DE1189763B

DE1189763B - Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfaehigkeit des Blutes waehrend einer Antikoagulantien-Therapie und Verfahren zur Herstellung des Reagens

Info

Publication number: DE1189763B
Application number: DEO6747A
Authority: DE
Inventors: Dr Med Paul Arnor Owren
Original assignee: PAUL ARNOR OWREN DR MED
Current assignee: PAUL ARNOR OWREN DR MED
Priority date: 1958-05-16
Filing date: 1959-04-30
Publication date: 1965-03-25
Also published as: GB917012A; FR1223856A; NL123584C; US3179567A; ES249137A1; NL238873A; CH408283A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

GOIn

Deutsche KL: 421-3/54

Nummer: 1189 763

Aktenzeichen: O6747IXb/421

Anmeldetag: 30. April 1959

Auslegetag: 25. März 1965

Orale Antikoagulantien (Dikumarol und Dikumarolabkömmlinge, Phenylindandion und ähnliche Substanzen) bewirken eine Herabsetzung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Sie kommen in großem Maße bei der Behadlung und Vorbeugung thrombotischer Geschehen zur Anwendung. Die Thromboseprophylaxe findet mehr und mehr bei arteriosklerotischen Leiden (Coronar-Infarkt, Angina pectoris, cerebrale und periphere arterielle Thrombosen) allgemeine Anwendung.

Eine wirkungsvolle Behandlung mit Antikoagulantien fordert eine regelmäßige Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes. Es ist notwendig, die Dosierung individuell zu gestalten; denn auf der einen Seite gilt es, Blutungskomplikationen, bedingt durch Überdosierung, zu meiden, auf der anderen Seite ist die Behandlung bei zu kleinen Gaben wirkungslos.

Mit früher beschriebenen Kontrollmethoden war es nicht möglich, die Gerinnungsfähigkeit des Blutes in jedem Fall mit ausreichender Sicherheit individuell genug zu bestimmen, um die Schwierigkeiten bei der Dosierung zu lösen. Man benötigt daher dringend eine Bestimmungsmethode, die eine genaue Kontrolle möglich macht.

Aus der folgenden Darlegung der Erfindung geht hervor, wie das vorliegende Problem mit Hilfe eines besonderen, hierfür entwickelten Reagens in einer zufriedenstellenden Weise gelöst ist.

Um die Erfindung leichter verständlich zu machen, soll zunächst ein kurzer Überblick über den Wirkungsmechanismus der Antikoagulantien gegeben werden.

Die Blutgerinnung ist abhängig von zwei teilweise voneinander getrennten Gerinnungssystemen, dem externen und dem internen System. Die peroral appli-

Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während einer Antikoagulantien-Therapie und Verfahren zur Herstellung des Reagens

Anmelder:

Dr. med. Paul Arnor Owren,

Blommenholm, Baerum (Norwegen)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein,

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger, Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Dr. med. Paul Arnor Owren,

Blommenholm, Baerum (Norwegen)

Beanspruchte Priorität:

Norwegen vom 16. Mai 1958 (128 104)

zierten Antikoagulantien bewirken eine Verminderung folgender Blutgerinnungsfaktoren: Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor. Von diesen Faktoren sind das Prothrombin und der Stuart-Faktor an beiden Systemen beteiligt. An beiden Systemen sind außerdem auch Proaccelerin und Fibrinogen beteiligt. Proconvertin ist nur im externen System und der Antihaemophilie-B-Faktor nur im internen System wirksam. Dies zeigt das folgende Schema:

Systeme der Blutgerinnung

Das »interne« System (»Kephalin-Zeit«)

Blut-Plättchen-Faktor 3 (»Kephalin«) Antihaemophilie-A-Faktor (A. H. G.) Antihaemophilie-B-Faktor (P. T. C.) Antihaemophilie-C-Faktor (P. T. A.) »Hageman«-Faktor

»Stuart«-Faktor Protombin

Das »externe« System
(»Thromboplastin-Zeit«)

Gewebsthromboplastin
Proconvertin

Proaccelerin

Fibrinogen

Bisher gab es keine brauchbare Methode, die es ermöglichte, das völlige Ausmaß der Verminderung der vier für den ganzen Gerinnungsprozeß bedeutungsvollen Faktoren quantitativ zu erfassen, d.h. sowohl im internen als auch im externen System.

509 520/34*

Die bisher gebräuchlichsten Methoden, nämlich die Quicksche Methode und die sogenannte PP-Methode (Prothrombin-Proconvertin-Methode), zeigen nur Veränderungen im externen System an. Sie weisen daher, wenn sie zur Überwachung der Antikoagulantienbehandlung verwendet werden, nur eine Verminderung von Proconvertin, Stuart-Faktor und Prothrombin nach. Eine Verminderung von Antihaemophilie-B-Faktor wird durch die Quicksche Methode überhaupt nicht und mit der PP-Methode nur zu einem sehr geringen Maße erfaßt.

Das erfindungsgemäße Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während einer Antikoagulantien-Therapie ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Thromboplastin mit schwacher, aber konstanter Aktivität in Kombination mit einem Kepha-Hn oder Kephalinsubstituenten mit sehr großer Aktivität menschlichem Plasma gegenüber enthält.

