese Mikroorganismen Identifizieren und unterseheidungskräftig machen, sind folgende:A preferred microorganism for the production of the derivatives of the muconic acid type for the purposes of the present invention is the above-mentioned Mooardla oorallina ATCO Rr. 19 070. The physiological and cultural properties which identify and distinguish these microorganisms are as follows:
Alters 24 bis 168 Std. Gram; Gm , GranulatAge 24 to 168 hours Grief; Gm, granules
Form: Stäbchen mit Verzweigungen in der jungen Kultur (0-48 Std.) Beweglichkeit: nicht beweglichShape: rods with branches in the young culture (0-48 hours) Agility: not agile
48 Stunden - 0.5-1.5 mal 1-5 Micron, einige Yerzweigun-72 Stunden - 1 mal 1-2 Micron gen48 hours - 0.5-1.5 times 1-5 microns, a few Yerzweigun-72 hours - 1 times 1-2 microns gen
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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
Menge:Lot:
Sediment:Sediment:
flockenartigflaky keinesnone mäßigeβ Wachstummoderate growth körnig, orangegrainy, orange
Verflüssigung: keine Wachstum: keinesLiquefaction: none Growth: none
Alter: Wachsturn:Age: Growth:
72 Stunden keines72 hours none
Alter:Age:
72 Stunden tief orange butterähnlich72 hours deep orange butter-like
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BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
Alter:Age:
72 Stunden72 hours
hellorange - cremefarbiglight orange - cream colored
butterähnlichsimilar to butter
MaltoseMaltose
SorbitSorbitol
DextroseDextrose
MannitMannitol
LactoseLactose
keine Säure keine Gasbildungno acid no gas formation
μ ti ti ημ ti ti η
M H M I» M ··M H M I »M ··
schwach alkalisch n weakly alkaline n
keine Säureno acid
aß-Arabinose Saccharose Lävulose Inosit schwach alkalisch "ate arabinose Sucrose Levulosis Inositol weakly alkaline "
M MM M
N N H ItN N H It
titi sehr gutes Wachstumvery good growth M Il MM Il M
Wachstum mäßiges Wachstum gutes Wachstum Wachstumgrowth moderate growth good growth growth
gutes Wachstumgood growth Il HIl H
Schwefelwasserstoff wird nicht gebildet Indol wird nicht gebildetHydrogen sulphide is not formed. Indole is not formed Es wird kein Phenol oder Naphthalin verwendet Stärke wird nicht hydrolysiertNo phenol or naphthalene is used. Starch is not hydrolyzed
Natrium- und Ammoniumsalze werden als Stickstoffquelle verwendet.Sodium and ammonium salts are used as a nitrogen source used.
Der oben erwähnte und als ATCC Nr. 19 071 identifizierte Mutant besitzt, ähnlich wie ATCG Nr. 19 070 ringspaltende Eigenschaften und erzeugt einen Muconsäuretypo Dieser Mutant hat dieselben unterscheidungskräftigen Eigenschaften, wie oben angegeben, erfordert jedoch im Gegensatz «u demThe one mentioned above and identified as ATCC No. 19 071 Similar to ATCG No. 19 070, the mutant has ring splitting Properties and creates a muconic acid type This mutant has the same distinctive properties, as stated above, but in contrast requires «u dem
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Stammorganismue ein spezielles Vitamin für das Wachstum, nämlich p-Aminobenzoesäure. Bei der Pennentation von p-Xylol ist der Mutant besser dazu veranlagt, eine Ansammlung von PTA und PHPT in der Brühe zu ergeben, als ATCC Nr. 19 070, doch bildet er nicht notwendigerweise diese Produkte und in manchen Fällen zeigt sich nur eine wesentliche Ansammlung von DMMA.Parent organism a special vitamin for growth, namely p-aminobenzoic acid. Upon pennentation of p-xylene, the mutant is more likely to give rise to an accumulation of PTA and PHPT in the broth than is ATCC No. 19 070, but it does not necessarily constitute this Products and in some cases only a substantial accumulation of DMMA.
