DE1298072B

DE1298072B - Process for the biochemical production of 5'-adenylic acid, adenosine diphosphate and adenosine triphosphate

Info

Publication number: DE1298072B
Application number: DE1966K0064407
Authority: DE
Inventors: Mitsawa Masanaru; Nara Takashi; Komura Toshio
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1965-02-10
Filing date: 1966-02-10
Publication date: 1969-06-26
Also published as: DE1300895B; GB1111891A; FR1554572A; DE1300896B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biochemi- gemessenen zulässigen ,Menge liegt, die angesammelten sehen Herstellung von 5'-Adenylsäure, Adenosindi-'¹ Produktmengen selbst dann geringerweirden, wenn die phosphat und Adenosintriphosphat durch Züchten vorhandene Manganmenge für die Ansammlung optieines Mikroorganismus in einem Adenin enthaltenden mal ist.The invention relates to a method for biochemical measured allowable amount is, look at the accumulated Preparation of 5'-adenylic acid, adenosine diphosphate ^'1 product amounts even lower Weirden when the phosphate and adenosine triphosphate opti a by culturing known amount of manganese for the accumulation of microorganism in an adenine containing times is.

üblichen Nährmedium. - 5 Die in Verbindung mit den obengenannten Mikro-usual nutrient medium. - 5 The in connection with the above-mentioned micro-

Aus der französischen Patentschrift 1 372 054 ist Organismenstämmen zu verwendenden zulässigen Menbereits die biochemische Herstellung von 5'-Adenyl- gen der Metallionen lassen sich daher nur durch besäure, Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat stimmte Konzentrationen oder Konzentrationsbedurch Züchten von Mikroorganismen in einem Kohlen- reiche definieren. Unter diesen Metallen üben äußerst hydrate, StickstofFsubstanzen und Mineralsalze ent- io geringe Mengen an Mn++ einen besonders großen Einhaltenden Nährmedium bekannt,, wobei beim Einsatz fluß auf die Produktausbeute aus. von 4% Glucose,'l7Ö nig 5'-Adenylsäpre, "10,00 mg Es ist also ersichtlich, daß das Mengenverhältnis derFrom the French patent specification 1,372,054, organism strains are already allowed to be used the biochemical production of 5'-adenyls of the metal ions can therefore only be achieved by acidic, Adenosine diphosphate and adenosine triphosphate varied concentrations or levels Define the cultivation of microorganisms in a coal kingdom. Exercise extremely among these metals Hydrates, nitrogen substances and mineral salts ent io small amounts of Mn ++ a particularly large adherent Nutrient medium known, where when used, flow on the product yield. of 4% glucose, 'l7Ö nig 5'-Adenylsäpre, "10.00 mg It can be seen that the quantitative ratio of the

Adenosindiphosphat und 90 mg Adenosintriphosphat vier MetaUionen zueinander eine wichtige Rolle spielt je Liter-erhalten werden. ■ ■ und daß nur bei Einhaltung der bestimmten.MengenAdenosine diphosphate and 90 mg adenosine triphosphate four metaUionen to each other plays an important role per liter can be obtained. ■ ■ and that only if the specified.quantities are adhered to

Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren 15 bemerkenswert große Mengen an Produkten angezur biochemischen Herstellung von 5'-Adenylsäure sammelt werden können.The present invention seeks to provide a method of producing remarkably large quantities of products biochemical production of 5'-adenylic acid can be collected.

(AMP), Adenosindiphosphat (ADP) undAdenosintri- Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des(AMP), adenosine diphosphate (ADP) and adenosine tri- The following examples serve to illustrate the

phosphat (ATP), wodurch sich eine höhere Ausbeute erfindungsgemäßen Verfahrens. Wenn nicht anders an diesen Substanzen erzielen läßt. angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf dasphosphate (ATP), resulting in a higher yield of the process according to the invention. If not otherwise can be achieved on these substances. given, the percentages relate to the

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß 5'-Adenyl- ao Gewicht je Liter Nährmedium. Die Angaben über die säure, Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat angesammelten Mengen von 5'-Adenylsäure (AMP), in höherer Ausbeute erhalten werden können, wenn Adenosindiphosphat (ADP) und Adenosintriphosphat man bestimmte Microorganismen in Gegenwart von (ATP) beziehen sich auf mg/ccm. bestimmten MetaUionen und bei ganz bestimmtenAccording to the invention it was found that 5'-adenyl ao weight per liter of nutrient medium. The information about the acid, adenosine diphosphate and adenosine triphosphate accumulated amounts of 5'-adenic acid (AMP), in higher yield can be obtained if adenosine diphosphate (ADP) and adenosine triphosphate certain microorganisms in the presence of (ATP) refer to mg / ccm. certain metaUions and with very certain

Konzentrationen dieser MetaUionen in einem sonst 25 Beispiel!Concentrations of these metaUions in an otherwise 25 example!

Adenin enthaltenden üblichen Nährmedium züchtet. Es wird Brevibacteriumammoniagenes ATCC15750Adenine-containing usual nutrient medium grows. It becomes Brevibacteriumammoniagenes ATCC15750

Das Verfahren zur biochemischen Herstellung von als Impfbakterium benutzt. Das Impfmedium enthält 5'-Adenylsäure, Adenosindiphosphat, Adenosintri-, 2% Glucose, eine Lösung eines Aminosäuregemisches phosphat durch Züchten eines Mikroorganismus in (je.70fi.g/l der folgenden Aminosäuren: L-Glycin, einem hierfür üblichen Adenin enthaltenden Nähr- 30 L-Alänin, L-Asparaginsäure, L-Tryptophan, L-Phemedium ist nun erfindungsgemäß dadurch gekenn- nylalanin, L-Prolin, L-Histidin, L-Lysin, L-Arginin, zeichnet, daß man Brevibacterium ammoniagenes L-Valin, L-Leucin und L-Isoleuein), 0,1 °/₀ K₂HPO₄, ATCC in Gegenwart von 2 mg/1 Fe++, 10 bis 30 [i.g/1 0,03 % MgSo₄ · 7H₃O, 0,25 % NaCl, 0,0005 °/₀ FeSO₄, Mn++, 2,7 mg/1 Ca++'und 100 Ws- 300 μg/l Zn++ oder 0,4 fAg/ccm MnSO₄- 4H₂O, 30 μg/l Biotin, 2 μg/ccm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 751 in 35 ^-Alanin, 1 μg/ccm Thiaminhydrochlorid und 0,2 % Gegenwart von 3 mg/1 Fe++, 20 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Harnstoff. Der pH-Wert des Impfmediums wird vor Ca++ und 250 μg/l Zn++ im Nährmedium züchtet. der Sterilisierung auf 7,3 eingestellt. Der HarnstoffThe process for the biochemical production of used as a vaccine bacterium. The inoculation medium contains 5'-adenylic acid, adenosine diphosphate, adenosine tri-, 2% glucose, a solution of an amino acid mixture phosphate by cultivating a microorganism in (each 70fi.g / l of the following amino acids: L-glycine, a nutrient containing adenine commonly used for this purpose) 30 L-alanine, L-aspartic acid, L-tryptophan, L-phemedium is now characterized according to the invention by nylalanine, L-proline, L-histidine, L-lysine, L-arginine, that Brevibacterium ammoniagenes L-valine, L-leucine and L-isoleuein), 0.1 ° / ₀ K ₂ HPO ₄ , ATCC in the presence of 2 mg / 1 Fe ++, 10 to 30 [ig / 1 0.03% MgSo ₄ · 7H ₃ O, 0, 25% NaCl, 0.0005 ° / ₀ FeSO ₄ , Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ 'and 100 Ws- 300 μg / l Zn ++ or 0.4 fAg / ccm MnSO ₄ - 4H ₂ O, 30 μg / l Biotin, 2 ug / cc Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 751 in 35 ^ -alanine, 1 ug / cc thiamine hydrochloride and 0.2% presence of 3 mg / 1 Fe ++, 20 ug / l Mn ++, 2.7 mg / 1 urea. The pH of the inoculation medium is grown before Ca ++ and 250 μg / l Zn ++ in the nutrient medium. the sterilization set to 7.3. The urea

Um die genannten Mengen der MetaUionen in dem wird getrennt von den anderen Bestandteilen sterilisiert Kulturmedium zu erhalten, ist es erforderlich, defi- und zu dem sterilisierten Impfmedium gegeben. Der nierte Mengen dieser Ionen in Form ihrer Sulfate oder 40 Mikroorganismus wird in dem steriUsierten Impf-Chloride zuzugeben. In dem Fall jedoch, in dem ein medium 24 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C Teil dieser Metalle, wie z. B. Mangan oder.Zink, als gezüchtet.In order to obtain the specified amounts of metaUions in the culture medium which is sterilized separately from the other components, it is necessary to add defi- and to the sterilized inoculation medium. The ned quantities of these ions in the form of their sulfates or microorganisms are to be added in the sterilized inoculating chlorides. In the case, however, in which a medium 24 hours at a temperature of 3O ⁰ C part of these metals, such as. B. Manganese or.Zinc, as grown.

Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Kultur- Das verwendete Fermentationsmedium hat dieImpurities in other components of the culture The fermentation medium used has the

mediums, z. B. in der Form von Kaliumphosphat und folgende Grundzusammensetzung: Magnesiumsalzen enthalten sind, ist es nicht besonders 45 ■ -mo/ Gi_UCOsemediums, e.g. B. in the form of potassium phosphate and the following basic composition: Magnesium salts are included, it is not particularly 45 ■ -mo / Gi _UCO se

erforderlich, diese Ionen dem Medium zuzusetzen. 1 2°/ K HPOnecessary to add these ions to the medium. 1 2 ° / K HPO

Wie aus obigem hervorgeht, sind die zu benutzenden 12°l° KH PO*'As can be seen from the above, the 12 ° l ° KH PO * 'to be used are

zulässigen Mengen an Mangan und Zink merklich 1*2 °/ MeSO *'7H OPermissible quantities of manganese and zinc are noticeably 1 * 2% / MeSO * '7HO

kleiner als diejenigen der beiden anderen Metalle, so 3oW/l Biotin* * ' smaller than those of the other two metals, so 3oW / l biotin * * '

daß die Mengen dieser Ionen, die als Verunreinigung 50 ₁₀ ^_g/_ccm β Alaninthat the amounts of these ions which are used as an impurity 50 ₁₀ ^ _g / _ccm β alanine

in den Bestandteilen eines Nährmediums enthalten S^g/ccm Thiaminhydrochlorid.The components of a nutrient medium contain S ^ g / ccm thiamine hydrochloride.

sind, in einigen Fallen ausreichen. Unter diesen beidenare sufficient in some cases. Among these two

Metallen ist die zu verwendende Menge an Mangan Fe⁺+, Mn++ und Zn++ werden in Form ihrer SulfateMetals, the amount to be used of manganese Fe ⁺ +, Mn ++, and Zn ++ in the form of their sulfates

besonders gering, hat jedoch nichtsdestoweniger einen und Ca++ in Form von CaCl₂ in verschiedenen Konbedeutsamen Einfluß auf das Wachstum der Stämme^: 55 zentrationen zügegeben. Der pH-Wert des Fermen- und die Ausbeute der Produkte. Wenn die Mangan- tationsmediums wird mit 5n-NaOH auf 8,5 eingestellt, menge die zulässige Grenze desselben überschreitet, Nach der Sterilisation wird Harnstoff, der gesondert wird das Wachstum der Stämme übermäßig gefördert, sterilisiert worden ist, zu dem Fermentationsmedium was zur Folge hat, daß sich die angesammelte Menge in einer solchen Menge gegeben, daß die Konzentration an Produkt beträchtlich verringert. Wenn jedoch die 60 0,6 % in bezug auf das Fermentationsmedium beträgt. Menge an Mangan innerhalb der genannten Konzen- Die Impfkultur wird zu dem Fermentationsmediumparticularly small, but nevertheless has one and Ca ++ in the form of CaCl ₂ in various concentrations has an influence on the growth of the stems ^: 55 concentrations. The pH of the fermentation and the yield of the products. If the manganese medium is adjusted to 8.5 with 5N NaOH, the amount exceeds the allowable limit of the same. After sterilization, urea, which has separately been excessively promoted growth of the stems, is sterilized, to the fermentation medium, which results in that the accumulated amount is given in such an amount that the concentration of product is considerably reduced. However, if the 60 is 0.6% with respect to the fermentation medium. Amount of manganese within the stated concentration The inoculum becomes the fermentation medium