Vorzugsweise enthält das Reagens daneben noch Rinderplasma, aus dem Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor entfernt sind. Ferner enthält es vorteilhaft auch Gerinnungsfaktoren, die durch die peroralen Antikoagulantien nicht vermindert werden, in großer Konzentration. Das Reagens enthält vorzugsweise auch Calciumchlorid in einer Menge, die nach Wiederauflösung des Reagens und Zufügung des Testplasmas eine optimale Konzentration für die Gerinnung gewährleistet.

Zur Herstellung des Reagens nach der Erfindung verfährt man wie folgt: Das in an sich bekannter Weise hergestellte Thromboplastin wird mit der ebenfalls in an sich bekannter Weise hergestellten Kephalinsuspension gemischt, aus Rinderplasma wird Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor durch wiederholte Absorption an unlöslichen Schwermetallsalzen, insbesondere Bariumsulfat, und anschließende Abtrennung des Salzes durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt, die erhaltene verarmte Plasmalösung wird dialysiert, und die dialysierte Plasmalösung wird zu dem Thromboplastin-Kephalin-Gemisch gegeben, der pH-Wert des Gemisches wird auf 6 bis 8 eingestellt, und schließlich setzt man das CaCl₂ hinzu.

Das grundlegende Problem bei der Herstellung des Reagens besteht darin, daß es sich hierbei um ein Gemisch enzymatisch aktiver Proteine handelt, bei deren Abtrennung und Reinigung von den begleitenden Proteinen alles vermieden werden muß, was eine Denaturierung zur Folge haben könnte. Nun stellt die Isolierung und Reinigung eines Proteins fast immer eine empirische Aufgabe dar, da die bekannten Fraktioniermethoden, wie z. B. Fraktionierung mit Salzen, insbesondere Ammonsulfat, Fällung mit organischen Lösungsmitteln, wie Alkohol und Aceton, Absorbierung an Cellulose, Aktivkohle, Aluminiumoxyd, Ionenaustauschern usw., alle unspezifisch sind und ihre zweckmäßige Zusammensetzung und Aufeinanderfolge nicht voraussehbar ist. Eine weitere Voraussetzung bildet ein entsprechend leistungsfähiger Test, mit dem die Ergebnisse der angewandten Trennverfahren überprüft werden können.

Die Herstellung des Thromboplastins und der Kephalinsuspension erfolgt in Anlehnung an bekannte ältere Verfahren, die ebenfalls auf den Erfinder zurückgehen. Die Herstellung eines enzymatisch aktiven und stabilen Rinderplasmas, aus dem Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor entfernt wurden, gelang erstmalig, wobei überraschenderweise die wiederholte Absorption an unlöslichen Schwermetallsalzen zum Ziel führte. Schwermetallionen sind bekanntlich starke Enzymgifte und haben gewöhnlich auch in Spuren eine Inaktivierung der Proteine zur Folge, so daß üblicherweise den Lösungen sogenannte Schwermetallfänger, wie z. B. Komplexbildner, zugesetzt werden, um spurenweise aus Gefäßen odei sonstigen Geräten herausgelöste Ionen zu entfernen. Auch die folgenden Verfahrensschritte waren keinesfalls naheliegend, da z. B. die Dialyse ebenfalls in vielen Fällen eine Inaktivierung des Enzyms zur Folge hat und daher zumeist nur vorsichtig und zui Entfernung von hohen Salzkonzentrationen, wie sie z. B. bei der Magnesiumsulfatfällung auftreten, angewendet wird.

In der Zeichnung zeigt F i g. 1 die Empfindlichkeit der drei diskutierten Methoden gegenüber abfallenden Mengen von Antihaemophilie-B-Faktor. Dit »Konzentration« des Antihaemophilie-B-Faktors im Vergleich zu den übrigen Faktoren ist in Prozent der Norm auf der Abszisse abgetragen. Die Gerinnungszeit ist in Sekunden (20 bis 160 Sekunden) auf der Ordinate abgetragen.

Die Untersuchung wurde durch Mischen von Antihaemophilie-B-Plasma mit Normalplasma in verschiedenen Mengenverhältnissen ausgeführt.

Kurve A zeigt die Empfindlichkeit der neuen Methode auf die Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors.

Kurve B zeigt die Empfindlichkeit der PP-Methode und Kurve C die der Quickschen Methode auf Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors.

Die in den Kurven dargestellten Unterschiede lassen sich dadurch erklären, daß bei der PP-Methode und der Quickschen Methode dem Plasma oder Blut ein sehr aktives Gewebsthromboplastin zugeführt wird.

Bei der Quickschen Methode verwendet man ein Kaninchenhirnextrakt und bei der PP-Methode ein Menschenhirnextrakt. Diese sehr aktiven Gewebsthromboplastine bewirken, daß ausschließlich eine Gerinnung über das äußere System abläuft, da sich der Gerinnungsvorgang hierbei sehr schnell vollzieht, lange bevor das interne System voll aktiviert ist. Daher beträgt die normale Gerinnungszeit von Plasma nach Zugabe von aktivem Thromboplastin, wie bei der Quickschen Methode, nur 12 bis 13 Sekunden. Das interne System braucht dagegen sogar nach Zufügung einer optimalen Menge von Kepha-Iin mindestens 50 Sekunden zur Bildung von Thrombin, das in einem weiteren Schritt Fibrinogen zur Gerinnung bringt. Die Hinzufügung von derartig aktivem Thromboplastin umgeht das interne System völlig. Die Quicksche Methode der Gerinnungszeitbestimmung (auch »Prothrombin-Zeit« oder »Thromboplastin-Zeit« genannt) weist demnach sogar bei völligem Fehlen des Antihaemophilie-B-Faktors ganz normale Werte auf (vgl. F i g. 1).