. Die folgenden Beispiele erläutern einige AusfUhrungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Analysen der erhaltenen Produkte wurden für diese Ansätze durch U.V. Spektroskopie ermittelt. Die anfallenden speziellen Produkte wurden durch Elementaranalysen sowie U.V., I.R. und Massenspektrogrammverfahren identifiziert.. The following examples explain some embodiments of the method according to the invention. The analyzes of the products obtained for these approaches were carried out by U.V. Determined by spectroscopy. The resulting special products were through elemental analyzes as well as U.V., I.R. and mass spectrogram method identified.
Wooardia corallina ATCC Hr. 19. 070 wurde verwendet, um alpha,alpha'-ΟΜΜΑ aus ρ-Xylol in einem 40-Ltr. Termentierungsgefäß herzustellen, das kontinuierlich wie ein Wirbelsystem betrieben wurde. J&ne Mlneralsalzlusung der oben angegebenen angenäherten Zusammensetzung wurde verwendet und h-Hexadeoan wurde als Wachstumseubstrat verwendet. Die Mischung wurde mit dem Organismus geimpft und bei 300C kräftig gerührt, während sie durch Hindurcheaugen von Luft in dem Wirbel« der von der geführten Mischung gebildet wurde, Wooardia corallin a ATCC Mr. 19. 070 was used to convert alpha, alpha'-ΟΜΜΑ from ρ-xylene in a 40 ltr. To produce a fermentation vessel that operated continuously like a vortex system. J & ne mineral salt solution of the approximate composition given above was used, and h-hexadeoane was used as a growth substrate. The mixture was inoculated with the organism and stirred vigorously at 30 ° C. while it was formed by sucking air through the vortex formed by the mixture being carried out,
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belüftet wurde. Zunächst ließ man den Organismus in Gegenwart dee Hexadecane zusammen mit Spurenraengen p-Xylol wachsen, bis eich etwa 5 - 6 g Zellen angesammelt hatten. Hierfür wurden etwa 24 Stunden benötigt. Danach wurde die Fermentation bei 3O0C fortgesetzt, während kontinuierlich ein· Mischung von 90 i» p-Xylol und 10 # n-Hexadecan (Volumenteile) in einer solchen Geschwindigkeit zugegeben wurde, daß sich die Geschwindigkeit der Zugabe von p-Xylol im Bereioh von 20 - 40 ml/Stunde bewegte. Auf diese Weise wurde die p-Xylol-Konzentration in der Permentationsbrühe im Bereich von 80 ■- 350 p.pc-m.- gehalten. Der pH schwankte während des Ansätze8 etwas, doch blieb er im allgemeinen innerhalb des Bereiches von 6,5 - 7»0„ Proben der Brtihe wurden zu verschiedenen Zeitpunkten während der Fermentation gezogen und man untersuchte sie auf den Gehalt an DMMA, DHFT und auch PTA. Es wurde keine nennenswerte Menge an einer der beiden zuletzt genannten Verbindungen ermittelt. Die DMMA-Ergebnisee waren folgende:has been ventilated. First, the organism was allowed to grow in the presence of the hexadecane together with trace amounts of p-xylene until about 5-6 g of cells had accumulated. This took about 24 hours. Thereafter, the fermentation at 3O 0 C was continued, while continuously withdrawing a · mixture of 90 i »p-xylene and 10 # n-hexadecane (by volume) was added at a rate such that the rate of addition of p-xylene in Bereioh moved from 20 - 40 ml / hour. In this way the p-xylene concentration in the permentation broth was kept in the range of 80-350 p.pc-m.-. The pH fluctuated somewhat during the preparation 8, but it generally remained within the range 6.5-7.0 "Samples of the series were taken at different times during the fermentation and examined for the content of DMMA, DHFT and also PTA . No significant amount of either of the last two compounds mentioned was determined. The DMMA results were as follows:
Unter den angewendeten Bedingungen sammelte sich als einziges Produkt im wesentlichen nur DMMA an. iJiee zeigt, daßUnder the conditions used, the only product that accumulated was essentially only DMMA. iJiee shows that
BADBATH
009836/2121009836/2121
der Organismus ATCO Nr. 19 070 stark selektiv bei der Herstellung des Muconsäureprodukts unter entsprechenden Bedingungen sein kann.the organism ATCO No. 19 070 is highly selective in the production of the muconic acid product under appropriate conditions can be.
