DE112009003576T5

DE112009003576T5 - Pflanzenwurzel-spezifische Nematodenresistenz

Info

Publication number: DE112009003576T5
Application number: DE112009003576T
Authority: DE
Inventors: Bonnie McCaig
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2008-12-11
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2012-09-06
Also published as: CA2744939A1; WO2010066600A1; ES2396412T3; CN102245776A; MX2011005773A; AR074589A1; EP2376635A1; EP2376635B1; BRPI0922513A2; US8536404B2; US20110247096A1; EP2527450A1

Abstract

Die Erfindung stellt Expressionsvektoren, die wurzelspezifische Promotoren in operativer Verknüpfung mit Polynukleotiden umfassen, welche in Synzytien von Nematoden-infizierten Pflanzen herunterreguliert sind, zur Verwendung in Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Nematodenbefall bereit. Die Erfindung stellt auch nematodenresistente transgene Pflanzen und Samen bereit, welche derartige Expressionsvektoren umfassen.

Description

Diese Patentanmeldung beansprucht den Prioritätsvorteil der am 11. Dezember 2008 eingereichten provisorischen U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 61/201,471, deren gesamter Inhalt hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität durch Verwendung von nematodenresistenten transgenen Pflanzen und Samen, und Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzen und Samen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nematoden sind mikroskopische Fadenwürmer, die sich von den Wurzeln, Blättern und Stengeln von mehr als 2000 Reihenkulturpflanzen, Gemüsen, Obstarten und Zierpflanzen ernähren, was einen geschätzten Nutzpflanzenverlust von 100 Milliarden US-Dollar weltweit verursacht. Eine Vielzahl an parasitischen Nematodenspezies infiziert Nutzpflanzen, wobei Wurzelgallennematoden (RKN bzw. Root-Knot-Nematoden), Zysten- und Läsions-bildende Nematoden eingeschlossen sind. Wurzelgallennematoden, welche durch die Hervorrufung von Wurzelgallenbildung an den Fraßstellen gekennzeichnet sind, besitzen ein relativ breites Wirtsspektrum und kommen deshalb parasitisch auf einer großen Zahl an Nutzpflanzenspezies vor. Die Zysten- und Läsions-bildenden Nematodenspezies besitzen ein eingeschränkteres Wirtsspektrum, aber verursachen dennoch erhebliche Verluste bei anfälligen Nutzpflanzen.
Parasitische Nematoden sind überall in den Vereinigten Staaten vorhanden, wobei die größten Konzentrationen in den warmen, humiden Regionen des Südens und Westens sowie in sandigen Böden auftreten. Der Sojabohnenzystennematode (Heterodera glycines), der bedeutendste Schädling von Sojabohnenpflanzen, wurde zuerst im Jahre 1954 in den Vereinigten Staaten in North Carolina entdeckt. Manche Gebiete sind so stark von dem Sojabohnenzystennematoden (SCN) befallen, dass die Sojabohnenproduktion ohne Bekämpfungsmaßnahmen wirtschaftlich nicht länger möglich ist. Obwohl Sojabohne die hauptsächliche wirtschaftliche Nutzpflanze ist, die von SCN angegriffen wird, parasitiert SCN auf insgesamt etwa fünfzig Wirten, einschließlich Feld-Nutzpflanzen, Gemüsen, Zierpflanzen und Unkräutern.
Anzeichen von Nematodenschaden beinhalten das Verkümmern und Gelbwerden der Blätter sowie das Verwelken der Pflanzen während Hitzeperioden. Nematodenbefall kann jedoch signifikante Ertragsverluste ohne jedwede offensichtlichen oberirdischen Erkrankungssymptome verursachen. Die primären Ursachen der Ertragsminderung beruhen auf unterirdischer Wurzelbeschädigung. Von SCN befallene Wurzeln sind zwergwüchsig oder verkümmert. Ein Nematodenbefall kann auch die Anzahl an Stickstoff-fixierenden Knöllchen auf den Wurzeln verringern und kann die Wurzeln anfälliger für Angriffe seitens anderer im Erdboden vorkommender Pflanzennematoden machen.
Der Nematoden-Lebenszyklus weist drei Hauptstufen auf: Ei, Jungtier und Adultstadium. Der Lebenszyklus variiert unter den Spezies der Nematoden. Der Lebenszyklus von SCN ist ähnlich zu den Lebenszyklen anderer pflanzenparasitischer Nematoden. Der SCN-Lebenszyklus kann üblicherweise bei Optimalbedingungen in 24 bis 30 Tagen abgeschlossen sein, wohingegen andere Spezies so lang wie ein Jahr oder mehr brauchen können, um den Lebenszyklus zu vollenden. Wenn im Frühling die Temperatur und die Feuchtigkeitsspiegel günstig werden, schlüpfen die wurmförmigen Jungtiere aus Eiern im Erdboden. Nur Nematoden im juvenilen Entwicklungsstadium sind in der Lage, Sojabohnenwurzeln zu infizieren.
Nach Eindringen in die Sojabohnenwurzeln bewegen sich die SCN-Jungtiere durch die Wurzel bis sie auf Gefäßgewebe stoßen, und an diesem Zeitpunkt beenden sie die Wanderung und beginnen zu fressen. Mit einem Stilett injiziert die Nematode Sekrete, welche bestimmte Wurzelzellen modifizieren und sie zu spezialisierten Fraßstellen umwandeln. Die Wurzelzellen werden morphologisch zu großen mehrkernigen Synzytien (oder im Fall von RKN zu Riesenzellen) umgewandelt, welche als eine Nährstoffquelle für die Nematoden verwendet werden. Somit stehlen die aktiv fressenden Nematoden der Pflanze essentielle Nährstoffe, was zu einem Ertragsverlust führt. Während weibliche Nematoden fressen, schwellen sie an und werden schließlich so groß, dass ihre Körper durch das Wurzelgewebe brechen und auf der Oberfläche der Wurzel freigelegt werden.
Nach einer Periode des Fressens wandern männliche SCN aus der Wurzel in den Erdboden und befruchten die vergrößerten adulten Weibchen. Danach sterben die Männchen, während die Weibchen an das Wurzelsystem angelagert bleiben und weiter fressen. Die Eier in den geschwollenen Weibchen beginnen sich zu entwickeln, anfänglich in einer Masse oder einem Eisack außerhalb des Körpers, und anschließend später innerhalb der Körperhöhle des Nematoden. Schließlich ist die gesamte Körperhöhle des adulten Weibchens mit Eiern gefüllt, und der Nematode stirbt. Es ist der mit Eiern gefüllte Körper des toten Weibchens, der als die Zyste bezeichnet wird. Die Zysten lösen sich schließlich ab und werden frei im Erdboden vorgefunden. Die Wände der Zyste werden sehr zäh, was einen hervorragenden Schutz für die ungefähr 200 bis 400 darin enthaltenen Eier bereitstellt. SCN-Eier überleben innerhalb der Zyste, bis geeignete Bedingungen für das Schlüpfen auftreten. Obwohl viele der Eier innerhalb des ersten Jahres zum Schlüpfen kommen können, werden viele ebenfalls innerhalb der schützenden Zysten mehrere Jahre lang überleben.
Ein Nematode kann sich aus eigener Kraft nur einige wenige Zoll pro Jahr durch das Erdreich bewegen. Allerdings kann sich der Nematodenbefall auf zahlreichen Wegen über erhebliche Distanzen ausbreiten. Alles, was das befallene Erdreich bewegen kann, ist zur Verbreitung des Befalls in der Lage, einschließlich Landwirtschaftsmaschinen, Fahrzeugen und Werkzeugen, Wind, Wasser, Tieren und Landarbeitern. Häufig kontaminieren samengroße Teilchen des Erdreichs das geerntete Saatgut. Folglich kann der Nematodenbefall ausgebreitet werden, wenn kontaminierte Samen von befallenen Feldern in nicht-befallenen Feldern eingepflanzt werden. Es gibt sogar Beweise, dass bestimmte Nematodenspezies von Vögeln verbreitet werden können. Nur einige dieser Ursachen können verhindert werden.
Zu herkömmlichen Praktiken zum Umgang mit Nematodenbefall zählen:
Aufrechthalten geeigneter Spiegel der Boden-Nährstoffe und des Boden-pH-Werts auf von Nematoden befallenem Land; Bekämpfen von anderen Pflanzenerkrankungen sowie Insekten- und Unkraut-Schädlingen; Anwenden von Sanierungspraktiken, wie Pflügen, Bepflanzen und Kultivieren von nematodenbefallenen Feldern nur nach der Bearbeitung von nicht-befallenen Feldern; gründliche Reinigung von Gerätschaften mit Hochdruck-Wasser oder -Dampf nach Arbeiten auf befallenen Feldern; Nicht-Gebrauch von auf befallenem Land herangezogenem Saatgut für das Bepflanzen von nicht-befallenen Feldern, es sei denn, das Saatgut ist geeignet gereinigt worden; Fruchtwechsel bei befallenen Feldern und Abwechseln von Wirtsnutzpflanzen mit Nicht-Wirtsnutzpflanzen; Anwendung von Nematiziden; und Anpflanzen resistenter Pflanzenvarietäten.