Es soll auch darauf hingewiesen werden, daß es Methoden zur Kontrolle des internen Systems gibt, die Kephalin an Stelle von Thromboplastin verwenden. Diese Methoden können je nach ihrer Art für die Bestimmung der verschiedenen Antihaemophiliefaktoren verwendet werden. Methoden dieser Art wurden jedoch aus zwei Gründen nie zur Über-

wachung der Antikoagulantien-Therapie benutzt. Erstens sind solche »Kephalin-Zeiten« sehr empfindlich gegenüber einer Reihe äußerer Einflüsse. Zweitens sprechen sie überhaupt nicht auf Veränderungen im externen Gerinnungssystem an, wobei insbesondere Schwankungen in der Proconvertinkonzentration sehr bedeutungsvoll sein können.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode dar, die es möglich macht, in einem Untersuchungsgang gleichzeitig die Gerinnungsfähigkeit des Blutes im internen und externen System zu bestimmen. Mit Hilfe des neuen Reagens wird der Gerinnungsablauf im internen und externen System gleichzeitig in Gang gesetzt, und zwar in der Art, daß sie annähernd mit der gleichen Geschwindigkeit ablaufen. Hierdurch wird erreicht, daß beide Systeme annähernd gleichen Einfluß auf die Gerinnungszeit des Bestimmungssystems ausüben.

Frühere Methoden zur Überwachung der
Antikoagulantien-Therapie

Hauptsächlich zwei Methoden wurden bisher, wie bereits berichtet, zur Überwachung der Antikoagulantien-Therapie verwendet:

I. Die Quicksche Methode.
II. Die PP-Methode.

I. Die Quicksche Methode
(A. J. Quick: Biol. Chem. J., 109, LXXIII [1935])

Die Quicksche Methode war ursprünglich als Methode zur Bestimmung des Prothrombins im Blut eingeführt worden. Das Proconvertin, der Stuart-Faktor und das Proaccelerin waren zu der Zeit noch unbekannt. Bei dieser Methode werden die Konzentrationen von Calcium und Thromboplastin konstant gehalten.

Diese Methode wurde geringfügigen Veränderungen unterzogen.

Die Ausführung ist in Kürze die folgende.

Reagenzien:

1. Thromboplastinsuspension: Acetongetrockneter Kaninchenhirnextrakt.

2. Calciumchloridlösung 0,01 molar.

Bestimmung: 0,1 ml Oxalatplasma wird mit 0,1 ml Thromboplastinlösung versetzt und im Wasserbad bei 37° C gehalten. Nach Zufügung von 0,1 ml einer 0,01 molaren Calciumchloridlösung wird die Gerinnungszeit bzw. »Thromboplastin-Zeit« (auch »Quicksche Prothrombin-Zeit« genannt) bestimmt.

Beurteilung: Die Methode erfaßt nur das externe Gerinnungssystem (s. Schema). Wie bereits dargelegt, ist das interne Gerinnungssystem ohne Einfluß auf diese Bestimmung.

Nur das Thromboplastin und Calcium werden bei der Quickschen Methode konstant gehalten. Die Veränderung irgendeines der übrigen Faktoren im externen System: Prothrombin, Proconvertin, Stuart-Faktor, Proaccelerin und Fibrinogen, würde demnach die beschriebene Quicksche »Thromboplastin-Zeit« beeinflussen können. Man nimmt an, daß während einer Behandlung mit Antikoagulantien Proaccelerin und Fibrinogen weitgehend konstant bleiben. Jede Verlängerung der Quickschen »Thromboplastin-Zeit« wird so auf eine Verminderung des Proconvertins, Stuart-Faktors und/oder Prothrombins zurückzuführen sein. Auf der anderen Seite wird eine Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors mit dieser Methode überhaupt nicht erfaßt. Bei der Haemophilie B ist die Quicksche »Thromboplastin-Zeit« normal (s. F i g. 1). Wird diese Methode daher zur Kontrolle bei der Dosierung im Verlaufe einer Antikoagulantien-Therapie verwendet, so besteht die Gefahr einer Blutungskomplikation infolge

ίο einer besonders starken Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors, da solch eine Veränderung mit Hilfe dieser Methode nicht nachgewiesen werden kann. Bei dem quantitativen Nachweis der verschiedenen beteiligten Faktoren in spezifischen Bestimmungssystemen wurde gefunden, daß der Antihaemophilie-B-Faktor oft bedeutend stärker vermindert ist als alle übrigen Faktoren. Dies kann man aus der F i g. 2 ersehen. Diese Ergebnisse gelten für Phenylindandion, aber Dikumarol und Dikumarolabkömmlinge haben grundsätzlich den gleichen Effekt.

Auf der Abszisse bedeuten die Zahlen 8-30 das Datum im März 1957, als diese Untersuchungen ausgeführt wurden. Die Untersuchungen wurden am 2. April 1957 abgeschlossen.

Auf der Ordinate ist der Prozentgehalt (dieser versteht sich nicht absolut, 100% bedeutet: normale »Konzentration«) an Prothrombin, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor, der an den betreffenden Tagen im Blut gefunden wurde, abgetragen.

