DE1263766B - Verfahren zur Herstellung von 9alpha-Fluor-16-methylen-prednisolon bzw. -21-estern - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/06

Nummer: 1263 766

Aktenzeichen: M 50789IV b/12 ο

Anmeldetag: 31. Januar 1959

Auslegetag: 21. März 1968

Es hat sich herausgestellt, daß 9«-Fluor-16-methylen-prednisolon und dessen 21-Ester interessante pharmakologische Eigenschaften besitzen. In der USA.-Patentschrift 2 865 808 wird zwar ein Herstellungsverfahren für 16-Methylen-corticosteroide beschrieben, jedoch hat die Nacharbeitung ergeben, daß es danach nicht möglich ist, die gewünschten 16-Methylen-steroide herzustellen. Insbesondere lassen sich die in den Beispielen 11 und 17 (Teil 2) der genannten USA.-Patentschrift beschriebenen Verfahren nicht reproduzieren. Man erhält nicht die gewünschten, in 1(2)-Stellung dehydrierten 16-Methylen-steroide, sondern lediglich Zersetzungsprodukte. Die in den Beispielen 9 und 17 der genannten USA.-Patentschrift angegebenen Verbindungen haben daher, zumal sie durch keine physikalischen Daten charakterisiert sind, nicht als bekannt zu gelten. Ferner wird nach der USA.-Patentschrift 2 865 808 als Ausgangsmaterial 16a-Hydroxy-hydrocortison verwendet, das selbst nur über eine Vielzahl von Reaktionsstufen erhältlich ist. Bisher existiert somit kein durchführbares Verfahren zur Herstellung von 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon und dessen 21-Estern.

Es wurde nun gefunden, daß man in guter Ausbeute 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon und 21-Ester desselben herstellen kann, wenn man als Ausgangsmaterial 16/i-Methyl-16a,17a-oxido-5-pregnen-3/:i-ol-20-on-3-acetat (I) (vgl. das Reaktionsschema) verwendet.

Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung von 9 α-Fluor-16-methylen-prednisolon bzw. -21-estern der allgemeinen Formel A

CH,Y

F=CH,

(Y = freie bzw. veresterte Hydroxylgruppe) welches darin besteht, daß man 16ß-Methyl-16a,17a-oxido-5-pregnen-3ß-ol-20-on-3-acetat (I) durch Erwärmen mit katalytischen Mengen einer starken Säure, z. B. einer Sulfonsäure, vorzugsweise p-Toluolsulfonsäure, in einem inerten Lösungsmittel, wie Benzol, in Verfahren zur Herstellung von
9a-Fluor-l 6-methylen-prednisolon bzw.
-21-estern.

Anmelder:

E. Merck Aktiengesellschaft,

6100 Darmstadt, Frankfurter Str. 250

Als Erfinder benannt:

Dr. Heinz-Jürgen Mannhardt, 6100 Darmstadt;

Dr. Karl-Heinz Bork, 6103 Griesheim;

Dr. Klaus Brückner,

Dr. Harald Metz, 6100 Darmstadt

16-Methylen-5-pregnen-3/3,17a-diol-20-on-3-acetat(II) überführt, sodann in an sich bekannter Weise diese Verbindung (II) mit mindestens 2 Mol äquivalentem Brom umsetzt, das erhaltene 5,6,2 l-Tribrom-16-methylen-pregnan-S/S.na-dioWO-on-S-acetat (III) durch aufeinanderfolgende Behandlung mit einem Jodid und einem Acetat, vorzugsweise mit Natriumjodid und Kaliumacetat, in 16-Methylen-5-pregnen-3/U7a, 21-triol-20-on-3,21-diacetat (IV) überführt, letzteres (IV) mit einer Kultur von Flavobacterium dehydrogenans oder einem daraus erhaltenen Enzym bebrütet, das erhaltene 16-Methylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion (V) mikrobiologisch in Ik- oder llß-Stellung hydroxyliert, das erhaltene ll(a-bzw. /})-Hydroxy-steroid (VIIa bzw. VIIb) in 21-Stellung acetyliert, das erhaltene ll(a-bzw./J)-Hydroxy-21-acetat (IXa bzw. IXb) in 9,11-Stellung dehydratisiert, an die 9(1 Inständige Doppelbindung des gebildeten 9(ll)-Dehydro-steroids (XI) HOBr bzw. HOCl addiert, das erhaltene 9a-Brom- bzw. 9a-Chlor-ll/J-hydroxy-steroid (XIII) mit einem Alkaliacetat oder einer organischen Base behandelt, das gebildete 9ß,llß-Oxido-steroid (XV) mit Fluorwasserstoff behandelt, das erhaltene 9a-Fluor-16-methylen-4-pregnen-3,20-dion-ll/U7a,21-triol-21-acetat (XVII) durch Behandlung mit in 1(2)-Stellung dehydrierenden Mikroorganismen in 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-acetat bzw. 9a-Fluor-l 6-methylen-prednisolon umwandelt und letzteres gegebenenfalls in 21-Stellung verestert, oder daß man eine der. verfahrensgemäß erhaltenen Zwischenverbindungen (V, Vila, VIIb, IXa, IXb, XI, XIII oder XV) nach an

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sich bekannten mikrobiologischen Methoden in 11/i-Hydroxylierung: Curvularia lunata, Cunnigha-

1(2)-Stellung dehydriert und das so erhaltene 1-De- mella blakesleeana, Mucor griseocyanus, Cephalahydro-derivat (VI, Villa, VIIIb, Xa, Xb, XII, XIV thecium sp., Trichothecium sp., Botrytis cinerea, bzw. XVI) soweit erforderlich, in analoger Weise Coniathyrium sp., Thamnidium sp., Streptomyces wie die entsprechenden, in 1-Stellung gesättigten 5 fradiae, Rhodoseptoria sp., Colletotrichum sp., Do-Verbindungen durch 11-Hydroxylierung und/oder thichiza sp., Absidia glauca, Pycnosporium sp. 21-Acetylierung und/oder 9,11-Dehydratisierung und/ 11 «-Hydroxylierung: Rhizopus (verschiedeneArten),

oder HOBr- bzw. HOCl-Addition und/oder Dehydro- Aspergillus (verschiedene Arten), Penicillium (verhalogenierung und/oder Fluorwasserstoffaufspaltung schiedene Arten), Fusarium (verschiedene Arten), in 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-acetat um- ro Neurospora sitophila, Trichothecium sp., Cephalowandelt und daß man gegebenenfalls die 21-Hy- thecium roseum, Pestalotia foedans, Dactylium dendroxygruppe der erhaltenen Verbindungen (V) bis droides, Heliocostylum pyriforme, Thamnidium sp., (VIII) nach an sich bekannten Methoden verestert Eurotium chevalieri, Mucor javanicus und verschie- und gegebenenfalls die erhaltenen Ester analog den dene Arten, Delacroixia coronata, Absidia glauca, Verbindungen (V) bis (XVII) behandelt. 15 Cunninghamella echinulata, ferner weitere Pilze der

Durch Behandlung der Verbindung (I) mit kata- Ordnung Mucorales.

lytischen Mengen einer starken Säure, z.B. einer Die mikrobiologische 11-Hydroxylierung wird nach

Sulfonsäure, vorzugsweise p-Toluolsulfonsäure oder an sich bekannten Methoden durchgeführt. Besondere Benzolsulfonsäure, in Benzol oder einem anderen Erfolge bei der 11 a-Hydroxylierung werden erzielt inerten Lösungsmittel, erhält man das entsprechende 20 bei Verwendung von Pilzen der Gattung Fusarium, 16-Methylen-steroid (II). wobei das als Ausgangsmaterial verwendete Steroid

Zur Einführung einer 21-Hydroxylfunktion be- vollständig umgesetzt wird, so daß langwierige Trennhandelt man die Verbindung (II) in einem geeigneten prozesse vermieden werden.

Lösungsmittel, z. B. in Eisessig-Chloroform, mit min- Die 11-Hydroxysteroide (Vila, VIIb) und (Villa,

destens 2 Moläquivalenten Brom, wobei man eine 25 VIIIb) werden nach an sich bekannter Acetylierung geringe Menge Halogenwasserstoff als Katalysator der 21-Hydroxygruppe (Bildung der Verbindungen zusetzt. Nach dieser Methode erhält man die Tri- IXa, IXb bzw. Xa, Xb) nach an sich bekannten bromverbindung (III). Das Rohprodukt dieser Bro- Methoden zu den 9(1 ^-ungesättigten Steroiden (XI) mierung wird z.B. in Acetonlösung mit Natrium- bzw. (XII) dehydratisiert. Bei Verwendung der 11/i-Hyjodid behandelt, wobei das 21-ständige Bromatom 30 droxysteroide (IXb) bzw. (Xb) sind alle üblichen gegen Jod ausgetauscht und die 5(6)-ständige Doppel- trans-Dehydratisierungsmittel geeignet, z. B. Phosbindung regeneriert wird. Durch Kochen mit einem phoroxychlorid oder Thionylchlorid in Pyridin. Bei Alkaliacetat, vorzugsweise Kaliumacetat, wird das Verwendung der 11 «-Hydroxysteroide (IXa) bzw. Jodatom in 21-Stellung durch die Acetoxygruppe (Xa) sind die üblichen cis-Dehydratisierungsmethoden ersetzt. Man erhält in guter Ausbeute 16-Methylen- 35 geeignet, z. B. Veresterung der «-Hydroxylgruppe 5-pregnen-3/il7a,21-triol-3,21-diacetat (IV). und anschließende basische oder thermische Ab-

Durch Bebrütung von (IV) mit einer Kultur von spaltung der entsprechenden Säure. Flavobacterium dehydrogenans oder einem daraus Nach bekannten Methoden wird an die 9(11 )-stän-

herstellbaren Enzym gelingt es, in bester Ausbeute dige Doppelbindung der so erhaltener! 9(11)-De- und in glatter Reaktion 16-Methylen-Reichsteins- 40 hydrosteroide (XI) bzw. (XII) unterchlorige oder Substanz-S (V) herzustellen. Als Nährlösung für unterbromige Säure angelagert. Die dabei entste-Flavobacterium dehydrogenans verwendet man z. B. henden ll/^-Hydroxy-9«-chlor- bzw. Mp'-Hydroxyeine auf pH 7,0 gepufferte Lösung eines l%igen 9a-brom-steroide (XIII) bzw. (XIV) werden — eben-Hefeextraktes' in Wasser. Nach etwa 10- bis 16stün- falls nach bekannten Methoden — durch Behandlung digem Wachstum bei etwa 28° C ersetzt man der 45 mit einem Alkaliacetat, vorzugsweise Kaliumacetat, Bakterienkultur die Verbindung (VI) zu. Die Be- oder einer organischen Base in die entsprechenden brütung wird unter Belüftung etwa 6 Stunden fort- 9/>\ 11 ß- Oxidoverbindungen (XV) bzw. (XVI) umgegesetzt. Den Fortgang der Reaktion kann man durch wandelt.
Messung des UV-Spektrums kontrollieren. Durch Behandlung der 9/5,11 p'-Oxidoverbindungen

Die Verbindungen (V, Vila, VIIb, IXa, IXb, XI, 5° (XV) bzw. (XVI) mit Fluorwasserstoff erhält man XIII, XV und XVII) können nach der Erfindung ^«-Fluor-lo-methylen-hydrocortison-Il-acetat (XVII) in an sich bekannter Weise in 1(2)-Stellung mikro- bzw. 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-acetat biologisch dehydriert werden. Dafür kommen z. B. (XVIII). Für die Verbindung (XVII) schließt sich dann die folgenden Mikroorganismen in Frage: Bacillus noch eine mikrobiologische l.(2)-Dehydrierung in sphaericus, Fusarium solani, Corynebacterium sim- 55 der oben beschriebenen Weise an. plex, Alternaria sp., Mycobacterium smegmatis, CaIo- Wie im Reaktionsschema angegeben, kann die

nectria decora, Mycobacterium lacticola, Ophiobolus zur Herstellung von 9 α-Fluor-16-methylen-prednisp., Alcaligenes sp., Didymella lycopersici, Protamino- solon erforderliche mikrobiologische 1(2)-Dehydriebacter sp., Septomyxa affinis, Nocardia sp., Cylindro- rung an sieben verschiedenen Zwischenverbindungen carpon radicicola, Streptomyces lavendulae, Bacillus 60 vorgenommen werden. Ferner kann die freie Hycyclooxydans. Die Fermentation benötigt etwa 4 bis droxylgruppe in 21-Stellung des erhaltenen 9«-Fluor-14 Stunden, je nachdem, welcher Mikroorganismus 16-methylen-prednisolons nach an sich bekannten verwendet wird. Besonders geeignet sind Kulturen Methoden verestert werden. Als Veresterungsmittel von Bacillus sphaericus var. fusiformis und Coryne- können z. B. die Halogenide oder die Anhydride bacterium simplex. ⁶5 folgender Säuren verwendet werden: Essigsäure und

Zur Einführung einer Ha- oder 1 Inständigen ihre höheren Homologen, z. B. tert-Butylessigsäure, Hydroxygruppe in die Verbindungen (V) oder (VI) Bernsteinsäure und deren höhere Homologe, Aminosind folgende Mikroorganismen geeignet: oder Alkylaminocarbonsäuren, Tetrahydrophthal-

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säure, Aminodicarbonsäuren, z.B. Asparaginsäure, rein erhalten wird. Ausbeute: 1,05g, Fp. 195 bis Cyclopentylpropionsäure, Phosphorsäure oder Schwe- 197 C, [u]_D —65,7 (Chloroform).

⁶DaTaIs Ausgangsmaterial benötigte 16/i-Methyl- ^c» Mikrobiologische Verseifung und Oxydation

16«,17u-oxido-5-pregnen-3/i-ol-20-on-3-acetat ist z.B. 5 Eine sterilisierte Lösung, bestehend aus 80g GIuaus 16-Methyl-5,16-pregnadien-3/-j-ol-20-on-3-acetat kose, 50 g Hefeextrakt, 30 g Ammoniumchlorid, mit leicht zugänglich. Dieses kann seinerseits in bekannter Leitungswasser auf 10 1 aufgefüllt und mit V₃₀molarer Weise durch Addition von Diazomethan an die Phosphatpufferlösung nach Sörensen auf pH 7,0 16(17)-Doppelbindung des 5,16-Pregnadien-3//-ol- eingestellt, wird mit 200 ml einer Schüttelkultur 20-on-3-acetats (diese Verbindung ist als technisches 10 von Flavobacterium dehydrogenans beimpft. Unter Produkt aus Diosgenin zugänglich) und anschlie- Ruhren und Belüften bei 28°C wird die Kultur ßende Pyrolyse des so erhaltenen Pyrazolinderivates 12 Stunden anwachsen gelassen. Nach Zugabe einer hergestellt werden (vgl. A. Wet t st ei 11, Helvetica konzentrierten Lösung von 12 g des Diacetats (IV) Chimica Acta. Bd. 27. S. 1803 [1944]). Anschließend in Aceton oder Aceton-Dimethylformamid (1:1) läßt erfolgt eine Umsetzung mit alkalischem Wasserstoff- 15 man die Kultur 10 Stunden bei unveränderten Bedinperoxid zum 16/i'-Methyl-16«,17a-oxido-5-pregnen- gungen reagieren. Die Lösung wird mit Chloroform 3/-<-ol-20-on. das durch übliche Acetylierung der mehrfach extrahiert, die Chloroformlösung getrocknet 3-Hydroxygruppe in die Ausgangsverbindung der und eingedampft. Der Eindampfrückstand wird durch Formel I übergeführt wird. Umkristallisieren gereinigt. Man erhält 8 g reines

Das verfahrensgemäß erhaltene 9a-Fluor-16-me- 20 16-Methylen-4-pregnen-17«,21 -diol-3,20-dion (V), thylen-prednisolon und seine 21-Ester sollen als Fp. 205 bis 206 C. [u]_D +46,6' (Chloroform), A_11111x entzündungshemmende Arzneimittel bei allen in Frage 240 nm, EJ"; 480.
kommenden Indikationen, z. B. rheumatischer Arthri- ., ,

tis. in der Humanmedizin verwendet werden. Sie eignen ^d) Mikrobiologische 11 «-Hydroxylierung

sich auch zur Bekämpfung hartnäckiger Allergien. 25 In einem Kleinfermenter werden 151 einer geeigneten Nährlösung (z. B. 5% Glukose, 0,1% Hefe-B ei spiel 1 extrakt, 0,05% Sojamehl, 0,3% NaNO₃, 0,05%

a) Epoxvdaufspaltune ^MS^S0* ' ^7H2⁰' ⁰^ KH₂PO₄, 0,05% KCl, 0,005%

FeSO₄ -7H₂O) mit 750 ml einer gut gewachsenen

Eine Lösung von 9,3 g 16/i-Methyl-16«.17a-oxido- 30 Schüttelkultur von Fusarium sp. (Sammlung E. Merck 5-pregnen-3/i-ol-20-on-3-acetat (I) in 350 ml wasser- Nr. 2083) beimpft. Die Kultur wächst unter starkem freiem Benzol wird nach Zusatz von 630 mg p-Toluol- Belüften und Rühren bei 28° C und erhält nach sulfonsäure 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g 16-Methylen-Reichdem Abkühlen wird die benzolische Lösung zuerst steins-Substanz-S (V) in 40 ml Dimethylformamid, mit 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung, dann 35 Die Umsetzung wird papierchromatographisch vermit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. folgt. Wenn im Chromatogramm keine Ausgangs-Es werden 5,4 g kristallisiertes 16-Methylen-5-pregnen- substanz mehr nachweisbar ist, wird der Ansatz 3,7,17a-diol-20-on-3-acetat (II) erhalten. Aus Methanol abgebrochen und die Kulturlösung dreimal mit 101 umkristallisiert, schmilzt die Verbindung bei 196 Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformbis 198 C. 40 extrakte werden eingedampft, der Rückstand wird

b) Bromierung und Umesterung ^mit Petroläther digeriert und aus Aceton umkristalli-

" siert. Man erhalt reines 16-MethyIen-ll-epi-hydro-

1.55 g 16-Methylen-5-pregnen-3p',17a-diol-20-on- cortison (Vila). Fp. 199 bis 20I = C, [u]_D +41,7^; (Di-

3-acetat (II) werden in 60 ml Eisessig und 15 ml oxan), A_1110x 241 nm, Ej^_n 445.

Chloroform gelöst und die Lösung auf 5 C abge- 45 .

kühlt. Innerhalb 20 Minuten werden nach Zugabe ^e> 21-Acetylierung

einiger Tropfen einer Lösung von Bromwasserstoff 2 g 16-Methylen-ll-epi-hydrocortison (VIIa) wer-

in Eisessig unter Rühren 62 ml einer 2%igen Lösung den in 10 ml Pyridin gelöst und 0,36 g Essigsäure-

von Brom in Eisessig zugetropft. Nach beendeter anhydrid zugegeben. Nach 15stündigem Stehen bei

Zugabe wird noch eine halbe Stunde weitergerührt. 50 Zimmertemperatur wird in Wasser eingegossen, mit

Die Lösung wird in Wasser gegossen, mit Äther Chloroform dreimal extrahiert, die Chloroformlösung

extrahiert und die Ätherlösung mit einer wäßrigen durch Schütteln mit Natriumhydrogencarbonatlösung

Lösung von Natriumhydrogencarbonat neutral ge- neutralisiert, getrocknet und im Vakuum eingedampft,

waschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung Der amorphe Rückstand von 16-Methylen-ll-epi-

wird im Vakuum eingedampft. Es hinterbleibt das 55 hydrocortison-21-acetat (IXa) wird direkt in die nach-

Tribromid (III) in öliger Form, das ohne Reinigung folgende Reaktion eingesetzt,
weiterverarbeitet wird. Dazu wird der Rückstand

in 60 ml Aceton gelöst. 1,5 g Natriumiodid und 6 g ^l) Wasserabspaltung

wasserfreies Kaliumacetat zugegeben und 4 Stunden 5 g 16-Methylen-11 -epi-hydrocortison-21 -ace-

am Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wird vom 60 tat (IXa) werden in 25 ml absolutem Chloroform

anorganischen Salz abfiltriert und die Lösung im und 25 ml Pyridin gelöst. Unter Kühlen auf 0^cC

Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in Chloro- und Rühren werden 7 g p-Toluolsulfochlorid zu-

form gelöst, diese Lösung dreimal mit Wasser aus- gegeben. Das Gemisch wird noch 2 Stunden bei

geschüttelt, im Vakuum eingedampft, in Benzol gelöst 0⁰C weitergeführt, anschließend über Nacht bei

und Magnesiumsilikat, bekannt unter dem Handels- 65 Zimmertemperatur stehengelassen, in Wasser ein-

namen Florisil, chromatographiert. Das Benzol-Chlo- gegossen und mehrfach mit Chloroform extrahiert.

roform-(l :1)-Eluat gibt beim Eindampfen das Di- Die vereinigten Chloroformlösungen werden neutrali-

acetat (IV), das durch Umkristallisieren aus Aceton siert und getrocknet. Nach Eindampfen wird der

Rückstand von 16-MethyIen-l l-epi-hydrocortison-1 l-tosylat-21-acetat aus Methanol umkristallisiert. Fp. 160 bis 161 C, [«]₀ +66,6 (Chloroform), X_nwx 229 nm, E{°; 433.

Der auf diese Weise erhaltene Ester (5,9 g) wird in 75 ml Eisessig gelöst und nach Zugabe von 9 g wasserfreiem Natriumacetat 30 Minuten am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wird in 500 ml Wasser eingerührt und die Fällung von rohem 16-Methylen-4,9(11)-pregnadien-17«,21 -diol-3,20-dion-21 -acetat (XI) abgesaugt. Das Produkt wird zur Reinigung aus Essigester umkristallisiert. Ausbeute: 2,6 g, Fp. 215 bis217°C,[«] ²S +5Γ(Dioxan),X_max 238,5 nm,E|:°_m421.

g) Anlagerung von unterbromiger Säure

7,8 g 16-Methylen-4,9(ll)-pregnadien-17«,21-diol-3,20-dion-21-acetat (XI) werden in 315 ml Dioxan und 40ml Wasser gelöst. Dann werden 4,55g N-Bromsuccinimid und 1,68 ml 70%ige Perchlorsäure zugegeben; das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Es wird in Wasser eingegossen, der ausgefallene Niederschlag abgesaugt, mit Wasser nachgewaschen und getrocknet. Das rohe 16-Methylen-9a-bromhydrocortison-21 -acetat (XIII, X = Br) wird direkt in die nachfolgende Verfahrensstufe eingesetzt.

h) Abspaltung von Bromwasserstoff

Das nach Beispiel 1 g) erhaltene rohe 16-Methylen-9a-bromhydrocortison-21-acetat (XIII) wird in 450ml Äthanol gelöst, mit 19 g Kaliumacetat versetzt und die Lösung 2 Stunden am Rückfluß gekocht. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und die entstehende Emulsion mehrfach mit Chloroform extrahiert; die vereinigten Chloroformlösungen werden in üblicher Weise aufgearbeitet. Der Eindampfrückstand ergibt, aus Methanol kristallisiert, reines 16-Methylen-Die Kulturlösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. Das rohe 9u-Fluor-16-methylen-prednisolon (XVIII, R = H) wird durch Umkristallisieren aus Äthanol rein erhalten. Fp. 246 bis 248 C, [«]₀ +26,6' (Dioxan), /,„„,. 238,5 nm, EU 410.

j₂) Mikrobiologische 1 (2)-Dehydrierung

Ein Kleinfermenter mit 15 1 Nährlösung (0,1% Hefeextrakt in ¹Z₃₀ molarer Phosphatpufferlösung, pH 6,8) wird mit 800 ml einer Submerskultur von Corynebacterium simplex beimpft. Die Kultur wächst bei 28 C unter starker Belüftung und Rühren und erhält nach 4 bis 8 Stunden einen Zusatz von 5 g 9 «-Fluor-16-methylen-hydrocortison-21 -acetat (XVII) in 200 ml Methanol. Die Dehydrierung wird dünnschichtchromatographisch verfolgt und ist nach etwa 8 Stunden beendet. Die Kulturlösung wird dreimal mit je 151 Chloroform ausgerührt, der Extrakt eingedampft und mit Petroläther gereinigt. Der Rückstand wird über Kieselgel filtriert. Das erhaltene 9u-Fluor-16-methylen-prednisoIon-21 -acetat (XVIII, R = Acetyl) wird aus Aceton kristallisiert. Fp. 219°C, [«] _D +30^c (Dioxan).

tat(XV). Ausbeute: 4,2 g, Fp. 210 bis 211°C, [a]₀ -34,7° (Dioxan), X_max 243 nm, EJ*_m 390.

i) Aufspaltung mit Fluorwasserstoff

4,2 g 16 - Methylen - 9/U Iß - oxido - 4 - pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat(XV) werden in 42 ml absolutem Chloroform gelöst und bei — 6O⁰C zu 25 ml eines Gemisches von 40 ml Tetrahydrofuran, 15 ml Chloroform und 25 g Fluorwasserstoff gegeben. Die Reaktionslösung wird 4 Stunden bei — 30° C, anschließend weitere 4 Stunden bei 0° C stehengelassen. Sie wird dann in Natriumhydrogencarbonatlösung eingegossen, das Steroid mit Chloroform extrahiert, die Chloroformlösung getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. Ausbeute: 1,9 g 90^^0^16-1116^^1^^)03^180^ 21 -acetat (XVH), Fp. 209 bis 211°C, [a]_D +71,4° (Chloroform), X_max 238 nm, EJ* 399.

J₁) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 0,5 1 Schüttelkultur von Bacillus sphaericus beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28° C und erhält nach etwa 10 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 9a-Fluor-16-methylen-hydrocortison-21-acetat (XVII), gelöst in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt (Lösungsmittelsystem B₄ nach Bush, aufsteigend) und ist nach 28 bis 36 Stunden vollständig.

k) Veresterung

Durch übliche Veresterung der Hydroxylgruppe in 21-Stellung des 9a-Fluor-16-methylen-prednisolons (XVIII, R = H) erhält man die folgenden Ester:

9a - Fluor - 16 - methylen - prednisolon - 21 - chloracetat: Fp. 232 bis 234° C, [«]!? +17^; (Dioxan), A_1110x 240 nm; EJ* 329;

9a-Fluor- 16-methylen-prednisolon-21 -trimethylacetat: Fp. 234 bis 235" C;

9α-Fluor-16-methylen-prednisok>n-21-tert.-butylacetat: Fp. 231 bis 232⁰C, [a]² _o ⁰ +20° (Chloroform); X_max 240 nm, EJl 320;

^a-Fluor-lo-rnethylen-prednisolon^l-diäthylaminoacetat: Fp. 216 bis 217°C, [a]!,⁰ + 26,6° (Dioxan); X_max 240 nm, EJ* 320. Das Hydrochlorid dieses Esters schmilzt bei 235 bis" 236⁰C, [a]I⁰ +36,8° (Wasser), X_max 240 nm, E\°i 281;

9a - Fluor -16- methylen - prednisolon - 21 - önanthat: Fp. 231 bis 232° C; [a] S¹ +4,5° (Chloroform).

Beispiel 2

a) Nach den Beispielen 1 a) bis 1 c) wird 16-Methylen-Reichsteins-Substanz-S hergestellt.

b) Mikrobiologische 11/i-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 5% Malzextrakt, 1% Saccharose, 0,2% Natriumnitrat, 0,1% Dikaliumphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,05% Kaliumchlorid und 0,005% Eisen(II)-sulfat (pH eingestellt auf 7,0) mit 800 ml einer Schüttelkultur von Curvularia lunata (Wacker) Boadijn beimpft und unter Rühren und starker Belüftung bei 28° C bebrütet. Nach 24stündigem Wachstum werden 5 g 16-Methylen-Reichsteins-Substanz-S, gelöst in 40 ml Dimethylformamid, zugesetzt. Die Umsetzung wird papierchromatographisch verfolgt. Wenn im Papierchromatogramm kein Ausgangsmaterial mehr nachweisbar ist, wird die Kulturlösung dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft und der Rückstand zur Entfernung

der Begleitprodukte an Kieselgel chroraatographiert. Das mit Chloroform-Essigester (1: 3) erhaltene Eluat enthält das gewünschte 16-Methylen-hydrocortison (VII b), das daraus in üblicher Weise gewonnen wird. Fp. 224 bis 225° C, [α] ₀ + 69,2° (Dioxan), X_max 241 mn. E|*_ra 466. Nach weiterem Umkristallisieren aus Aceton schmilzt die Verbindung bei 232 bis 233° C.

c) Acetylierung

5 g 16-Methylen-hydrocortison (VIIb) werden mit 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene 16-Methylenhydrocortison-21-acetat (IXb) abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisieren aus Aceton. Fp. 217 bis 219⁰C.

d) Wasserabspaltung

1 g lo-Methylen-hydrocortison-^l-acetat (IXb) wird in 10 ml Pyridin mit 0,150 ml Thionylchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch anschließend für 15 Minuten auf 100⁰C erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Gemisch in 75 ml Wasser eingegossen, und die ausgefallenen Kristalle werden abgesaugt. Man erhält 16 - Methylen - 4,9(11) - pregnadien - 17a,21 - diol-3,20-dion-21-acetat (XI), das nach Umkristallisation aus Essigester bei 215 bis 217°C schmilzt, [α]?? +51° (Dioxan), X_max 238,5 nm, E}* 421.

e) Das erhaltene 16-Methylen-4,9(ll)-pregnadien-17ci,21-diol-3,20-dion-21-acetat(XI) wird, wie in den Beispielen 1 g) bis 1 J₁) beschrieben, in '9a-Fluormethylen-prednisolon (XVIII, R = H) umgewandelt.

Beispiel 3
a) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

In einem Kleinfermenter werden 15 1 einer Nährlösung aus 1% Hefeextrakt, pH 6,8, mit 0,5 1 Schüttelkultur von Bacillus sphaerieus beimpft. Die Kultur wächst unter ständigem Rühren und starker Belüftung bei 28° C und erhält nach etwa 10 Stunden einen Zusatz von 7,5 g 16-Methylen-Reichsteins-Substanz-S (V), hergestellt nach Beispiel 1 c), gelöst in 300 ml Methanol. Die Dehydrierung wird papierchromatographisch verfolgt (Lösungsmittelsystem B₄ nach Bush, aufsteigend) und ist nach 28 bis 36 Stunden vollständig. Die Kulturlösung wird dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert, die vereinigten Chloroformlösungen werden eingedampft. Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert. Man erhält reine l-Dehydro-16-methylen-Reichsteins-Substanz-S (VI), Fp. 222 bis 226°C, [α]?? -16° (Chloroform), X_max 244 nm, E}* 473.

b) Mikrobiologische lla-Hydroxylierung

In einem Kleinfermenter werden 151 einer Nährlösung aus 5% Glukose, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Natriumnitrat, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,001% Eisen(II)-sulfat und V₃₀ Mol Phosphatpuffer nach Sörensen (pH 5,6) mit 800ml Schüttelkultur von Penicilliüm sp. (Sammlung E. Merck Nr. 2168) beimpft. Die Kultur wächst unter Rühren und starker Belüftung und erhält nach 24 Stunden einen Zusatz von 5 g 1 -Dehydro-16 -methylen- Reichsteins -Substanz-S, gelöst in 40 ml Dimethylformamid. Die Hydroxylierung wird papierchromatographisch verfolgt. Nach Beendigung der Umsetzung wird, wie im Beispiel 3 a) angegeben, aufgearbeitet. Durch Umkristallisieren aus Aceton wird reines 16-Methylen-11-epi-prednisolon (Villa) erhalten.

c) Wasserabspaltung

Analog Beispiel If) wird aus 16-Methylen-ll-epiprednisolon (über das 21-Acetat und das 11-Tosylat-21 - acetat) das 16 - Methylen -1,4,9(11) - pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (XII) dargestellt.

d) Anlagerung von unterbromiger Säure

Analog Beispiel 1 g) wird aus 16 - Methylenl,4,9(ll)-pregnatrien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat das 9a - Brom -16 - methylen - prednisolon - 21 - acetat (XIV, X = Br) dargestellt.

e) Abspaltung von Bromwasserstoff

Analog Beispiel lh) wird aus 9a-Brom-16-methy-

len-prednisolon-21-acetat (XIV, X = Br) das 16-Methylen-9ß,l Iß - oxido -1,4 - pregnadien - 17a,21 - diol-3,20-dion-21-acetat (XVI) dargestellt. Fp. 216 bis 220°C, [a]f -13,3° (Dioxan), X_max 249 nm, E}*_m357.

f) Aufspaltung mit Fluorwasserstoff

Analog Beispiel Ii) wird aus 16-Methylen-9/?,ll/?-oxido-l,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion- 21-acetat (XVI) das 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-acetat (XVIII, R = Acetyl) dargestellt. Fp. 223 bis224°C,

, E!?_m379.