Beispiel II ... Example II ...
Ein anderer Ansatz wurde unter ähnlichen Bedingungen wie im Beispiel I durchgeführt, mit der Abweichung, daß eine geringere Rührgeschwindigkeit angewendet wurde, und man die Fermentation 106 Stunden lang durchführte. Die Analyse der Brühe nach Ablauf dieser Zeit ergab die folgenden Ergebnisse: Another approach was carried out under similar conditions as in Example I, with the difference that one slower agitation speed was used and fermentation was carried out for 106 hours. The analysis the broth after this time gave the following results:
oc,<x.«-DMMA 13c 4 g./Liter PTA Io1 go/Literoc, <x. "- DMMA 13c 4 g./liter PTA Io1 go / liter
IHPT vernachlässigterIHPT neglected
Eine Reihe von 4 Permentationsversuchen von p-Xylol wurde unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I durchgeführt mit der Abweichung, daß der Mutant ATCC Nr, 19 071 verwendet wurde, der pH zwischen den Ansätzen variiert wurde und die Ansätze bei etwa 120 Stunden beendigt wurden. In allen diesen Fällen sammelte sich nur ein einziges Produkt, nur alpha,alpha'-DMMA an, dessen Mengen folgende waren:A series of 4 attempts at permeation of p-xylene was made under essentially the same conditions as in Example I carried out with the exception that the mutant ATCC No. 19 071 was used, the pH was varied between the batches and the batches at about 120 hours were terminated. In all of these cases only a single product, only alpha, alpha'-DMMA, accumulated, its Quantities of the following goods:
6/2111 * Bad original6/2111 * B ad original
159346Ö159346Ö
maximale Ausbeute an DMMAmaximum yield of DMMA
6.0 4.4 g./l.6.0 4.4 g./l.
6.5 8.1 rt 6.5 8.1 rt
7.0 11,6 »7.0 11.6 »
8.0 Oo06 » .8.0 Oo06 ».
Biese Ergebnisse zeigen, daß die beste Bildung des Hueonsäurehomologes bei einem pH in der Gegend von 7 erhalten wird, und daß die Bildung des Produktes mit diesem besonderen Mikroorganismus deutlich bei einem höheren pH herabgesetzt wird. Das gleiche gilt für ATCC Nr» 19 070.These results show that the best formation of the hueonic acid homolog at a pH in the region of 7, and that the formation of the product with this particular microorganism is markedly reduced at a higher pH will. The same applies to ATCC No. 19 070.
Nocardia salmonicolor ATCC Kr. 19 149 wurde bei dem Fermentieren von p-Xylol unter Bildung DHPT verwendet. Das 40 1 Fermentierungsgefäß wurde im allgemeinen in der gleichen Weise wie in Beispiel I verwendet. Man ließ die ersten 36 Stunden den Organismus auf n-Hexadecan, bei einem pH von ötwa7,0, wachsen, worauf der pH in dem Bereich von 7,5 bis 8,0 gehalten wurde. Dann wurde eine 90:10 Mischung von p-XylonsHexsd®can kontinuierlich in einer solchen Geschwindigkeit eingeführt, daß die p-Xylolkonzentration in der Flüssigkeit bei 50-200 p.p.m. gehalten wurde. Das Produkt bestand in diesem Pail nur aus DHPT und PTA und ihre Konzentration in der Flüssigkeit für die 3 Proben war folgende: Nocardia salmonicolor ATCC Kr. 19 149 was used in the fermentation of p-xylene to produce DHPT. The 40 liter fermentation vessel was used in generally the same manner as in Example I. The organism was allowed to grow on n-hexadecane, at a pH of about 7.0, for the first 36 hours, after which the pH was maintained in the range of 7.5 to 8.0. Then a 90:10 mixture of p-XylonsHexsd®can was continuously introduced at a rate such that the p-xylene concentration in the liquid was maintained at 50-200 ppm. The product in this pail consisted only of DHPT and PTA and their concentration in the liquid for the 3 samples was as follows:
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
