DE1212679B

DE1212679B - Verfahren zur Herstellung von Insulinloesungen

Info

Publication number: DE1212679B
Application number: DEN15365A
Authority: DE
Inventors: Jorgen Schlichtkrull
Original assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Current assignee: Novo Terapeutisk Laboratorium AS
Priority date: 1957-08-03
Filing date: 1958-07-18
Publication date: 1966-03-17

Description

Verfahren zur Herstellung von Insulinlösungen - ,. Die vorliegende Erfindung betrifft ein. Verfahren zur Herstellung eines schnellwirkenden stabilen Insulinpräparates durch Auflösung von Insulin in einem wäßrigen injizierbaren Medium.
Von der sich auf die chemischen Eigenschaften des Insulins beziehenden Literatur ist es bekannt, daß Insulin bei seinem isoelektrischen Punkt (pH rund 5,5) in Wasser am schwersten löslich ist, und daß die Löslichkeit mit fallendem bzw. steigendem pH-Wert zunimmt. So ist es bekannt, daß Insulin bei einem pH-Wert von 2 bis 3 bzw. 7 bis 8 in Wasser löslich ist.
Die in der Therapie verwendeten Insulinlösungen sind indessen immer auf einem pH-Wert von 2,5 bis 3,5 eingestellt. Ein solcher pH-Wert wird beispielsweise sowohl in der englischen als auch in der amerikanischen Pharmacopea vorgeschrieben. Dies hängt damit zusammen, daß für therapeutische Zwecke eine langdauernde Stabilität der Insulinlösungen unbedingt erforderlich ist, und .daß man bisher der Ansicht war, daß Insulinlösungen bei einem pH-Wert von 3 zehnmal stabiler sind als bei pH 7,2.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der neuen überraschenden Beobachtung,. daß es im Widerspruch zu der bisher alleinherrschenden Auffassung möglich ist, für therapeutische Zwecke verwendbare Insulinlösungen mit einem pH-Wert von 7 bis 8 und mit hegvorragender Stabilität herzustellen.
Zu der Erfindung. führende Untersuchungen haben gezeigt, daß Rinderinsulinkristalle mit einem Zinkgehalt von 0,340/0 in einem wäßrigen Medium bei pH 7,0 ohne Zusatz von Zinkionen rekristallisiert werden können, während dies mit Schweineinsulinkristallen nicht möglich ist, weil das Schweineinsulin bei pH 7,0 in Lösung verbleibt. Es besteht mit anderen Worten ein großer Unterschied der Löslichkeit von Rinderinsulin und Schweineinsulin im wäßrxgen Medium bei neutraler Reaktion, was als völlig unerwartet betrachtet werden muß. Durch die Verwendung von Schweineinsulin eröffnet sich zum erstenmal die Möglichkeit, therapeutische Insulinlösungen mit dem- pH-Wert des Blutes und mit der erforderlichen Stabilität herzustellen.
Im Einklang mit den obigen Erläuterungen kennzeichnet sich das mit dem Stand der Technik grundsätzlich brechende Verfahren nach der Erfindung durch die Verwendung von Schweineinsulin und Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7 bis B.
Es wurde ferner gefunden, daß die Stabilität der Schweineinsulinlösungen selbst bei der Anwesenheit von Ionen der für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metalle, insbesondere Zink,. nicht beeinträchtigt wird, wenn der Gehalt der Lösungen, an diesen Metallionen weniger als 13 - A - 10-3 Milli. äquivalente pro Liter ist, wobei A die Anzahl der internationalen Einheiten von Insulin pro Kubikzentimeter angibt. Mit einer Insulinkonzentration von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter bedeutet dies für Zink, daß die Schweineinsulinlösungen weniger als etwa 1,7 mg°/o an Zinkionen aufweisen sollen. Die Zulässigkeit solcher Zinkionenkonzentrationen war nicht zu erwarten, wenn man berücksichtigt, daß Rinderinsulin schon bei der Gegenwart von Zinkionen in einer Menge von 0,6 mg°/o bei einer Insulinkonzentration von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter kristallisiert.
