DE1442263B

DE1442263B - Process for the biotechnological production of alpha ketoglutaric acid and L-glutamic acid

Info

Publication number: DE1442263B
Authority: DE
Inventors: Kimura Kazuo Machmda Yamaguchi Ken Tokio Tanaka Katsunobu (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von «-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure durch aerobes Züchten von Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter in n-Paraffine mit 11 bis 18 Kohlenstoffatomen als Hauptkohlenstoffquelle, Stickstoffsubstanzen, anorganische Salze und Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedien bei hierfür üblichen pH-Werten. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen der Gattuns Arthrobacter, Arthrobacter simplex ATCC 15799, Arthrobacter paraffines ATCC 15590, Arthrobacter paraffineus ATCC 19064 oder ATCC 19065 einsetzt.The invention relates to a process for the biotechnological production of -ketoglutaric acid and L-glutamic acid by aerobic cultivation of microorganisms of the genus Arthrobacter in n-paraffins having 11 to 18 carbon atoms as the main carbon source, nitrogen substances, inorganic salts and nutrient media containing growth factors at pH values customary for this purpose. This procedure is characterized in that the microorganisms of the species Arthrobacter, Arthrobacter simplex ATCC 15799, Arthrobacter paraffines ATCC 15590, Arthrobacter paraffineus ATCC 19064 or ATCC 19065 begins.

Spezifisch wird das Wachstum der Mikroorganismen und die Ausbeute an den gewünschten Produkten äußerst beschleunigt, wenn ein Kulturmedium verwendet wird, das als Wachstumsfaktoren mindestens eine der folgenden Substanzen Vitamin B₁ (Thiamin), Vitamin B₁₂, p-Aminobenzoesäure, Vitamin H (Biotin), deren Derivate oder eng verwandte Verbindungen und in bezug auf die anorganischen Salze eine hohe Konzentration an Eisenionen enthält.Specifically, the growth of the microorganisms and the yield of the desired products are extremely accelerated if a culture medium is used which contains at least one of the following substances: vitamin B ₁ (thiamine), vitamin B ₁₂ , p-aminobenzoic acid, vitamin H (biotin) as growth factors , their derivatives or closely related compounds and, with respect to the inorganic salts, contain a high concentration of iron ions.

Darüber hinaus wird durch die Anwesenheit von Calciumcarbonat im Fermentierungsmedium ein wirksamer und erheblicher Anstieg der Anhäufung an α-Ketoglutarsäure erreicht. Unter Verwendung geeigneter Kulturbedingungen beträgt die Menge an angesammelter «-Ketoglutarsäure mehr als 70 g/l, was einer Ausbeute von etwa 70% hinsichtlich der verbrauchten Menge an η-Paraffin entspricht.In addition, the presence of calcium carbonate in the fermentation medium makes it more effective and a significant increase in the accumulation of α-ketoglutaric acid was achieved. Using appropriate Culture conditions, the amount of accumulated «-ketoglutaric acid is more than 70 g / l, which corresponds to a yield of about 70% in terms of the amount of η-paraffin consumed.

Auf Grund des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt sich eine Fermentierungsausbeute von gleichzeitig a-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure, die — verglichen mit üblichen α-Ketoglutarsäure- und L-Glutaminsäure-Fermentierungsverfahren (»J. Am. Chem. Soc«, 74, 1952, S. 5142 ff., und französische Patentschrift 1 229 336), bei denen zudem im Gegensatz zu den im vorliegenden Verfahren zum Einsatz kommenden wohlfeilen Kohlenwasserstoffen Kohlehydrate als Ausgangsmaterial verwendet werden — bemerkenswert hoch ist. Dies dürfte darauf zurückzuführen sein, daß das erfindungsgemäß verwendete Kohlenwasserstoffausgangsmaterial einen hohen Kohlenstoffgehalt je Volumeinheit hat, die die Kohlenstoffstruktur des Produktes ergibt, verglichen mit den üblichen Kohlehydratausgangsmaterialien. Darüber hinaus ist die Luftoxydationsreaktion bei dem erfindungsgemäß angewandten Mikroorganismen äußerst wirksam.Due to the method according to the invention, a fermentation yield of simultaneously results a-ketoglutaric acid and L-glutamic acid, which - compared to common α-ketoglutaric acid and L-glutamic acid fermentation process ("J. Am. Chem. Soc", 74, 1952, pp. 5142 ff., And French Patent specification 1 229 336), in which, in contrast to those in the present process, coming cheap hydrocarbons carbohydrates are used as starting material - is remarkably high. This is likely to be due to the fact that the invention used Hydrocarbon feedstock has a high carbon content per unit volume that makes up the carbon structure of the product compared to the usual carbohydrate starting materials. About it In addition, the air oxidation reaction is extreme in the microorganisms used in the present invention effective.