B e i s ρ i e 1 4 .

a) Mikrobiologische 1(2)-Dehydrierung

Analog Beispiel Ij₁) werden 7,5 g 16-Methylenhydrocortison (VlIb) durch Einwirkung von Bacillus sphaerieus zu 16-Methylen-prednisolon (VIIIb) dehydriert. Fp. 225 bis 226° C. Durch Umkristallisation aus Aceton erhöht sieh der Schmelzpunkt auf 233 bis 235° C; X_max 243 ηΐμ, ε = 15 900, [α] ₀ + 22° (Dioxan).

b) 21-Acetylierung

5 g 16-Methylen-prednisolon (VIIIb) werden in 30 ml Pyridin und 30 ml Essigsäureanhydrid 1 Stunde auf dem Dampfbad erwärmt. Das Gemisch wird in Wasser eingegossen und das ausgefallene 16-Methylen-prednisolon-21-acetat (Xb) abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Aceton, Fp. 219°C, [a]_D +30° (Dioxan).

c) Wasserabspaltung

Analog Beispiel 2d) wird 16-Methylen-prednisolon-21-aeetat (Xb) mit Thionylchlorid—Pyridin in 16-Methylen- l,4,9(ll)-pregnatrien-3,20-dion- 17a,21 -diol-21-acetat (XII) umgewandelt.

d) Das 16-Methylen-l,4,9(l l)-pregnatrien-3,20-dion-17a,21-diol-21-acetat (XII) wird, wie in den Beispielen 3d) bis 3f) besehrieben, in 9a-Fluor-16-methylenprednisolon-21-acetat (XVIII, R = Acetyl) umgewandelt. Fp. 223 bis 224° C, X_max 238 nm, E}1 379.

Beispiel 5

a) Analog Beispiel 2 c) werden 4 g 16-Methylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion (V) mit Essigsäureanhydrid und Pyridin behandelt. Nach üblicher Aufarbeitung wird lo-Methylen^-pregnen-Ha^l-diol-3,20-dion-21-acetat (V) erhalten. Fp. 160 bis 161⁰C, {__ay_D ⁰ +72° (Chloroform); X_max 240 nm, EJ* 424.

809 519/698

b) 1 !^-Hydroxylierung

Analog Beispiel 2 b) werden 5 g 16-Methylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (V) der Einwirkung einer Submerskultur von Curvularia lunata ausgesetzt. Das ölige Rohprodukt wird an Kieselgel chromatographiert, um entstandene Nebenprodukte, insbesondere durch Verseifung entstandenes VIIb. abzutrennen. Das mit Chloroform erhaltene Eluat enthält das gewünschte 16-Methylen-hydrocortison-21-acetat (Kb), das nach der Isolierung aus Aceton umkristallisiert wird. Fp. 216 bis 219°C.

c) Das erhaltene 16-Methylen-hydrocortison-21-acetat wird, wie in den Beispielen 2 d) und Ig) bis Ij₂) beschrieben, in 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-acetat (XVIII, R=Acetyl) umgewandelt. Fp. 219° C.

Beispiel 6 a) 1,2-Dehydrierung

Analog Beispiel Ij₂) werden 5 g 16-Methylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (V) mit Corynebacterium simplex beimpft. Das erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt und das Benzol-Chloroform-Eluat (1:1) im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird aus Aceton umkristallisiert und ergibt 16-Methylen-l,4-pregnadien-17a,21 - diol - 3,20 - dion - 21 - acetat (VI'). Fp. 189 bis 190⁰C, [α]? +2,6° (Dioxan), X_max 244 nm, E}· 392.

30 b) Mikrobiologische llß-Hydroxylierung

Analog Beispiel 2 b) werden 3 g 16-Methylenl,4-pregnadien-17a,21-diol-3,20-dion-21-acetat (VI') mit Curvularia lunata beimpft. Das ölige Rohprodukt wird durch Chromatographie an Kieselgel aufgetrennt, wobei das Chloroform-Essigester-Eluat (1:1) das 16-Methylen-prednisolon-21-acetat (Xb) enthält, das nach Isolierung aus Aceton umkristallisiert wird. Fp. 217 bis 219°C, [a]l° + 30° (Dioxan).

c) Das erhaltene 16-Methylen-prednisolon-21-acetat (Xb) wird, wie in den Beispielen 4 c) und 4d) beschrieben, in 9a - Fluor -16 - methylen - prednisolon-21-acetat (XVIII, R = Acetyl) umgewandelt. Fp. 223 bis 224° C.

Beispiel 7

45

a) Das nach Beispiel 2 b) hergestellte 16-Methylenhydrocortison (VIIb) wird in an sich üblicher Weise in folgende Ester (IXb) übergeführt:

16 - Methylen - hydrocortison - 21 - trimethylacetat, Fp. 195 bis 197°C;

16 - Methylen - hydrocortison - 21 - tert. - butylacetat, Fp. 196 bis 197⁰C, [α]!? +^T73° (Chloroform);' X_max 240 nm, EU 382.

b) Die nach Beispiel 7 a) erhaltenen Ester (IXb) werden analog den Beispielen 2d) und 2e) in die entsprechenden 9a-Fluorverbindungen übergeführt, wobei man 9a-Fluor-16-meth'ylen-prednisolon-21-trimethylacetat, Fp. 234 bis 235° C und 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21-tert.-butylacetat, Fp. 231 bis 232⁰C, [_a]² _D° + 20° (Chloroform); %_max 240nm, E¹Z 320 erhält.

B e i s ρ i e 1 8

' a) Das nach Beispiel 4 a) hergestellte 16-Methylenprednisolon (VIIIb) wird in an sich üblicher Weise verestert, wobei man die folgenden 21-Ester (Xb) erhält:

16 - Methylen - prednisolon - 21 - trimethylacetat, Fp. 224 bis 226°C, [a]f + 19° (Chloroform); X_max nm, EJ* 339;

16 - Methylen - prednisolon - 21 - tert. - butylacetat, Fp. 217 bis 218°C, [α]!? + 32° (Dioxan); X_max 242 nm, E₁ ¹* 344;

lo-Methylen-prednisolon^l-önanthat, Fp. 199 bis 200° C, [a] ²S +18° (Chloroform); X_max 242 nm, EJ*_m333;

lo-Methylen-prednisolon^l-p-tert.-butylbenzoat, Fp. 202 bis 204°C, [α]?? + 96° (Chloroform);

16 - Methylen - prednisolon - 21a - naphthylacetat, Fp. 238 bis 240⁰C, [α]ί,^α + 2,0 (Chloroform).

b) Die nach Beispiel 8 a) erhaltenen Ester (Xb) werden analog den Beispielen 4 c) und 4d) in die entsprechenden 9a-Fluorderivate übergeführt, wobei man die folgenden Verbindungen erhält:

9a - Fluor -16 - methylen - prednisolon - 21 - trimethylacetat, Fp. 234 bis 235°C;

^a-Fluor-lo-methylen-prednisolon^l-tert-butylacetat, Fp. 231 bis 232° C;

9a-Fluor-16-methylen-prednisolon-21 -önan that, Fp. 231 bis 232° C, [α] ff + 4,5° (Chloroform).

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von 9a-Fluor-16-methylen-prednisolon bzw. -21-estern der allgemeinen Formel A

   CH₂Y

   HO

   /OH F=CH,

   (Y = freie bzw. veresterte Hydroxylgruppe) dadurch gekennzeichnet, daß man 16/i-Methyl-16a,l 7a-oxido-5-pregnen-3/?-ol-20-on-3-acetat (I) durch Erwärmen mit katalytischen Mengen einer starken Säure, insbesondere einer Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure, in einem inerten Lösungsmittel, insbesondere Benzol, in 16-Methylen-5-pregnen-3/i, 17a-dipl-20-on-3-acetat (II) überführt, sodann in an sich bekannter Weise . diese Verbindung (II) mit mindestens 2 Moläquivalenten Brom umsetzt, das erhaltene 5,6,21-Tribrom -16 - methylen - pregnan - 3ß, 1 la - diol - 20 - on-3-acetat (III) durch aufeinanderfolgende Behandlung mit einem Jodid und einem Acetat,- insbesondere mit Natriumjodid und Kaliumacetat, in 16 - Methylen - 5 - pregnen - 3j?,17a,21 - triol - 20 - on-3,21-diacetat (IV) überführt, diesen Ester (IV) mit einer Kultur von Flavobacterium dehydrogenans oder einem daraus erhaltenen Enzym bebrütet, das erhaltene 16-Methylen-4-pregnen-17a,21-diol-3,20-dion (V) mikrobiologisch in Uo- oder Umstellung hydroxyliert, das erhaltene ll(a-bzw./?)-Hydroxy-steroid (VIIa) bzw. (VIIb) in 21 -Stellung acetyliert, das erhaltene 1 l(a- bzw. /J)-Hydroxy-21-acetat (Ka) bzw. (Kb) in 9,11-Stellung dehydratisiert, an die 9(1 Inständige Doppelbindung des gebildeten 9(1 l)-Dehydro-steroids (XI) HOBr bzw. HQCl addiert, das erhaltene

   9a-Brom- bzw. 9α - Chlor- lift- hydroxy -steroid (XIII) mit einem Alkaliacetat oder einer organischen Base behandelt, das gebildete 9/Ul/i-Oxidosteroid (XV) mit Fluorwasserstoff behandelt, das erhaltene 9a - Fluor -16 - methylen - 4 - pregnen-3,20-dion-ll/U7a,21-triol-21-acetat (XVII) durch Behandlung mit in 1(2)-Stellung dehydrierenden Mikroorganismen in 9 α-Fluor-16-methylen-prednisolon^l-acetatbzw^a-Fluor-lo-methylen-prednisolon umwandelt und letzteres gegebenenfalls in 21-Stellung verestert, oder daß man eine der verfahrensgemäß erhaltenen Zwischenverbindungen (V, Vila, VIIb, IXa, IXb, XI, XIII oder XV) nach an sich bekannten mikrobiologischen Me-

   thoden in 1(2)-Stellung dehydriert und das so erhaltene 1-Dehydro-derivat (VI, Villa, VIIIb, Xa, Xb, XII, XIV bzw. XVI) soweit erforderlich, in analoger Weise durch 11-Hydroxylierung und/oder 21-Acetylierung und/oder 9,11-Dehydratisierung und/oder HOBr- bzw. HOCl-Addition und/oder Dehydrohalogenierung und/oder Fluorwasserstoffaufspaltung in 9a-Fluor-16-methylenprednisolon-21-acetat umwandelt und daß man gegebenenfalls die 21-Hydroxygruppe der erhaltenen Verbindungen (V) bis (VIII) nach an sich bekannten Methoden verestert und gegebenenfalls die erhaltenen Ester analog den Verbindungen (V) bis (XVII) behandelt.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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