Es sind Verfahren zur genetischen Transformation von Pflanzen vorgeschlagen worden, um eine erhöhte Resistenz gegen pflanzenparasitische Nematoden herbeizuführen. Zum Beispiel beinhalten zahlreiche Vorgehensweisen die Transformation von Pflanzen mit doppelsträngiger RNA, die zum Inhibieren essentieller Nematodengene in der Lage ist. Bei anderen landwirtschaftlichen Biotechnologie-Vorgehensweisen wird vorgeschlagen, Gene überzuexprimieren, welche Proteine codieren, die für Nematoden toxisch sind. Die U.S.-Patente Nr. 5 589 622 und 5 824 876 richten sich auf die Identifizierung von Pflanzengenen, die spezifisch in oder nahe der Fraßstelle der Pflanze nach der Anlagerung durch den Nematoden exprimiert werden.
US 2009/0089896 offenbart einen Promotor eines Mtn21-like-Gens, das in Synzytien von SCN-infizierter Sojabohne induziert wird. WO 2008/077892 offenbart einen Promotor eines Peroxidase-like-Gens, das in Synzytien von SCN-infizierter Sojabohne induziert wird. WO 2008/071726 offenbart einen Promotor eines Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase-like-Gens, das in Synzytien von SCN-infizierter Sojabohne induziert wird. WO 2008/095887 offenbart einen Promotor eines Mtn3-like-Gens, das in Synzytien von SCN-infizierter Sojabohne induziert wird. WO 2008/095888 offenbart den Promotor eines At5g12170-like-Gens, das in Synzytien von SCN-infizierter Sojabohne induziert wird.
Eine Anzahl von Patentveröffentlichungen offenbart in prophetischer Weise und beansprucht generisch bzw. allgemein transgene Pflanzen, die ein oder mehrere beliebige von tausenden Pflanzengenen umfassen und verbesserte landwirtschaftliche Merkmale aufweisen. Beispiele solcher Veröffentlichungen schließen US2004/0031072 , US2006/0107345 , US2004/0034888 , US2004/0019927 , US2004/0045049 , US2004/0019927 , US2006/0272060 , WO2005/5112608 , US2006/0150283 und US2007/0214517 ein. Pathogenresistenz, einschließlich Nematodenresistenz, wird als ein potentiell verbessertes landwirtschaftliches Merkmal der in diesen Veröffentlichungen beschriebenen transgenen Pflanzen offenbart. Allerdings bringt keine dieser Veröffentlichungen irgendein offenbartes Gen spezifisch mit verbesserter Nematodenresistenz in transgenen Pflanzen, die das Gen enthalten, in Verbindung.
Serin-Arginin-reiche (SR-reiche) Proteine sind Schlüsselregulatoren der pflanzlichen Genexpression, wobei verschiedene Genfamilien-Mitglieder zum konstitutiven Spleißen von RNA, zum Export aus dem Zellkern, zur Aufrechthaltung von mRNA-Stabilität und zur Proteintranslation beitragen. SR-Proteine sind auch beim alternativen RNA-Spleißen beteiligt, wobei sie spezifische RNA-Sequenzen binden und die Bildung von Spliceosom-Komplexen an schwachen Spleißstellen steuern. ”SR-reiche” Genfamilien sind in Pflanzen mäßig vertreten, wobei sich diverse Untergruppen in ungefähr fünf Motiv-basierte Kategorien einteilen lassen.
Das ”Avr9-elicited 111B-like”-Gen ist ein Transkriptionsfaktor mit Sequenzhomologie zu 111B ACRE (”Avr9/Cf-9 rapidly elicited”) aus Mcotiana tabacum und DREB1A/CBF3 aus Arabidopsis. In Tabak ist das 111B ACRE-Gen ein mit Pathogenese zusammenhängender Transkriptionsaktivator, der in das Cf-9-Resistenzgen exprimierenden Linien als Reaktion auf durch Cladosporium fulvum, einen biotrophen Pilz, exprimiertes Avr9 rasch induziert wird. In anderen Spezies sind CBF3/DREB1-Gene bei der Aktivierung der abiotischen Stressantwort beteiligt. Das U.S.-Pat. Nr. 7 345 217 offenbart die SEQ ID NR.: 1408, ein ”Avr9-elicited 111Blike”-Gen, das angeblich ein Homolog einer als G912 bezeichneten Arabidopsis thaliana-DNA ist. Das U.S.-Pat. Nr. 7 345 217 offenbart generisch zahlreiche Kategorien potentieller Anwendungszwecke für die tausenden darin offenbarten Gene, und eine dieser Kategorien wird als Krankheitsresistenz, einschließlich Nematodenresistenz, identifiziert. Jedoch sind die einzigen in U.S.-Pat. Nr. 7 345 217 für G912 und dessen Homologe vorgeschlagenen spezifischen Anwendungszwecke verbesserte Toleranzen gegenüber Kälte-, Frost-, Dürre- und Salzstress.
Basische Helix-Loop-Helix(bHLH) und Dehydration-Responsives-Element-Bindungs(DREB)-Transkriptionsfaktoren sind ebenfalls regulatorische Schlüsselmoleküle in Pflanzen. Die physiologischen Funktionen mancher bHLH-Gene sind in Pflanzen experimentell aufgezeigt worden. Von den R- und TT8-Genen ist bekannt, dass sie die Anthocyanin-Akkumulation in Mais und Arabidapsis regulieren, und andere bHLH-Gene interagieren mit Phytochrom und regulieren die Lichtantwort. Andere bHLH-Gene regulieren die Hormon-Signalleitung. Die physiologische Rolle der meisten pflanzlichen bHLH-Gene ist jedoch unbekannt, und es besteht wenig Sequenzkonservierung zwischen bHLH-Genfamilien-Mitgliedern außerhalb der KernbHLH-Signaturdomäne.
Dirigent-like-Proteine gehören zu einer großen vielfältigen Genfamilie, die in allen größeren bis heute analysierten Landpflanzengruppen gefunden wird. Dirigentcodierende Gene lassen sich in 5 phylogenetische Subfamilien, Dir-A bis Dir-E, einordnen. Von der Dir-A-Subfamilie wurde gezeigt, dass sie im Zusammenspiel mit Phenoloxidasen den stereospezifischen Zusammenbau von Ligninen (Zellwand-Komponenten) und Lignanen (pflanzliche Antioxidantien und Abwehrverbindungen) in einer Reihe von Pflanzenspezies steuert. Die Expression von PsDIR1, einem Dir-A-Gen aus Pisum sativa, vermittelt Resistenz gegenüber mehreren pilzlichen Pathogenen in transgenem Canola. Dir-A-Subfamiliengene werden durch eine breite Vielzahl an Stressformen, wie mechanischer Verwundung, Herbivorie und Pilzinfektion, induziert. Die spezifischen biochemischen Funktionen von Genen aus den Subgruppen Dir-B-, Dir-C-, Dir-D- und Dir-E(Dir-like)-Proteine sind nicht so gut charakterisiert, obwohl man von Genen aus der Dir-C-Subfamilie gezeigt hat, dass sie durch Jasmonsäurebehandlung, Salicylsäure und Fraß durch avirulente Hessenfliegenlarven induziert werden.
Bislang wurde keine genetisch modifizierte Pflanze, die ein Transgen umfasst, das zur Herbeiführung von Nematodenresistenz in der Lage ist, in irgendeiner Nation dereglementiert. Folglich besteht fortgesetzt ein Bedarf daran, sichere und wirksame Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung pflanzenparasitischer Nematoden mit Hilfe der landwirtschaftlichen Biotechnologie zu identifizieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben festgestellt, dass die Expression eines Transgens, das ein Serin-Arginin-reiches Protein, AVR9-elicited_111B-like-Protein, ein bHLH-Protein oder ein Dirigent-like-Protein codierendes Polynukleotid umfasst, in Wurzeln Sojabohnenpflanzen resistent gegen SCN-Infektion machen kann. Folglich stellt die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen und Samen sowie Verfahren zur Überwindung oder wenigstens Abschwächung eines Nematodenbefalls wertvoller landwirtschaftlicher Nutzpflanzen bereit.
In einer Ausführungsform sieht die Erfindung einen isolierten Expressionsvektor vor, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; b) einem Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein codiert; c) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und d) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist.
In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer nematodenresistenten transgenen Pflanze vor, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines rekombinanten Expressionsvektors, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus:

i) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; ii) einem Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein codiert; iii) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und iv) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist; b) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem rekombinanten Expressionsvektor; c) Regenerieren transgener Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und d) Selektieren transgener Pflanzen, welche erhöhte Resistenz gegen pflanzenparasitische Nematodeninfektion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, die den rekombinanten Expressionsvektor nicht umfassen, zeigen.

In noch einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung eine nematodenresistente transgene Pflanze vor, die einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus:

a) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; b) einem Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein codiert; c) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und d) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist.

In einer anderen Ausführungsform sieht die Erfindung einen Samen vor, welcher sortenecht hinsichtlich eines Transgens ist, das einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus:

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1a–1b zeigen die Tabelle von SEQ ID NR., welche entsprechenden Genen und Promotoren zugeordnet sind. Die SEQ ID NR. 1, 37, 39 und 49 entsprechen den G. max-Vollängen-Nukleotidsequenzen für Polynukleotide, welche Serin/Arginin-reiches Protein (SEQ ID NR.: 1), Avr9-elicited 111b-Protein (SEQ ID NR.: 37), bHLH-Protein (SEQ ID NR.: 39) bzw. Dirigent-like-Protein (SEQ ID NR.: 49) codieren. Synzytien-induzierte Promotorsequenzen sind in SEQ ID NR.: 57 (TPP-like-Promotor aus A. thaliana), SEQ ID NR.: 58 (MtN3-like-Promotor aus G. max) und SEQ ID NR.: 59 (Promotor aus dem Genort At5g12170 von A. thaliana) angegeben. Der als PcUbi4-2 bezeichnete konstitutive Ubiquitinpromotor aus P. crispum ist in SEQ ID NR.: 60 angegeben.
Die 2a–2c zeigen ein Aminosäurealignment von exemplarischen Serin/Arginin-reichen Proteinen, das mit Hilfe der Vector NTI-Softwaresuite v10.3.0 (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) durchgeführt wurde.
Die 3 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Basischen-Helix-loop-Helix-Proteinen, das mit Hilfe der Vector NTI-Softwaresuite v10.3.0 (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwert = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) durchgeführt wurde.
Die 4 zeigt ein Aminosäurealignment von exemplarischen Dirigent-like-Proteinen, das mit Hilfe der Vector NTI-Softwaresuite v10.3.0 (Lückenöffnungs-Strafwert = 10, Lückenerweiterungs-Strafwerk = 0,05, Lückentrennungs-Strafwert = 8) durchgeführt wurde.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung kann durch Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die hierin eingeschlossenen Beispiele leichter verstanden werden. Überall in dieser Patentanmeldung wird auf verschiedene Veröffentlichungen Bezug genommen. Die Offenbarungen von allen diesen Veröffentlichungen, und diejenigen Bezugsstellen, die innerhalb dieser Veröffentlichungen zitiert werden, sind in ihrer jeweiligen Gesamtheit hiermit durch den Bezug darauf in diese Patentanmeldung einbezogen, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, den diese Erfindung betrifft. Die hierin verwendete Terminologie dient lediglich dem Zwecke der Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen und ist nicht als einschränkend beabsichtigt. Wie hierin verwendet, kann ”ein” oder ”eine” abhängig vom Zusammenhang, in dem es verwendet wird, eines oder mehrere bedeuten. So kann die Bezugnahme auf ”eine Zelle” zum Beispiel bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann. Wie hierin verwendet, bedeutet das Wort ”oder” ein beliebiges Mitglied einer bestimmten Liste und schließt auch jedwede Kombination von Mitgliedern dieser Liste ein.
Wie hierin definiert, ist eine ”transgene Pflanze” eine Pflanze, welche mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie so verändert worden ist, dass sie eine isolierte Nukleinsäure enthält, welche ansonsten nicht in der Pflanze vorhanden wäre. Wie hierin verwendet, schließt der Begriff ”Pflanze” eine gesamte Pflanze, Pflanzenzellen und Pflanzenteile ein. Pflanzenteile schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Stengel, Wurzeln, Samenanlagen, Staubblätter, Blätter, Embryonen, meristematische Regionen, Callusgewebe, Gametophyten, Sporophyten, Pollen, Mikrosporen und dergleichen ein. Die transgene Pflanze der Erfindung kann männlich-steril oder männlich-fruchtbar sein und kann ferner andere Transgene als diejenigen einschließen, welche die hierin beschriebenen isolierten Polynukleotide umfassen.
Wie hierin definiert, sind der Begriff ”Nukleinsäure” und ”Polynukleotid” austauschbar und beziehen sich auf RNA oder DNA, welche linear oder verzweigt, einzel- oder doppelsträngig, oder ein Hybrid davon ist. Der Begriff umfasst ebenfalls RNA/DNA-Hybride. Ein ”isoliertes” Nukleinsäuremolekül ist ein solches, das von anderen Nukleinsäuremolekülen, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind (d. h. Sequenzen, die andere Polypeptide codieren), im Wesentlichen getrennt ist. Zum Beispiel wird eine klonierte Nukleinsäure als isoliert angesehen. Eine Nukleinsäure wird ebenfalls als isoliert angesehen, wenn sie durch menschlichen Eingriff verändert oder an einem Locus oder einem Ort platziert worden ist, bei dem es sich nicht um ihre natürliche Stelle handelt, oder wenn sie durch Transformation in eine Zelle eingebracht worden ist. Darüber hinaus kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, frei von manchem des sonstigen zellulären Materials, mit dem es von Natur aus assoziiert ist, oder von Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder sonstigen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird, vorliegen. Obgleich es gegebenenfalls sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der codierenden Region eines Gens lokalisierte untranslatierte Sequenz beinhalten kann, kann es bevorzugt sein, die Sequenzen, welche von Natur aus die codierene Region in ihrem natürlich vorkommenden Replikon flankieren, zu entfernen.
Der Begriff ”Gen” wird im breiten Sinne verwendet, um auf ein beliebiges Segment von Nukleinsäure, das mit einer biologischen Funktion in Zusammenhang steht, Bezug zu nehmen. So schließen Gene Introns und Exons, wie etwa in einer genomischen Sequenz, oder nur die codierenen Sequenzen, wie in cDNAs, und/oder die für ihre Expression erforderlichen regulatorischen Sequenzen ein. Zum Beispiel bezieht sich Gen auf ein Nukleinsäurefragment, welches mRNA oder funktionelle RNA exprimiert, oder ein spezifisches Protein codiert, und welches regulatorische Sequenzen einschließt.