Kurve D zeigt den Prozentgehalt an Prothrombin im Blut; Kurve E zeigt den Prozentgehalt an Proconvertin und Kurve F den Prozentgehalt an Antihaemophilie-B-Faktor.

Wie hieraus hervorgeht, war der Spiegel der drei erwähnten Faktoren bei Beginn der Untersuchung annähernd lOO^fl/o. Am 9. März 1957 wurde mit der Gabe des Antikoagulans Phenylindandione begonnen. Die tägliche Dosis ist im oberen Anteil der Figuren aufgezeichnet. Die vertikale Linie zur Linken dieses Anteils bedeutet 100 mg Phenylindandione. Die Größe jeder Tagesdosis erscheint, auf der vertikalen Linie herab abgetragen, in Höhe des betreffenden auf der Abszisse verzeichneten Datums. Am 25. März wurde mit der Verabreichung des Antikoagulans aufgehört. Der Prozentgehalt der Faktoren stieg daraufhin schnell an.

Man ist der Ansicht, daß die Tatsache, daß die Quicksche Methode unempfindlich gegenüber einet Verminderung an Antihaemophilie-B-Faktor ist, eine der Ursachen für die relativ häufigen Blutungskomplikationen, wenn die Quicksche Methode als Kontrolle für die Antikoagulantien-Therapie benutzt wird, ist.

Unter anderen Nachteilen dieser Methode möge noch hervorgehoben werden, daß sie unempfindlich gegenüber Veränderungen aller drei beteiligten Faktoren, sofern diese sich im Bereich von 50 bis 100 % des Normalen bewegen, ist. Ferner ist die verwendete Calciumkonzentration, wenn der Hämatokritwert des Blutes nicht normal ist, nicht optimal. Außerdem ist die »Thromboplastin-Zeit« durch die Proaccelerinkonzentration im Testplasma beeinflußt. Das Proaccelerin ist unstabil und wird während der Lagerung von Oxalatplasma beeinflußt. Das Proaccelerin ist unstabil und wird während der Lagerung von Oxalatplasma inaktiviert. Aus diesem Grunde werden für diese Methode relativ frische Blutproben benötigi.

II. PP-Methode (Prothrombin-Proconvertin-Methode)

Reagenzien:

1. Thromboplastinsuspension: schenhimextrakt.

Wäßriger Men-

2. Absorbiertes Rinderplasma.

3. Calciumchloridlösung in optimaler Konzentration (normalerweise 0,025 molar).

Ausführung: 0,2 ml absorbiertes Rinderplasma werden mit 0,2 ml Thromboplastinsuspension und 0,2 ml einer 1:10-Verdünnung des Testplasmas versetzt. Dieses Inkubationsgemisch wird im Wasser bad bei 37° C gehalten. Nach Zufügung von 0,2 ml Calciumchloridlösung wird die Gerinnungszeit gemessen.

Beurteilung: Wie im Falle der Quickschen Me thode ist die PP-Methode eine Bestimmung der Thromboplastin-Zeit, d. h., sie ist in erster Linie eine Methode zur Bestimmung der Aktivität im externen Gerinnungssystem. Die hauptsächlichen Unterschiede zwischen der PP-Methode und der Quickschen Methode sind folgende:

1. Zur Stabilisierung der Proaccelerin- und Fi- brinogeakonzentrationen wird ein neues Reagens, das absorbierte Rinderplasma, eingeführt. Die Bestimmung ist daher unabhängig von der Konzentra tion dieser Faktoren im Testplasma. Da die Faktoren, die im Verlaufe einer Antikoagulantienbehandlung vermindert werden, während der Lagerung von Blut oder Plasma relativ stabil sind, kann diese Methode auch bei gelagerten Blutproben zur Anwendung kommen.

2. Es kommt eine Verdünnung des Testplasmas im Verhältnis 1:10 zur Anwendung. Dies erhöht die Empfindlichkeit der Methode, besonders im Be reich zwischen 50 und 100%. Die Verdünnung des Testplasmas hat außerdem den Vorteil, daß bei unterschiedlichen Hämatokritwerten das Risiko einer inoptimalen Calciumkonzentration weit geringer als bei der Quickschen Methode ist. Das Verdünnen eliminiert auch noch die Einwirkung kleiner Heparinmengen auf das Testplasma.

Wie die Quicksche Methode so ist auch die PP- Methode empfindlich gegenüber Verminderungen des Prothrombine, des Stuart-Faktors und des Proconvertins.

Das in der PP-Methode verwendet Thromboplastin (wäßriger Menschenhirnextrakt) übt zusätz lich zu seinem thromboplastischen Effekt einen Kephalineffekt auf das interne Gerinnungssystem aus. Dieser Effekt ist jedoch nicht optimal. Als Folge dieses Kephalineffektes und der Testplasmaverdünnung kann man nachweisen, daß die PP-Methode eine gewisse, wenn auch außerordentlich geringe Empfindlichkeit gegenüber einer starken Verminde rung des Antihaemophilie-B-Faktors, falls das äußere Gerinnungssystem bereits weitgehend im Verlaufe einer Antikoagulantienbehandlung gestört ist, besitzt (s. Fig. 1). Diese Empfindlichkeit der PP-Methode auf Verminderung an Antihaemophilie-B-Faktor ist, vom Standpunkt der klinischen Praxis aus gesehen, bei weitem zu gering, als daß sie einen sicheren Schutz gegen Blutungskomplikationen infolge starker Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors bieten könnte.