Wenn eine überwiegende L-Glutaminsäurebildung durch Überführung von α-Ketoglutarsäure, die das Hauptprodukt der vorstehend aufgeführten Mikroorganismen-Stämme darstellt, erzielt werden soll, können die bei der Verwendung von Sacchariden als Ausgangsmaterial zur Herstellung von L-Glutaminsäure bekannten Maßnahmen, nämlich dem Fermentierungsmedium bei einem pH von 6 bis 9 Ammoniumionen zuzugeben, angewandt werden. Es können so 30 bis 50°/o der sonst gebildeten a-Ketoglutarsäure als L-Glutaminsäure erhalten werden.If there is a predominant build-up of L-glutamic acid by transferring α-ketoglutaric acid, which is the main product of the microorganism strains listed above is to be achieved, the use of saccharides as Starting material for the production of L-glutamic acid known measures, namely the fermentation medium adding ammonium ions at a pH of 6 to 9 can be used. It can be like that 30 to 50% of the otherwise formed α-ketoglutaric acid can be obtained as L-glutamic acid.

Jedoch besitzen die genannten zur Herstellung von α-Ketoglutarsäure unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Ausgangsmaterial geeigneten Mikroorganismen eine Oxydationskapazität, die sich von den industriell zur Herstellung von L-Glutaminsäure verwendeten Mikroorganismen unterscheidet. Infolgedessen besteht eine Neigung, daß die erzeugte L-Glutaminsäure wieder zu α-Ketoglutarsäure oxydiert wird. Durch geeignete Hemmung der Zersetzung von L-Glutaminsäure und geeignete Zufuhr einer wesentliehen Quelle für den Aminorest zu dem Medium, kann aber die sonst gebildete α-Ketoglutarsäure zu mehr als 90% als L-Glutaminsäure erhalten werden.However, the above have for the production of α-ketoglutaric acid using hydrocarbons microorganisms suitable as starting material have an oxidation capacity that differs from the different microorganisms used industrially for the production of L-glutamic acid. Consequently there is a tendency that the generated L-glutamic acid is re-oxidized to α-ketoglutaric acid. Appropriate inhibition of the decomposition of L-glutamic acid and appropriate supply of a substantial amount Source of the amino radical to the medium, but the otherwise formed α-ketoglutaric acid can be added more than 90% can be obtained as L-glutamic acid.

Insbesondere werden die vorstehenden ErgebnisseIn particular, the above results

mit dem erfindungsgemäß zum Einsatz kommenden Mikroorganismen erhalten, wenn nach einer besonderen Ausführungsform die Züchtung in einem Fermentierungsmedium ausgeführt wird, das einen primären oder sekundären einwertigen Alkohol mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, Benzoesäure, Glycerin, einen Zuckeralkohol, beispielsweise Sorbit, Mannit od. dgl., Sulfanilsäure, oder Mischungen davon enthält.obtained with the microorganisms used according to the invention, if after a special Embodiment the cultivation is carried out in a fermentation medium which has a primary or secondary monohydric alcohol having 4 to 12 carbon atoms, benzoic acid, glycerin, a Contains sugar alcohol, for example sorbitol, mannitol or the like, sulfanilic acid, or mixtures thereof.

Die folgenden Versuche dienen der Erläuterung der Erfindung. Falls nicht anders angegeben, sind die angegebenen Prozentsätze Gewichts/Volumprozent.The following experiments serve to illustrate the invention. Unless otherwise stated, those are stated Weight / volume percentages.

Die Versuche werden unter Verwendung der folgenden Bakterienstämme ausgeführt:The experiments are carried out using the following bacterial strains:

Arthrobacter simplex ATCC Nr. 15799,
Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 15590.Arthrobacter simplex ATCC No. 15799,
Arthrobacter paraffineus ATCC No. 15590.