Die Begriffe ”Polypeptid” und ”Protein” werden hierin austauschbar verwendet, um auf ein Polymer von aufeinanderfolgenden Aminosäureresten Bezug zu nehmen.
Die Begriffe ”funktionsfähig verbunden” und ”in operativer Verknüpfung mit” sind austauschbar und bezeichen, wie hierin verwendet, die Assoziation von isolierten Polynukleotiden auf einem einzelnen Nukleinsäurefragment, so dass die Funktion eines isolierten Polynukleotids durch das andere isolierte Polynukleotid beeinflusst wird. Zum Beispiel sagt man, dass eine regulatorische DNA mit einer DNA, die eine RNA exprimiert oder ein Polypeptid codiert, ”funktionsfähig verbunden” ist, wenn die zwei DNAs so gelegen sind, dass die regulatorische DNA die Expression der codierenden DNA beeinflusst.
Der Begriff ”Promotor”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche, wenn sie an eine Nukleotidsequenz von Interesse ligiert ist, zur Steuerung der Transkription der Nukleotidsequenz von Interesse zu mRNA in der Lage ist. Ein Promotor ist typischerweise, obwohl nicht notwendigerweise, 5' (z. B. stromaufwärts) von einem Nukleotid von Interesse (z. B. proximal zur Transkriptionsstartstelle eines Strukturgens), dessen Transkription zu mRNA er steuert, lokalisiert und sieht eine Stelle für die spezifische Bindung durch RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren für die Initiation der Transkription vor.
Der Begriff ”Transkriptions-regulatorisches Element”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Polynukleotid, das zum Regulieren der Transkription eines funktionsfähig verbundenen Polynukleotids in der Lage ist. Er schließt, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Promotoren, Enhancer, Introns, 5'-UTRs und 3'-UTRs ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Vektor” auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transportieren einer anderen Nukleinsäure, an die es verknüpft worden ist, in der Lage ist. Ein Typ von Vektor ist ein ”Plasmid”, was eine kreisförmige doppelsträngige DNA-Schleife bezeichnet, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. In der vorliegenden Beschreibung können ”Plasmid” und ”Vektor” austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors ist. Ein Vektor kann ein binärer Vektor oder eine T-DNA sein, welche die linke Border und die rechte Border umfasst, und kann ein Gen von Interesse dazwischen umfassen. Der Begriff ”Expressionsvektor” ist austauschbar mit dem Begriff ”Transgen”, wie hierin verwendet, und bedeutet einen Vektor, der zum Lenken der Expression eines bestimmten Nukleotids in einer passenden Wirtszelle in der Lage ist. Die Expression des Nukleotids kann eine Überexpression sein. Ein Expressionsvektor umfasst ein regulatorisches Nukleinsäureelement, das funktionsfähig an eine Nukleinsäure von Interesse verknüpft ist, die – wahlfrei – funktionsfähig an ein Terminationssignal und/oder anderes regulatorisches Element verknüpft ist.
Der Begriff ”Homologe”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Gen, das mit einem zweiten Gen durch Abstammung von einer gemeinsamen anzestralen DNA-Sequenz verwandt ist. Der Begriff ”Homologe” kann auf die Beziehung zwischen Genen, die durch das Ereignis der Speziation getrennt wurden (z. B. Orthologe), oder auf die Beziehung zwischen Genen, die durch das Ereignis der genetischen Duplikation getrennt wurden (z. B. Paraloge), zutreffen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Orthologe” auf Gene aus unterschiedlichen Spezies, die sich durch Speziation aber aus einem gemeinsamen anzestralen Gen evolviert haben. Orthologe behalten im Lauf der Evolution dieselbe Funktion bei. Orthologe codieren Proteins mit den gleichen oder ähnlichen Funktionen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff ”Paraloge” auf Gene, welche durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge weisen in der Regel unterschiedliche Funktionen oder neue Funktionen auf, aber diese Funktionen können verwandt sein.
Der Begriff ”konservierte Region” oder ”konservierte Domäne”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Region in heterologen Polynukleotid- oder Polypeptidsequenzen, in der ein relativ hoher Grad an Sequenzidentität zwischen den verschiedenen Sequenzen besteht. Die ”konservierte Region” kann zum Beispiel aus dem Mehrfach-Sequenzalignment mit Hilfe des Clustal W-Algorithmus identifiziert werden.
Der Begriff ”Zelle” oder ”Pflanzenzelle”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine einzelne Zelle und schließt ebenfalls eine Population von Zellen ein. Die Population kann eine reine Population sein, welche einen Zelltyp umfasst. Ebenso kann die Population mehr als einen Zelltyp umfassen. Eine Pflanzenzelle innerhalb der Bedeutung der Erfindung kann isoliert (z. B. in Suspensionskultur) oder in einem Pflanzengewebe, Pflanzenorgan oder einer Pflanze bei einem beliebigen Entwicklungsstadium enthalten sein.
Der Begriff ”sortenecht”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenvarietät bezüglich einer bestimmten Eigenschaft, wenn sie zu dem Ausmaß genetisch homozygot hinsichtlich dieser Eigenschaft ist, dass wenn die sortenechte Varietät selbst-bestäubt wird, eine signifikante Menge an unabhängiger Segregation der Eigenschaft unter den Nachkommen nicht beobachtet wird.
Der Begriff ”Nullsegregant”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Nachkommen (oder aus den Nachkommen abgeleitete Linien) einer transgenen Pflanze, welcher das Transgen aufgrund Mendel'scher Segregation nicht enthält.
Der Begriff ”Wildtyp”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenzelle, einen Samen, eine Pflanzenkomponente, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan, oder eine ganze Pflanze, welche(r/s) nicht genetisch modifiziert oder in einem experimentellen Sinn behandelt worden ist.
Der Begriff ”Kontrollpflanze”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Pflanzenzelle, ein Explantat, einen Samen, eine Pflanzenkomponente, ein Pflanzengewebe, ein Pflanzenorgan oder eine ganze Pflanze, die zum Vergleich gegenüber einer transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze zum Zweck der Identifizierung eines gesteigerten Phänotyps oder eines wünschenswerten Merkmals in der transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze verwendet wird. Eine ”Kontrollpflanze” kann in manchen Fällen eine transgene Pflanzenlinie sein, welche ein(en) Leer-Vektor oder -Markergen umfasst, aber nicht das rekombinante Polynukleotid von Interesse enthält, das in der transgenen oder genetisch modifizierten Pflanze, die ausgewertet wird, vorhanden ist. Eine Kontrollpflanze kann eine Pflanze von der gleichen Linie oder Varietät wie die transgene oder genetisch modifizierte Pflanze, die getestet wird, sein, oder bei ihr kann es sich um eine andere Linie oder Varietät handeln, wie etwa um eine Pflanze, die bekanntermaßen einen spezifischen Phänotyp, ein Charakteristikum oder einen bekannten Genotyp aufweist. Eine geeignete Kontrollpflanze schließt eine genetisch unveränderte oder nicht-transgene Pflanze der hierin zur Erzeugung einer transgenen Pflanze verwendeten parentalen Linie ein.
Der Begriff ”Synzytien-Stelle”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fraßstelle, welche in Pflanzenwurzeln nach Nematodenbefall gebildet wird. Die Stelle wird als eine Quelle von Nährstoffen für die Nematoden verwendet. Ein Synzytium ist die Fraßstelle für Zysten-Nematoden, und Riesenzellen sind die Fraßstellen von Wurzelgallen-Nematoden.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung einen isolierten Expressionsvektor bereit, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; b) einem Polynukleotid, das ein AVR9-eliceted_111B-like-Protein codiert; c) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und d) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist.
Jedweder wurzelspezifische Promotor kann im Expressionsvektor der Erfindung verwendet werden. Exemplarische wurzelspezifische Promotoren schließen, ohne Einschränkung darauf, den Promotor, der aus dem Mais-Nicotianamin-Synthase-Gen abgeleitet ist ( US 20030131377 ), und den Reis-RCC3-Promotor ( US 11/075,113 ) ein. Von besonderer Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung sind wurzelspezifische Promotoren, die in Nematoden-Fraßstellen (d. h. Synzytien) induziert werden. Vorzugsweise können der in WO 2008/095887 offenbarte nematodeninduzierbare Mtn3-like-Promotor, der in US 2009/0089896 offenbarte nematodeninduzierbare Mtn21-like-Promotor, der in WO 2008/077892 offenbarte nematodeninduzierbare Peroxidase-like-Promotor, der in WO 2008/071726 offenbarte nematodeninduzierbare Trehalose-6-Phosphat-Phosphatase-like-Promotor und der in WO 2008/095888 offenbarte nematodeninduzierbare At5g12170-like-Promotor, im Expressionsvektor der Erfindung nematodeninduzierbar verwendet werden.
Jedwedes Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert, kann in dem isolierten Expressionsvektor der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise codiert das Polynukleotid ein Serin-Arginin-reiches Protein, das aus der Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 253 von SEQ ID NR.: 2 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 249 von SEQ ID NR.: 4 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 247 von SEQ ID NR.: 6 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 249 von SEQ ID NR.: 8 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 249 von SEQ ID NR.: 10 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 245 von SEQ ID NR.: 12 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 240 von SEQ ID NR.: 14 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 261 von SEQ ID NR.: 16 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 280 von SEQ ID NR.: 18 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 248 von SEQ ID NR.: 20 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 252 von SEQ ID NR.: 22 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 265 von SEQ ID NR.: 24 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 263 von SEQ ID NR.: 26 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 220 von SEQ ID NR.: 28 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 220 von SEQ ID NR.: 30 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 263 von SEQ ID NR.: 32 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 218 von SEQ ID NR.: 34 umfasst; und einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 245 von SEQ ID NR.: 36 umfasst, gewählt ist. Stärker bevorzugt codiert das Polynukleotid ein Serin-Argininreiches Protein, das die Aminosäuren 1 bis 253 von SEQ ID NR.: 2 umfasst.
Jedwedes Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-Protein codiert, kann in dem isolierten Expressionsvektor der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das AVR9-elicited_111B-Protein die Aminosäuren 1 bis 226 von SEQ ID NR.: 38.
Jedwedes Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert, kann in dem isolierten Expressionsvektor der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise wird das basische Helix-Loop-Helix-Protein aus der Gruppe gewählt, die aus einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 231 von SEQ ID NR.: 40 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 226 von SEQ ID NR.: 42 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 232 von SEQ ID NR.: 44 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 233 von SEQ ID NR.: 46 umfasst; und einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 260 von SEQ ID NR.: 48 umfasst, besteht. Stärker bevorzugt umfasst das basische Helix-Loop-Helix-Protein die Aminosäuren 1 bis 231 von SEQ ID NR.: 40.
Jedwedes Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, kann in dem isolierten Expressionsvektor der Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise wird das Dirigent-like-Protein aus der Gruppe gewählt, die aus einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NR.: 50 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NR.: 52 umfasst; einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 189 von SEQ ID NR.: 54 umfasst; und einem Polypeptid, das die Aminosäuren 1 bis 189 von SEQ ID NR.: 56 umfasst, besteht. Stärker bevorzugt umfasst das Dirigent-like-Protein die Aminosäuren 1 bis 191 von SEQ ID NR.: 50.
In einer anderen Ausführungsform wird der isolierte Expressionsvektor der Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung einer nematodenresistenten transgenen Pflanze verwendet, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen des oben beschriebenen rekombinanten Expressionsvektors; b) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem rekombinanten Expressionsvektor; c) Regenerieren transgener Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und d) Selektieren transgener Pflanzen, welche erhöhte Resistenz gegenüber pflanzenparasitischer Nematodeninfektion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, die den rekombinanten Expressionsvektor nicht umfassen, zeigen.

Eine Vielzahl von Verfahren zur Einbringung von Polynukleotiden in das Genom von Pflanzen und für die Regenerierung von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen ist bekannt, zum Beispiel in Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und Wu R, Academic Press, 15–38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer; Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128–143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br. Med. Bull. 56(1): 62–73.
Transformations-Verfahren können direkte und indirekte Verfahren der Transformation einschließen. Geeignete direkte Verfahren schließen Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, Liposom-vermittelte Transformation ( US 4 536 475 ), Biolistik-Verfahren unter Einsatz der Genkanone (Fromm ME et al., Bio/Technology. 8(9): 833-9, 1990; Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2: 603, 1990), Elektroporation, Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltiger Lösung und Mikroinjektion ein. Im Falle dieser direkten Transformationsverfahren müssen die verwendeten Plasmide keinen besonderen Anforderungen genügen. Einfache Plasmide, wie diejenigen der pUC-Serie, pBR322, M13mp-Serie, pACYC184 und dergleichen können zur Verwendung kommen. Wenn intakte Pflanze aus den transformierten Zellen regeneriert werden sollen, befindet sich vorzugsweise ein zusätzliches selektierbares Markergen auf dem Plasmid. Die Techniken zur direkten Transformation sind für dikotyle und monokotyle Pflanzen gleichermaßen geeignet.
Die Transformation kann ebenfalls durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium (zum Beispiel EP 0 116 718 ), virale Infektion mittels viraler Vektoren ( EP 0 067 553 ; US 4 407 956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161 ) oder mittels Pollen ( EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4 684 611 ) durchgeführt werden. Auf Agrobacterium basierende Transformationstechniken (speziell für dikotyle Pflanzen) sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Der Agrobacterium-Stamm (z. B. Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes) umfasst ein Plasmid (Ti- oder Ri-Plasmid) und ein T-DNA-Element, das nachfolgend an die Infektion mit Agrobacterium in die Pflanze übertragen wird. Die T-DNA (transferierte DNA) wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert. Die T-DNA kann auf dem Ri- oder Ti-Plasmid lokalisiert sein oder ist getrennt davon in einem sogenannten binären Vektor enthalten. Verfahren für die Agrobacterium-vermittelte Transformation sind, zum Beispiel, in Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229, beschrieben. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist zum Beispiel in White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 128–143; Potrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Molec. Biol. 42: 205–225, beschrieben.
Die hierin beschriebenen Nukleotide können direkt in das Plastidengenom transformiert werden. Die Plastidenexpression, bei der Gene durch homologe Rekombination in die mehreren tausend Kopien des zirkulären Plastidengenoms, die in jeder Pflanzenzelle vorhanden sind, inseriert werden, zieht einen Nutzen aus dem Vorteil der enormen Kopienzahl gegenüber nukleär exprimierten Genen, wodurch hohe Expressionsspiegel erlaubt werden. In einer Ausführungsform werden die Nukleotide in einen Plastiden-Targetingvektor inseriert und in das Plastidengenom eines gewünschten Pflanzenwirts transformiert. Pflanzen, die homoplasmisch hinsichtlich Plastidengenomen sind, welche die Nukleotidsequenzen enthalten, werden erhalten und sind präferentiell zu einer hohen Expression der Nukleotide in der Lage. Die Plastidentransformations-Technologie ist zum Beispiel umfangreich in den U.S.-Pat. Nr. 5 451 513 , 5 545 817 , 5 545 818 und 5 877 462 in WO 95/16783 und WO 97/32977 , sowie in McBride et al. (1994) PNAS 91, 7301–7305, beschrieben.
Das oben beschriebene Verfahren erzeugt eine andere Ausführungsform der Erfindung, nämlich eine nematodenresistente transgene Pflanze, die einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; b) einem Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein codiert; c) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und d) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist. Die transgenen Pflanzen der Erfindung können verwendet werden, um den Befall einer Nutzpflanze durch einen pflanzenparasitischen Nematoden zu bekämpfen.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Pflanzenzüchtung bereit, z. B. um eine gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze herzustellen. Die transgenen Pflanzen der Erfindung können mit gleichartigen transgenen Pflanzen oder mit transgenen Pflanzen, denen die Nukleinsäuren der Erfindung fehlen, oder mit nicht-transgenen Pflanzen unter Anwendung bekannter Verfahren zur Pflanzenzüchtung gekreuzt werden, um Samen herzustellen. Ferner kann die transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung eine andere transgene Pflanze abdecken und/oder damit gekreuzt werden, welche eine oder mehrere Nukleinsäuren umfasst, wodurch ein ”Stapel” von Transgenen in der Pflanze und/oder ihren Nachkommen erzeugt wird. Der Samen wird dann angepflanzt, wodurch man eine gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze erhält, die den Expressionsvektor der Erfindung umfasst. Die gekreuzte fruchtbare transgene Pflanze kann den Expressionsvektor von einem weiblichen Elternteil oder von einem männlichen Elternteil geerbt haben. Die zweite Pflanze kann eine Inzucht-Pflanze sein. Die gekreuzte fruchtbare Transgene kann ein Hybrid sein.
”Gen-Stacking” kann auch durch Überführen von zwei oder mehr Genen mittels Pflanzentransformation in den Zellkern bewerkstelligt werden. Mehrere Gene können während der Transformation entweder sequentiell oder gleichzeitig in den Zellkern eingeführt werden. Gemäß der Erfindung können mehrere Gene, welche Serin-Arginin-reiche-, AVR9-elicited_111B-like-, bHLH- und Dirigent-like-Proteine codieren, ”gestapelt” werden, um eine gesteigerte Nematodenresistenz vorzusehen. Diese gestapelten Kombinationen können durch ein beliebiges Verfahren erzeugt werden, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, Kreuzen von Pflanzen durch herkömmliche Verfahren oder durch genetische Transformation. Wenn die Merkmale durch genetische Transformation gestapelt werden, können die Gene für Serin-Arginin-reiche-, AVR9-elicited_111B-like-, bHLH- und Dirigent-like-Proteine in beliebiger Weise kombiniert werden. Wenn zum Beispiel zwei Gene eingeführt werden sollen, können die zwei Sequenzen in separaten Transformationskassetten oder auf der gleichen Transformationskassette enthalten sein. Die Expression der Sequenzen kann vom selben oder unterschiedlichen Promotoren angetrieben werden.
Die oben beschriebenen transgenen Pflanzen bringen noch eine andere Ausführungsform der Erfindung hervor, nämlich einen Samen, welcher sortenecht hinsichtlich eines Transgens ist, das einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Polynukleotid, das ein Serin-Arginin-reiches Protein codiert; b) einem Polynukleotid, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein codiert; c) einem Polynukleotid, das ein basisches Helix-Loop-Helix-Protein codiert; und d) einem Polynukleotid, das ein Dirigent-like-Protein codiert, gewählt ist. Die transgenen Samen der Erfindung können verwendet werden, um den Befall einer Nutzpflanze durch einen pflanzenparasitischen Nematoden zu bekämpfen.
Nutzpflanzen und entsprechende parasitische Nematoden sind in ”Index of Plant Diseases in the United States” (U.S. Dept. of Agriculture, Handbuch Nr. 165, 1960); "Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America" (Society of Nematologists, 1985); sowie "Fungi an Plants and Plant Products in the United States" (American Phytopathological Society, 1989) aufgelistet. Zum Beispiel schließen pflanzenparasitische Nematoden, auf die die vorliegende Erfindung abzielt, ohne Einschränkung darauf, Zysten-Nematoden und Wurzelgallen-Nematoden ein. Spezifische pflanzenparasitische Nematoden, auf welche die vorliegende Erfindung abzielt, schließen, ohne Einschränkung darauf, Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globodera pallida, G. rostochiensis oder Globodera tabacum, Meloidogyne incognita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. naasi, M. exigua, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus, Radopholus similis, Radopholus citrophilus, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus vulnus, Paratylenchus curvitatus, Paratylenchus zeae, Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Paratrichodorus minor, Paratrichodorus christiei; Anguina tritici, Bidera avenae, Subanguina radicicola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Tylenchulus semipenetrans, Hemicycilophora arenaria, Rhadinaphelenchus cocophilus, Belonolaimus longicaudatus, Trichodorus primitivus, Nacobbus aberrans, Aphelenchoides besseyi, Hemicriconemoides kanayaensis, Tylenchorhynchus claytoni, Xiphinema americanum, Cacopaurus pestis, Heterodera zeae, Heterodera filipjevi und dergleichen ein.
Pflanzen, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung nematodenresistent gemacht werden können, schließen monokotyle Pflanzen und dikotyle Pflanzen ein. Zu den in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellten nematodenresistenten Pflanzen zählen, ohne Einschränkung darauf, Mais, Weizen, Reis, Gerste, Hafer, Roggen, Sorghum, Banane und Raygras. Die Pflanze kann aus einer Gattung stammen, die aus der Gruppe bestehend aus Erbse, Alfalfa, Sojabohne, Karrotte, Selerie, Tomate, Kartoffel, Baumwolle, Tabak, Pfeffer bzw. Paprika, Ölsamenraps, Bete bzw. Rübe, Kohl, Blumenkohl, Broccoli, Kopfsalat, A. thaliana, und dergleichen gewählt ist.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche keinesfalls zur Auferlegung von Einschränkungen auf den Umfang derselben interpretiert werden sollen.
Beispiel 1: Vektorkonstruktion
Unter Anwendung eines Bioinformatik-Vorgehens wurden vier Sojabohne-Gene, TA52573_3847 (SEQ ID NR.: 3), AVR9-elicited_111B (SEQ ID NR.: 37), GmbHLH_47172355 (SEQ ID NR.: 39) und GmDirigent_59580836 (SEQ ID NR.: 49), als in Synzytien von SCN-infizierten Sojabohnewurzeln, im Vergleich zu nicht-infiziertem Wurzelgewebe, herunterreguliert identifiziert. Wie hierin beschrieben, codiert das als TA52573_3847 SEQ ID NR.: 3 bezeichnete Gen ein Serin-Argininreiches Protein. Das in den isolierten, nachstehend beschriebenen Expressionsvektoren verwendete ”GmSerin-Arginin-reich”-Gen (SEQ ID NR.: 1) codiert ein Protein mit 93% Sequenzidentität zu TA52573_3847 (SEQ ID NR.: 3).