Im Laufe der Zeit wurden andere Modifikationen der Quickschen Methode empfohlen, z. B. die Anwendung anderer Thromboplastinpräparate — aus. Kaninchenlunge oder Menschenhirn, einige in acetongetrockneter Form, und andere in lyophilisierter Form. Testplasmaverdünnungen mit der Absicht, die Empfindlichkeit der Methode besonders im Bereich von 50 bis 100% zu erhöhen, kamen ebenfalls zur Anwendung. Die Änderung der Calciumkonzentration in bezug auf den Hämatokritwert des Blutes wurde auch schon empfohlen, um eine optimale Rekalzifizierung zu sichern. Jedoch hat keine dieser Modifikationen das Prinzip der Methode geändert, und keine vermochte es, die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors zu beheben.

Die Reagenzien für die PP-Methode — das absorbierte Rinderplasma und die Thromboplastinsuspensionen — wurden auch in lyophilisierter Form hergestellt. Diese Änderung übte natürlich keinen Einfluß auf die fehlende Empfindlichkeit der Methode gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors aus.

Methode bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Reagens zur Überwachung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während der Antikoagulantien-Therapie

Aus obiger Beschreibung geht hervor, daß keines der bisher zur Verfügung stehenden Hilfsmittel eine zufriedenstellende Kontrolle bei der Antikoagulantien-Therapie darstellt. Das erfindungsgemäße Präparat erlaubt dagegen eine zufriedenstellende Kontrolle dieser Therapie.

Dieser Vorgang basiert auf einem gänzlich neuen Prinzip, und zwar darauf, daß die Bestimmung der Aktivität im internen und externen Gerinnungssystem gleichzeitig und kombiniert durchgeführt wird. Bisher gab es keine Methode für solch eine kombinierte Bestimmung. Die beiden Gerinnungssysteme wurden immer getrennt untersucht. Die Methode basiert auf einem Reagenz, das beide Gerinnungssysteme gleichzeitig und derart in Gang setzt, daß beide nahezu die gleiche Zeit gebrauchen. Um diese Bedingung zu erfüllen, wurden dem internen Gerinnungssystem optimale Bedingungen für größte Geschwindigkeit gegeben, indem Kephalin aus Menschenhirn oder andere Kephaline, welche die gleiche Aktivität besitzen, dem Reagens in optimaler Konzentration zugesetzt wurden. Unter diesen Bedingungen wird das interne Gerinnungssystem allein in ungefähr 50 Sekunden zur vollständigen Gerinnung führen.

Gleichzeitig enthält das Reagens ein Thromboplastin, das das externe Gerinnungssystem in Gang setzt. Dieses Thromboplastin ist solcher Natur, daß es in optimaler Konzentration eine geringe und eine konstante Aktivität besitzt. Das hat zur Folge, daß die Geschwindigkeit im externen Gerinnungssystem im Vergleich zu der normalen Geschwindigkeit aktiver Thromboplastinarten, wie sie bei der Quickschen und PP-Methode zur Anwendung kommen, bedeutend herabgesetzt ist. Das Thromboplastin, das bei dieser Methode zur Anwendung kommt, soll in optimaler Konzentration bei der Verwendung von normalem Plasma eine Thromboplastin-Zeit von 35 bis 50 Sekunden geben.

Theoretisch könnte ein solch schwaches Thromboplastin durch Verdünnung eines aktiven Thrombo-

9 10

plastins (derart, wie es für die Quicksche und PP- Index dar. Der entscheidende Unterschied gegen-

Methode verwendet wird) erhalten werden. Bei sol- über früheren Mechoden ist, wie bereits beschrieben,

chem Vorgehen erhält man jedoch ein labiles und die Empfindlichkeit der neuen Methode gegenüber

praktisch unbrauchbares Reagens, da kleine Ände- einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors.

runeen in ihrer Aktivität beträchtliche Schwankun- 5 _. ,τ.

gen in der Zeitmessung verursachen. Im erfindungs- Zusammensetzung des Reagens

gemäßen Reagens kommt daher ein Thromboplastin Das neue Reagens hat die folgende Zusammen-

zur Anwendung, das eine stabile und niedrigere Setzung:

Aktivität bei optimaler Konzentration aufweist und 1. Thromboplastin. Dieses Thromboplastin hat in

einen relativ weiten Bereich optimaler Konzentratio- io optimaler Konzentration eine niedrige Aktivität und

nen besitzt. zeigt mit Normalplasma eine Thromboplastin-Zeit

Als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines sol- von 35 bis 50 Sekunden. Dieses Thromboplastin

chen Thromboplastins werden Organe gewisser Tier- wird aus tierischen Organen, die auf Grund ihrer

arten verwendet. Das hergestellte Thromboplastin ist Artspezifität nur langsam mit menschlichem Procon-

artspezifisch und reagiert nur langsam mit mensch- 15 vertin reagieren, hergestellt. Beispiele sind: Rinder-,

lichem Proconvertin. Thromboplastine, hergestellt Pferde- und Schweinegehirn.