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Unter den Bedingungen dieses Ansatzes war die Konzentration von IWPT größer als die von PTA zu einer bestimmten Zeit, doch sammelte sich später bei der Ferment!erung PTA schneller an, als DHPT und überstieg dessen Konzentration. Die relativen Anteile von KiPT und PTA variieren typischerweiae bei dieser Fermentierungsform, wenn Noeardiastämme verwendet werden* die zur Bildung von DHPT anstelle von DMMA fähig sindcConcentration was under the terms of this approach of IWPT greater than that of PTA at a given time, but later, during fermentation, PTA collected more quickly as DHPT and exceeded its concentration. The relative proportions of KiPT and PTA typically vary in this form of fermentation when Noeardia strains * which are capable of producing DHPT instead of DMMA are used c
Brei Ansätze wurden unter Bedingungen durchgeführt, die im allgemeinen denen des Beispiels 4 ähnlich waren; es wurde wiederum ATGG Nr. 19 149 verwendet, und die p-Xylol-Konzentration in der Brühe8 die der Wachstumsstufe auf n~Hexadecan folgte, wurd© auf Werte von etwa 50, 150 bzw. 250 mg/l eingestellt. Die anfängliehe Blldungsgesehwindigkeit von SHPT und PTA nach dem Einführen eines 90s1G-Gemisch@s von p-Xylol und n-Hexadeean wurde bestimmt und es wurden auch Ausbeuten dieser Produkte nach etwa 96 Stunden erhalten» Die Ergebnisse waren folgende: Slurry runs were run under conditions generally similar to those of Example 4; ATGG No. 19 149 was again used, and the p-xylene concentration in broth 8 which followed the growth stage on n-hexadecane was adjusted to values of about 50, 150 and 250 mg / l, respectively. The initial rate of formation of SHPT and PTA after the introduction of a 90% mixture of p-xylene and n-hexadeane was determined and yields of these products were also obtained after about 96 hours. The results were as follows:
0.0 9-8'3.6721 Ii'0.0 9-8'3.6721 Ii '
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
~ 27 -~ 27 -
p-Xylol Konss., Anfangsbildungs- Ausbeutenach . mg./l. geschwindigkeit 96 3td.. g./l< p-xylene con., initial formation yields according to . mg./l. speed 96 3td .. g./l <
/l/ta/ l / ta
50 0P09 0.27 lc? 6„850 0 P 09 0.27 lc? 6 "8
150 0.11 0.17 2.9 5.5150 0.11 0.17 2.9 5.5
250 Q«20 0.0.9· 5o0 4-5250 Q «20 0.0.9 · 5o0 4-5
Pie Werte zeigen, daß das Erhöhen u: XyIol-Konzentration innerhalb der ausprobierten ßrensen die Bildung von PTA herabdrückt und die KaximumauBbeute von DHPT erhöht«Pie values show that the increase in u: xylene concentration the formation of PTA within the tested ßrensen and the maximum yield of DHPT increases «
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von. Zellen von Nocardia salaonicolor ATCC Hr. 19-14.9 unter Nicht-Weoh·- tiuaebedingungen bei der BienOxydation von p-Xylol. Zunftohst lies «an verschiedene Proton der Zellen auf n-Hsxadeoan i*i einen 40 1 FeraentiensngsgvfäS bei eines pH von etwa 7 34 Stunden lang wachsen. Die. Zellen wurden von der Brühe abzentrifugiert und dann in einer Phosphat-Pufferlösung suspendiert, die nur HagHPO^ und KHgPOj in eolchen Mengen enthielt, dafi der pH bei etwa 8 gehalten wurde. Ss waren keine Stickstoffquellen eier Spurenelemente anwesend. Zwei Proben der Zellen in der Pufferlösung wurden mit einer Zellenkonzentration von etwa 5 bzw. 15 g/l hergestellt.This example explains how to use. Cells of Nocardia salaon icolor ATCC Hr. 19-14.9 under non-Weoh-tiu conditions in the oxidation of p-xylene. Zunftohst let different protons of the cells grow on n-Hsxadeoan i * i a 40 l FeraentiensngsgvfäS at a pH of about 7 34 hours. The. Cells were centrifuged from the broth and then suspended in a phosphate buffer solution containing only HagHPO ^ and KHgPOj in such amounts that the pH was kept at about 8. There were no sources of nitrogen or trace elements present. Two samples of the cells in the buffer solution were prepared at a cell concentration of about 5 and 15 g / L, respectively.