Der konstitutive Ubiquitinpromotor aus Petersilie ( WO 2003/102198 ; SEQ ID NR.: 60, genannt PcUbi4), der nematoden-induzierbare MtN3-like-Promotor aus Sojabohne ( WO 2008/095887 , SEQ ID NR.: 58), der nematoden-induzierbare TPP-like-Promotor aus Arabidopsis ( WO 2008/071726 , SEQ ID NR.: 57) und der konstitutive Super-Promotor (siehe US 5 955 646 ) wurden verwendet, um die in der nachstehenden Tabelle 1 beschriebenen Konstrukte herzustellen. Tabelle 1

Vektor-Name	Promotor	Gen-Name	SEQ ID NR.: der Gene
RBM024	PcUbi4	GmSerin-Arginin-reich	SEQ ID NR.: 1
RBM036	MtN3-like	GmSerin-Arginin-reich	SEQ ID NR.: 1
RBM019	PcUbi4	AVR9-elicited_111B	SEQ ID NR.: 37
RBM031	MtN3-like	AVR9-elicited_111B	SEQ ID NR.: 37
RTP1124	Super	AVR9-elicited_111B	SEQ ID NR.: 37
RTP1125	TPP-like	AVR9-elicited_111B	SEQ ID NR.: 37
RTP1126	PcUbi4	GmbHLH_47172355	SEQ ID NR.: 39
RTP1127	MtN3-like	GmbHLH_47172355	SEQ ID NR.: 39
RTP1086	PcUbi4	GmDirigent_59580836	SEQ ID NR.: 49
RTP1090	MtN3-like	GmDirigent_59580836	SEQ ID NR.: 49