Die nach der Erfindung hergestellten Insulinpräparate zeigen selbst nach jahrelanger Aufbewahrung. keine Veränderung des physikalischen Zustandes und der biologischen Aktivität der Lösung. Insbesondere erfolgt keine Ausfällung des gelösten Insulins während der Aufbewahrung, selbst dann nicht, wenn in der Lösung Metallionen vorhanden sind, welche die Kristallisation des Insulins begünstigen.
Zum Nachweis der unerwarteten Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Insulinlösungen wird auf die Zeichnung verwiesen, woraus hervorgeht, daß eine frisch hergestellte Lösung nach der Erfindung auf Kaninchen dieselbe Insulinwirkung ausübt wie die 22 Monate bei 4'C aufbewahrte Insulinlösung. Die geprüfte Insulinlösung hatte einem .pH-Wert von etwa 7 und enthielt iii 11 cm3: 40 Einheiten von gelöstem Schweineinsulin, 7,0 mg NaCl, `- _ - .- .-1 mg Nipagin, 1,4 mg CH.COONa,,3 H20. , _ Neben der unerwarteten Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Insulinlösungen weisen diese auch noch andere wesentliche Vorteile- auf.
Bei der Verwendung der Insulinlösungen bei der Schockbehandlung--in--der Psychiatrie reichen- ganz bedeutend kleinere Insuhnmengen aus, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Die Bedeutung dieser Tatsache bedarf--keiner näheren Erläuterung, denn bekanntlich ist Einspritzen von Insulin in nicht zuckerkranke Menschen infolge hypoglykämischer Erscheinungen immer-gefährlich. - -- - - -In vielen Fällen von Diabetes ist es für die gute Einstellung des Patienten mit so wenigen Injektionen pro Tag wie möglich- erwünscht, daß das verwendete Insulinpräparat nicht nur eine protahierte Wirkung, sondern auch eine ausgesprochene Initialwirkung entfaltet.
Die Depotinsuline weisen im allgemeinen eine für solche Fälle ausreichende- Initialwirkung nicht auf, weshalb Zumischung einer injizierbaren Insulinlösung Verwendung gefunden- hat. -Da die--meisten-Depot= insuhne den pH-Wert des Blutes haben, vertragen sich die .bisher- bekannten sauren. :Insulinlösungen nicht mit Depotinsnlnen.-'Es wär-deshälb erforderlich, die Zumischung in der Spritze Vorzunehmen. Däß dadurch ein Unsicherheitsfaktor eingeführt wird, dürfte klar sein.
Mittels . der nach der- Erfindung - hergestellten Insulinlösung wird es zum erstenmal möglich, Depotinsulin und Insulinlösung fabrikmäßig zu vermischen. Diese Vermischbarkeit der nach der Erfindung hergestellten Insulinlösüng mit Depotinsulin, insbesondere mit protahiert wirkenden Insülinkristallsuspensionen mit niedrigem Gehalt an für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metallen, stellt einen erheblichen Fortschritt dar.
Es ist bekannt, bei der Herstellung von aus einer wäßrigen Suspension einer Insulinausfällung bestehenden Präparaten mit neutraler Reaktion und verzögerter Wirkung zur Aufrechterhaltung der neutralen Reaktion eine Puffersubstanz zu verwenden. Als Puffersubstanzen können beispielsweise Phosphat-, G`itrat-, Azetat-, Borat-, Maleat-, Diäthylbarbiturat-und Glycinpuffer verwendet werden. Mich ist es bekannt, daß einzelne dieser Puffersubstanzen Ionen der für die Kristallisation des Insulins erforderlichen Metalle, wie Zink, derart binden, daß die Löslichkeit des Insulins bei neutraler Reaktion nicht verringert wird. So werden die Ionen all dieser Metalle beispielsweise durch Citratpuffer komplex gebunden.