aus Rinder-, Schweine- und Pferdehirn, haben dieses 2. Kephalin. Dieses Kephalin ist dadurch charak-

Charakteristikum. terisiert, daß es mit menschlichem Plasma intensiv

Diese Kombination in einem Reagens: Ein Throm- reagiert. Es kann aus Menschenhirn hergestellt wer-

boplastin mit schwacher Aktivität gegenüber Men- zo den. Auch andere Kephalin-Lezithin-Präparate, die

schenplasma, zusammen mit einem menschlichen intensiv mit menschlichem Plasma reagieren, können

Kephalin (oder Kephalinsubstituenten), beide in opti- verwendet werden, z. B. ein Kephalinpräparat von

maler Konzentration, zu mischen, hat zur Folge, daß Sojabohnen.

das interne und externe Gerinnungssystem nahezu 3. Absorbiertes Ochsenplasma. Dieses wird in der

gleichen Einfluß auf die Gerinnungszeit ausüben. 25 Art hergestellt, daß es eine hohe und gleichblei-

Daher ist diese Methode sowohl empfindlich gegen- bende Menge all der Gerinnungsfaktoren, die durch

über einer Verminderung des Antihaemophilie-B- die Antikoagulantienbehandlung nicht verändert

Faktors im internen System als auch gegenüber einer werden, enthält, während es gleichzeitig frei von den

Verminderung des Proconvertins im externen System. folgenden vier Faktoren Prothrombin, Stuart-Faktor,

Außerdem zeigen natürlich der Stuart-Faktor und 30 Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor ist.

das Prothrombin, die in beiden Systemen eingreifen, 4. Calciumchlorid. Calciumchlorid ist dem Reagens

ihre Wirkung. in einer Menge zugesetzt, die nach Zufügung des

Fig. 1 zeigt die deutliche Empfindlichkeit dieser Testplasmas eine optimale Konzentration für die

Methode gegenüber einer großen Verminderung des Gerinnung bietet.

Antihaemophilie-B-Faktors, im Gegensatz zu der 35 All die vier aufgeführten Anteile werden in einem

sehr mangelhaften Empfindlichkeit der Quickschen Reagens vereinigt. Dieses Reagens ist so stabil, daß

Methode und der sehr schwachen Empfindlichkeit es sogar in Lösung nach 24 Stunden Lagerung bei

der PP-Methode. Hieraus folgt, daß die prinzipiellen Zimmertemperatur unveränderte Aktivität zeigt.

Unzulänglichkeiten der bisher gebräuchlichen Me- Diese Stabilität wird unter anderem dadurch erzielt,

thoden und Reagenzien in allen wesentlichen Punk- 40 daß es gelang, die obenerwähnten vier Gerinnungs-

ten abgeschafft wurden. faktoren völlig zu eliminieren. Natürlich war es

Die Erfindung basiert fernerhin auf der Erkennt- früher möglich, Thromboplastin und Calcium in

nis, daß die bestimmten Gerinnungszeiten unabhän- einem Reagens zu vereinigen. Jedoch war es nicht

gig von Veränderungen aller der Gerinnungsfakto- möglich, nach Zusatz von Calcium zu einem absor-

ren, die bei der Antikoagulantienbehandlung nicht 45 bierten Plasma in oder ohne Gegenwart von Throm-

betroffen werden, sein sollen. Dem wird Rechnung boplastin dieses als ein stabiles Reagens zu erhalten,

getragen, indem alle diese Faktoren in hoher und Dieses »Alles-in-einem«-Reagens wird ampulliert

konstanter Menge in das Reagens einbezogen wer- in lyophilisierter Form zur Verteilung gebracht. Die

den. Hierzu wird ein sorgfältig absorbiertes Ochsen- Untersuchungen zeigten eindeutig die optimalen Be-

plasma, ähnlich wie bei der PP-Methode, verwendet. 50 dingungen für die Stabiliät des getrockneten Präpa-

Dieses absorbierte Rinderplasma enthält eine große rates, insbesondere in bezug auf die Ionenstärke, die

Menge an Antihaemophilie-A-Faktor, Antihaemo- Konzentration der Antikoagulantien usw.

philie-C-Faktor und Hageman-Faktor (aus dem in- Das lyophilisierte Reagens wird für die Kapillar-

ternen System) und Proaccelerin und Fibrinogen (die methode oder die Venenblutmethode in destilliertem

auf beide Systeme einwirken). Ferner ist es derart 55 Wasser bzw. einer Calciumchloridlösung gelöst,

aufbereitet, daß es keine nachweisbaren Mengen an Stabilität: Nach Lagerung der Ampullen über

Proconvertin, Antihaemophilie-B-Faktor, Stuart- 30 Tage bei 47° C zeigte das Reagens unveränderte

Faktor und Prothrombin (gerade die vier während Aktivität.

der Antikoagulantienbehandlung verminderten Fak- . _ , _

toren) enthält. 60 Aufbereitung des Reagens

Daraus folgt, daß das Reagens spezifisch für und Im folgenden wird die Aufbereitung des zur Erfin-

empfindlich gegenüber all den vier während einer dung gehörigen neuen Reagens beschrieben.

