DE112008003430T5

DE112008003430T5 - Oberflächenplasmonenresonanz benutzendes Fluoreszenzmikroskop

Info

Publication number: DE112008003430T5
Application number: DE112008003430T
Authority: DE
Inventors: Hyeon Bong Pyo; Moon Youn Jung; Seon Hee Park
Original assignee: Electronics and Telecommunications Research Institute ETRI
Current assignee: Electronics and Telecommunications Research Institute ETRI
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2008-06-04
Publication date: 2010-10-07
Also published as: WO2009078511A1; KR20090064917A

Abstract

Oberflächenplasmonenresonanz benutzendes Fluoreszenzmikroskop, umfassend:
eine Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht, zur Bereitstellung von monochromatischem Licht in einer transversalen magnetischen Mode mit einer Wellenlänge, die mit einer Absorptionswellenlänge eines bestimmten Fluorophors übereinstimmt;
einen Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor zum Anregen von Oberflächenplasmonenresonanz mittels des monochromatischen Lichts, um ein Fluoreszenzsignal des bestimmten Fluorophors zu verstärken, der an einer Probe angebracht ist, die sich in einem Plasmonen-evaneszenten Feld befindet; und
einen ersten Lichtdetektor zum Detektieren des im Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor verstärkten Fluoreszenzsignals, um Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe zu ermöglichen.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Oberflächenplasmonenresonanz (Surface plasmon Resonance; SPR) benutzendes Fluoreszenzmikroskop, zum Maximieren eines Fluoreszenzsignals einer Bioprobe, die mit einem Fluorophor markiert ist, unter Benutzung von SPR, um Verfolgung der Bioprobe zu ermöglichen.
Die Erfindung wurde unterstützt durch das ITR&D-Programm von MIC/IITA [2006-S-007-02, Ubiquitous Health Monitoring Module and System Development].
Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht
Fluoreszenzmikroskope machen von dem Prinzip Gebrauch, dass ein Fluorophor Fluoreszenzlicht emittiert, wenn es Licht mit einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Fluoreszenzmikroskop bezieht sich auf Vorrichtungen zum Behandeln einer Probe mit Fluorophoren (fluoreszierenden Farbstoffen) und dann Einstrahlen von Licht mit einer Absorptionswellenlänge der Fluorophore in die Probe, um Verfolgung der Probe auf Grund der Licht emittierenden Fluorophore zu ermöglichen. Fluoreszenzmikroskope werden hauptsächlich benutzt, um biologische Objekte zu untersuchen.
1 ist eine Prinzipskizze, die einen Aufbau eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops veranschaulicht.
Unter Bezugnahme auf 1 enthält das Fluoreszenzmikroskop ein erstes Lichtfilter 11, eine Objektivlinse 12, einen dichroitischen Spiegel 13, ein zweites Lichtfilter 14, eine Lichtempfangseinheit 15 und eine Platte 16. Das erste Lichtfilter 11 filtert monochromatisches Licht 10a, das mit einer Absorptionswellenlänge eines Fluorophors übereinstimmt, der an einer auf der Platte 16 platzierten Probe 17 angebracht ist, aus weißem Licht 10. Der dichroitische Spiegel 13 selektiert das gefilterte monochromatische Licht 10a mit der Absorptionswellenlänge. Die Objektivlinse 12 strahlt das monochromatische Licht 10a in die Probe 17 ein. Das zweite Lichtfilter 14 filtert Licht, das mit einer Emissionswellenlänge des Fluorophors der Probe 17 übereinstimmt, aus Licht 10b, das von dem Fluorophor der Probe 17 erzeugt wird und durch die Objektivlinse 12 und den dichroitischen Spiegel 13 hindurchgeht. Das zweite Lichtfilter 14 führt das gefilterte Licht mit der Emissionswellenlänge der Lichtempfangseinheit 15 zu.
Die Lichtempfangseinheit 15 wird mittels einer Okularlinse oder eines ladungsgekoppelten Bauelements (CCD) realisiert. Die Lichtempfangseinheit 15 detektiert das empfangene Licht mit der Emissionswellenlänge des an der Probe 17 angebrachten Fluorophors und zeigt es an und ermöglicht Beobachtungen einer Fluoreszenzintensität der Probe 17.
SPR-Sensoren sind Sensoren, die SPR benutzen, die auftritt, wenn in einer transversalen magnetischen Mode (TM-Mode) polarisiertes Licht unter einem Winkel, der eine SPR-Bedingung erfüllt, auf einem dünnen Metallfilm einfällt.
Die Energie des einfallenden Lichts wird unter einer SPR-Bedingung, dass ein Wellenvektor einer auf dem dünnen Metallfilm einfallenden Lichtquelle mit jenem der Oberflächenplasmonen zusammenpasst, in einer Oberflächenplasmonenmode nahezu absorbiert. Als Folge wird daher die Intensität des die Totalreflexion an einer Metalloberfläche erfahrenden Lichts minimiert. Die SPR-Bedingung ändert sich auf Grund einer winzigen Änderung eines Brechungsindex von dielektrischen Materialien auf der Metalloberfläche. Durch Messung der Änderung der SPR-Bedingung kann biochemische Interaktion quantitativ analysiert werden. Die SPR-Sensoren gehören bekanntlich zu einem der typischen nichtmarkierenden Biosensorverfahren, die biomolekulare Interaktion ohne Marken wie z. B. Fluorophore messen können.
Prinzipaufbauten der SPR-Sensoren werden unter Bezugnahme auf 2 bis 4 beschrieben.
Unter Bezugnahme auf 2 bis 4 enthalten SPR-Biosensoren jeweils im Allgemeinen Prismen 21a, 21b und 21c, flache transparente dielektrische Substrate 22, dünne Metallfilme 23, Polarisatoren 25a, 25b und 25c und Lichtempfangseinheiten 26a, 26b und 26c. Die SPR-Biosensoren dafür eingerichtet, von Lichtquellen 24a, 24b und 24c erzeugtes polarisiertes Licht mittels der Polarisatoren 25a, 25b und 25c in einer TM-Mode zu polarisieren, dann das TM-polarisierte Licht durch die Prismen 21a, 21b und 21c auf den dünnen Metallfilmen 23 einfallen zu lassen und dann Licht, das von den dünnen Metallfilmen 23 reflektiert und zu den Prismen 21a, 21b und 21c emittiert wird, mittels der Lichtempfangseinheiten 26a, 26b und 26c zu detektieren.
Durch die Prismen 21a, 21b und 21c einfallendes Licht induziert SPR an den dünnen Metallfilmen 23. Durch auf den Oberflächen des dünnen Metallfilms 23 absorbierte Proben 20 verursachte Änderungen der effektiven Brechungsindizes oder effektiven Dicke werden gemessen, indem Änderungen der SPR-Bedingungen durch die Analyse des in den Lichtempfangseinheiten 26a, 26b und 26c detektierten reflektierten Lichts detektiert werden.
Im Detail bewegt der SPR-Biosensor von 2 die Lichtquelle 24a unter Benutzung eines Bewegungs-Controllers (nicht gezeigt) und ändert einen Einfallswinkel von mittels des Polarisators 25a in TM-Mode polarisiertem, von der Lichtquelle 24a erzeugtem monochromatischem Licht und lässt das in TM-Mode polarisierte Licht auf dem Prisma 21a einfallen. Dadurch misst der SPR-Biosensor von 2 eine durch eine Änderung eines effektiven Brechungsindex oder einer effektiven Dicke der Probe 20 auf dem dünnen Metallfilm 23 verursachte Änderung des SPR-Winkels.
Der SPR-Biosensor von 3 fixiert einen Einfallswinkel des von der Lichtquelle 24b erzeugten monochromatischen Lichts, während das einfallende Licht in Form einer zweidimensionalen Ebene ausgedehnt wird, um eine zweidimensionale Lichtempfangseinheit wie z. B. eine CCD zu benutzen. Dadurch beschreibt der SPR-Biosensor von 3 mittels einer relativen Grauwertdifferenz eine an jedem Punkt (Pixel) auf dem dünnen Metallfilm 23 auftretende Änderung des effektiven Brechungsindex oder der effektiven Dicke der Probe 20. Im Allgemeinen wird der SPR-Biosensor in Form eines Mehrkanal-Sensorsystems angewendet.
Der SPR-Biosensor von 4 steuert einen Brennpunkt des von der Lichtquelle 24c erzeugten monochromatischen Lichts unter Benutzung einer Linse 27, so dass das einfallende Licht in allen Richtungen zur Oberfläche des Prismas 21c senkrecht sein kann. Wie der SPR-Biosensor von 2 misst der SPR-Biosensor von 4 mittels einer Änderung des SPR-Winkels eine Änderung eines effektiven Brechungsindex oder einer effektiven Dicke der Probe 20 auf dem dünnen Metallfilm 23.
Bei den konventionellen SPR-Biosensoren werden die dünnen Metallfilme 23 nicht direkt auf Reflexionsflächen der Prismen 21a, 21b und 21c ausgebildet, sondern auf den flach ausgeführten transparenten dielektrischen Substraten 22 wie z. B. einem Objektträgerglas oder einem Mikroskop-Deckglas mit denselben Brechungsindizes wie die Prismen 21a, 21b und 21c, um eine selbstzusammengebaute Monoschicht (Self-Assembled Monolayer; SAM) auf einer Sensoroberfläche auszubilden oder anderweitige biochemische Behandlung zu erleichtern und auch um die Prismen 21a, 21b und 21c wiederholt zu benutzen. Danach wird Index-anpassendes Öl zwischen die flachen transparenten dielektrischen Substrate 22 und die Prismen 21a, 21b und 21c eingebracht.
Das konventionelle Fluoreszenzmikroskop kann jedoch optisches Hintergrundrauschen verursachen, da Licht mit einer Emissionswellenlänge und Licht mit einer Absorptionswellenlänge, welche von einem dichroitischen Spiegel durchgelassen oder reflektiert werden, eines an einer Probe angebrachten Fluorophors denselben Lichtweg haben. Daher besteht der Nachteil, dass Beseitigung des optischen Hintergrundrauschens sehr von der Leistung des Lichtfilters abhängt, das das Licht mit der Emissionswellenlänge oder das Licht mit der Absorptionswellenlänge filtert.
Um dies zu verbessern, müssen die Wege des der Probe zugeführten Lichts mit der Absorptionswellenlänge und des Lichts mit der Emissionswellenlänge vollständig getrennt werden.
Offenbarung der Erfindung
Technisches Problem
Die vorliegende Erfindung wurde gemacht, um die vorerwähnten Probleme mit dem Stand der Technik zu lösen, und daher stellt die vorliegende Erfindung ein SPR benutzendes Fluoreszenzmikroskop zur Verbesserung eines Rauschabstands (Signal to Noise Ratio; SNR) durch Trennung der Lichtwege von Licht mit einer Absorptionswellenlänge eines Fluorophors und von Licht mit einer Emissionswellenlänge des Fluorophors bereit.
Technische Lösung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) benutzendes Fluoreszenzmikroskop bereitgestellt. Das Mikroskop enthält eine Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht, einen SPR-Sensor und einen ersten Lichtdetektor. Die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht stellt in einer transversalen magnetischen Mode (TM-Mode) monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge bereit, die mit einer Absorptionswellenlänge eines bestimmten Fluorophors übereinstimmt, der an einer Probe angebracht ist, die sich in einem Plasmonen-evaneszenten Feld befindet. Der SPR-Sensor regt Oberflächenplasmonen mittels des monochromatischen Lichts an, um ein Fluoreszenzsignal des bestimmten Fluorophors zu verstärken. Der erste Lichtdetektor detektiert das im SPR-Sensor verstärkte Fluoreszenzsignal, um Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe zu ermöglichen.
Das Mikroskop kann weiterhin einen zweiten Lichtdetektor zum Detektieren des vom SPR-Sensor totalreflektierten monochromatischen Lichts in TM-Mode enthalten, um Verfolgung einer SPR-Bedingung des SPR-Sensors zu ermöglichen.
Die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht kann eine Lichtquelle zur Erzeugung von Licht, ein erstes Lichtfilter und einen Polarisator enthalten. Das erste Lichtfilter lässt nur das monochromatische Licht mit der Wellenlänge, die mit der Absorptionswellenlänge des bestimmten Fluorophors übereinstimmt, unter dem von der Lichtquelle erzeugten Licht durch. Der Polarisator wandelt das vom ersten Lichtfilter durchgelassene monochromatische Licht in TM-Mode-Licht um.
Der SPR-Sensor kann ein flaches transparentes dielektrisches Substrat, einen dünnen Metallfilm, ein Prisma und eine Abstandsschicht enthalten. Der dünne Metallfilm ist oben auf dem flachen transparenten dielektrischen Substrat ausgebildet und unterstützt Oberflächenplasmonen. Das Prisma ist an einer Unterseite des flachen transparenten dielektrischen Substrats ausgebildet und lässt das monochromatische Licht in transversaler magnetischer Mode, das von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht einer Einfallsebene des Prismas zugeführt wird und mit der Absorptionswellenlänge des Fluorophors übereinstimmt, auf dem dünnen Metallfilm einfallen, um die Oberflächenplasmonenresonanz anzuregen, und emittiert das von dem dünnen Metallfilm reflektierte Licht in eine Emissionsebene. Die Abstandsschicht ist in einer vorbestimmten Dicke auf dem dünnen Metallfilm ausgebildet, hält mittels der Dicke einen minimalen Abstand zwischen dem an der Probe angebrachten Fluorophor und dem dünnen Metallfilm aufrecht und verhindert strahlungslose Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem dünnen Metallfilm.
Der erste Lichtdetektor kann ein zweites Lichtfilter und eine Lichtempfangseinheit enthalten. Das zweite Lichtfilter ist auf dem SPR-Sensor angeordnet und lässt nur monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge, die mit einer Emissionswellenlänge des bestimmten Fluorophors übereinstimmt, unter dem von dem SPR-Sensor einfallenden Licht durch. Die Lichtempfangseinheit empfängt das durch das zweite Lichtfilter durchgelassene Licht mit der Emissionswellenlänge und ermöglicht Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe.
Vorteilhafte Wirkungen
Wie oben dargelegt, hat ein Fluoreszenzmikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung die hervorragende Wirkung, ein Fluoreszenzsignal eines Fluorophors unter Benutzung des in einem SPR-Sensor induzierten Plasmonen-evaneszenten Feldes zu verstärken und eine Absorptionswellenlänge des Fluorophors von einem Beobachtungspunkt unter Benutzung der Totalreflexion (Total Internal Reflection; TIR) vollständig zu trennen, wodurch das SNR sehr verbessert wird.
Außerdem hat das Fluoreszenzmikroskop die hervorragende Wirkung, dass es durch SNR-Verbesserung eine hohe Empfindlichkeit und ein kleines Hintergrundsignal verglichen mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop erwarten lässt, und bildet ein miniaturisiertes Fluoreszenzmikroskop, das an die Eigenschaften eines bestimmten Fluorophors angepasst ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Prinzipskizze, die einen Aufbau eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops veranschaulicht;
2 bis 4 sind Prinzipskizzen, die Aufbauten von konventionellen SPR-Sensoren veranschaulichen;
5 ist eine Prinzipskizze, die einen Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;
6 ist ein Graph, der Absorptions- und Emissionsspektren eines zum Detektieren von Biomolekülen allgemein benutzten Fluorophors zeigt; und
7 und 8 sind Skizzen, die verschiedene Beispiele von SPR-Sensoren veranschaulichen, die für ein Fluoreszenzmikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
Beste Art zur Ausführung der Erfindung
Es folgt eine Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen. In der folgenden Beschreibung werden bekannte Funktionen oder Aufbauten nicht im Detail beschrieben, da sie die Erfindung mit unnötigen Details in den Schatten stellen würden.
Man beachte, dass überall in den Zeichnungen gleiche Bezugszeichen benutzt werden, um dieselben oder ähnliche Elemente, Merkmale und Strukturen darzustellen.
Überall in der Beschreibung umfasst 'ein Teil mit einem anderen Teil verbinden' nicht nur 'direktes Verbinden', sondern auch 'indirektes Verbinden' mit einem anderen, dazwischen liegenden Element. 'Irgendein Element enthaltend' bezeichnet nicht, ein anderes Element auszuschließen, sondern ein anderes Element zusätzlich einschließen zu können, wenn nicht anders angegeben.
5 ist eine Prinzipskizze, die einen Aufbau eines Fluoreszenzmikroskops gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht Unter Bezugnahme auf 5 enthält das Fluoreszenzmikroskop eine Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31, einen SPR-Sensor 32 und einen ersten Lichtdetektor 33. Die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 stellt monochromatisches Licht (nachfolgend als ”Absorptionswellenlängenlicht” bezeichnet) mit einer Wellenlänge, die mit einer Absorptionswellenlänge eines bestimmten Fluorophors übereinstimmt, in einer transversalen magnetischen Mode (TM-Mode) bereit. Der SPR-Sensor 32 regt Oberflächenplasmonen infolge des von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 in der TM-Mode bereitgestellten Absorptionswellenlängenlichts an und verstärkt ein Fluoreszenzsignal des bestimmten Fluorophors in dem Plasmonen-evaneszenten Feld. Der erste Lichtdetektor 33 detektiert das verstärkte Fluoreszenzsignal und ermöglicht Beobachtungen der Fluoreszenzintensität einer Probe 30. Das Fluoreszenzmikroskop kann weiterhin einen zweiten Lichtdetektor 34 zum Detektieren des die Totalreflexion im SPR-Sensor 32 erfahrenden TM-Mode-Absorptionswellenlängenlichts enthalten, um Verfolgung einer SPR-Bedingung des SPR-Sensors 32 zu ermöglichen.
Im Detail enthält die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 eine Lichtquelle 311, ein erstes Lichtfilter 312 und einen Polarisator 313. Das erste Lichtfilter 312 lässt das Absorptionswellenlängenlicht des bestimmten Fluorophors unter dem von der Lichtquelle 311 erzeugten Licht durch. Der Polarisator 313 wandelt durch das erste Lichtfilter 312 durchgelassene Absorptionswellenlängenlicht in TM-Mode-Licht um. Die Lichtquelle 311 kann realisiert werden mittels einer Quelle für monochromatisches Licht oder einer Weißlichtquelle, einschließlich einer Wolfram-Halogen-Lampe (Quarz-Wolfram-Halogen(QTH)-Lampe), eines Lasers und einer Leuchtdiode (LED). Außerdem kann die Lichtquelle 311 Lichtquellen mehrerer Typen benutzen, wie z. B. eine Punktlichtquelle, eine ausgedehnte Parallellichtquelle und eine keilförmige Lichtquelle.
Die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 kann nach Bedarf weiterhin eine oder mehrere Linsen enthalten (eine Kugellinse oder eine Zylinderlinse) (nicht gezeigt), die hinter dem Polarisator 313 angeordnet sind. Die eine oder mehreren Linsen wandeln das TM-Mode-Absorptionswellenlängenlicht in zweidimensionales ausgedehntes paralleles Licht um. Das Absorptionswellenlängenlicht fällt in Form von zweidimensionalem parallelem Licht auf dem SPR-Sensor 32 ein.
Das Absorptionswellenlängenlicht von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 fällt hier unter einem SPR-Winkel des SPR-Sensors 32 auf dem SPR-Sensor 32 ein.
Somit induziert das unter dem SPR-Winkel einfallende Absorptionswellenlängenlicht von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 eine SPR-Anregung im SPR-Sensor 32.
Es wird ein Detailaufbau des SPR-Sensors 32 beschrieben. Der SPR-Sensor 32 enthält ein Prisma 321, ein flaches transparentes dielektrisches Substrat 322, einen dünnen Metallfilm 323 und eine Abstandsschicht 324.
Durch Optikkopplungswirkung lässt das Prisma 321 Absorptionswellenlängenlicht, welches unter dem SPR-Winkel von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 durch eine Einfallsebene einfällt, zu einer Grenzfläche zwischen dem flachen transparenten dielektrischen Substrat 322 und dem dünnen Metallfilm 323 hindurchgehen und emittiert das Absorptionswellenlängenlicht, das die Totalreflexion an der Grenzfläche erfährt, in eine Emissionsebene. Im Detail ist es wünschenswert, das Prisma 321 dreieckförmig auszubilden.
Das flache transparente dielektrische Substrat 322 liegt unter dem dünnen Metallfilm 323 und hat an seiner Unterseite mit einer Oberfläche des dreieckförmigen Prismas 321 Kontakt.
Das Prisma 321 und das flache transparente dielektrische Substrat 322 können entweder durch ein Index-anpassendes Öl usw. gekoppelt werden oder können in einem gleichen Körper, z. B. transparentem Kunststoff mit hohem Brechungsindex, ausgebildet sein. Der Fall der einstückigen Ausbildung wird später im Detail beschrieben.
Da der dünne Metallfilm 323 aus Metall hergestellt ist, das Oberflächenplasmonen unterstützt, tritt durch das unter dem SPR-Winkel einfallende monochromatische Licht SPR auf. Im Detail ist der dünne Metallfilm 323 aus Metall gebildet, das eine negative Dielektrizitätskonstante bei einer Dicke von Dutzenden Nanometern (nm) hat, wie z. B. Gold (Au), Silber (Ag), Kupfer (Cu) und Aluminium (Al). Von diesen Metallen werden im Allgemeinen Silber (Ag), das den schärfsten SPR-Peak zeigt, und Gold (Au) mit hervorragender Oberflächenstabilität benutzt.
Die Abstandsschicht 324 dient dazu, strahlungslose Energieübertragung von dem Fluorophor 303 zu dem dünnen Metallfilm 323 zu verhindern, die auftreten kann, wenn der an der Probe 30 angebrachte Fluorophor 303 näher an den dünnen Metallfilm 323 herankommt als wenn sie in einer bestimmten Distanz von ungefähr 10 nm sind.
5 zeigt zum Beispiel ein Sandwich-Immunoassay-Verfahren. In 5 wird ein Detektor-Antikörper 302 in die Probe 30 injiziert. Der Detektor-Antikörper 302, welcher mit einem Fluorophor 303 konjugiert ist, kann an ein Antigen 304 gebunden werden, das ein Zielmolekül ist, dessen Konzentration zu bestimmen ist. Ein Fang-Antikörper 301 ist oben auf der Abstandsschicht 324 des SPR-Sensors 32 immobilisiert. Der Fang-Antikörper 301 kann an ein Antigen 304 gebunden werden, das das Zielmolekül ist, dessen Konzentration zu bestimmen ist. Somit findet wegen einer Bioreaktion zwischen Antikörper und Antigen eine Kopplung von Fang-Antikörper 301 – Antigen 304 – Detektor-Antikörper 302 – Fluorophor 303 an einer Oberfläche der Abstandsschicht 324 statt.
Hinsichtlich der Bioreaktion dient die Abstandsschicht 324 dazu, den Fluorophor 303 und den dünnen Metallfilm 323 zu trennen, so dass sie sich nicht näher als eine vorbestimmte Distanz kommen.
Dementsprechend wird die Abstandsschicht 324 aus einem dielektrischen Medium in einer vorbestimmten Dicke ausgebildet, um die minimale Abstandsdistanz zwischen dem Fluorophor 303 und dem dünnen Metallfilm 323 bereitzustellen. Es ist wünschenswert, dass die Abstandsschicht 324 so angelegt ist, dass sie eine Dicke innerhalb eines Bereichs hat, um strahlungslose Energieübertragung des Fluoreszenzsignals zu verhindern, während das Fluoreszenzsignal infolge des Einflusses des Plasmonen-evaneszenten Feldes, welches in der zum dünnen Metallfilm 323 senkrechten Richtung exponentiell abnimmt, verstärkt wird.
Die Abstandsschicht 324 muss so gestaltet sein, dass das Fixieren an einer Oberfläche des dünnen Metallfilms 323 erleichtert wird und Oberflächenorientierung, gleichförmige räumliche Verteilung und leichte Funktionalisierung ihrer Oberfläche ermöglicht wird. Zum Beispiel kann die Abstandsschicht 324 selbstzusammengebaute Monoschicht (SAM), Polyethylenglykol (PEG) oder Dextran benutzen.
Der erste Lichtdetektor 33 ist in der entgegengesetzten Richtung zum Prisma 321 basierend auf dem dünnen Metallfilm 323 des SPR-Sensors 32 ausgebildet, das heißt, in einer vorbestimmten Höhe von einer Oberseite der Abstandsschicht 324 des SPR-Sensors 32, auf dem die Probe 30 platziert ist. Der erste Lichtdetektor 33 detektiert ein Fluoreszenzsignal, welches durch SPR des dünnen Metallfilms 323 verstärkt wird, des in der Probe 30 enthaltenen Fluorophors 303. Dafür enthält der erste Lichtdetektor 33 ein zweites Lichtfilter 331 und eine Lichtempfangseinheit 332. Das zweite Lichtfilter 331 lässt monochromatisches Licht (nachfolgend als ”Emissionswellenlängenlicht” bezeichnet) mit einer Wellenlänge, die mit einer Emissionswellenlänge des Fluorophors 303 übereinstimmt, unter dem von der Probe 30 erzeugten Licht durch. Die Lichtempfangseinheit 332 empfängt das durch das zweite Lichtfilter 331 durchgelassene Emissionswellenlängenlicht und ermöglicht Beobachtungen einer Fluoreszenzintensität der Probe 30. Die Lichtempfangseinheit 332 kann durch eine Okularlinse, ein ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD), das eine zweidimensionale Empfangseinheit ist, usw. realisiert werden, da das Fluoreszenzmikroskop bezweckt, die Gestalt eines Ziels oder einer Bioreaktion zu verfolgen.
Eine Beschreibung des Betriebs des Fluoreszenzmikroskops wird für den Beispielfall gegeben, dass ein Beobachter Beobachtungen des Antigens 304 der Probe 30 in einem Sandwich-Immunoassay-Verfahren vornimmt.
In dem Beispiel wird der Detektor-Antikörper 302, der mit dem Fluorophor 303 gekoppelt ist und gleichzeitig mit dem Antigen 304 gekoppelt ist, das das Zielmolekül ist, in die Probe 30 injiziert. Der Fang-Antikörper 301, der spezifisch an das Antigen 304 gebunden werden kann, wird an der Abstandsschicht 324 des SPR-Sensors 32 fixiert. Als Folge induziert die Bioreaktion Kopplung mit der Oberfläche der Abstandsschicht 324 in der Reihenfolge Fang-Antikörper 301 – Antigen 304 – Detektor-Antikörper 302 – Fluorophor 303.
In diesem Zustand fällt Absorptionswellenlängenlicht in einer TM-Mode mit einer Wellenlänge, die mit einer Absorptionswellenlänge des Fluorophors 303 übereinstimmt, durch die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht 31 zu dem Prisma 321 des SPR-Sensors 32 unter dem SPR-Winkel auf dem dünnen Metallfilm 323 auf. In dem Fall tritt an einer Oberfläche des dünnen Metallfilms 323 SPR auf. Dabei induziert das Plasmonen-evaneszente Feld Verstärkung eines Fluoreszenzsignals des an der Oberfläche der Abstandsschicht 324 angeordneten Fluorophors 303, das heißt, Emissionswellenlängenlicht. Der davon angeordnete erste Lichtdetektor 33 detektiert das verstärkte Emissionswellenlängenlicht.
Basierend auf dem dünnen Metallfilm 323, an dem SPR auftritt, erfährt das Absorptionswellenlängenlicht die Totalreflexion an einer Unterseite des dünnen Metallfilms 323, und das Emissionswellenlängenlicht wird an einer Oberseite des dünnen Metallfilms 323 erzeugt. Somit sind Wege des Absorptionswellenlängenlichts und des Emissionswellenlängenlichts vollständig getrennt. Dies kann eine Verminderung eines Hintergrundsignals für ein im ersten Lichtdetektor 33 detektiertes Fluoreszenzsignal bewirken, was einen Rauschabstand (SNR) verbessert.
Die Verstärkung des Fluoreszenzsignals des Fluorophors 303 wird durch Einstellung der SPR-Wellenlänge auf die Absorptionswellenlänge des Fluorophors 303 erreicht. Die Verstärkung des Fluoreszenzsignals kann auch maximiert werden, wenn Plasmonenresonanz maximiert wird. Dabei hängen ein Messbereich und eine Empfindlichkeit von einem Messziel ab, da die SPR-Winkeländerung proportional zu einer Brechungsindexänderung von dielektrischen Materialien auf dem dünnen Metallfilm 323 unter derselben Wellenlängenbedingung ist.
Die Abstandsschicht 324 stellt eine Distanz zwischen dem Fluorophor 303 und dem dünnen Metallfilm 323 ein und kann somit folgende Energieübertragung zu dem dünnen Metallfilm 323 verhindern. Als Folge wird das verstärkte Fluoreszenzsignal konstant gehalten.
Der zweite Lichtdetektor 34 kann Absorptionswellenlängenlicht empfangen, das die Totalreflexion im SPR-Sensor 32 erfährt, eine Änderung des SPR-Winkels im SPR-Sensor 32 detektieren und kann benutzt werden, um das Fluoreszenzmikroskop zu steuern.
6 ist ein Graph, der die Spektren der Absorption und Emission eines zum Detektieren von Biomolekülen allgemein benutzten Fluorophors zeigt. Insbesondere zeigt 6 ein Absorptionsspektrum 41 und ein Emissionsspektrum 42 für Alexa 647, Invitrogen. Das Absorptionsspektrum 41 und das Emissionsspektrum 42 überlappen sich teilweise, wie in 6 gezeigt. Daher kann Absorptionswellenlängenlicht teilweise gemischt sein, obwohl ein zweites Lichtfilter 14 in 1 Emissionswellenlängenlicht herausfiltert. Wenn daher Wege des Absorptionswellenlängenlichts und des Emissionswellenlängenlicht gemäß der vorliegenden Erfindung vollständig getrennt sind, kann der Einfluss des Absorptionswellenlängenlichts voltständig beseitigt werden.
Wie oben erwähnt, soll das Fluoreszenzmikroskop der vorliegenden Erfindung ein Fluoreszenzsignal eines Fluorophors unter Benutzung des SPR-Phänomens verstärken. Zu diesem Zweck kann ein SPR-Sensor 32 als SPR-Sensoren verschiedener Typen benutzt werden.
7 und 8 sind Skizzen, die verschiedene Beispiele von auf ein Fluoreszenzmikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung anwendbaren SPR-Sensoren veranschaulichen. Die für das Fluoreszenzmikroskop benutzten SPR-Sensoren werden unter Bezugnahme auf 7 und 8 im Detail beschrieben.
Unter Bezugnahme zuerst auf 7 kann der SPR-Sensor 40 ein Sensorsubstrat 41, einen dünnen Metallfilm 43 und eine Abstandsschicht 44 enthalten. Ein Prisma 42 ist in einem gleichen Körper auf einer Unterseite des Sensorsubstrats 41 ausgebildet. Ein dünner Metallfilm 43 ist oben auf der Oberfläche des Sensorsubstrats 41 ausgebildet, das in der senkrechten Richtung zum Prisma 41 angeordnet ist, um Oberflächenplasmonen zu unterstützen. Die Abstandsschicht 44 ist auf dem dünnen Metallfilm 43 fixiert und stellt eine Distanz zwischen dem dünnen Metallfilm 43 und einem Fluorophor ein, so dass keine Energieübertragung vom Fluorophor zum dünnen Metallfilm 43 stattfindet.
Unter Bezugnahme auf 8 enthält der SPR-Sensor 50 ein flaches transparentes Sensorsubstrat 51, einen dünnen Metallfilm 53, eine Abstandsschicht 54 und einen oder mehrere Kanäle 55. Ein Prisma 52 ist in einem gleichen Körper auf einer Unterseite des Sensorsubstrats 51 ausgebildet. Der dünne Metallfilm 53 ist oben auf der Oberfläche des Sensorsubstrats 51 ausgebildet, das in der senkrechten Richtung zum Prisma 51 angeordnet ist, um Oberflächenplasmonen zu unterstützen. Die Abstandsschicht 54 ist auf dem dünnen Metallfilm 53 fixiert und stellt eine Distanz zwischen dem dünnen Metallfilm 53 und einem Fluorophor ein, so dass keine Energieübertragung vom Fluorophor zum dünnen Metallfilm 53 stattfindet. Die ein oder mehreren Kanäle 55 sind auf der Abstandsschicht 54 quer über das SPR-Tauchband ausgebildet, an welchem reflektiertes Licht durch SPR des dünnen Metallfilms 53 minimiert wird. Alle oder ein Teil der Kanäle 55 sind bzw. ist aus unterschiedlichen dielektrischen Materialien ausgebildet.
Das heißt, die Sensorsubstrate 41 und 51 erhält man durch einstückiges Ausbilden des Prismas 321 und des flachen transparenten dielektrischen Substrats 322 von 5 unter Benutzung desselben Materials. Die Sensorsubstrate 41 und 51 können transparente optische Polymermaterialien mit hohem Brechungsindex benutzen, einschließlich Polystrol (PS), Polymethyl-Methacrylat (PMMA), Polycarbonat (PC) und zyklischem Olefin-Copolymer (COC). Die Sensorsubstrate 41 und 51 können auf eine Art wie z. B. durch Spritzformen ausgebildet werden. Die Sensorsubstrate 41 und 51 machen es unnötig, durch einzelne Handarbeit ein Index-anpassendes Öl zwischen dem Prisma 321 und dem flachen transparenten dielektrischen Substrat 322 einzubringen. Daher kann die Benutzungsbequemlichkeit verbessert werden.
Die dünnen Metallfilme 43 und 53 werden aus Metall ausgebildet, das durch einen externen Stimulus leicht Elektronen emittiert und eine negative Dielektrizitätskonstante bei einer Dicke von Dutzenden Nanometern (nm) hat, wie z. B. Gold (Au), Silber (Ag), Kupfer (Cu) und Aluminium (Al). Von diesen Metallen werden im Allgemeinen Silber (Ag), das den schärfsten SPR-Peak zeigt, und Gold (Au) mit hervorragender Oberflächenstabilität benutzt.
Die Prismen 42 und 52 strahlen einfallendes Licht in die dünnen Metallfilme 43 und 53 für SPR-Anregung ein und emittieren von den dünnen Metallfilmen 43 und 53 reflektiertes Licht. Die Prismen 42 und 52 sind dreieckförmig ausgebildet.
Im Detail können die Sensorsubstrate 41 und 51 für bequeme Benutzung in derselben Gestalt und Größe wie solche im Standard-Objekträgerformat ausgebildet werden. Zum Beispiel werden die Sensorsubstrate 41 und 51 in einer Rechteckform realisiert. Das heißt, die Prismen 42 und 52 werden einstückig an einseitigen Unterseiten der Sensorsubstrate 41 und 51 ausgebildet, die jeweils eine rechteckige Gestalt und eine vorbestimmte Dicke haben. Die dünnen Metallfilme 43 und 53 werden in zu den Prismen 42 und 52 senkrechten Richtungen auf den Oberseiten der darauf angeordneten Sensorsubstrate 41 und 51 ausgebildet.
Die Abstandsschichten 44 und 54 stellen die minimale Abstandsdistanz zwischen dem Fluorophor und den dünnen Metallfilmen 43 und 53 bereit, um strahlungslose Energieübertragung eines Fluoreszenzsignals auf die dünnen Metallfilme 43 und 53 zu verhindern. Strahlungslose Energieübertragung kann stattfinden, wenn der Fluorophor, der ein Indikatormaterial für ein Zielmaterial ist, das zur Beobachtung bestimmt ist, näher an die dünnen Metallfilme 43 und 53 herankommt als wenn sie in einer bestimmten Distanz von ungefähr 10 nm sind. Es ist wünschenswert, dass die Abstandsschichten 44 und 54 so angelegt sind, dass sie eine Dicke innerhalb eines Bereichs haben, um strahlungslose Energieübertragung des Fluoreszenzsignals des Fluorophors zu verhindern, während das Fluoreszenzsignal infolge des Einflusses des Plasmonen-evaneszenten Feldes, welches in der zu den dünnen Metallfilmen 43 und 53 senkrechten Richtung exponentiell abnimmt, verstärkt wird. Die Abstandsschichten 44 und 54 werden mittels selbstzusammengebauter Monoschicht (SAM), Polyethylenglykol (PEG) oder Dextran realisiert, um das Fixieren an einer Oberfläche des dünnen Metallfilms 323 zu erleichtern und Oberflächenorientierung, gleichförmige räumliche Verteilung und leichte Funktionalisierung ihrer Oberfläche zu ermöglichen.
Bei dem SPR-Sensor 40 von 7 werden spezifisch an Zielmaterialien gebundene Biomoleküle an einer Oberfläche der Abstandsschicht 44 fixiert. Danach wird eine Probe mit einem mit Zielmaterialien koppelnden Fluorophor auf den fixierten Biomolekülen eingegeben. Dadurch werden die an der Abstandsschicht 44 fixierten Biomoleküle mit den Zielmaterialien der Probe gekoppelt.
In diesem Zustand wird Absorptionswellenlängenlicht des Fluorophors in einer TM-Mode dem SPR-Sensor 40 zugeführt, welcher in einer Untersuchungsposition in dem Fluoreszenzmikroskop von 5 platziert ist. Der SPR-Sensor 40 erzeugt dann SPR, so dass ein Fluoreszenzsignal des in dem Plasmonen-evaneszenten Feld angeordneten Fluorophors verstärkt wird. Dies ermöglicht Verfolgung der Zielmaterialien, die das angebrachte Fluorophor aufweisen und an die Oberfläche der Abstandsschicht 44 des SPR-Sensors 40 gekoppelt sind, durch den ersten Lichtdetektor 33.
Der SPR-Sensor 50 von 8 enthält weiterhin einen oder mehrere, auf der Abstandsschicht 54 ausgebildete Kanäle 55. Alle oder ein Teil der Kanäle 55 sind bzw. ist aus dielektrischen Materialien mit unterschiedlichem Brechungsindex ausgebildet, das heißt, aus Biomolekülen ausgebildet, die sich spezifisch an unterschiedliche Zielmoleküle binden. Die ein oder mehreren Kanäle 55 können jeweils mit den unterschiedlichen Zielmaterialien gekoppelt werden. Somit ermöglicht es der SPR-Sensor 50 von 8, gleichzeitige Beobachtungen von unterschiedlichen Zielmaterialien vorzunehmen.
Obwohl die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen gezeigt und beschrieben worden ist, ist dem Fachmann klar, dass Modifizierungen und Veränderungen vorgenommen werden können, ohne den Geist und Schutzbereich der Erfindung, wie durch die beigefügten Ansprüchen definiert, zu verlassen.
Zusammenfassung
OBERFLÄCHENPLASMONENRESONANZ BENUTZENDES FLUORESZENZMIKROSKOP
Ein Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) benutzendes Fluoreszenzmikroskop enthält eine Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht, einen SPR-Sensor und einen ersten Lichtdetektor. Die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht stellt monochromatisches Licht bereit, das mit einer Absorptionswellenlänge eines bestimmten Fluorophors übereinstimmt, der an einer Probe angebracht ist. Der SPR-Sensor regt Oberflächenplasmonen an, um ein Fluoreszenzsignal des bestimmten Fluorophors zu verstärken. Der erste Lichtdetektor detektiert das Fluoreszenzsignal, um Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe zu ermöglichen.

Claims

Oberflächenplasmonenresonanz benutzendes Fluoreszenzmikroskop, umfassend: eine Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht, zur Bereitstellung von monochromatischem Licht in einer transversalen magnetischen Mode mit einer Wellenlänge, die mit einer Absorptionswellenlänge eines bestimmten Fluorophors übereinstimmt; einen Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor zum Anregen von Oberflächenplasmonenresonanz mittels des monochromatischen Lichts, um ein Fluoreszenzsignal des bestimmten Fluorophors zu verstärken, der an einer Probe angebracht ist, die sich in einem Plasmonen-evaneszenten Feld befindet; und einen ersten Lichtdetektor zum Detektieren des im Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor verstärkten Fluoreszenzsignals, um Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe zu ermöglichen.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht das monochromatische Licht in transversaler magnetischer Mode bereitstellt, das auf den Oberflächenplasmonenresonanz-Winkel des Oberflächenplasmonenresonanz-Sensors eingestellt ist.
Mikroskop nach Anspruch 1, das weiterhin umfasst: einen zweiten Lichtdetektor zum Detektieren des vom Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor totalreflektierten monochromatischen Lichts in transversaler magnetischer Mode, um Verfolgung einer Oberflächenplasmonenresonanz-Bedingung des Oberflächenplasmonenresonanz-Sensors zu ermöglichen.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht umfasst: eine Lichtquelle zur Erzeugung von Licht; ein erstes Lichtfilter zum Durchlassen nur des monochromatischen Lichts mit der Wellenlänge, die mit der Absorptionswellenlänge des bestimmten Fluorophors übereinstimmt, unter dem von der Lichtquelle erzeugten Licht; und einen Polarisator zum Umwandeln des durch das erste Lichtfilter durchgelassenen monochromatischen Licht in Licht in einer transversalen magnetischen Mode.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei der Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor umfasst: ein flaches transparentes dielektrisches Substrat; einen dünnen Metallfilm, der oben auf dem flachen transparenten dielektrischen Substrat ausgebildet ist und Oberflächenplasmonen unterstützt; ein Prisma, das an einer Unterseite des flachen transparenten dielektrischen Substrats ausgebildet ist und das monochromatische Licht in transversaler magnetischer Mode, das von der Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht einer Einfallsebene des Prismas zugeführt wird und mit der Absorptionswellenlänge des Fluorophors übereinstimmt, auf dem dünnen Metallfilm einfallen lässt, um die Oberflächenplasmonenresonanz anzuregen, und das von dem dünnen Metallfilm reflektierte Licht in eine Emissionsebene emittiert; und eine Abstandsschicht, die in einer vorbestimmten Dicke auf dem dünnen Metallfilm ausgebildet ist und mittels der Dicke einen minimalen Abstand zwischen dem an der Probe angebrachten Fluorophor und dem dünnen Metallfilm aufrechterhält und strahlungslose Energieübertragung von dem Fluorophor zu dem dünnen Metallfilm verhindert.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei der erste Lichtdetektor umfasst: ein zweites Lichtfilter, das auf dem Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor angeordnet ist und nur monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge, die mit einer Emissionswellenlänge des bestimmten Fluorophors übereinstimmt, unter dem von dem Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor einfallenden Licht durchlässt; und eine Lichtempfangseinheit, die dazu dient, das durch das zweite Lichtfilter durchgelassene Licht mit der Emissionswellenlänge zu empfangen und Verfolgung einer Fluoreszenzintensität der Probe zu ermöglichen.
Mikroskop nach Anspruch 4, wobei die Lichtquelle realisiert ist mittels einer Quelle für monochromatisches Licht oder einer Weißlichtquelle, umfassend eine Quarz-Wolfram-Halogen-Lampe, einen Laser und eine Leuchtdiode.
Mikroskop nach Anspruch 4, wobei die Einheit zur Bereitstellung von monochromatischem Licht weiterhin umfasst: eine oder mehrere Linsen, die hinter dem Polarisator angeordnet sind und das monochromatische Licht in transversaler magnetischer Mode in zweidimensionales ausgedehntes paralleles Licht umwandelt.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei der Oberflächenplasmonenresonanz-Sensor weiterhin umfasst: einen oder mehrere Kanäle, die an einer Oberseite der Abstandsschicht ausgebildet sind und die teilweise oder alle aus unterschiedlichen dielektrischen Materialien ausgebildet sind, die jeweils mit unterschiedlichen Zielmaterialien gekoppelt sind.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei das Prisma dreieckförmig ausgebildet ist.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei das Prisma und das flache transparente dielektrische Substrat aus demselben Material in einem Körper ausgebildet sind.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei der dünne Metallfilm aus einem der Metalle Gold (Au), Silber (Ag), Kupfer (Cu) und Aluminium (Al) ausgebildet ist, die durch einen externen Stimulus leicht Elektronen emittieren und eine negative Dielektrizitätskonstante haben.
Mikroskop nach Anspruch 5, wobei die Abstandsschicht aus Materialien ausgebildet ist, die das Fixieren an einer Oberfläche des dünnen Metallfilms erleichtern und Oberflächenorientierung, gleichförmige räumliche Verteilung und leichte Funktionalisierung ihrer Oberfläche ermöglichen.
Mikroskop nach Anspruch 6, wobei die Lichtempfangseinheit mittels einer Okularlinse oder eines ladungsgekoppelten Bauelements, das eine zweidimensionale Lichtempfangseinheit ist, realisiert ist.
Mikroskop nach Anspruch 11, wobei das Prisma und das flache transparente dielektrische Substrat realisiert sind mittels transparentem optischen Polymer mit hohem Brechungsindex, umfassend Polystrol, Polymethyl-Methacrylat, Polycarbonat und zyklisches Olefin-Copolymer.
Mikroskop nach Anspruch 13, wobei die Abstandsschicht mittels selbstzusammengebauter Monoschicht, Polyethylenglykol oder Dextran realisiert ist.