DE1279385B - Verfahren zur Bestimmung des Bilirubingehaltes von Koerperfluessigkeiten, insbesondere von Serum und Urin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

GOIn

Deutsche KL: 421-3/54

Nummer: 1279 385

Aktenzeichen: P 12 79 385.0-52 (H 58983)

Anmeldetag: 31. März 1966

Auslegetag: 3. Oktober 1968

Gegenstand der Erfindung bildet ein neuartiges und besonders vorteilhaftes Verfahren zur Bestimmung des Bilirubingehaltes von Körperflüssigkeiten, insbesondere von Serum und Urin.

Die Auswertung klinisch-chemischer Analysen beruht oft auf der photometrischen Messung einer gefärbten Lösung, die durch Reaktion des gesuchten Stoffes mit einem spezifischen Reagens entstanden ist. Dazu bedient man sich eines Photometers, d. h. eines Gerätes, mit dem die Absorption eines monochromatischen Lichtstrahles durch die zu untersuchende Flüssigkeit gemessen wird. Bei Photometern, bei denen das monochromatische Licht durch ein Glasfilter erzielt wird, hängt die Wellenlänge dieses Lichtes also von dem verwendeten Filter ab. Neben der auf dem Filter angegebenen Wellenlänge läßt dieses auch noch Lichtstrahlen benachbarter Wellenlängen in mehr oder minder großem • Maß hindurch. Damit ist die Messung der Farblösung in einem Photometer von der Beschaffenheit des Filters abhängig und demgemäß mehr oder minder unsicher.

Bei klinisch-chemisch photometrischen Untersuchungen wird daher unter anderem aus den obengenannten Gründen neben der eigentlichen Analyse eine Standardlösung bekannten Gehaltes mit untersucht, die bei der Messung zum Vergleich herangezogen wird und gewissermaßen die Eichung des Photometers bei dem verwendeten Filter und der zur Verfügung stehenden Spannung vorgenommen. Voraussetzung für die Verwendbarkeit solcher Standardlösungen ist ihre Haltbarkeit über einen längeren Zeitraum. Hier besteht nun bei der Bestimmung des Gehaltes an Bilirubin die Schwierigkeit, daß sämtliche Lösungen dieses Stoffes nur sehr kuze Zeit, wenige Minuten bis höchstens etwa eine halbe Stunde, haltbar sind. Solche Standardlösungen müssen daher sofort nach Anfertigung gemessen werden, und es muß demgemäß für jede Bestimmung, die mit einer Standardlösung verglichen werden soll, jedesmal eine frische Standardlösung hergestellt werden.

Für die Bestimmung des Bilirubingehaltes von Körperflüssigkeiten gibt es verschiedene Möglichkeiten. Ein solches bekanntes Verfahren zur Bestimmung des Bilirubingehaltes beruht auf der Fähigkeit dieses Stoffes, sich mittels diazotierter Sulfanilsäure in einen löslichen Azofarbstoff überführen zu lassen, in dessen Menge dann mittels einer entsprechenden Vergleichslösung ermittelt werden kann.

Um für dieses Verfahren eine haltbare Standardlösung zu erhalten, hat man versucht, an Stelle des Bilirubins eine Lösung von N-(l-Naphthyl)-äthylen-

Verfahren zur Bestimmung des Bilirubingehaltes von Körperflüssigkeiten, insbesondere von Serum und Urin

Anmelder:

Dr. Heinz Haury Chemische Fabrik,

8000 München, Schleißheimer Str. 343

Als Erfinder benannt:

Dipl.-Chem. Dr. Rudolf Fried, 8022 Grünwald;

Dr. Joachim Hoeflmayr, 8000 München

diaminchlorid zu verwenden (P. K. Bilisiss & R. J. Speer, CUn.Chem. 9, 553 [1963]), die ebenfalls mit diazotierter Sulfanilsäure einen roten Farbstoff bildet, dessen Absorptionsspektrum dem des Bilirubins in saurer Lösung sehr ähnlich ist. Nachteilig wirkt sich bei diesem Verfahren jedoch aus, daß die Messung des Azofarbstoffes von N-(1-Naphthyläthylendiamin zum Vergleich mit dem Azofarbstoff von Bilirubin dabei in saurer Lösung vorgenommen werden muß und man nicht die weit empfindlichere und weit spezifischere Messung im alkalischen Milieu vornehmen kann. In diesem stimmen nämlich die Absorptionsspektren beider Farbstoffe nicht mehr überein.

Es wurde nun die überraschende Feststellung gemacht, daß es demgegenüber doch eine Möglichkeit gibt, das vorerwähnte, auf der Fähigkeit des BiIirubins zur Bildung eines löslichen Azofarbstoffes durch Umsetzung mit diazotierter Sulfanilsäure beruhende Verfahren auch im alkalischen Milieu durchführen und sich damit diese empfindlicheren und weit spezifischeren Messungen auch unter Verwendung haltbarer Standardlösungen nutzbar machen zu können.

Es wurde nämlich gefunden, daß eine 0,2 bis 1,0 mgf/oige wäßrige Lösung von Evansblau in dem üblichen Meßbereich von 570 bis 600 nm bei einem pH-Wert zwischen 5,5 bis 7,5 das gleiche Absorptionsspektrum aufweist wie die Azofarbstofflösung des Bilirubins in alkalischer Lösung. Eine solche Lösung von Evansblau läßt sich also zur Eichung eines Photometers für die Bilirubinbestimmung mit der Diazomethode verwenden, wenn ihre Konzentration mit einem frisch hergestellten echten Bilirubinstandard eingestellt wird.

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Die Einstellung erfolgt zweckmäßig auf folgende Weise: 40 mg analysenreines Bilirubin, werden in 20 ml O₅In Natriumkarbonatlösung gelöst. 1,0 ml dieser Lösung werden mit 8,0 ml 5%iger Humanalbuminlösung und 1,0 ml 0,1 η Essigsäure verdünnt. Diese Lösung wird nochmalls mit 5%iger Humanalbuminlösung auf 100 ml verdünnt und ,enthält somit 4mgVo Bilirubin. Sofort nach dem Ansetzen wird diese Eichlösung in an sich bekannter^>:Weise mit diazotierter ,Sulfanilsäure umgesetzt .und durch Zugabe von Fehlingscher Lösung in alkalisches Milieu übergeführt. Die so entstandene Farblösung wird in einem absolut messenden Photometer bestimmt und ihre Extinktion festgehalten. Eine Lösung... _ von 2 mg Evansbiau in 100 ml destilliertem Wasser wir,d durch Verdünnen auf die nach obiger Weise gefundene Extinktion eingestellt. Sie entspricht einem Standard von 4,0mg%.und,kann je nach Wunsch noch weiter verdünnt wetdejiv'

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Bestimmung'des Bilirubihgehaltes von Körperflüssigkerten, insbesondere von Serum und .Urin, durch Überführung des Bilirubins mitteis diazotierter Sulfanilsäure in einen löslichen Äzofarbstoff und Ermittlung der Menge desselben im alkalischen Milieu mittels einer entsprechenden Vergleichslösung, dadurch gekennzeichnet, daß als Vergleichslösung eine ..auf einen pH-Wert,.ypn_5J5_.bis J7,5 eingestellte 0,2 bis i,0mg%ige wäßrige Lösung von Evansbiau verwendet wird, i

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