Die Expressionsvektoren umfassten außerdem die mutierte Form des in WO 2008/124495 beschriebenen Acetohydroxysäure-Synthase(AHAS)-Selektionsgens, das Resistenz gegen das Herbizid ARSENAL (Imazapyr, BASF Corporation, Mount Olive, NJ) verleiht. Die Expression von AHAS2 wurde durch den Petersilie-Ubiquitin-Promotor (SEQ ID NR.: 60) angetrieben.
Beispiel 2: Nematoden-Bioassay
Ein Bioassay zur Auswertung der Nematodenresistenz, die durch die hierin beschriebenen Polynukleotide vermittelt wird, wurde mit Hilfe eines bewurzelten Pflanzen-Testsystems durchgeführt, das in der gleichzeitig anhängigen, in gemeinschaftlichem Besitz befindlichen, USSN 12/001,234 offenbart ist. Transgene Wurzeln werden nach Transformation mit den in Beispiel 1 beschriebenen binären Vektoren erzeugt. Mehrere transgene Wurzellinien werden subkultiviert und mit Oberflächen-dekontaminierten Rasse-3-SCN-Jungtieren des zweiten Stadiums (J2) beim Spiegel von etwa 500 J2/Nertiefung inokuliert. Vier Wochen nach der Nematoden-Inokulation wird die Zystenzahl in jeder Vertiefung gezählt. Für jedes Transformationskonstrukt wird die Anzahl an Zysten pro Linie berechnet, um die durchschnittliche Zystenzahl und den Standardfehler für das Konstrukt zu bestimmen. Die Zystenzahl-Werte für jedes Transformationkonstrukt werden mit den Zystenzahl-Werten einer parallel getesteten Leer-Vektorkontrolle verglichen, um zu ermitteln, ob das getestete Konstrukt zu einer Verringerung in der Zystenzahl führt. Bewurzelte Explantatkulturen, die mit den Vektoren RBM024, RBM036, RBM019, RBM031, RTP1124, RTP1125, RTP1126, RTP1127 und RTP1090 transformiert waren, zeigten einen allgemeinen Trend zu verringerten Zysten-Anzahlen und Weibchen-Index im Vergleich zur bekannten anfälligen Varietät Williams82. Transgene Wurzeln, welche das durch den konstitutiven PcUbi4-Promotor regulierte GmDirigent_59580836-Gen exprimieren (Vektor RTP1086), zeigten keine verringerten Zystenzahlen im Vergleich zu Kontrolllinien. Einige Wurzellinien, die das GmSerin-Arginin-reich-Gen mit dem PcUbi4-Promotor konstitutiv exprimieren, entwickelten dunkelbraune Flecken. Die Lage von dunkelbraunen Flecken variierte unter den transgenen Wurzellinien, wobei sie in einigen Fällen auf verstreute einzelne Zellen oder Seitenwurzel-Austrittszonen beschränkt waren, oder sich vollständig entlang der Länge von älteren Wurzeln erstreckten. Transgene Wurzeln, welche das durch den konstitutiven PcUbi4-Promotor (RBM019) oder den konstitutiven Super-Promotor (RTP1124) regulierte AVR9-elicited_111B-Gen überexprimieren, entwickelten dickere und kürzere Wurzeln und verringerte Zahlen an Seitenwurzeln im Vergleich zu Kontrolllinien.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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WO 2008/095888 [0012, 0047]
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Claims

Verfahren zur Herstellung einer nematodenresistenten transgenen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines rekombinanten Expressionsvektors, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein, welches die Aminosäuren 1 bis 226 von SEQ ID NR: 38 umfasst, codiert; b) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem rekombinanten Expressionsvektor; e) Regenerieren transgener Pflanzen aus der transformierten Pflanzenzelle; und d) Selektieren transgener Pflanzen, welche erhöhte Resistenz gegenüber pflanzenparasitischer Nematodeninfektion im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, die den rekombinanten Expressionsvektor nicht umfassen, zeigen.
Nematodenresistente transgene Pflanze, die einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das ein Serin-Arginin-reiches Protein, welches die Aminosäuren 1 bis 226 von SEQ ID NR: 38 umfasst, codiert.
Samen, welcher sortenecht hinsichtlich eines Transgens ist, das einen rekombinanten Expressionsvektor umfasst, der einen wurzelspezifischen Promotor in operativer Verknüpfung mit einem Polynukleotid umfasst, das ein AVR9-elicited_111B-like-Protein, welches die Aminosäuren 1 bis 226 von SEQ ID NR: 38 umfasst, codiert;