DE1295888B

DE1295888B - Method for determining resistance in red blood cells

Info

Publication number: DE1295888B
Application number: DE1964Y0000823
Authority: DE
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1964-04-24
Filing date: 1964-04-24
Publication date: 1969-05-22

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur bequemen Durchführung einer Bestimmung der Resistenz roter Blutkörperchen. The invention relates to a method for conveniently performing a Determination of red blood cell resistance.

Werden rote Blutkörperchen in einer isotonischen Salzlösung suspendiert und wird danach die Konzentration des Salzes in diesem Suspensionsmedium nach und nach verringert und von isotonisch nach hypotonisch geändert, so erleiden Form und Volumen der suspendierten Zellen eine Änderung, schließlich zerreißt die Zellwand, und Hämoglobin tritt aus. Red blood cells are suspended in an isotonic saline solution and then the concentration of the salt in this suspension medium is gradually and after decreased and changed from isotonic to hypotonic, so suffer form and Volume of suspended cells changes, eventually the cell wall tears, and hemoglobin leaks out.

Der Grad dieser Hämolyse, die auf Grund der Änderung der Salzkonzentration im Suspensionsmedium eintritt, ist ein Anzeichen für Alter und Beschaffenheit der Zellen. Er kann optisch bestimmt werden, da der ausgetretene, frei gelöste Blutfarbstoff die optischen Eigenschaften des Suspensionsmediums verändert.The degree of this hemolysis, which is due to the change in salt concentration occurs in the suspension medium is an indication of the age and nature of the Cells. It can be determined optically, as the leaked, freely dissolved blood pigment changes the optical properties of the suspension medium.

Zur Resistenzbestimmung wird bislang üblicherweise eine Reihe Salzlösungen bereitgestellt, wobei die Konzentrationen von isotonisch gegen hypotonisch abnehmen. In jede der Lösungen werden einige Tropfen Blut gegeben, und nach einiger Zeit wird visuell überprüft, bei welcher Salzkonzentration Hämolyse eingetreten ist. To date, a number of salt solutions have usually been used to determine resistance provided, with the concentrations decreasing from isotonic to hypotonic. A few drops of blood are added to each of the solutions, and after a while it becomes visually checked at what salt concentration hemolysis occurred.

Dieses Verfahren nach dem Stand der Technik hat den Nachteil, daß in den vorgelegten Röhrchen die Konzentration nur sprunghaft variiert werden kann. This method according to the prior art has the disadvantage that in the presented tube the concentration can only be varied by leaps and bounds.

Das Verhalten der Blutkörperchen unter kontinuierlicher Anderung der Salzkonzentration kann nicht beobachtet werden, so daß die Meßgenauigkeit und der Informationsgehalt des Testresultats beschränkt sind. So ist es z. B. nach einem Verfahren gemäß dem Stand der Technik nicht möglich, die Einheitlichkeit der Blutkörperchenresistenz zu bestimmen.The behavior of blood cells with continuous change in Salt concentration can not be observed, so that the measurement accuracy and the Information content of the test result are limited. So it is z. B. after a Prior art methods do not allow the uniformity of blood cell resistance to determine.

Es kann nur diejenige Salzkonzentration ermittelt werden, bei der der größte Teil der Blutkörperchen zerplatzt. Nachteilig ist auch die relativ große Menge Blut, die bei einer einzigen Bestimmung verbraucht wird. Schließlich liefert die visuelle Methode Ungenauigkeiten im Resultat, die von individuellen Faktoren abhängen.Only that salt concentration can be determined at which most of the blood cells burst. The relatively large one is also disadvantageous Amount of blood consumed in a single determination. Finally delivers the visual method inaccuracies in the result caused by individual factors depend.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Blutkörperchenresistenzbestimmung zu schaffen, nach dem unter Verbrauch von nur sehr geringen Blutvolumina das Resistenzverhalten der roten Blutkörperchen umfassend und genau registriert werden kann. The object of the invention is to provide a method for determining blood cell resistance to create, after the consumption of only very small blood volumes, the resistance behavior of the red blood cells can be recorded comprehensively and accurately.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die Blutkörperchen zunächst in einer isotonischen Salzlösung suspendiert und dann die Salzkonzentration dieses Suspensionsmediums allmählich verringert und den sich mit der Konzentrationsänderung ändernden Hämolysegrad beobachtet. According to the invention, this object is achieved in that the blood cells first suspended in an isotonic saline solution and then the salt concentration this suspension medium gradually decreases and changes with the change in concentration changing degree of hemolysis observed.

Es ist bei diesem Verfahren von Vorteil, daß man einzig und allein mit nur einer Suspension arbeitet, so daß man die gesamte Bestimmung mit sehr geringen Blutmengen durchführen kann. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet weiter den Vorteil, daß man durch Beobachtung der unter standardisierten Bedingungen erfolgenden Hämolyse unter anderem sowohl den mittleren Resistenzwert als auch die durchschnittliche Abweichung von diesem Mittelwert bestimmen kann.It is an advantage in this procedure that you only works with only one suspension, so that you can make the entire determination with very little Can carry amounts of blood. The method according to the invention also offers the advantage that by observing the hemolysis taking place under standardized conditions including both the mean resistance value and the average Can determine deviation from this mean value.

Vorzugsweise bringt man die isotonische Salzlösung mit den suspendierten Blutkörperchen in einen Behälter, dessen Wandung mindestens teilweise aus einer Dialysemembran besteht, und taucht diesen Behälter zur allmählichen Verringerung der Salzkonzentration in eine hypotonische Lösung ein. The isotonic salt solution is preferably brought with the suspended one Blood cells in a container, the wall of which at least partially consists of a Dialysis membrane and submerges this container for gradual reduction the salt concentration into a hypotonic solution.

An Stelle der hypotonischen Lösung kann man vorteilhaft auch destilliertes Wasser verwenden. Instead of the hypotonic solution, it is also advantageous to use distilled Use water.

Vorteilhaft bestimmt man die Hämolysegeschwindigkeit, indem man die Anderung der Lichtdurchlässigkeit kolorimetrisch aufzeichnet. Dabei wird die Messung überraschenderweise nicht durch die Hüllen der zerplatzten und durch die noch intakten Blutkörperchen gestört. The rate of hemolysis is advantageously determined by the Changes in light transmission are recorded colorimetrically. Thereby the measurement Surprisingly, not through the shells of the burst and those that are still intact Blood cells disturbed.

Weiter ist es von Vorteil, unmittelbar die erste Ableitungskurve der in Zwischenräumen von wenigen Sekunden durchgeführten Messung der Lichtdurchlässigkeit aufzuzeichnen. Auf diese Weise erhält man vorteilhaft die Änderungsgeschwindigkeit der Hämolyse zu jedem Zeitpunkt und insbesondere auch den Zeitpunkt, an dem die Lichtdurchlässigkeit die größte momentane Änderung erleidet, ohne zusätzliche mathematische Auswertung der Meßkurven. It is also advantageous to use the first derivative curve directly the measurement of the light transmission carried out in intervals of a few seconds to record. In this way, the rate of change is advantageously obtained the hemolysis at any point in time and in particular also the point in time at which the Light transmission suffers the greatest instantaneous change without any additional math Evaluation of the measurement curves.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand schematischer Zeichnungen an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. In the following the invention is illustrated by means of schematic drawings explained in more detail using an exemplary embodiment.

F i g. 1 zeigt die schematische Darstellung einer Apparatur zur Durchführung des Verfahrens; F i g. 2 zeigt die perspektivische Ansicht eines Behälters für die zu untersuchende Probe im zusammengesetzten Zustand; F i g. 3 zeigt die perspektivische Ansicht eines Rahmens für den Behälter nach F i g. 2; F i g. 4 zeigt die perspektivische Ansicht einer Dialysemembran, welche die Öffnungen des Rahmens nach F i g. 3 bedeckt; F i g. 5 zeigt eine perspektivische Ansicht eines Halters, der dazu bestimmt ist, die Dialysemembran fest an den Rahmen anzudrücken; F i g. 6 zeigt in schematischer Darstellung ein Blockschaltbild einer Signalmeßeinrichtung zur Durchführung des Verfahrens. F i g. 1 shows the schematic representation of an apparatus for implementation the procedure; F i g. Fig. 2 shows the perspective view of a container for the sample to be examined in the assembled state; F i g. 3 shows the perspective View of a frame for the container according to FIG. 2; F i g. 4 shows the perspective View of a dialysis membrane which covers the openings of the frame according to FIG. 3 covered; F i g. 5 shows a perspective view of a holder intended to press the dialysis membrane firmly against the frame; F i g. 6 shows in schematic Representation of a block diagram of a signal measuring device for performing the Procedure.

Wie aus F i g. 1 zu ersehen, umfaßt ein System zur Untersuchung der osmotischen Verletzlichkeit der roten Blutkörperchen eine Untersuchungszelle 20, eine Lichtquelle 50, eine optische Beobachtungs- und Registriereinrichtung, die sich ihrerseits aus einem Linsensystem 62, einer lichtempfindlichen Zelle oder Photozelle 63, einem Verstärker 64 und einer Anzeige- bzw. Aufzeichnungseinrichtung 66 zusammensetzt. As shown in FIG. 1 includes a system for examining the osmotic vulnerability of red blood cells an examination cell 20, a light source 50, an optical observation and registration device, the in turn from a lens system 62, a light-sensitive cell or photocell 63, an amplifier 64 and a display or recording device 66 composed.

Die Untersuchungszelle 20 besteht aus einer durchsichtigen äußeren Zelle 24 und einer inneren Zelle 22, die schematisch als ein aus einer Dialysemembran gebildeter Schlauch dargestellt ist. In die innere Zelle 22 wird eine vorbestimmte Menge Blut in isotonischer Salzlösung 25 und in die äußere Zelle 24 eine hypotonische Lösung (oder destilliertes Wasser) 27 eingebracht. Das Ganze kann in einem weiteren Gefäß (durchsichtig oder mit Fenstern versehen) untergebracht sein, das mit Einrichtungen versehen ist, die die Versuchsanordnung bei konstanter Temperatur halten. Der Lichtstrahl aus der Lichtquelle 50 wird beim Durchgang durch ein Linsensystem 52 parallel ausgerichtet und tritt bei 55 ein. Der aus der Zelle 24 austretende Strahl 56 geht durch das Linsensystem 62 und fällt auf die Photozelle 63; der dort erzeugte Strom wird im Verstärker 64 verstärkt und durch die Aufzeichnungseinrichtung 66 aufgezeichnet. The examination cell 20 consists of a transparent outer one Cell 24 and an inner cell 22, which is shown schematically as one of a dialysis membrane formed hose is shown. In the inner cell 22 is a predetermined Amount of blood in isotonic saline solution 25 and in the outer cell 24 a hypotonic one Solution (or distilled water) 27 introduced. The whole thing can be done in another Vessel (transparent or windowed) to be housed with the facilities is provided that keep the experimental set-up at a constant temperature. The ray of light from the light source 50 is aligned in parallel when passing through a lens system 52 and enters at 55. The beam 56 exiting the cell 24 passes through the Lens system 62 and falls on photocell 63; the electricity generated there is used in the Amplifier 64 is amplified and recorded by the recording device 66.

Eine bevorzugte Ausführungform der inneren Zelle 22 ist in F i g. 2 bis 5 dargestellt. Die Untersuchungszelle umfaßt einen Rahmen 7t aus Kunststoff oder Metall mit einer durchgehenden Öffnung 72. Vorzugsweise sind zwei Kanäle73 und 74 vorgesehen, die sich von der Öffnung 72 nach oben erstrecken. A preferred embodiment of the inner cell 22 is shown in FIG. 2 to 5 shown. The examination cell comprises a frame 7t made of plastic or metal with an opening 72 therethrough. Preferably there are two channels 73 and 74 provided, extending upward from opening 72.

Über den Rahmen 71 ist ein Dialyseschlauch 75 derart gespannt, daß sich zwei Fenster 76 und 77 bilden und daß die beiden Kanäle 73 und 74 an ihrem oberen Ende nicht von der Membran bedeckt werden.A dialysis tube 75 is stretched over the frame 71 in such a way that two windows 76 and 77 form and that the two channels 73 and 74 at their upper end are not covered by the membrane.

Die Dimensionen des Dialyseschlauches 75 sind so gewählt, daß der durch die durchgehende Öffnung 72 und die Fenster 76 und 77 umschriebene Raum dicht abgeschlossen wird. Ein Halter78 sorgt dafür, daß das untere Ende der Dialysemembran 75 fest an den Rahmen 71 angedrückt wird. Die Suspension von Erythrocyten in isotonischer Salzlösung 25 wird mittels einer Spritze eingefüllt, deren Nadel durch einen der Kanäle 73 und 74 eingeführt wird, so daß durch den anderen Kanal Luft entweichen kann. Nach Einführen einer vorbestimmten Menge an Suspension wird die Zelle 22 in den äußeren Behälter24, der die hypotonische Lösung 27 enthält, eingesetzt und in bestimmten Zeitabständen der Lichtdurchgang abgelesen. Dieser ist ein Maß für den Hämolysegrad.The dimensions of the dialysis tube 75 are chosen so that the by the through opening 72 and the windows 76 and 77 tightly circumscribed space is completed. A holder78 ensures that the lower end of the dialysis membrane 75 is pressed firmly against the frame 71. The suspension of erythrocytes in isotonic Saline solution 25 is filled in by means of a syringe, the needle of which passes through one of the Channels 73 and 74 is introduced so that air can escape through the other channel can. After introducing a predetermined amount of suspension, the cell 22 is in the outer container 24 containing the hypotonic solution 27 is inserted and in the passage of light is read at certain time intervals. This is a measure of that Degree of hemolysis.

Durch genaue Bestimmung der Hämolysegeschwindigkeit lassen sich zusätzliche Informationen erlangen. Eine elektrische Schaltung, mit deren Hilfe man die abgeleitete Kurve unmittelbar aus den sich in jedem Moment ergebenden Werten über die Photozelle 63 erhält, zeigt Fig. 6. By precisely determining the rate of hemolysis, additional Obtain information. An electrical circuit with the help of which one can derive the Curve directly from the values resulting at each moment via the photocell 63 is shown in FIG. 6.

Es ist schematisch ein Blockschaltbild dargestellt, wobei das Eingangssignal an Klemmen 110 und 111 eines Verstärkers 112 angelegt ist, der mit einem ersten Verstärkerll3 und über einen Schalter 115 mit einem zweiten Verstärker 114 verbunden ist. A block diagram is shown schematically, with the input signal is applied to terminals 110 and 111 of an amplifier 112, which is connected to a first Amplifier III and connected to a second amplifier 114 via a switch 115 is.

Parallel zu den Eingangsklemmen des Verstärkers 114 ist zwischen diesem und dem Schalter 115 ein Kondensator 116 geschaltet. An seinem Ausgang ist der Verstärker 113 in Serie geschaltet mit dem Ausgangsende des Verstärkers 114 und dem Eingang eines Registriergeräts 117. Der Schalter 115 wird nach einem zeitlich festgelegten Programm eine und ausgeschaltet durch eine geeignete mechanische Einrichtung, z. B. einem Motor 119, der auch mit dem Zeiger 120 des Registriergeräts 117 verbunden ist.In parallel with the input terminals of amplifier 114 is between it and a capacitor 116 is connected to the switch 115. The amplifier is at its output 113 connected in series with the output end of amplifier 114 and the input a recorder 117. The switch 115 is set after a timed Program on and off by a suitable mechanical device, e.g. B. a motor 119, which is also connected to the pointer 120 of the recorder 117 is.

Der Stand dieses Zeigers 120 entspricht zu jedem Zeitpunkt der an den Eingangsklemmen 110, 111 anliegenden Spannung. Ein Schreiber registriert diese Werte in bestimmten Zeitintervallen. Ändert sich der Eingangswert an den Klemmen 110 und 111 nur langsam, so kann man ohne weiteres die Kurve erhalten, welche die erste Ableitung des sich langsam ändernden Signals darstellt. Nimmt man an, daß jeweils nach zwei Sekunden eine Aufzeichnung gemacht werden soll und daß man vom Nullwert ausgeht, so zeigt das erste Aufsetzen des Zeigers den Nullwert an. 2 Sekunden später, während welcher Zeit der Schalter 115 geöffnet ist, wird das Signal bei einem etwas höheren Wert sein. Der Kondensator 116 ist noch ungeladen, so daß der Ausgangswert am Verstärker 114 gleich Null ist. Am Ende der 2 Sekunden wird der Schalter 115 geschlossen und gleichzeitig der Zeiger 120 niedergedrückt, so daß er den Ablesungswert im Augenblick des Schließens des Schalters registriert. Zu diesem Zeitpunkt entspricht der Ausgangswert aus den Verstärker 113 funktionell der Amplitude des Eingangssignals, so daß der Ausgangswert der in Serie geschalteten Verstärker 113 und 114 gleich dem momentanen Wert des Signals ist, das aufgezeichnet wird. Zu gleicher Zeit wird der Schalter 115 geschlossen, der Kondensator 116 lädt sich auf den momentanen Spannungswert auf, und da der Zeiger 120 in seiner Stellung festgehalten wird, bleibt der ansteigende Ausgangswert aus dem Verstärker 114 ohne Wirkung. Der Steuerungsmechanismus 119 gibt den Zeiger 120 frei und öffnet den Kontakt 115, so daß für das nächste 2-Sekunden-Intervall der Kondensator 116 eine Ladung speichert, derart, daß die Ausgangsspannung am Verstärker 114 gleich der Spannung ist, die zu der Zeit besteht, wo der Zeiger 120 das zweite Mal aufsetzt. Am Ende des 2-Sekunden-Intervalls, wo dann die dritte Aufzeichnung gemacht wird, entspricht die Ausgangsspannung am Verstärker 113 dem momentanen Wert des Eingangssignals. Der Ausgangswert am Verstärkerll4 ist auf dem Wert der zweiten, 2 Sekunden früher gemachten Aufzeichnung, und somit ist die auf dem Zeiger 120 unmittelbar vor der dritten Aufzeichnung einwirkende Spannung gleich der Spannungsänderung während der vorangehenden 2 Sekunden. Dann verursacht der Motor 119 das Niederdrücken des Zeigers 120, der nun die Spannungsänderung während dieses Intervalls aufzeichnet, und der Schalter 115 wird geschlossen, so daß der Kondensator 116 auf den momentanen Spannungswert des Verstärkers 112 aufgeladen wird. Da der Zeiger in seiner Stellung festgehalten wird, wird dies nicht aufgezeichnet.The position of this pointer 120 corresponds to an at any point in time the voltage applied to the input terminals 110, 111. A clerk registers this Values in certain time intervals. If the input value at the terminals changes 110 and 111 only slowly, one can easily get the curve which the represents the first derivative of the slowly changing signal. Assume that a recording is to be made every two seconds and that the Zero value, the first touch of the pointer shows the zero value. 2 seconds later, during which time switch 115 is open, the signal is at be of a slightly higher value. The capacitor 116 is still uncharged, so that the Output value at amplifier 114 is zero. At the end of the 2 seconds the Switch 115 closed and at the same time the pointer 120 depressed, so that it registers the reading at the moment the switch closes. to the output value from amplifier 113 corresponds functionally to this point in time the amplitude of the input signal, so that the output value of the series-connected Amplifiers 113 and 114 is equal to the instantaneous value of the signal being recorded will. At the same time the switch 115 is closed, the capacitor 116 charges refer to the current voltage value, and since the pointer 120 is in its position is held, the increasing output from amplifier 114 remains without Effect. The control mechanism 119 releases the pointer 120 and opens the contact 115 so that for the next 2 second interval the capacitor 116 has a charge stores so that the output voltage at amplifier 114 equals the voltage that exists at the time the pointer 120 touches down the second time. At the end of the 2 second interval where the third recording is made the output voltage at amplifier 113 corresponds to the instantaneous value of the input signal. The output value at the amplifier114 is at the value of the second, 2 seconds earlier record made, and thus the one on pointer 120 is immediately prior to the Third record, applied voltage equal to the change in voltage during the previous 2 seconds. Then the motor 119 causes the pointer to be depressed 120, which now records the change in voltage during this interval, and the Switch 115 is closed, so that the capacitor 116 has the current voltage value of the amplifier 112 is charged. As the pointer is held in place is not recorded.

Auf diese Weise wird der Vorgang weitergeführt, und es wird unmittelbar eine Kurve aufgezeichnet, welche die erste Ableitung der Eingangssignale darstellt. Dies entspricht dem Andruck v2 - v1 t2 - tl worin v2 die momentane Spannung zum Aufzeichnungszeitpunkt t2 ist, während vt die Signalspannung bei der voraufgehenden Aufzeichnungszeit ti bedeutet. Ist t2 - t1 ausreichend kurz, so wird die Ableitungskurve erhalten, und bei der Messung der osmotischen Verletzlichkeit ist ein Intervall von 2 Sekunden für diesen Zweck genug. Der Zeitpunkt, zu welchem die Kurve (momentan) die größte Änderung erleidet, ist klar ersichtlich. Innerhalb 10 Minuten werden bei diesem Verfahren etwa 300 Punkte aufgezeichnet, und die Kurve ist genau genug für klinische Zwecke. That way, the process continues, and it becomes immediate plotted a curve representing the first derivative of the input signals. This corresponds to the pressure v2 - v1 t2 - tl where v2 is the current voltage for Recording time t2, while vt is the signal voltage at the previous one Recording time ti means. If t2 - t1 is sufficiently short, the derivative curve becomes and when measuring osmotic vulnerability there is an interval of 2 seconds is enough for this purpose. The point in time at which the curve (currently) undergoes the greatest change is evident. Be within 10 minutes this procedure records about 300 points and the curve is accurate enough for clinical purposes.

Der Zeitpunkt maximaler Lichtdurchlässigkeitsänderung, d. h. der Zeitpunkt maximaler Hämolysegeschwindigkeit von Beginn des Versuchs an gerechnet, ist ein Maß für die mittlere Resistenz der Blutkörperchen. Das Untersuchungsresultat kann verglichen werden mit Resultaten, die man unter den gleichen (Standard-)Bedingungen mit Eichblutsorten bekannter Resistenz erzielt. Man kann aber auch in Blindversuchen die zeitliche Konzentrationsänderung in der im inneren Behälter befindlichen ursprünglich isotonischen Lösung bei einer bestimmten Membran und bei Standardbedingungen bestimmen; so kann man die Zeitskala in eine Konzentrationsskala umeichen, wobei man die im Zeitpunkt maximaler Hämolysegeschwindigkeit im Inneren des Gefäßes herrschende Konzentration und damit den Absolutwert der Resistenz ablesen kann. The point in time of the maximum change in light transmittance, i.e. H. the Time of maximum hemolysis rate calculated from the beginning of the experiment, is a measure of the mean resistance of blood cells. The examination result can be compared with results obtained under the same (standard) conditions achieved with calibration blood varieties of known resistance. But you can also do blind tests the change in concentration over time in the originally located in the inner container determine isotonic solution at a given membrane and under standard conditions; so you can re-calibrate the time scale in a concentration scale, whereby you can use the im Time of maximum hemolysis rate prevailing concentration inside the vessel and thus can read the absolute value of the resistance.

Claims

Claims: 1. Method for determining resistance in red blood cells, in which the blood cells are suspended in various salt concentrations from isotonic versus hypotonic and hemolysis is observed, d a - characterized in that the blood cells are initially in an isotonic Suspended saline solution and then the salt concentration of this suspension medium gradually decreased and the degree of hemolysis, which changes with the change in concentration observed.

2. The method according to claim 1, characterized in that the placing isotonic saline solution in a container with the suspended blood cells, whose wall consists at least partially of a dialysis membrane, and that one this container to gradually reduce tion of the salt concentration in a hypotonic Solution dips.

3. The method according to claim 2, characterized in that in place distilled water is used for the hypotonic solution.

4. The method according to claim 1, characterized in that the hemolysis rate is determined by the migration of the light transmittance of the suspension colorimetrically is recorded.

5. The method according to claim 4, characterized in that immediately the first derivative curve of the light transmittance is recorded.