trationen geregelt wird, wird eine gute Produktaus- in einer Menge von 10 Volumprozent gegeben. Das beute erhalten. Es muß jedoch noch erwähnt werden, Fermentationsmedium wird dann in verschiedene ■ daß diese zuletzt genannte gute Produktausbeute nur 250-ccm-Erlenmeyerkolben gegossen. Es wird dann ; dann erhalten wird, wenn auch die zulässigen, defi- 65 durch aerobe Schüttelkultur bei einer Temperatur von nierten Mengen der anderen drei MetaUionen zugegen 30° C gezüchtet; Adenin wird zu dem Fermentationssind. Schließlich ist zu bemerken, daß in dem FaUe, in medium nach 48stündiger Züchtung in einer Menge dem die vorhandene Calciummenge unterhalb der an- von 3,5 mg/ccm gegeben. Die Mengen an AMP, ADPtrations is regulated, a good product output is given in an amount of 10 percent by volume. That get loot. It must be mentioned, however, that fermentation medium is then divided into different ■ that this last-mentioned good product yield only poured 250 cc Erlenmeyer flasks. It will then; is then obtained, albeit the permissible, defi- 65 by aerobic shaking culture at a temperature of ned amounts of the other three metaUions grown at 30 ° C; Adenine will be used to ferment. Finally, it should be noted that in the FaUe, in medium after 48 hours of cultivation in an amount to which the amount of calcium present is given below the limit of 3.5 mg / ccm. The amounts of AMP, ADP

und ATP, die sich nach weiterem 48stündigem Züchten nach der Zugabe des Adenins angesammelt haben, werden in der Tabelle angegeben.and ATP accumulated after an additional 48 hours of cultivation after the addition of the adenine, are given in the table.

VerVer Fe++Fe ++ Mn++Mn ++ Ca++Ca ++ Zn++Zn ++ AMP ADP ATPAMP ADP ATP Spurtrack 0,20.2 0,10.1 suchsearch mg/1mg / 1 vefivefi mg/1mg / 1 W?/lW? / L (mg/ccm)(mg / ccm) 0,70.7 0,70.7 1,21.2 11 00 3030th 2,72.7 100100 Spurtrack Spurtrack Spurtrack 22 22 00 2,72.7 100100 0,90.9 1,11.1 1,21.2 33 22 3030th 00 100100 1,21.2 1,51.5 2,02.0 44th 22 3030th 2,72.7 00 1,11.1 1,71.7 7,37.3 55 22 1010 2,72.7 100100 Spurtrack Spurtrack Spurtrack 66th 22 3030th 2,72.7 100100 1,91.9 2,02.0 6,96.9 77th 22 100100 2,72.7 100100 Spurtrack Spurtrack Spurtrack 88th 22 1010 2,72.7 300300 99 22 1010 2,72.7 600600

Example 2

Es wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 als Impfbakterium benutzt. Es wird gezüchtet und fermentiert unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 3 mg/1 Fe++, 20 μg/l Mn++, 2,7 mg/1 Ca++ und 250 μg/l Zn++. Bei Zusatz von 4,0 mg/ccm Adenin nach 48stündiger Züchtung wird nach insgesamt 96stündiger Züchtung oder Fermentierung festgestellt, daß sich in der Fermentationsflüssigkeit 1,9 mg/ccm AMP, 2,3 mg/ccm ADP und 6,8 mg/ccm ATP angesammelt haben.It becomes Brevibacterium ammoniagenes ATCC15751 used as a vaccine bacterium. It is grown and fermented under the same conditions as im Example 1 described using 3 mg / 1 Fe ++, 20 μg / l Mn ++, 2.7 mg / 1 Ca ++ and 250 μg / l Zn ++. With the addition of 4.0 mg / ccm adenine after 48 hours of cultivation, after a total of 96 hours of cultivation or fermentation found that 1.9 mg / cc AMP, 2.3 mg / cc ADP and 6.8 mg / cc ATP have accumulated.