Die vorstehend aufgeführten Stämme wurden als Impfbakterien verwendet, und jeder wurde unter Schütteln in einem Kulturmedium kultiviert, welches 1,0% Kerosin, 0,2% Hefeextrakt, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Pepton und 0,5% NaCl enthielt, wobei bei einem pH-Wert von 7,2 bei einer Temperatur von 28° C in einer Kammer von konstanter Temperatur während 24 Stunden gearbeitet wurde. 2 ml von jeder dieser Kulturen wurde im Fermentierungsmedium verwendet. Die Zusammensetzung der Fermentierungsmedien war folgende:The strains listed above were used as the inoculating bacteria and each was taken under Shaking cultivated in a culture medium containing 1.0% kerosene, 0.2% yeast extract, 1.0% meat extract, Containing 1.0% peptone and 0.5% NaCl, with a pH of 7.2 at a temperature of 28 ° C in a constant temperature chamber was worked for 24 hours. 2 ml of each these cultures were used in the fermentation medium. The composition of the fermentation media was the following:

a) 5% n-Paraffin+), 0,2% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,005% MnSO₄ · 4 H₂O, 2,0% NH₄NO₃, 5 γ/Ι Vitamin B₁, 0,1 m γ/\ Vitamin B₁₂, 10 y/1 p-Aminobenzoesäure, 2 γ/1 Vitamin H, 0,005 % FeSO₄- 7 H„O, 0,01% Maisquellwasser, 3,0% CaCO₃.a) 5% n-paraffin +), 0.2% KH ₂ PO _4, 0.1% MgSO ₄ ■ 7H ₂ O, 0.005% MnSO ₄ · 4 H ₂ O, 2.0% NH ₄ NO _3, 5 γ / Ι vitamin B ₁ , 0.1 m γ / \ vitamin B ₁₂ , 10 y / 1 p-aminobenzoic acid, 2 γ / 1 vitamin H, 0.005% FeSO ₄ - 7 HO, 0.01% corn steep liquor, 3 , 0% CaCO ₃ .

b) 5,0 % n-Paraffin+), 0,2 % KH₂PO₄,0,1 % MgSO₄ ■ 7 HoO, 0,001% MnSO₄ · 4 H,O, 2,0% NH₄NO₃, 0,001 % FeSO₄ · 7 H»O, 0,01 % Maisquellwasser, 2,0% CaCO₃.b) 5.0% n-Paraffin +), 0.2% KH ₂ PO _4, 0.1% MgSO ₄ ■ 7 HoO, 0.001% MnSO ₄ · 4 H, O, 2.0% NH ₄ NO _3, 0.001 % FeSO ₄ · 7 HO, 0.01% corn steep liquor, 2.0% CaCO ₃ .

+ ) η-Paraffin: Mischung mit einem Gehalt 95% Cn-Ci₈-n-Paraffinen. +) η-paraffin: mixture with a content of 95% Cn-Ci ₈ -n-paraffins.

Die Kultur wurde bei 28 ⁰C in einem 500-ml-Saka-The culture was at 28 ⁰ C in a 500 ml Saka-

guchi-Kolben durchgeführt, wobei jeder 20 ml der vorstehend aufgeführten Fermentierungsmedien enthielt.guchi flasks, each taking 20 ml of the above listed fermentation media.

Die Kultivierung wurde während 4 Tagen unter aerobem Schütteln ausgeführt.The cultivation was carried out for 4 days with aerobic shaking.

Vergleichsergebnisse des Wachstums und der Menge an erzeugter α-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure bei der Durchführung der vorstehenden Fermentierung sind in Tabelle I zusammengefaßt.Comparative results of the growth and the amount of α-ketoglutaric acid and L-glutamic acid produced in carrying out the above fermentation are summarized in Table I.

L5799
Nr. 15590 ....L5799
No. 15590 .... Tabelle ITable I. α-Ketoglutarsäure
a) g/dl , b)g/dlα-ketoglutaric acid
a) g / dl, b) g / dl 1.0
1,51.0
1.5 L-Glutaminsäure
a) g/dl : b) g/tllL-glutamic acid
a) g / dl: b) g / tll 0,1
0,20.1
0.2 Angewandter StammApplied trunk Wachstum
a) b)growth
away) 1,5
2,51.5
2.5 0,2
0,40.2
0.4 Arthrobacter simplex ATCC Nr.
Arthrobacter paraffineus ATCCArthrobacter simplex ATCC No.
Arthrobacter paraffineus ATCC '----:---·[· 4—ί'----: --- · [· 4 — ί

Wie aus Tabelle I ersichtlich, wird bei Vorhandensein von Vitaminen und anorganischen Salzen, insbesondere Eisenionen, in entsprechenden Konzentrationen als Bestandteile des Kulturmediums das Wachstum der Bakterien und die Erzeugung von «-Ketoglutarsäure und L-Glutaminsäure bemerkenswert erhöht. Weiterhin ist ersichtlich, daß erhebliche Mengen an «-Ketoglutarsäure neben L-Glutaminsäure aus η-Paraffinen durch Verwendung der genannten Mikroorganismen des Genus Arthrobacter erhalten werden.As can be seen from Table I, in the presence of vitamins and inorganic salts, in particular Iron ions, in appropriate concentrations as components of the culture medium The growth of bacteria and the production of -ketoglutaric acid and L-glutamic acid are remarkable elevated. It can also be seen that considerable amounts of -ketoglutaric acid in addition to L-glutamic acid obtained from η-paraffins by using said microorganisms of the genus Arthrobacter will.

Die Überführung der Fermentierung zur überwiegenden «-Ketoglutarsäurebildung in eine Fermentierung zur überwiegenden L-Glutaminsäurebildung unter Verwendung der genannten Arthrobacter-Stämme ist in den folgenden Versuchen dargestellt.The conversion of fermentation to predominantly -ketoglutaric acid formation in fermentation for the predominant formation of L-glutamic acid using the Arthrobacter strains mentioned is shown in the following experiments.

Zu diesem Zweck ist es notwendig, eine Reaktion einzuführen, die die Aminogruppe der L-Glutaminsäure aus α-Ketoglutarsäure ergibt, während gleichzeitig die Zersetzung der erhaltenen L-Glutaminsäure gehemmt wird, um bei der Fermentierung hauptsächlich L-Glutaminsäure zu erzeugen.For this purpose it is necessary to introduce a reaction that reduces the amino group of L-glutamic acid from α-ketoglutaric acid while at the same time the decomposition of the obtained L-glutamic acid is inhibited, mainly during fermentation Generate L-glutamic acid.

Infolgedessen wurden Ammoniumionen, die wesentlich als Amingruppenquelle bei der Synthese von L-Glutaminsäure sind, kontinuierlich in das Fermentierungsmedium zugeführt und der pH-Wert desselben bei 7,0 bis 8,2 gehalten. Dieser pH-Bereich ist optimal für die Herstellung von L-Glutaminsäure.As a result, ammonium ions were essential as a source of amine groups in the synthesis of L-glutamic acid are continuously fed into the fermentation medium and the pH of the same held at 7.0 to 8.2. This pH range is ideal for the production of L-glutamic acid.

Die pH-Wert-Einstellung des Fermentierungsmediums und die Zufuhr von Ammoniumionen wurden durch Zugabe von entweder einer wäßrigen Lösung von Harnstoff, Ammoniakwasser oder einer wäßrigen Ammoniumcarbonatlösung erreicht. Die Züchtung war die gleiche, wie sie vorstehend in Verbindung mit Tabelle I beschrieben wurde. Als Fermentierungsmedium wurde das vorstehend unter a) angegebene verwendet.The pH adjustment of the fermentation medium and the supply of ammonium ions were by adding either an aqueous solution of urea, ammonia water or an aqueous one Ammonium carbonate solution reached. The cultivation was the same as that used in connection with Table I has been described. The fermentation medium given above under a) was used used.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II zusammengefaßt.The results of these experiments are summarized in Table II.

Table II

a-Ketoglutar-a-ketoglutar- L-GlutaminL-glutamine säureacid säureacid (g/dl)(g / dl) (g/dl)(g / dl) Arthrobacter simplexArthrobacter simplex ATCC Nr. 15799 ...ATCC No. 15799 ... 1,01.0 0,80.8 Arthrobacter paraffmeusArthrobacter paraffmeus ATCC Nr. 15590] ...ATCC No. 15590] ... 1,21.2 1,01.0

Wie aus Tabelle II ersichtlich, ist die Menge an L-Glutaminsäure gesteigert, während diejenige an «-Ketoglutarsäure gesenkt ist, wenn die vorstehend aufgeführte pH-Einregelung und die Zufuhr von Ammoniumionen in das Fermentierungsmedium angewandt werden. Es ergibt sich daraus, daß die Zufuhr von Ammoniumionen und die beschriebene pH-Einstellung wesentlich sind, um eine hohe Menge an L-Glutaminsäure zu erhalten.As can be seen from Table II, the amount of L-glutamic acid is increased while that of «-Ketoglutaric acid is lowered when the above-mentioned pH adjustment and the supply of Ammonium ions can be applied to the fermentation medium. It follows that the feed of ammonium ions and the described pH adjustment are essential to a high amount of L-glutamic acid.

Es wurde jedoch festgestellt, daß große Mengen an «-Ketoglutarsäure dennoch angehäuft wurden und daß die L-Glutaminsäure eine Neigung zeigte, während der letzten Stufen der Züchtung Zersetzung zu erleiden. Um dieses Problem zu lösen, werden dem Fermentierungsmedium, wie bereits auch schon vorstehend ausgeführt, die gegebenenfalls zur Steigerung der Ausbeute an L-Glutaminsäure durch Umwandlung von «-Ketoglutarsäure zuzusetzenden Substanzen, aliphatische Alkohole, d. h. die Zuckeralkohole, Glycerin, primäre oder sekundäre einwertige Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen, Benzoesäure, Sulfanilsäure und Mischungen derartiger Substanzen, eingesetzt. Die Zuckeralkohole sind bekannt und umfassen Verbindungen wie Sorbit, Mannit, Galactit u. dgl. Zu den primären oder sekundären einwertigen Alkoholen, die verwendet werden können, gehören z. B. 1-Butanol, 2-Butanol, 2-Methyl-l-propanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 1-Hexanol, 2-Hexanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 1-Octanol, 2-Octanol, 1-Dodecanol u. dgl., d. h. die primären und sekundären einwertigen Alkohole mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen. Diese Substanzen können zu dem Fermentierungsmedium in einer Menge von 0,01 bis 2,0 Gewichtsprozent zugegeben werden.However, it was found that large amounts of -ketoglutaric acid were still accumulated and that L-glutamic acid showed a tendency to undergo decomposition during the final stages of cultivation. In order to solve this problem, the fermentation medium, as already mentioned above carried out, optionally to increase the yield of L-glutamic acid by conversion Substances to be added by «-ketoglutaric acid, aliphatic alcohols, d. H. the sugar alcohols, Glycerine, primary or secondary monohydric alcohols with 4 to 12 carbon atoms, benzoic acid, sulfanilic acid and mixtures of such substances are used. The sugar alcohols are known and include Compounds such as sorbitol, mannitol, galactitol and the like. To the primary or secondary monohydric alcohols, which can be used include e.g. B. 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 1-pentanol, 2-pentanol, 1-hexanol, 2-hexanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 1-dodecanol and the like; i.e. H. the primary and secondary monohydric alcohols containing 4 to 12 carbon atoms. These substances can may be added to the fermentation medium in an amount of 0.01 to 2.0 percent by weight.

Es kann entweder ein einziges η-Paraffin mit 11 bis 18 Kohlenstoffatomen oder ein Gemisch von mehr als einem dieser η-Paraffine bei dem erfindungsgemäßen Verfahren angewandt werden. Weiterhin kann ein Gemisch von einem oder mehr dieser η-Paraffine mit einer weiteren Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, wobei das η-Paraffin der Hauptbestandteil ist. Zu η-Paraffinen innerhalb des vorstehend aufgeführten Bereiches der Kohlenstoffzahl gehören n-Undecan, n-Dodecan, n-Tridecan, n-Tetradecan, n-Pentadecan, n-Hexadecan, n-Heptadecan und n-Octadecan sowie Mischungen davon.It can either be a single η-paraffin with 11 to 18 carbon atoms or a mixture of more than one of these η-paraffins can be used in the process according to the invention. Farther a mixture of one or more of these η-paraffins with a further carbon source can be used with η-paraffin being the main component. To η-paraffins within the above The range of carbon numbers listed includes n-undecane, n-dodecane, n-tridecane, n-tetradecane, n-pentadecane, n-hexadecane, n-heptadecane and n-octadecane and mixtures thereof.

Die Einzelheiten der Züchtung sind üblich und dem Fachmann geläufig. Zum Beispiel gehören zu anderen Kohlenstoffquellen, die in geringeren Anteilen verwendet werden können, Kohlehydrate, z. B. Glucose, Stärkehydrolysate, Melassen u. dgl. oder andere übliche Kohlenstoffquellen. Zu anorganischen Salzen, die angewandt werden können, gehören Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Kaliumchlorid, Ferrosulfat, Calciumcarbonat u. dgl. Zu üblichen Stickstoffquellen, die angewandt werden können, gehören Hefeextrakt, Pepton, Fischmehl od. dgl. Wie vorstehend aufgeführt, können verschiedene wesentliche Nährstoffe zu dem Medium zugegeben werden.The details of the cultivation are customary and familiar to the person skilled in the art. For example, belong to others Sources of carbon which can be used in lesser proportions, carbohydrates, e.g. B. glucose, Starch hydrolysates, molasses and the like or other common carbon sources. To inorganic salts, which can be applied include potassium phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, potassium chloride, Ferrous sulfate, calcium carbonate and the like to common nitrogen sources that are employed can include yeast extract, peptone, fish meal or the like. As mentioned above, various can essential nutrients are added to the medium.

Die η-Paraffine können zu dem Medium in einer Menge zwischen etwa 5 und 15 Gewichtsprozent zugesetzt werden. Die Fermentierung wird vorzugsweise bei einer Kultur-Temperatur von 25 bis 38° C ausgeführt.The η-paraffins can be added to the medium in an amount between about 5 and 15 percent by weight can be added. The fermentation is preferably carried out at a culture temperature of 25 to 38 ° C executed.

Nach Beendigung des Fermentierungsverfahrens kann die L-Glutaminsäure und «-Ketoglutarsäure nach üblichen Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch eine Ionenaustauschbehandlung.After completion of the fermentation process, the L-glutamic acid and -ketoglutaric acid can be added conventional methods can be obtained, for example by an ion exchange treatment.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die angegebenen Prozentsätze auf Gewichts/Volumprozent.The following examples serve to further illustrate the present invention. if not otherwise stated, the percentages given relate to weight / volume percent.

example 1

3 1 eines Nährmediums aus 0,2% K_nHPO₄, 0,1 % MgSO₁-7 H,O, 0,002% MnSO₄ · 4 H.,0, 0,02% FeSO₄-7 H₂O, 2,0% NH₄NO₃, 3y/l Vitamin B₁, 0,1 m y/ml Vitamin B₁₂, 0,01% Maisquellwasser und 3,0% CaCO₃ wurden bei einem pH-Wert von 7,2 in einem 5-1-Porzellanfermentiergefäß sterilisiert. Dann wurden 200 g eines Gemisches von C_n- bis C₁₈-n-Paraffinen (C₁₁: 7,0%, C₁₂: 30%, C₁₃: 25%, C₁₄: 24%,3 1 of a nutrient medium of 0.2% K _n HPO ₄ , 0.1% MgSO ₁ -7 H, O, 0.002% MnSO ₄ · 4 H., 0, 0.02% FeSO ₄ -7 H ₂ O, 2 , 0% NH ₄ NO ₃ , 3y / l vitamin B ₁ , 0.1 my / ml vitamin B ₁₂ , 0.01% corn steep liquor and 3.0% CaCO ₃ were at a pH of 7.2 in a 5 -1-porcelain fermentation vessel sterilized. Then 200 g of a mixture of C _n - to C ₁₈ n-paraffins (C ₁₁ : 7.0%, C ₁₂ : 30%, C ₁₃ : 25%, C ₁₄ : 24%,

S₅ C₁₅: 10%, C_1(i:l,5%, C₁₇-C₁₈ 2,5%) hierzu zugesetzt. Dieses Fermentierungsmedium wurde dann mit einer Impfkulturilüssigkeit von Arthrobacter simplex ATCC Nr. 15799, die vorübergehend mittels einerS ₅ C ₁₅ : 10%, C _{1 (i} : 1.5%, C ₁₇ -C ₁₈ 2.5%) added to this. This fermentation medium was then inoculated with a culture liquid of Arthrobacter simplex ATCC No. 15799, which was temporarily obtained by means of a

Schüttelkultur in einem Bouillonmedium während 24 Stunden inkubiert worden war, in einer Menge von lO°/o geimpft. Die Züchtung wurde dann während 96 Stunden unter Rühren mit 600 UpM ausgeführt, während keimfreie Luft mit 1 l/Min, von 28 ⁰C eingeblasen wurde. Nach Beendigung der Züchtung wurden 18 g/l «-Ketoglutarsäure und 1 g/l L-Glutaminsäure erhalten.Shake culture had been incubated in a broth medium for 24 hours, inoculated in an amount of 10%. The cultivation was then carried out for 96 hours with stirring at 600 rpm, while sterile air at 1 l / min at 28 ^° C. was blown in. After the cultivation was completed, 18 g / l «-ketoglutaric acid and 1 g / l L-glutamic acid were obtained.

Example 2

IOIO

Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 19065 wurde in derselben Weise, wie im Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, jedoch wurde das Fermentierungsmedium durch kontinuierliche Zugabe von Ammoniakwasser auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 eingeregelt.Arthrobacter paraffineus ATCC No. 19065 was found in cultured in the same manner as described in Example 1, except that the fermentation medium was used adjusted to a pH value of 7.0 to 7.5 by continuously adding ammonia water.

Nach 72stündiger Kultur waren 35 g/l L-Glutaminsäure und 3 g/l α-Ketoglutarsäure vorhanden.After 72 hours of culture, there was 35 g / L of L-glutamic acid and 3 g / l α-ketoglutaric acid present.

Example 3

Arthrobacter paraffineus ATCC Nr. 19064 wurde in 20 ml eines Fermentierungsmediums, das 0,1 % KH„PO₄, 0,1% NaHPO₄-UH₂O, 0,1% MgSO₄-7H₂O, 0,002% FeSO₄-7 H₂O, 5y/l Vitamin B₁, 2,0% (NH^)₂SO₄, 0,03% Maisquellwasser, lOOy/ml Adenin und 5,0% n-Dodecan enthielt, bei einem pH-Wert von 7,0 in einem 500-ml-Sakaguchi-Kolben eingeimpft und das Gemisch unter Schütteln während 96 Stunden bei 3O⁰C gezüchtet. Der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 bis 8,0 durch Zugabe von Harnstoff lösung und Ammoniakwasser zu dem Fermentierungsmedium eingestellt. Nach Beendigung der Züchtung waren mg/ml L-Glutaminsäure und 3 mg/ml «-Ketoglutarsäure in dem Fermentierungsmedium vorhanden.Arthrobacter paraffineus ATCC No. 19064 was in 20 ml of a fermentation medium containing 0.1% KH "PO ₄ , 0.1% NaHPO ₄ -UH ₂ O, 0.1% MgSO ₄ -7H ₂ O, 0.002% FeSO ₄ - 7 H ₂ O, 5y / l vitamin B ₁ , 2.0% (NH ^) ₂ SO ₄ , 0.03% corn steep liquor, 100y / ml adenine and 5.0% n-dodecane, at a pH of 7.0 inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask, and cultured with shaking the mixture for 96 hours at 3O ⁰ C. The pH was adjusted to about 7.0 to 8.0 by adding urea solution and ammonia water to the fermentation medium. After the completion of the cultivation, mg / ml of L-glutamic acid and 3 mg / ml of-ketoglutaric acid were present in the fermentation medium.

Claims

Patent claims:

1. Process for the biotechnological production of -ketoglutaric acid and L-glutamic acid by aerobic cultivation of microorganisms of the genus Arthrobacter in η-paraffins with 11 to 18 carbon atoms as the main carbon source, nitrogen substances, inorganic salts and Nutrient media containing growth factors at pH values customary for this purpose, characterized in that that as microorganisms of the genus Arthrobacter, Arthrobacter simplex ATCC 15799, Arthrobacter paraffineus ATCC 15590, Arthrobacter paraffineus ATCC 19064 or Arthrobacter paraffineus ATCC 19065 begins.

2. The method according to claim 1, characterized in that said microorganism strains brings in a nutrient medium for use, the additional 0.01 to 2.0 percent by weight of a primary or secondary monohydric alcohol with 4 to 12 carbon atoms, a sugar alcohol, Contains glycerol, benzoic acid, sulfanilic acid or mixtures of these substances.