Antikoagulantienbehandlung verminderten Faktoren Thromboplastin: Man verwendete Rinderhirn, da,

ist. Gleichzeitig wird es durch Veränderungen an- wie schon oben beschrieben, das Rinderhirnthromboderer Gerinnungsfaktoren nicht beeinflußt. Die 65 plastin träge mit menschlichem Proconvertin auf

durch diese Methode erzielten Gerinnungszeiten stel- Grund ihrer Artspezifität reagiert. Rinderhirnextrakt

len daher einen der vollständigen Wirkung der Anti- gibt in optimaler Konzentration mit normalem

koagulantien auf die Blutgerinnung entsprechenden menschlichem Plasma eine Thromboplastin-Zeit von

annähernd 35 Sekunden. Es wird in der gleichen Weise wie das Menschenhirnthromboplastin aufbereitet (P. A. Owren, J. elin. &Lab. Invest., I, S. 81 [1949]).

»Rohe« Kephalinsuspension: Diese wird entsprechend der kürzlich veröffentlichten Methode aus Menschenhirn hergestellt (P. Hjort, S. I. Rapaport und P. A. Owren, J. Lab. elin. Medicine, 46, S. 89 bis 97 [1955]).

Die Menge an Thromboplastin und Kephalin (oder Kephalinsubstituenten) ist derart abgestimmt, daß ihre Konzentration im endgültigen Reagens optimal ist.

Absorbiertes Ochsenplasma

1. Blut und Plasma werden so behandelt, daß das absorbierte Plasma neben dem Antihaemophilie-A-Faktor, Hageman-Faktor, Proaccelerin und Fibrinogen eine hohe Konzentration an Antihaemophilie-C-Faktor in nicht aktivisierter Form enthält. Das entscheidende dieses Umstandes hat man früher nicht verstanden.

2. Absorption wird mit Bariumsulfat ausgeführt, und zwar in solcher Menge und durch wiederholte Absorption, daß das Substrat völlig frei von Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor ist.

3. Zur vollständigen Entfernung des suspendierten Bariumsulfates wird außerordentlich sorgfältig zentrifugiert.

4. Als neues Prinzip kommt die Dialyse bei der Aufbereitung dieses Reagens zur Anwendung, um folgendes zu erreichen:

a) Entfernung des plasmatischen Kohlensäure-Bikarbonat-Puffer-Systems. Dies ist für eine genaue Einstellung und Stabilisierung des pH in dem endgültigen, getrockneten Präparat nötig.

b) Entfernung des Oxalates. Dies ist nötig erstens für die Stabilität des Proaccelerins, zweitens um das Ausfallen des Calciumoxalates mit der damit verknüpften Absorption von Gerinnungsfaktoren während der Ausführung des Tests zu verhindern, und drittens, um die Verwendung von Citrattestplasma während der Bestimmungen zu erlauben.

5. Nach der Dialyse wird das pH sorgfältig eingestellt (auf einen Wert zwischen pH 6 und 8, um ein optimales und stabiles pH nach der Wiederauflösung des getrockneten Präparates zu erzielen. Dies hat entscheidenden Einfluß auf die bleibende Qualität des Reagens und auf die Löslichkeit des Fibrinogen? bei der Wiederauflösung).

Thromboplastin, Kephalin (oder Kephalinsubstituent) und Calcium werden dem absorbierten Ochsenplasma in einer für den im Test ablaufenden Gerinnungsprozesses optimalen Konzentration zugesetzt.

Das so erhaltene Präparat wird gefriergetrocknet.

Gebrauchsanweisung

Bei der Verwendung des Präparates zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes verfährt man aut folgende Weise:

Nach Auflösung des Reagens in destilliertem Wasser oder einer Calciumchloridlösung (s. oben) werden 0,5 ml davon mit Hilfe einer Pipette in kleine Teströhrchen (Durchmesser 8 bis 9 mm, Länge 60 mm) übergeführt. Eine abgemessene Menge des zu untersuchenden Plasmas oder Blutes (s. unten) wird hinzugefügt und die Gerinnungszeit mit einer Stoppuhr gemessen. Die erhaltene Zeit bringt die Einwirkung der Antikoagulantienbehandlung auf den Gerinnungsprozeß zum Ausdruck. Die Bestimmung wird in einem Wasserbad bei 37° C ausgeführt.

ίο Die erhaltene Gerinnungszeit wird auf die in Prozenten ausgedrückte relative Aktivität an Hand einer Korrelationskurve übertragen. Beispiele für Korrelationskurven sind in der Fig. 3 gegeben. Diese Korrelationskurven zeigen das Verhältnis der erzielten Gerinnungszeit in den zwei Systemen zur Gerinnungsaktivität in Prozent.

Auf doppeltlogarithmischem Papier wird die Konzentration des Normalplasmas in Prozent auf der Abszisse und die Gerinnungszeit in Sekunden auf

ao der Ordinate abgetragen. Die Kurve K zeigt die Kapillarblutmethode, die eine Menge von 0,10 ml gebraucht. Kurve H zeigt die Methode, die für Citratvollblut, Menge 0,10 ml, und für Citratplasma in folgender Verdünnung: 3 Teile Plasma zu 2 Teilen

as physiologischer Kochsalzlösung, Menge 0,10 ml. Die Kurve G zeigt die Methode für Citratplasma in Verdünnung 1:5 und mit einer Plasmamenge von 0,20 ml.