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■ BAD■ BATHROOM
Eine Fermentierung jeder Probe bei 300C wurde unter Wirbel* belüftungsbedingungen durchgeführt, indem kontinuierlich in die Suspension eine 10:90 Mischung von p-Xylol:n-Hexadecan in einer solchen Menge eingeleitet wurde, daß die p-Xylol-Konzentration in der Mischung bei 200 - 300 p.p.in. gehalten wurde. Von jedem Ansatz wurden Proben der Flüssigkeit nach 16, 26 bzw. 34 Stunden nach der Zugabe p-Xylol gezogen und analysiert. Die Ergebnisse waren folgende:A fermentation of each sample at 30 0 C was carried out aeration conditions under vortex * by a 10:90 mixture of p-xylene continuously in the suspension: n-hexadecane was introduced in an amount such that the p-xylene concentration in the mixture at 200-300 ppin. was held. Samples of the liquid were taken from each batch 16, 26 and 34 hours after the addition of p-xylene and analyzed. The results were as follows:
ZellenkonzentrationCell concentration
15.15th
von p-Xylol,Time of the
of p-xylene,
StdoEncore
Stdo
zentration,Product con
centering,
2616
26th
1o51.3
1o5
Diese Ergebnisse zeigen, daß entsprechende Stämme Hocardl® DHPT aus p-Xylol unter Nicht-Wachstumsbedingungen produzieren können. In diesen Fällen übersteigt die Menge an PTA im wesentlichen die Menge des angesammelten DHPT, doch kann bei Fermentierungen unter unterschiedlichen Bedingungen der relative Anteil der beiden Produkttypen umgekehrt werden. i>ie Werte zeigen, daß die Mengen an angesam- :These results show that corresponding strains Hocardl® Producing DHPT from p-xylene under non-growth conditions can. In these cases the amount exceeds PTA is essentially the amount of DHPT accumulated, but can occur during fermentations under different conditions the relative proportion of the two product types can be reversed. i> he values show that the amounts of accumulated:
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BADBATH
melten Produkten von der angewendeten Zellenkonzentration in dea Phosphat-Puffermedium abhängen.melt products from the applied cell concentration depend in the phosphate buffer medium.
Es wurden Schüttelkolbenansätze unter Verwendung drei verschiedener dihydroxylierender und nicht-decarboxylierender Stämme von Nocardia bei der Fermentierung von p-Xylol durchgeführte Im einzelnen handelte es sich um Nocardia aalmonicolor ATCC Nr. 19 149 der Beispiele IV bis VI, einen anderen Stamm von Nocardia corallina, identifiziert als ATCC Nr-, 19 148 und einen Stamm Nocardia minima, identifiziert als ATCC Nr, 19 150. Das Verfahren dieser Ansätze besteht darin, daß 100 ml Kinerälsalzlösung in einem 500 ml SchUttelkolben mit dem Organismus geimpft werden, daß man 0,05 ml n-Hexadecan zugibt, 24 Stunden lang bei 300C schüttelt, danach kleine Mengen p-Xylol zusammen mit n-Hexadecan von Zeit zu Zeit zugibt und insgesamt etwa 96 Stunden lang schüttelt. Die Pensen tationabiere (fermentation beers) wurden dann durch U.V. Absorptionsanalyse untersucht. Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse für zwei Ansätze mit jedem Mikroorganismusstamm.There were carried out Schüttelkolbenansätze different using three dihydroxylierender and non-decarboxylating strains of Nocardia in the fermentation of p-xylene In particular, it was No cardia aalmonicolor ATCC no. 19149 of Examples IV to VI, a different strain of Nocardia corallina, identified as ATCC Nr-, 19 148 and a strain Nocardia minima identified as ATCC Nr, 19 150. The procedure of these approaches is that 100 ml of Kinerälsalzlösung in a 500 ml shake flask are inoculated with the organism that one 0.05 ml Adding n-hexadecane, shaking for 24 hours at 30 ° C., then adding small amounts of p-xylene together with n-hexadecane from time to time and shaking for a total of about 96 hours. The fermentation beers were then examined by UV absorption analysis. The following table shows the results for two runs with each microorganism strain.
DHPT PTADHPT PTA
0,30 Io 150.30 Io 15
0,37 U080.37 U08
Oo27 U 13Oo27 U 13
0*19 UOT0 * 19 UOT
O 15 Oo45O 15 Oo45
O1,15 0.41O 1 , 15 0.41
BAP o^v 0 0 98 36/2121BAP o ^ v 0 0 98 36/2121
Die Werte zeigen, da3 jeder der genannten Stämme auch den Benzolring dihydroxylieren kann, ohne daß er gleichzeitig eine Decarboxylierung verursacht. Jedoch echeint keiner dieser Stämme die Bildung des Muconsäurehomologes zu verursachen, wenigstens nicht unter den hier angewendeten JPermentierungsbedingungen.The values show that each of the named tribes also has the Benzene ring can dihydroxylate without it at the same time causes decarboxylation. However, no one appears of these strains to cause the formation of the muconic acid homologue, at least not among those used here JPermentation conditions.
Zwei Ansätze wurden in Permentationsrührgefaßen unter Verwendung von Nocardia corallina ATCC Nr. 19 070 und ATCC 19 071 durchgeführt. Bei jedem Ansatz wurde eine Mischung von 480 ml eines Anionaustauscherharzes mit genügend Mineralsalzlösung verwendet, so daB ein gesamtes Volumen von 3000 ml erhalten wurde. Das Medium enthielt auch 0,2 $> fepton und 0,1 < Fleischbrühe und sein pH wurde auf etwa 6,5 gehalten. Nach dem Impfen der Organismen lieS man sie auf n-Hexadecan 36 Stunden lang wachsen, worauf p-Xylol in kleinen Mengen von Zeit zu Zeit zugegeben wurde, während man die Mischung rührte und bei 300C belüftete„ Jeder Ansatz wurde insgesamt 120 Stunden durchgeführt und es wurden insgesamt 24 al p-Xylol verwendet. Die Arten und Mengen der Produkte einschließlich derjenigen, die auf dem Anionaustauscherharz absorbiert waren, als auch diejenigen in der Brühe wurden dann bestimmt. Die kombinierten Ergebnisse sind folgende:Two runs were carried out in permentation stirred vessels using Nocardia corallina ATCC No. 19 070 and ATCC 19 071. A mixture of 480 ml of an anion exchange resin with enough mineral salt solution was used in each batch so that a total volume of 3000 ml was obtained. The medium also contained 0.2 $> fepton and 0.1 < broth and its pH was maintained at about 6.5. After inoculating the organisms, they were allowed to grow on n-hexadecane for 36 hours, after which p-xylene was added in small amounts from time to time while the mixture was stirred and aerated at 30 ° C. Each batch was carried out for a total of 120 hours and a total of 24 al p-xylene were used. The types and amounts of the products including those absorbed on the anion exchange resin as well as those in the broth were then determined. The combined results are as follows:
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19 071ATCC No.
19 071
Menge dee Produkts, g./l. Brühe Progtikt Amount of product, g./l. Broth Progtikt
ΚΙΜΑ
DHPT
PTA
DMC2 ΚΙΜΑ
DHPT
PTA
DMC 2
a 3,6-Dimethyleateehol a 3,6-dimethyleateehol
Aus diesen Vierten kann man entnehmen^ daß beide Mikroorganiemen unter den bei diesen Ansätzen verwendeten Bedingungen eine Ansammlung sowohl des substituierten Huconsaureproduktes als euch des substituierten 2,3-Bihydroxybenzoeeäureproduktes verursachen können. Ferner zeigen die Werte, daß es unter manchen Umständen möglich 1st, daß sich substituiertes Katechol als Zwischenprodukt aneaamelt, doch ist dessen Anteil für die speziellen, hler verwendeten Mikroorganismentämme kleiner.From these fourths it can be seen that both microorganisms under the conditions used in these approaches an accumulation of both the substituted huconic acid product than you of the substituted 2,3-bihydroxybenzoic acid product can cause. Furthermore, the data show that in some circumstances it is possible for substituted catechol to accumulate as an intermediate, but it does is its share for the special, hler used Microorganism strains smaller.
Bei des £uletst beschriebenen Beispiel wurde ~ wie erwähnt - ein Anionauetaueeherhars in der FerDentierungeaiechung während der Fermentierung verwendet. Die Verwendung eines solchen Harzes während der Fenaentierung verursacht eine unerwartete Verbesserung d@r Ausbeute des gewünschten Säureproduktes. Jedoch let sine derartige Verwendung hier nicht beansprucht, da si© Gegenstand einer gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung der gleichen Anmelderin mitIn the example described above, ~ was mentioned as - an Anionauetaueeherhars in the FerDentierungeaiechung used during fermentation. The use of such a resin during fencing causes a unexpected improvement in the yield of the desired Acid product. However, let sine such usage here not claimed because it is the subject of one at the same time filed patent application by the same applicant
BADBATH
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dem Titel "Verfahren zum Hersteilen von Karbonsäuren durch mikrobiologische Oxydation von Kohlenwasserstoffen" (unser Zeichen DA-678) ist»entitled "Process for the preparation of carboxylic acids by microbiological oxidation of hydrocarbons "(our sign DA-678) is»
Die obigen Beispiele erläutern die Herstellung von methylsubstituierten Muconsäuren und/oder 2,3-Dihydroxybenzqeeäuren aus C«-C10-Methylbenzolen der angegebenen Art* Wenn auch die Beispiele im einzelnen auf die Biooxydation von p-XyIo1 gerichtet sind, so geben doch Fermentierungen mit anderen Methylbenzolen der oben definierten Art analoge Ergebnisse. PUr diese anderen Kohlenwasserstoffsubstrate verlaufen die Fermentierungereaktionen nach analogen Stoffwechselwegen, so daß eine oder die andere oder beide dieser Säurearten gebildet werden, wenn iiamer dihydroxylierende und nicht-decarboxylierende Stämme von Nocardia für die Fermentierung verwendet werden.The above examples explain the production of methyl-substituted muconic acids and / or 2,3-dihydroxybenzene acids from C «-C 10 -methylbenzenes of the type specified * Even though the examples are specifically directed to the bio-oxidation of p-XyIo1, fermentations are included results analogous to other methylbenzenes of the type defined above. For these other hydrocarbon substrates the fermentation reactions proceed by analogous metabolic pathways so that one or the other or both of these types of acid are formed when similar dihydroxylating and non-decarboxylating strains of Nocardia are used for fermentation.
Die nach dem ©rfindungegemäßen Verfahren herstellbaren Säuren sind wertvolle Produkte mit verschiedenen kommerziellen Anwendungsmöglichkeiten« Beispielsweise sind die substituierten Muconsäuren, die doppelt endständige Säuren sind, für die Herstellung von Polymeren verschiedener Typen geeignet. Die Dihydroxybenzoesäuren eignen sich als chelatbildend« Substanzen, Metallentaktivierungemittel und Farbstoffzwischenprodukte.Those which can be produced according to the method according to the invention Acids are valuable products with various commercial uses «For example, the substituted muconic acids, which are double terminal acids, for the production of polymers of various Types suitable. The dihydroxybenzoic acids are suitable as chelating substances, metal deactivators and dye intermediates.
PatentansprücheClaims
0 0 9836/21210 0 9836/2121
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