Aus den obigen Beispielen kann leicht entnommen werden, daß entweder ein synthetisches Nährmedium oder ein natürliches Medium in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, solange es die wesentlichen Nährstoffe für das Wachstum des benutzten Mikroorganismenstammes enthält. Solche Nährstoffe sind in der Technik gut bekannt und umfassen Substanzen wie eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen u. dgl., die von den eingesetzten Mikroorganismen in geeigneten Mengen gebraucht werden. So können als Kohlenstoffquelle z. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Maltose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen usw., oder jede andere geeignete Kohlenstoff quelle, wie z. B. Glycerin, Mannit, Sorbit, organische Säuren, Glutaminsäure usw., verwendet werden. Diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Gemischen aus zwei oder mehreren dieser Substanzen verwendet werden. Als Quelle für Stickstoff können die verschiedensten Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie z. B. Harnstoff oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat usw., oder Aminosäuren bzw. Aminosäuregemische oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z. B. Maisquellwasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydrolysate, Caseinaminosäuren, Fischextrakte, Reiskleiextrakte usw., verwendet werden. Auch diese Substanzen können entweder allein oder in Form von Mischungen aus zwei oder mehrerenFrom the above examples it can easily be seen that either a synthetic nutrient medium or a natural medium is suitable in the present invention as long as it is essential Contains nutrients for the growth of the strain of microorganisms used. Such nutrients are in well known in the art and include substances such as a carbon source, a nitrogen source, inorganic Compounds and the like used in suitable amounts by the microorganisms used will. So can be used as a carbon source z. B. carbohydrates such as glucose, fructose, maltose, Starch, starch hydrolyzate, molasses, etc., or any other suitable carbon source, such as. B. glycerin, Mannitol, sorbitol, organic acids, glutamic acid, etc. can be used. These substances can either alone or in the form of mixtures of two or more of these substances can be used. Various types of inorganic or organic salts or Connections such as B. urea or ammonium salts, such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, Ammonium phosphate, etc., or amino acids or amino acid mixtures or natural nitrogen-containing substances, such as. B. Corn steep water, Yeast extract, meat extract, peptone, fish meal, casein hydrolysates, casein amino acids, fish extracts, Rice bran extracts, etc. can be used. These substances can either be used alone or in the form of mixtures of two or more

ίο dieser Substanzen verwendet werden. Anorganische Verbindungen, außer den Metallionen der vorliegenden Erfindung, die zu dem Nährmedium gegeben werden können, sind unter anderem Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat oder Natriumchlorid usw. Weiterhin müssen dem Medium Nährstoffe zugesetzt werden, die für das Wachstum des jeweils verwendeten Mikroorganismenstammes wesentlich sind, wie z. B. Histidin oder Adenin. Wie in der Fermentationstechnik üblich, können dem Medium weiterhin wachstumsfördernde Mittel, wie z. B. Biotin oder Aminosäuren, wie z. B. Glutamin- oder Asparaginsäure, zugesetzt werden.ίο of these substances are used. Inorganic Compounds other than the metal ions of the present invention that are added to the nutrient medium can include magnesium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, Potassium monohydrogen phosphate or sodium chloride, etc. Furthermore, nutrients must be added to the medium which are necessary for the Growth of the particular strain of microorganisms used are essential, such as. B. histidine or Adenine. As usual in fermentation technology, the medium can continue to promote growth Means such as B. biotin or amino acids, such as. B. glutamic or aspartic acid can be added.

Die Fermentation wird unter den in der Technik üblichen aeroben Bedingungen, wie z. B. durch aerobesThe fermentation is carried out under the aerobic conditions customary in the art, such as, for. B. by aerobes

as Schütteln der Kultur oder unter Rühren einer Submerskultur unter Einführung von sterilisierter Luft, bei einer Temperatur von etwa 20 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 5 bis 9 durchgeführt.The culture is shaken or a submerged culture is stirred with the introduction of sterilized air, at a temperature of about 20 to 40 ° C and one pH of about 5 to 9 carried out.

Nach Beendigung der Fermentation können 5'-Adenylsäure, Adenosindiphosphat und Adenosintriphosphat nach üblichen Verfahren aus der Fermentationsflüssigkeit abgetrennt werden, wie z. B. durch Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Extraktion mit Lösungsmitteln, Fällung mit Metallsalzen, Chromatographie u. dgl.After the fermentation has ended, 5'-adenic acid, adenosine diphosphate and adenosine triphosphate can be added be separated from the fermentation liquid by conventional methods, such as. B. by treatment with ion exchange resins, extraction with solvents, precipitation with metal salts, chromatography and the like

Claims

Claim:

Process for the biochemical production of 5'-adenylic acid, adenosine diphosphate and adenosine triphosphate by growing a microorganism in a nutrient medium containing adenine customary for this purpose, characterized in that Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15750 in the presence of 2 mg / 1 Fe ++, 10 to 30 μg / l Mg ++ , 2.7 mg / 1 Ca ++ and 100 to 300 μg / l Zn ++ or Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 751 in the presence of 3 mg / 1 Fe ++, 20 μg / l Mn ⁺ +, 2.7 mg / 1 Ca ++ and 250 μg / l Zn ++ grows in the nutrient medium.