Wenn man beim Verfahren der Erfindung eine Zusetzung einer Lösung der erwähnten Metalle verwendet, ist die zulässige Menge davon von der gewählten Puffersubstanz abhängig. Bei der Verwendung von Citrat- oder Phosphatpuffer sind somit viel größere Zinkmengen zulässig, als wenn eine andere, das Zink bei - neutraler Reaktion nichtbindende Puffersubstanz gebraucht wird. Im Hinblick auf die Stabilität der_ Insulinlösung bei' -läügerer Aufbewahrung richtet - sich` die .obere Grenze für den Gehalt .an-den genannten Metallen in der Insulinlösung nach dem pH-Wert und der Aufbewahrungstemperatur der Lösung. Je höher der Metallgehalt' und je niedriger die. Aufbewahrungstemperatur ist, desto höher muß -der pH-Wert der Lösung sein, um letztere auch bei langer Aufbewahrung stabil zu. erhalten. , Die folgenden Ausführungsbeispiele dienen zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Beispiel 1 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) amorphen, zinkfreien Schweineinsulins werden in 500 cm3 Wasser, das 2 cm3 1 n-HCl, 50 g Glukose und 2 g Phenol enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert, mit 1 n-NaOH auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellt und mit sterilem Wasser auf 1000 cm3 verdünnt.
-.Beispiel 2 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) kristallinen Schweineinsulins, das etwa 0,4 °/o Zink enthält, werden in 500 cm3 Wasser; das 2 cm3 1 n-HCI, 50 g Glukose und -1 g p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert und mit 500 cm3 einer sterilen Lösung - von 0,Ö2molarem Natriumpliosphat neutralisiert (pH.=.7,5). -Wenn erforderlich, wird der pH der Mischung mit 1 ri-NaOH auf einen pH von 7,3 bis 7,5 eingestellt.
Beispiel 3- ' 1,74 g (40 000 internationale Einheiten) etwa 0,7 °/o Zink enthaltenden kristallinen Schweineinsulins werden in 400 cm3 Wasser, das 2 cm3 1 n-HCI und 1 g p-Oxybenzoesäuremethylester enthält, gelöst. Die Lösung wird steril gefiltert, und es werden 500 cm3 einer sterilen 0,02molaren Natriumazetatlbsung zugegeben, die 1,40/, NaCl enthält. Der pH-Wert wird mit 1 n-NaOH auf 7,3 bis 7,5 eingestellt und anschließend- die Lösung mit. sterilem Wasser auf 1000 cm3 verdünnt.
Bei all den vorgenannten Beispielen haben die erhaltenen Lösungen einen Insulingehalt von 40 internationalen Einheiten pro Kubikzentimeter. Man kann indessen auch Lösungen mit einer höheren Insulinkonzentration wie beispielsweise 80 internationale Einheiten pro Kubikzentimeter herstellen. Mit zunehmender Insulinkonzentration und übrigens derselben Zusammensetzung der Lösungen ist es zweckmäßig, einen höheren pH-Wert einzustellen, damit bei der Aufbewahrung mit Sicherheit kein Insulin aus den Lösungen ausfällt.
Wie bereits vorstehend betont, hat der Gehalt der Lösungen an Zink und ähnlichen Metallen und die Art des gegebenenfalls verwendeten Puffers Einfluß auf die Löslichkeit des Schweineinsulins. Dies ist zu beachten, wenn höhere Insulinkonzentrationen verwendet werden.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung eines schnellwirkenden und stabilen Insulinpräparates durch Auf- Lösung von Insulin in einem wäßrigen injizierbaren Medium, gekennzeichnet durch die Verwendung von Schweineinsulin und Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf 7 bis B.
In Betracht gezogene Druckschriften: Britische Patentschriften Nr. 708 888, 709 927; französische Patentschrift Nr.1054122; V i n c k e, »Darstellung von Hormonpräparaten,«,
3. Auflage, Leipzig 1955, S. 57 und 58.