Die Methode kann sowohl für Kapillarblut (VoIlblut), das keinen Zusatz an Antikoagulantien enthält, als auch für Citratblut oder Citratplasma verwendet werden. Das Reagens ist mit einer optimalen Calciumkonzentration für Kapillarblut versehen und kann daher nicht ohne weiteres für Citratblut odei Citratplasma, da die Calciumkonzentration hierfür nicht optimal ist, verwendet werden.

Bei Verwendung von Citratblut oder Citratplasma muß daher das getrocknete Reagens mit einer 3,2-mMol-Calciumchloridlösung, die die in der zu testenden Blutprobe befindliche Citratmenge kompensiert, aufgelöst werden.

1. Kapillarblut. In die Fingerbeere oder das Ohrläppchen wird ein Hautschnitt gelegt, der ausreichenden Blutaustritt gewährleistet. 0,10 ml des VoIlblutes werden in eine Pipette aufgezogen und sofort mit 0,5 ml des Reagens, das bereits bei 37° C in einem Wasserbad aufbewahrt wurde, gemischt. Die Gerinnungszeit wird daraufhin bestimmt.

2. Citratblut. Venenblut wird mit 3,13%iger Natrium-Citrat-Dihydrat-Lösung (im Verhältnis 1 Teil Natriumcitratlösung zu 9 Teilen Blut) versetzt. Beispiel: 0,2 ml Natriumcitratlösung wird in eine 2-ml-Spritze aufgezogen. Aus einer Venenpunktion wird dann die Spritze bis zur Menge von 2 ml mit Blut aufgefüllt. Die Blutprobe wird dann in ein Teströhrchen gefüllt, 0,10 ml Citratblut werden mit Hilfe einer Pipette entfernt und mit 0,5 ml Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben beschriebenen Weise bestimmt.

3. Citratplasma. Citratblut wird in der gleichen Weise wie unter Punkt 2 abgenommen. Nach dem Zentrifugieren werden 0,6 ml Citratplasma in ein Teströhrchen übergeführt, 0,4 ml physiologische Kochsalzlösung hinzugefügt und beides gemischt.

Mit Hilfe einer Pipette werden 0,10 ml des verdünnten Plasmas entfernt und sofort mit 0,5 ml des Reagens vermischt. Die Gerinnungszeit wird in der oben angegebenen Weise bestimmt.

Das neue »Alles-in-einenKK-Reagens gemäß der Erfindung macht es möglich, eine kombinierte Bestimmung der Gerinnungsaktivität sowohl des internen als auch des externen Gerinnungssystems auszuführen.

Die Herstellung des Reagens beruht auf bisher noch nicht angewandten Grundsätzen.

Das Reagens zeigt im Vergleich zu früheren Reagenzien eine Anzahl von Vorteilen:

1. ist es sehr stabil bei Zimmertemperatur und vereinfacht so die Verteilung und Lagerung.

2. hält es eine Erhitzung bis zu 47° C für mindestens 30 Tage aus und kann daher auch in tropischen Regionen verwendet werden.

3. erweist sich, da man nur ein Reagens benötigt, die Herstellung als vereinfacht, und die Ausführung des Tests geht schneller vor sich als bei früheren Methoden.

20

4. stellt sie die einzige bisher bekannte Methode dar, die einen durch orale Antikoagulantien hervorgerufenen Gerinnungsdefekt in genügend sicherer Weise erkennen läßt. Im Gegensatz zu früheren Methoden zeigt diese sich gegenüber einer Verminderung des Antihaemophilie-B-Faktors empfindlich.

5. Infolge der oben beschriebenen Besonderheiten gewährt diese Methode einen weit größeren Schutz gegenüber Blutungskomplikationen als andere Methoden.

6. ist die Methode zeitsparend.

7. zeigt sie auf Grund der Stabilität des Reagens

in wiederaufgelöster Form verläßliche und reproduzierbare Ergebnisse.

Claims

Patentansprüche:

1. Reagens zur Kontrolle der Gerinnungsfähigkeit des Blutes während einer Antikoagulantien-Therapie, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Thromboplastin mit schwacher, aber konstanter Aktivität in Kombination mit einem Kephalin oder Kephalinsubstituenten mit sehr großer Aktivität menschlichem Plasma gegenüber enthält.

2. Reagens nach Anspuch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es daneben noch Rinderplasma enthält, aus dem Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor entfernt sind.

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Rinderplasma alle Gerinnungsfaktoren, die durch die peroralen Antikoagulantien nicht vermindert werden, in großer Konzentration enthält.

4. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es Calciumchlorid in einer Menge, die nach Wiederauflösung des Reagens und Zufügung des Testplasmas eine optimale Konzentration für die Gerinnung gewährleistet, enthält.

5. Verfahren zur Herstellung des Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das in an sich bekannter Weise hergestellte Thromboplastin mit der ebenfalls in an sich bekannter Weise hergestellten Kephalinsuspension mischt, daß man ferner aus Rinderplasma Prothrombin, Stuart-Faktor, Proconvertin und Antihaemophilie-B-Faktor durch wiederholte Absorption an unlöslichen Schwermetallsalzen, insbesondere Bariumsulfat, und anschließende Abtrennung des Salzes durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt, die erhaltene verarmte Plasmalösung dialysiert und die dialysierte Plasmalösung zu dem Thromboplastin-Kephalin-Gemisch gibt, den pH-Wert des Gemisches auf 6 bis 8 einstellt und schließlich das CaCl₂ zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das erhaltene Produkt lyophilisiert wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen