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BEZUGNAHME AUF EINE VERWANDTE
ANMELDUNG
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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität der US Provisional Patent
Application Nr. 60/813,712 vom 15. Juni 2006 mit der Bezeichnung „System
for Improved Ion Channel Recordings and Related Measurement of Objects
and Analytes in Solution".
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet elektrolytischer Messsysteme
und insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Messen eines zeitvarianten
Ionenstroms in einer elektrolytischen Umgebung mit einer verbesserten
Empfindlichkeit und Bandbreite.
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2. Diskussion des Standes
der Technik
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Die
Messung der elektrischen Leitfähigkeit kleiner
fluidischer Bereiche ist bei vielen Anwendungen von Bedeutung. Beispielsweise
können
kleine Partikel, etwa Viren, die in einem Fluid gelöst sind, unter
Verwendung einer Widerstandsimpulstechnik gemessen werden, d. h.,
durch Messen der zeitweiligen Änderung
der durchschnittlichen Fluidleitfähigkeit, die sie bewirken,
wenn sie eine solche Öffnung Passieren.
In den vergangenen Jahren ist es von großer wissenschaftlicher und
technologischer Bedeutung geworden, die Variation der elektrischen
Leitfähigkeit
von Einheiten, die die Membranenwand einer Zelle überbrücken, zu
messen. Solche Einheiten, wie Proteinporen, Ionenkanäle, Transporter
und verwandte Einheiten (hier durch den Gruppennamen Ionenkanäle bezeichnet),
steuern die Passage bestimmter Ionen in/oder aus einer Zelle. Das
Messen der Ionenflüsse
durch den elektrischen Strom, den sie tragen, ist viel einfacher,
schneller und grundlegender als andere Verfahren wie die Verwendung
eines radioaktiven Tracer.
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Elektrische
Messungen der Ionenkanalaktivität
gehen auf Hodgkin's
und Huxley's Identifikaktion von
Strömen,
die durch homogene Anordnungen von Kanälströmen, die sie als „Ionenleiter" bezeichnet haben,
zurück.
Messungen von Strömen
durch einkanalige Proteine, jeweils nur ein Molekül, begannen mit
der Arbeit von Haydon und Hladky. Sie stellten fest, dass Ströme durch
einzelne Gramicidinkanäle einen
rechteckigen zeitlichen Verlauf hatten und dass die Dauer der Öffnung den
zeitabhängigen
Vorgängen
entsprachen, die von Hodgkin und Huxley untersucht worden war, während die
Amplitude des Stroms durch den Kanal dem „Sofortstrom", der von diesen
aufgezeichnet waren, entspricht.
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Hunderte
Typen von Ionenkanälen
wurden bis heute mit elektrischen Verfahren untersucht, wobei Tausende
von Ionenkanälen
und Transporter noch zu untersuchen sind. Kanalströme variieren
von gegenwärtig
nicht messbaren (~Picoampere (Pa)) bis Hunderten von Pa. Viele der
biologisch und medizinisch wichtigen Ionenkanäle haben nicht messbare Einkanalströme und ihre
Leitfähigkeit
muss aus makroskopischen Messungen vieler Ionenkanäle abgeschätzt werden.
Zusätzlich
zu dem Erfordernis des Aufzeichnens von kleineren Stromänderungen
wird allgemein angenommen, dass die Geschwindigkeit vieler Ionenkanalübergänge schneller
ist als die Antwortzeit von existierenden Aufzeichnungssystemen, diese
Kanäle
blieben ungemessen.
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Den
wichtigsten Fortschritt des Aufzeichnens von Ionenkanälen haben
Sakmann und Neher gemacht, die ein Patchpipettenverfahren entwickelten,
das das Aufzeichnen von Einkanalströmen mit einer dünnwandigen,
gezogenen Glaspipette, die gegen eine Zellmembran gedrückt wird,
erlaubte. Ein Beispiel eines derartigen Systems ist in 1 gezeigt.
Obwohl dies nicht gezeigt ist, würde
die ganze Patchclampvorrichtung typischerweise von einer elektrisch
leitfähigen
Abschirmung eingeschlossen sein, um die Aufnahme von elektromagnetischem Rauschen
zu minimieren. Es hat sich gezeigt, dass die Messempfindlichkeit
erheblich erhöht
würde durch
Einziehen der Membran um mehrere Mikron in die Pipette durch ein
Ansaugen, um so die Fläche
der Membran in Kontakt mit der Fläche des Glases zu erhöhen. Üblicherweise
wird die Pipette von Hand positioniert. In automatischen ZellPatchsystemen
werden Zellen durch Saugen in eine Öffnung in der Größenordnung
eines Mikrons in eine Glas- oder eine Silikonfläche gezogen. Wenn die Zelle
einmal angebracht ist, muss ein elektrischer Strom über einen
Ionenkanal hergestellt werden durch Durchdringen der Zellmembran
mit einer scharfen Elektrode oder Ausziehen eines Patches von Zellmembranen,
die in dem Messbereich angeordnet sind, um es dem Teil des Ionenkanals
auf der Innenfläche
der Zelle zu erlauben, dem Elektrolyt in dem Bad ausgesetzt zu sein.
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Ein
alternativer, direkterer Weg ist das Erzeugen einer Membran mit
einem Ionenkanal und entweder das Suspendieren der Membran über eine Öffnung (typischerweise
in der Größenordnung
von 100 Mikron oder Mikrometern (μm)
im Durchmesser) in einem festen Material wie Teflon oder deren Stützen mit
einer festen Elektrodenfläche,
möglicherweise über polymere
Fäden.
Ein Beispiel eines derartigen suspendierten künstlichen Membransystems ist in 2 gezeigt.
Obwohl dies nicht gezeigt ist, ist dies System typischerweise von
einer elektrisch leitenden Abschirmung umschlossen. Dieses Verfahren erlaubt
den makroskopischen Zugriff von beiden Seiten der Membran, ist jedoch
sehr fragil. Das Letztere ist robust, aber die Chemie der Lipid-
und Polymertheter erfordert, dass eine inerte Elektrode (beispielsweisse
Gold) mit einer vorherrschenden Kapazität (d. h., Wechselstrom (AC)),
die mit dem Elektrolyt gekoppelt ist, verwendet werden muss. Zusätzlich verhindert
das sehr kleine Fluidvolumen wegen des Aufbaus von Ionenkonzentrationsgradienten über der Membran
in dem Bereich zwischen der Membran und der festen Fläche die
Verwendung traditioneller Gleichstrom (DC)-Verfahren zum Messen
des Kanalstroms.
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Bezüglich der
Messempfindlichkeit und der Bandbreite sind übliche Ionenkanalaufzeichnungen durch
das Stromrauschen des Verstärkers
der ersten Stufe begrenzt und das effektive Stromrauschen, das durch
das Spannungsrauschen des Verstärkers
der ersten Stufe verursacht wird, wirkt auf die Gesamtkapazität an dem
Verstärkereingang.
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Es
wird jetzt auf 1 Bezug genommen. Ein typisches
Patchclampsystem 200 weist eine Membran 201 und
ein Elektrolytbad 202 auf, das die folgenden Eigenschaften
hat. Die Eingangskapazität eines
erststufigen Verstärkers 204 beträgt 15 Pikofard
(pF). Die Kapazität
eines Pipettenhalters 208 variiert von 1–5 pF und
die Kapazität
einer Pipette 212 beträgt
auch 1–5
pF. Größere Pipettenkapazitäten sind
Halter zugehörig,
die metallische Abschirmungen haben (Axon Instruments). Jedoch erzeugt
das Eintauchen der dünnwandigen
Spitze der Patchpipette in das Bad 202 eine weitere Kapazität in der Größenordnung
von 1 pF/mm. Obwohl es möglich
ist, die Pipettenspitze nur sehr geringfügig einzutauchen, ist es schwierig
einzustellen und die Schwierigkeit zum Implementieren für eine bestimmte
Zeitdauer, da der Fluidpegel sich aufgrund des Verdampfens ändert. Für ein typisches
Eintauchen der Spitze um 5 Millimeter (mm) beträgt die zusätzliche Kapazität 5 pF und
ist ein fundamentales Ergebnis der Pipettenspitze mit einer sehr
dünnen
Wand. Die Kapazität
eines Drahts 220, der von einem Elektrodensystem 224 zu
der Systemelektronik läuft,
hängt von
dem Drahtdurchmesser und der Drahtlänge ab. Unter der Annahme,
dass der Draht einen Durchmesser von 1 mm hat und 20 Zentimeter
(cm) lang ist und dass die (nicht gezeigte) Abschirmung einen Abstand
von 10 cm bis 1 Meter (m) hat, beträgt die Drahtkapazität 1,5–2,1 pF.
Gemeinsam liegt die Gesamtkapazität des Verstärkereingangs in dem Bereich
von 25–30 pF.
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Die
Kapazität
der künstlichen
Membranvorrichtung 228 ist typischerweise höher. Es
wird auf 2 Bezug genommen. Dieselben
Kapazitätswerte ergeben
sich für
einen erststufigen Verstärker 230 und
Verbindungsdrähten 234,
die den erststufigen Verstärker 230 mit
Elektroden 236 verbinden, eine Membran 238 ist
jedoch auf einem Teflonblatt 239 suspendiert, das beide
Fluidvolumen 240 und 242 teilt und eine Fläche hat,
die 1.000–10.000
mal größer ist
als die der Membran 201 des Patchpipettensystems. Dies
erzeugt eine zusätzliche
Shuntkapazität
in dem Bereich von 5–100
pF. Zusätzlich
erzeugt die Kapazität
der Messseite des Elektrolytbades oder Fluidvolumens 240 eine
Kapazität,
die sich linear mit dem Radius des Bades erhöht und typischerweise wenigstens
ein pF beträgt.
Typischerweise beträgt die
Gesamtkapazität
an dem Verstärkereingang
der vorbekannten Vorrichtung mit künstlicher Membran 22–120 pF.
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Die
obigen vorbekannten Systeme sind in dem Sinne gut optimiert, dass
die internen Beiträge zu
dem Messrauschen annähernd
gleich sind. Beispielsweise sind das Stromrauschen und das Spannungsrauschen,
das auf die Gesamteingangskapazität wirkt, annähernd gleich.
Dies stellt ein Trade-Off bei der Ausbildung des erststufigen Verstärkers für die bekannte
Eingangsimpedanz dar und die beiden üblichen Arten von Messvorrichtungen
erreichen schließlich
Begrenzungen aufgrund ihrer mechanischen Ausbildung. Bei der Patchpipette
liegt die Begrenzung in der Pipette selbst. Für den Teflonnapf liegt die
Begrenzung in der Fläche
der Membran. Infolgedessen wurden in den etwa 20 Jahren, in denen Patchpipetten
und die zugehörigen
künstlichen
Zweischichtmessungen durchgeführt
worden sind, nur sehr unzureichende Verbesserungen der Empfindlichkeit
und der Bandbreite erreicht und diese beruhen fast vollständig auf
den Fortschritten auf dem Gebiet der Elektronik.
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Darauf
basierend besteht ein Bedarf nach einem System, das wesentliche
Verbesserungen bei Ionenkanalaufzeichnungen ermöglicht. Ein solches System
muss die erforderlichen elektrischen Eigenschaften zum Verbessern
der Empfindlichkeit und der Bandbreite haben, die durch gut optimierte
vorhandene Technologien erreicht wird, und darf bei der Verwendung
nicht schwerer sein und darf nicht auch teurer sein als die gegenwärtige Technologie.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist auf eine elektrische Messvorrichtung oder
ein elektrolytisches Messsystem und ein Verfahren zum Messen eines zeitvarianten
Ionenstroms gerichtet. In Übereinstimmung
mit der Erfindung weist die Vorrichtung ein erstes und ein zweites
Fluidvolumen oder eine erste oder eine zweite Fluidkammer auf, die
mit einem Elektrolyt gefüllt
sind und von einem Substrat getrennt sind, das mit einem oder mehreren Öffnungen versehen
ist. Ein oder mehrere Analyte, die zu untersuchen sind, werden in
eine oder beide Kammern eingefüllt.
Die Vorrichtung weist eine erste Elektrode auf, die in der ersten
Kammer oder dem ersten Elektrolytbad positioniert sind und eine
zweite Elektrode, die in der zweiten Kammer oder dem Messvolumen positioniert
ist. Das Aufbringen einer Potentialdifferenz zwischen der ersten
und der zweiten Elektrode erzeugt ein elektrisches Feld. Das elektrische
Feld verursacht einen Ionenstrom, der durch eine oder mehrere Öffnungen,
die die beiden Volumen miteinander verbindet, fließt. Eine
elektrische Ausleseschaltung mit hoher Empfindlichkeit ist über jede
der Öffnungen
verbunden und mit der ersten Kammer und der zweiten Kammer unter
Verwendung von vorzugsweise resistiven (beispielsweise faradayischen) oder
Kapazitätselektroden
gekoppelt, die mit dem Eingang eines erststufigen Verstärkers verbunden sind.
Dieser Verstärker
ist wiederum mit nachfolgenden Verstärkerstufen verbunden.
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Vorzugsweise
werden die Öffnungen
durch eine oder mehrere Membranen abgedeckt, die das Einsetzen eines
oder mehrerer Ionenkanäle
erlauben. Der elektrische Widerstand über eine Öffnung mit einer angebrachten
Membran ist in der Größenordnung
von 1 Gigaohm (GΩ)
und vorzugsweise eine Größenordnung
höher zum
Minimieren des wechselnden Stroms, der parallel zu dem Ionenkanalstrom
fließt.
Alternativ wird die Vorrichtung betrieben, ohne dass die Öffnung von
einer Membran abgedichtet wird, beispielsweise zum Erkennen von Änderungen
im Strom aufgrund von Partikeln, die die Öffnung passieren. Jedoch wird
die Erfindung in diesem Fall vorzugsweise bei höheren Frequenzen genutzt. Beispielsweise
hat eine Öffnung
mit einem Durchmesser von 20 Nanometern (nm) (annähernd der
gegenwärtige
Zustand nach dem Stand der Technik bei dem Herstellen von Öffnungen
in Glas und Silikon in Nanogröße) eine
Leitfähigkeit
in der Größenordnung von
10 Megaohm (MΩ)
bei einer Füllung
mit Kaliumchloridlösung
(KCl) von 1 Molar (M). In diesem Fall wird die Erfindung vorzugsweise
genutzt zum Messen von Signalen oberhalb von 1 Kilohertz (kHz).
Bei einer größeren Öffnung oder
bei mehreren Öffnungen
ist die Frequenz, bei der die Vorrichtung betrieben wird, in einer
optimalen Weise höher
in einem linearen Verhältnis
zu der Änderung
der Gesamtleitfähigkeit.
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Die
Membran kann über
die Öffnung
durch ein Verfahren des Beschichtens gebildet werden durch Bläschenfusion
oder andere in dem Stand der Technik bekannte Verfahren. Die Form
der Membran hängt
von der Hydrophobie der Substanzfläche ab. Die Membran kann aus
einer lipiden Doppelschicht gebildet sein oder jedem Material, das ähnliche
Eigenschaften hat, beispielsweise Polydimethysiloxan (PDMS). Zusätzlich kann
die Membran aus einer lebenden Zelle in der Weise, die für das Patchclamping verwendet
wird, extrahiert werden.
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Im
Gegensatz zu den oben diskutierten vorbekannten Systemen hat das
System, das nach der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist, eine
Gesamtkapazität
an einem Verstärkereingang
einschließlich des
Verstärkers
selbst von 2–10
pF. Diese dramatische Verringerung der Kapazität ermöglicht eine Reduktion des internen
Rauschens des Systems oder des Stromrauschens, wodurch eine signifikante
Verbesserung der Empfindlichkeit erreicht wird. Diese Verbesserung
kann erreicht werden unabhängi
davon, ob eine Systemöffnung
offen ist oder wenn eine Widerstandsimpulstechnik zum Zählen und
Abmessen von Partikeln verwendet wird oder wenn eine Membran und
Ionenkanal über
die Öffnung
vorhanden ist. Weiter ermöglicht
die Reduktion des internen Rauschens ein Ausführen von Messungen bei Bandbreiten,
die erheblich über
den Bereich vorbekannter Systeme hinaus gehen. Wegen der verbesserten Sensitivität erlaubt
die Vorrichtung die Verwendung eines verringerten Ionenstroms. Dies
erlaubt Implementationen mit der Verwendung von geringeren Vorspannungen
und die Verwendung von Elektrolyten mit geringerer Konzentration.
Vorzugsweise ist das System nach der vorliegenden Erfindung nicht schwieriger
zu verwenden und nicht teurer als die vorbekannte Technologie.
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Die
vorliegende Erfindung bietet eine höhere Messempfindlichkeit und – bandbreite
durch Kombinieren dreier bestimmter Ansätze zum Minimieren der Kapazität, die mit
dem Eingang des erststufigen Verstärkers verbunden ist. Zunächst weist
die Vorrichtung eine Öffnung
auf mit einer lateralen Dimension, die geringer als 10 μm und geringer
als 50 nm in dem Fall, dass keine Membran die Öffnung abdichtet. ist. Zweitens
ist, um einen Vorteil aus der sehr geringen Öffnungskapazität zu haben,
die Kapazität, die
das erste Volumen mit dem zweiten Volumen verbindet, die über dem
Substrat auftritt, die die eine oder die mehreren Öffnungen
hat, geringer als 1 pF und vorzugsweise geringer als 0,25 pF. Dies
wird durch Minimieren der Fläche
des Substrats erreicht, das dem Fluid ausgesetzt ist und macht das
Substrat ausreichend dick. Drittens sind die Messelektroden und
der erststufige Verstärker
innerhalb von 5 cm der Öffnung
mit der Nanogröße angeordnet
und neue Schaltungsausgestaltungen und ein Packaging schafft eine
sehr hohe Empfindlichkeit für
eine sehr hohe Eingangsimpedanz bei einem kleinen Gesamtvolumen.
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Bei
der bevorzugten Anordnung wird der Ionenstrom, der durch eine kleine
Fluidöffnung
oder einen kleinen Ionenkanal fließt, mit einer Empfindlichkeit
und einer Bandbreite gemessen, die diejenige vorbekannter Verfahren
erheblich übersteigt.
Der fundamentale interessierende Parameter ist die Zeitvariation
des Ionenstroms. Es können
jedoch in einigen Fällen
andere physikalische Variablen wie der Leckstrom der Membran oder
andere vorhandene Zustände
oder quasi-vorhandene Zustandseigenschaften der interessierende
Parameter sein. Bei einigen Ausführungsbeispielen
eines Ionenkanals, der eine Membran überspannt, können die
Ionenkanäle ihre
natürliche
Form haben oder können
bearbeitet oder anders modifiziert sein, wie dies für bestimmte Eigenschaften
erforderlich ist. Eine besondere Anwendung dieser Erfindung ist
das Messen von diskreten Leitfähigkeitszuständen in
Ionenkanälen.
Diese Zustände ändern sich
stochastisch bei dem Vorhandensein von Analyten in einer Weise,
die es erlaubt, Konzentrationen und Arten gesondert zu bestimmen. Eine
weitere Anwendung der Erfindung ist das Messen des Kanalstroms,
wenn die Leitfähigkeit
einfach mittels eines Blockierungseffekts bestimmt wird der durch
das Vorhandensein eines Analyts in der Öffnung wie bei den üblichen
Coulterzählern
erzeugt wird. Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden eingehenden Beschreibung
bevorzugter Ausführungsbeispiele
in Verbindung mit den Zeichnungen, wobei einander entsprechende
Bezugszeichen sich auf entsprechende Teile in den verschiedenen
Ansichten beziehen.
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KURZE ERLÄUTERUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
ein übliches
vorbekanntes Patchclampmesssystem;
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2 zeigt
ein übliches
vorbekanntes künstliches
Membranmesssystem;
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3 zeigt
eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung, die in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist;
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4 zeigt
eine teilweise Querschnittsansicht der Öffnung von 3 mit
einer Lipidmembran;
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5 zeigt
eine Querschnittsansicht eines alternativen Ausführungsbeispiels der Vorrichtung nach
der vorliegenden Erfindung;
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6 zeigt
eine Teilquerschnittsansicht der Öffnung von 3 mit
einer Zellmembran;
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7 zeigt
eine Teilquerschnittsansicht des Messvolumens von 3 und
ein Kapillarinstrument;
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8 zeigt
eine Teilquerschnittsansicht eines alternativen Ausführungsbeispiels
zu demjenigen von 7, wobei das Kapillarinstrument
eine Elektrode ist;
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9 ist
ein Ausführungsbeispiel
der Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung mit kontinuierlichen
Proben; und
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10 ist
eine Tabelle, die die Empfindlichkeit der vorliegenden Vorrichtung
mit derjenigen einer üblichen
Patchklemme und üblichen
künstlichen Membransystemen
zeigt.
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EINGEHENDE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Es
wird zunächst
auf 3 Bezug genommen. Eine elektrolytische Messvorrichtung
oder elektrolytisches Messsystem, das in Übereinstimmung mit der Erfindung
aufgebaut ist, ist allgemein mit 2 bezeichnet. Das Messsystem 2 weist
eine erste Fluidkammer oder ein Elektrolytbad 4 auf, in
den ein erstes Elektrolyt 6 vorhanden ist und eine zweite
Elektrolytkammer oder ein Messvolumen 8, das mit einem zweiten
Elektrolyt 10 versehen ist. Das Messvolumen 8 wird
von dem Elektrolytbad 4 von einer Grenzstruktur 11 getrennt,
die aus einer dicken Grenzwand 12 und einem Substrat 14 beschichtet
ist, die mit einer Dichtung (nicht gezeigt) verbunden sind mit einem elektrischen
Widerstand von wenigstens 1 GΩ,
vorzugsweise höher.
Alternativ kann die Struktur 11 als eine einzelne Einheit
ausgebildet sein etwa durch Gießen
oder Formen. Bei dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Struktur 11 in
Form eines Rohres. Es versteht sich jedoch, dass die Struktur 11 verschiedene
geometrische Formen haben kann.
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Ein
Befestigungssubstrat 16 erstreckt sich über die Oberseite des Elektrolytbades 4 und
des Messvolumens 8. Messelektroden 18 und 19 erstrecken
sich durch das Bewässerungssubstrat 16 und
in das Elektrolytbad 4 bzw. das Messvolumen 8.
In Übereinstimmung
mit der Erfindung ist die Wand 12 aus einem Material mit
einer sehr geringen Leitfähigkeit
gefertigt und ist vorzugsweise 0,2 mm dick mit einem Innendurchmesser
von 1 mm. Eine derartige Wanddicke und ein Durchmesser führen zu
einer Kapazität
pro mm der eingetauchten Länge
der Wand 14 von 0,1 pF pro mm, gegeben durch die Formel
C = 2 πε/In(daußen/dinnen). Vorzugsweise beträgt die Dicke der Wand 12 wenigstens
0,4 mm, was zu einer Kapazität
pro Einheitslänge
von 0,06 pF pro mm führt.
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Bei
einer Struktur 11 mit einem Innendurchmesser von 1 mm beträgt der Bereich
des Elektrolyts 10, die zu dem Elektrolytbad 4 über das
Substrat 14 weist, 0,78 mm2. Das
Substrat 14 ist vorzugsweise wenigstens 25 μm dick, unter
Voraussetzung einer Kapazität
von 1 pF in Übereinstimmung
mit der Formel C = εA/t,
wobei t die Dicke des Substrats 14 ist. Die durchschnittliche
Dicke des Substrats 14 beträgt vorzugsweise wenigstens
50 μm, was
die Kapazität, die
die beiden Elektrolytvolumen 4 und 8 koppelt,
auf 0,5 pF oder weniger begrenzt. Bei diesen Berechnungen wird zur
Vereinfachung ein kreisförmiger
Querschnitt angenommen, es versteht sich jedoch, dass auch quadratischer
Querschnitt oder andere Geometrien verwendet werden können. Die
Gesamtkapazität,
die das innere Elektrolytvolumen 8 mit dem äußeren Elektrolytvolumen 4 über die
Struktur 11 koppelt, ist vorzugsweise kleiner als 2 pF
und besonders bevorzugt kleiner als 0,25 pF.
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Das
Substrat 14 beinhaltet eine Öffnung 22. Die Öffnung 22 ist
vorzugsweise kleiner als 10 μm
bei Verwendung mit einer Membran und vorzugsweise kleiner als 50
nm, bei Verwendung ohne eine Membran. In beiden Fällen wird
die Leistungsfähigkeit
mit einer verringerten Öffnungsfläche verbessert.
Unterhalb eines Durchmessers von 3 μm in dem Fall einer Membrandichtung
ist die Kapazität über die
Membran klein verglichen mit anderen Kapazitäten an dem Eingang und es wird
keine signifikante weitere Verbesserung erreicht. Bei dem Fall keiner
Membran sollte der Öffnungsdurchmesser
so gering wie möglich
sein, vorzugsweise geringer als 20 nm und besonders bevorzugt geringer
als 10 nm. Diese Öffnung in
Nanogröße kann
konstruiert werden durch ein Trackätzverfahren durch übliche Silikonbearbeitung oder
durch das Verfahren des Abdichtens eines Drahtes in Glas und dessen
Entfernen. Die Öffnung 22 ist
konisch dargestellt, um den elektrischen Widerstand des Fluids (Elektrolyts)
in Reihe mit der Verengung der Öffnung 22 zu
minimieren. Es ist jedoch nicht wesentlich, dass die Öffnung 22 konisch
ist, es können
auch eine zylindrische oder jede andere Form verwendet werden unter
der Voraussetzung, dass der in Reihe mit einem Ionenkanal, der über die Öffnung 22 positioniert
ist, liegende elektrische Widerstand geringer ist als etwa das Zehnfache
des Ionenkanalwiderstands.
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Das
Substrat 14 besteht aus einem Kunststoff wie Polyamid,
Silizium sehr geringer Leitfähigkeit,
Glas, Quarz, Saphir und äquivalentem
Material. Die hauptsächlichen
Anforderungen an das Substrat 14 sind, dass dieses eine
geringe elektrische Leitfähigkeit,
eine geringe dielektrische Verlusttangente hat und vorzugsweise
ausreichend flach ist, um eine Membran mit einer elektrischen Abdichtung
mit hohem Widerstand zu tragen. Das Substrat 14 und die Trennwand 12 sind
vorzugsweise durch dasselbe Material gebildet. In dem Fall, dass
ein Wafersubstrat wie Silizium verwendet wird, ist es möglich, den
Bereich des Substrats 14, der zu dem Elektrolyt durch übliche Halbleiterverarbeitungsverfahren
freigelegt wird, wesentlich zu reduzieren. Wenn der Bereich reduziert
wird, kann das Substrat 14 sehr viel dünner sein und zeigt weiterhin
eine adäquate
kleine Kapazität.
Zur Vereinfachung der Herstellung der Öffnung 22 durch übliche photolithographische
Verfahren wird der Substratbereich, der zu dem Elektrolyt frei liegt, derart
gewählt,
dass das Substrat 14 vorzugsweise eine Dicke geringer als
1 μm hat.
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Die
dicke Wand 12 und eine Außenwand 24 des Elektrolytbades 4 sind über ein
Befestigungssubstrat 16 verbunden. Wie zuvor erwähnt, sind
die Messelektroden 18 und 19 mit dem Befestigungssubstrat 16 verbunden
und kontaktieren das Elektrolyt 6, 10 in dem Elektrolytbad 4 bzw.
dem Messvolumen 8. Die Elektroden 18 und 19 können entweder
vom üblichen nicht-polarisierbaren
Typ sein, etwa Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) oder einem nicht-reaktiven
Material wie Platin (Pt), wenn ein vollständiges AC-Verfahren verwendet
wird.
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Ein
Verstärker 26 der
ersten Stufe ist direkt auf das Befestigungssubstrat 16 montiert
zum Minimieren der Länge
eines Drahts 27, der den Verstärker 26 mit der Elektrode 19 verbindet.
Vorzugsweise ist der Draht 27 nicht länger als 5 cm und vorzugsweise
geringer als 2 cm. Zusätzlich
weisen die dem Verstärker 26 zugehörigen Schaltungen
Schutz- und Erdungsschaltungen (nicht gezeigt), um die Streukapazität als auch
eine zugehörige
Rückkopplungssteuerschleife
(nicht gesondert gekennzeichnet) zu minimieren. Einige oder mehrere
Bohrungen sind in dem Befestigungssubstrat 16 gebildet,
um ein Eingeben und Entfernen der Elektrolyte 6 und 10 und
eines Analyts 29 zu erlauben.
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Eine
Spannung zum Treiben des Ionenstroms zwischen den Elektroden 818 und 19 muss angelegt
werden, wie dies in 3 gezeigt ist. Vorzugsweise
ist eine Spannungsquelle 17 mit der Badelektrode 18 verbunden
und auf die Masse des elektrischen Systems bezogen. Der Ausleseverstärker 26 ist
mit einem Strom-Wandler verbunden, dessen positiver Eingang mit
Masse verbunden ist. Alternativ kann es geeigneter sein, die Spannungsquelle 17 mit dem
positiven Eingang des Verstärkers 26 zu
verbinden. Zusätzlich
kann eine gesonderte Elektrode (nicht gezeigt), die mit einem Hochimpedanzpuffer verbunden
ist, in das Bad 4 eingetaucht sein. Der Ausgang dieser
Bezugselektrode kann gesondert aufgezeigt werden, um eine direktere
Messung des Potentials des Bades 4 aufzuzeichnen.
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Elektrolyten 6 und 10 sind
typischerweise übliche
biokompatible Lösungen
wie 0,1 M KCl, obwohl bei nicht-biologischen Anwendungen eine Vielzahl von
leitfähigen
Fluiden oder Lösungen
verwendet werden können.
Bei der Verwendung wird eine Spannungsquelle 17 zum Anlegen
eines elektrischen Potentials zwischen den Elektroden 18 und 19 zum
Treiben eines elektrischen Stroms zwischen diesen und durch die Öffnung 22 in
Nanometergröße verwendet. Die
Treiberspannung kann wie bei der üblichen Praxis eine Gleichspannung
sein, die bei dem Messen von Ionenkanalströmen verwendet wird, oder es kann
ein AC-Treiber verwendet werden und der sich ergebende Strom wird
demoduliert durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Der
fundamentale interessierende Parameter ist ein zeitvarianter Ionenstrom
Ic, der die Öffnung 22 von dem
Bad 4 in die Messkammer 8 in Antwort auf ein Zielanalyt 29 passiert,
wie in 4 gezeigt.
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Ein
Substrat 14 trennt, wie gezeigt, das Elektrolytbad 4 von
dem Messvolumen 8. In einigen Fällen kann eine offene Öffnung 22 ohne
weitere Modifikation verwendet werden, um das Vorhandensein von
Objekten in der Nähe
der Öffnung
durch deren Effekt auf den elektrischen Strom, der durch die Öffnung fließt, zu messen.
Jedoch ist die Öffnung 22 vorzugsweise
von einer lipiden Doppelschicht oder einer Zweilipidmembran 30 (wie
in 4 gezeigt) oder ein äquivalentes Material wie PDMS,
einem flüssigen
Film oder auch ein festes Material, das das Einbringen eines Ionenkanals
in derselben Art erlaubt, überspannt.
Die Membran kann über
die Öffnung
gebildet sein durch ein Beschichtungsverfahren durch Bläschenfusion
oder ein anderes bekanntes Verfahren. Die Bildung der Membran hängt von
der Hydrophobie der Substratfläche
ab. Vorzugsweise erzeugt die Membran 30 einen elektrischen
Widerstand (Dichtungswiderstand) zwischen dem Elektrolytbad 4 und
dem Elektrolyt 10 in der Größenordnung von 10 GΩ. Insbesondere
hat sich gezeigt, dass die Lipidmembranen auf Glas eine Dichtung
von 10 GΩ oder mehr
erzeugen.
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In
dem Fall der Membran 30 hängt die Konfiguration der Doppelschicht
von den Flächeneigenschaften
des Substrats 14 ab. Bei einem hydrophilen Substrat wie
Glas bildet die Membran 30 als eine einzige Doppelschicht über der
Gesamtfläche
des Substrats 14 ein kleines Wasserpolster wie in den 4 und 6–8 gezeigt.
Wenn das Substrat 14 dagegen aus einem hydrophoben Material
wie Teflon gebildet ist oder dessen Außenfläche mit einem hydrophoben Material
beschichtet ist, wird die Doppelschicht nur in dem Bereich über der Öffnung 22 ausgebildet.
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Vorzugsweise
hat die Membran 30 einen Ionenkanal 32, der in
diesen eingesetzt ist, der die Membran 30 individuell oder
in einigen Kombinationen mit anderen Ionenkanälen überspannt. In dem am meisten
bevorzugten Fall überspannt
der Ionenkanal 32 den Bereich 30 über der Öffnung 22.
Wenn die Membran 30 das Substrat 14 überspannt,
kann der Ionenkanal 32 mit einer physikalischen Struktur, die
von der Membran 30 vorragt, von einem Innenwandabschnitt 34 der Öffnung 22 eingefangen
werden, wie in 4 gezeigt, was verhindert, dass
der Ionenkanal 32 weg von der Öffnung 22 diffundiert. Dies
wird durch das Einsetzen des Ionenkanals 32 von dem Messvolumen 8 über die Öffnung 22 erreicht.
Ergebnisse zeigen bereits, dass es nicht wesentlich ist, dass der
Ionenkanal 32 genau in dem bestimmten Bereich angeordnet ist und
dass in dem Fall, dass eine Doppelschichtmembran 30 das
Substrat 14 abdeckt, Kanalströme von dem Ionenkanal 32 gemessen
werden können,
die in Bereichen der Membran 30 sind, die nahe der Öffnung 22 liegen, wie
dies auftritt, wenn ein Ionenkanal 32 in einen Teil der
Membran 30 direkt benachbart zu (d. h., über) dem
Substrat eingesetzt ist oder zu diesem gewandert ist.
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Eine
andere mögliche
Ausbildung für
die Membran 30 ist die Anordnung auf der Innenseite der Membran 14,
d. h., innerhalb des Volumens 8, nicht also dem Elektrolytbad 4.
Dieses Ausführungsbeispiel
bezieht sich auf eine Vorrichtung 2', wie sie in 5 gezeigt
ist, die eine Struktur ist, die insbesondere anwendbar ist zum Erzeugen
eines Feldes von Messelementen in einem festen Material wie einem Siliziumwafer.
Dieses verwendet festes Material (beispielsweise Si) zum Erzeugen
einer dickwandigen Grenze 12' mit
einer Basis 40, etwa PDMS auf dem Boden der Grenze 12' zum Erzeugen
einer kleinen Füllleitung 42 zum
Erlauben eines Zugangs zu einem Messvolumen 8'. Ein Ionenkanal
(in 5 nicht gezeigt jedoch entsprechend dem Ionenkanal 32 nach dem
ersten Ausführungsbeispiel)
wird in eine Membran 30' von
einer Badseite 4' über eine
Nanopore oder eine Öffnung 22' in einer Grenze 12' eingesetzt. Falls
gewünscht,
ist ein elektrophoretischer oder leitfähiger Ring 48 auf
der Grenze 12' um
den Bereich der Öffnung 22' ausgebildet
und wird auf ein gewünschtes
Potential angehoben, um eine elektrostatische Kraft zum Unterstützen der
Adressierung des Kanals zu erzeugen. Ein Nutzen der Membranausbildung
von 5 besteht darin, dass, wie in 4,
die Ionenkanäle 32 mit
einer Struktur, die von der Membran 30' vorragt, in der Öffnung 22' eingefangen
werden durch die Innenwand 34' der Öffnung 22', was ein Wegdiffundieren
der Ionenkanäle 32 verhindert. Ein
zweiter Nutzen besteht darin, dass ein minimaler Bereich der Membran 30' einem etwaigen
Analyt ausgesetzt wird, das dem System zugeführt wird über das Badvolumen 4', was mögliche chemische Belastungen
der Membran 30' des
Analyts minimiert. Drittens begrenzt in dem Fall eine Membran 30' die inhärent löslich ist,
wie einem Lipid, das kleinere Volumen des Messvolumens 8' die Gesamtlipidlösung in
dem Elektrolyt.
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Der
Fall, in dem eine Membran aus einer Zelle extrahiert wird, nähert sich
der Ausbildung, die in 6 gezeigt ist, an. In diesem
Fall wird ein Substrat 14 gegen eine (nicht vollständig gezeigte)
Zelle gedrückt
und eine Membran 50 ist die Zellmembran selbst, so dass
ein zellulärer
Ionenkanal 52 bereits in der Membran 50 vorhanden
ist. In diesem Fall wird das Substrat 14 nicht mit der
Außenstruktur 24 des Elektrolytbades
verbunden, die Vorrichtungsstruktur 11 und das Befestigungssubstrat 16 mit
der zugehörigen
Elektronik bewegt sich frei in dem Elektrolytbad 4, um
gegen die Zellen angeordnet zu werden, wenn dies erforderlich ist.
Um das Anhaften der Membran 50 zu unterstützen, kann
die Fläche
des Substrats 14 optional mit einem Material wie einem
Polylysin oder Fibronektin beschichtet sein, wie in 6 gezeigt, obwohl
auch bei einer solchen Klebeschicht angenommen wird, dass eine Wasserschicht 31'' noch vorhanden ist. Zusätzlich kann
ein Saugen auf ein Messvolumen 8 bei einem Patchclamping
einer Zelle aufgebracht werden. Die höhere Empfindlichkeit, die durch
die vorliegende Erfindung geschaffen wird, erlaubt ein Screenen
von zellulären
Iionenkanälen, etwa
eines Ionenkanals 52, der eine Leitfähigkeit hat, die zu gering
ist, um durch die vorbekannte Technik gemessen zu werden.
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Ein
Vorteil der vorbekannten Systemausbildung besteht darin, dass die
Gesamtkapazität
an dem Verstärkereingang
auf 10 pF und mehr, vorzugsweise auf 6 pF und besonders bevorzugt
auf 2 pF reduziert ist. Die Gesamtkapazität ist die Summe der Kapazität über einer
Membran, falls vorhanden, die Kapazität über die Wand 12 und
das Substrat 14, die Kapazität des Drahtes 27,
die die Messelektrode 19 mit dem Verstärker 26 verbindet,
zu der effektiven Schaltungsmasse und der Kapazität des Transistors und
anderer (nicht gezeigte) Schaltungselemente einschließlich der
Streukapazität
in der Verstärkerschaltung.
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Ein
weiterer Vorteil ergibt sich aus der Öffnung in Nanogröße nach
der vorliegenden Erfindung daraus, dass, da die Öffnungsgröße verringert ist, die Membran
mechanisch und elektrisch robuster wird. Die erhöhte elektrische Robustheit
wird begleitet durch die Erhöhung
der Messempfindlichkeit für
die Ionenkanäle,
die angelegte Spannungen tolerieren können, die größer sind
als die übliche
Größe von 150
Millivolt (mV). Im Allgemeinen induziert die erhöhte Spannung einen Kanalstrom,
der direkt proportional zunimmt, vorausgesetzt eine lineare Erhöhung des
gemessenen Signal-Rausch-Verhältnisses.
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Eine
signifikantes Ziel des sehr kleinen Ausbildens der Öffnung ist
die Zeit, die erforderlich ist, um einen Ionenkanal einzusetzen.
Ein Skalieren einer Öffnung
mit einem Durchmesser von 100 μm
zu eine von 1 μm
erhöht
die Zeit, die erforderlich ist, um einen Ionenkanal einzusetzen,
in der Größenordnung
von 10.000. Für
eine Membran, die wesentlich kleiner ist als diejenige, die bei
einem Standardpatchpipettieren verwendet wird, könne die Einbringzeit prohibitiv
lang sein. Bei einer Membran von einem Durchmesser von 25 mm wäre die Einbringzeit 16.000.000
mal länger
als bei einem Experiment mit einer üblichen künstlichen Membran. Eine Lösung zum
Reduzieren der Einbringzeit ist es, den Ionenkanal so nahe wie möglich an
den Öffnungsbereich
zu bringen. Ein Weg, dies zu erreichen, nutzt den besonderen Vorteil
der Messsystemausbildung von 3, wie in 7 gezeigt.
Eine kleine Kapillare 60 wird in das Messvolumen 8 eingebracht
zum Zweck des Indizierens eines Ionenkanals oder eines zu prüfenden Analyts
in die unmittelbare Nähe
einer Öffnung 22.
Dieses relativ kleine Volumen des Messvolumens 8 wirkt
als eine natürliche
Führung
zum Ausrichten der Kapillare 60 mit der Öffnung 22.
Bei einem in 8 gezeigten Ausführungsbeispiel
ist eine Kapillare 60' in
einem Leiter 64 beschichtet und wird als eine Elektrode
derart verwendet, dass eine gesonderte Elektrode nicht erforderlich
ist. Zusätzlich
können
Elektrophorese oder Elektroosmose verwendet werden zum Erhöhen der
Geschwindigkeit des Bringen eines Ionenkanals an eine Öffnung.
Nachdem der Ionenkanal in der Nähe
der Öffnung
ist, erhöht die
begrenzte Geometrie die elektrischen Felder, wodurch diese Antriebskräfte erhöht werden.
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Ein
Verfahren der Verwendung eines üblichen
Sampleausführungsbeispiel 2'' nach der vorliegenden Erfindung
wird jetzt unter Bezugnahme auf die 9 diskutiert.
Das System 2" weist
ein Elektrolytbad oder ein Fluidzufuhrelement 104 und ein
Elektrolytbad 108 auf, das mit einem Elektrolyt 110 versehen
ist. Das Fluidzufuhrelement 104 ist von dem Elektrolytbad 108 durch
eine Struktur 111 gesondert, das aus einer dicken Wandgrenze 112 und
einem Substrat 114 besteht. Zusätzlich erstreckt sich ein Befestigungssubstrat 116 über die
Oberseite des Elektrolytbads 118. Messelektroden 118 und 119 erstrecken
sich in das Fluidzufuhrelement 104 bzw. das Elektrolytbad 108.
Das Substrat 114 weist eine Öffnung 122 auf. Eine
Aufzeichnungselektronik 126 ist mit der Elektrode 119 über einen
Leiterdraht 127 verbunden. Eine Spannungsquelle 117 ist
mit der Badelektrode 118 verbunden und auf die elektrische
Masse des Systems bezogen. Das Zufuhrelement 104 ist an
dem Substrat 114 flüssigkeitsdicht
angebracht und beinhaltet einen fluidgefüllten Kanal 154, der über die Öffnung 122 verläuft zum
Zwecke des Lieferns von interessierenden Fluidproben zu der Fläche der Öffnung 122.
Fluide werden in das Zufuhrelement 104 an einem Zugangsanschluss 156 angegeben
und an einem Auslassanschluss 158 entfernt. Eine Messelektrode 118 ist,
wie gezeigt, in dem Kanal 154 befestigt oder in einem Fluidvolumen,
das mit dem Kanal 154 über
eine geringe elektrische Impedanz verbunden ist. Der Kanal 154 kann
jede geeignete Größe haben,
wie sie durch die Eingangs- und Ausgangsanforderungen der Probe
bestimmt wird. In einigen Tabellen sind der Querschnittsbereich
des Kanals 154 und/oder dessen Länge so klein wie möglich um
den Betrag des Analyts zu minimieren, der gesammelt werden muss.
In diesen Fällen
ist der Querschnitt des Kanals 154 vorzugsweise geringer als
1 mm2 und besonders bevorzugt ist der Kanal 154 in
dem Zufuhrelement 104 ausgebildet durch eine Mikrofluidtechnologie
und hat einen Flächenquerschnitt der Öffnung 122 in
der Größenordnung
von 10 μm
in der Breite × 10 μm in der
Höhe und
eine Länge
in der Größenordnung
von 1 cm.
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Die
Erfindung hat erhebliche Vorteile gegenüber vorhandenen Technologien
durch Verringern der Kapazität
parallel zu einem Ionenkanal durch die Verwendung eines sehr kleinen
Membranbereichs (d. h. über
die Öffnung)
in Nanogröße, die
Verwendung einer relativ dicken Wandgrenzstruktur verglichen mit
den „Patchpipetten", die bei den üblichsten Messungen
verwendet wird und eine hohe integrierte Ausbildung, die weiter
die Leiterlänge
minimiert. Weiter erlaubt die sehr kleine Öffnung die Verwendung von höheren angelegten
Spannungen und Erzeugung von größeren Kanalströmen. Zusätzlich wird bei
dem Stand der Technik die Leitfähigkeit
des Elektrolyts üblicherweise
so hoch wie möglich
angesetzt, um den Ionenstrom zu maximieren. In einigen Fällen wäre es erwünscht, die
Elektrolytkonzentration zu reduzieren oder die Eigenschaften über einen
Bereich von Konzentrationen zu messen. Dies erfolgt typischerweise
bei dem Stand der Technik jedoch nicht aufgrund der Berücksichtigung
des Signal-Rausch-Verhältnisses
(SNR). Die höhere
Empfindlichkeit des vorliegenden Systems erlaubt die Verwendung
eines reduzierten Ionenstroms. Dies wiederum erlaubt die Implementation
mit der Verwendung einer geringen Vorspannung oder die Verwendung
von geringeren vorhandenen Elektrolyten mit einer geringeren Konzentration.
Beispielsweise erlaubt eine Verbesserung der Systemempfindlichkeit
um den Faktor fünf
eine Reduktion der Vorspannung von 100 mV auf 20 mV oder eine Reduzierung der
Elektrolytkonzentration von 1 M auf 0,2 M.
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10 vergleicht
die Verbesserungen der Empfindlichkeit und der Bandbreite bei üblichen
Teflonöffnungen
(künstliche
Membran) und Patchpipettensystemen. Es ist werter der Effekt der
Zunahme der angelegten Vorspannung um den Faktor 10 bei äquivalenter
Empfindlichkeit an dem Eingang des Verstärkers oder der Aufzeichnung
der Elektronik gezeigt.
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Wie
in 10 gezeigt, nimmt die Zunahme der Empfindlichkeit
um einen Faktor von 2 bis 4 zu bei gegenwärtig verwendeten Messfrequenzen
von 2–10
kHz und auf 20 bis 40, wenn eine um das Zehnfache höhere Spannung
verwendet wird. Zusätzlich bietet
das System eine Erhöhung
der Messbandbreite gegenüber
dem Stand der Technik bei Standardempfindlichkeitspegeln um das
Fünf- bis
Zehnfache, abhängig
davon, ob die erste Verstärkerstufe
dazu optimiert ist, bei höheren
Frequenzen zu arbeiten. Diese Erhöhung der Bandbreite ermöglicht die
unmittelbare Anwendung bei dem Detektieren von Ereignissen, die
sehr schnelle Änderungen
des elektrischen Stroms verursachen, etwa DANN, die durch einen
Kanal wandert. Bis heute können
derartige schnelle Änderungen
nicht direkt gemessen werden.
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Obwohl
die Erfindung unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsbeispiele
beschrieben worden ist, versteht es sich, dass verschiedene Änderungen
und/oder Modifikationen der Erfindung ausgeführt werden können, ohne
sich von dem Grundgedanken zu lösen.
Beispielsweise versteht es sich, dass obwohl die verschiedenen in
den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele
nur ein einziges Ionenkanalsystem zeigen, die vorliegende Erfindung
aufgewendet werden kann mit einem Feld von Messelementen. Im Allgemeinen
soll die Erfindung nur durch den Schutzbereich, der sich aus den
folgenden Ansprüchen
ergibt, beschränkt
sein.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Eine
Vorrichtung und ein Verfahren zum Messen eines Zeitvariantenionenstroms
in einem elektrolytischen System (2, 2', 2'') mit einer ersten Fluidkammer
(4, 4', 104)
und einer zweiten Fluidkammer (8, 8', 108), die durch eine
Grenzstruktur (115, 12', 111) getrennt ist, wobei
die Grenzstruktur (11, 12', 111) dicke Wände (12, 112)
aufweist und ein Substrat (14, 114) mit einer Öffnung (22, 22', 122)
in dieser mit der ersten (4, 4', 104) und der zweiten
Fluidkammer (8, 8', 108),
die über
die Öffnung
(22, 22', 122)
miteinander kommunizieren. Ein Potential wird zwischen die Elektroden 18, 19, 118, 119)
in der jeweiligen ersten (4, 4', 104) bzw. der zweiten
(8, 8', 108)
Fluidkammer angelegt, so dass ein elektrischer Strom zwischen ihnen
und durch die Öffnung
(22, 22', 122)
verursacht wird. Die Gesamtkapazität des Systems ist kleiner 10
pF. Analyte über
der Öffnung (22, 22', 122)
werden gemessen. Ein Verstärker
(26, 126) in der Nähe der Grenzstruktur (11, 12', 111)
und den Elektroden (18, 19, 118, 119)
verstärkt
das Ionenstromsignal.