DE1186981B

DE1186981B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Danomycin

Info

Publication number: DE1186981B
Application number: DEB72408A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kawaguchi; Masanori Okanishi; Hiroshi Tsukiura
Original assignee: Bristol Banyu Research Institute Ltd
Current assignee: Bristol Banyu Research Institute Ltd
Priority date: 1962-07-03
Filing date: 1963-06-25
Publication date: 1965-02-11

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Danomycin Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum mit der Bezeichnung Danomycin und auf Verfahren zu dessen Herstellung. Im besonderen bezieht sie sich auf ein Verfahren zur Herstellung durch Fermentation sowie auf die Abscheidung und Reinigung der Substanz. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum in verdünnten Lösungen, als Rohkonzentrate, als gereinigte Feststoffe und in reiner kristalliner Form. Danomycin hemmt das Wachstum grampositiver Bakterien einschließlich besonders der Staphylokokken, die gegenüber anderen Antibiotika resistent sind. Danomycin ist ungiftig und besitzt gegenüber mit grampositiven Bakterien infizierten Mäusen eine therapeutische Wirkung. Es ist auch wertvoll bei der Behandlung von mit grampositiven Bakterien infizierten Menschen, beispielsweise bei Lungenentzündung. Danomycin gehört zur Gruppe der Eisen enthaltenden Antibiotika; es wurde ursprünglich als Antibiotikum Nr. 425 bezeichnet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Antibiotikum Danomycin, das das Wachstum grampositiver Bakterien hemmt, in Wasser löslich und in Aceton unlöslich ist, eine orangerötliche Farbe besitzt, eine negative Ninhydrin Tollens- und Fehlingreaktion zeigt und in gereinigter Form bei 135 bis 138'C unter Zersetzung schmilzt; in Wasser zeigt es ein ultraviolettes Absorptionsspektrum mit Maxima bei 270 m#t (E'1'. = 48), 325 m#t (El l.'. = 12,6) und 430 m#t (E' Cm = 15,6); die Analyse ergab C 48,82°/o, H 7,05°/0,N 7,81°/0, Fe 3,13°/o und 0 (als Differenz) 33,190/,.
Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Danomycin Gegenstand der vorliegenden Erfindung, indem ein Stamm des Streptomyces albaduncus in einer wässerigen, ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthaltenden Kohlenhydratlösung unter submersen aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis die Lösung eine wesentliche Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien aufweist, worauf das Danomycin aus der Lösung gewonnen wird.
Der das erfindungsgemäße Antibiotikum erzeugende Organismus wurde aus einer Bodenprobe isoliert und stellt eine neue Art der Gattung Streptomyces dar, die als Streptomyces albaduncus bezeichnet wird. Eine Kultur des lebenden Organismus mit der Laboratoriumsbezeichnung Nr. 13246 wurde in der American Type Culture Collection, Washington, D. C., hinterlegt und dieser Sammlung als ATCC 14698 überlassen.
Der Stamm Nr. 13246 des S. albaduncus besitzt folgende Kennzeichen: 1. Das Luftmycel ist kurz und gewellt; die Sporenträger weisen Schleifen oder Haken auf und bilden kaum linksgerichtete Spiralen. Die mittels Elektronenmikroskop beobachtete Sporenoberfläche ist dünn.
2. Czapek-Agar: Die Kultur ist blaßgelbbraun und dringt in den Agar ein. Das weiße Luftmycel ist dürftig, und es wird kein lösliches Pigment gebildet.
3. Glycerin-Czapek-Agar: Die Kultur ist klein und blaßgelbbraun; sie dringt in den Agar ein. Das weiße Luftmycel ist dürftig, und es bildet blaßgelbbraune lösliche Pigmente.
4. Glycerin-Ammoniumsalz-Agar: Die Kultur ist klein und gelblichweiß, und es wird weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment gebildet.
5. Glucose-Asparagin-Agar: Die blaßgelbohvbraune Kultur ist glänzend und dringt in den Agar ein. Das weiße Luftmycel ist pulverig, und ein aprikosengelbes lösliches Pigment wird gebildet.
6. Stärke-Agar: Die dunkelgraubraune Kultur ist glänzend und dringt in den Agar ein; es tritt weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment auf. Die Stärke wird stark hydrolysiert. 7. Nähr-Agar: Die blaßgelbe Kultur ist klein und dringt in den Agar ein. Weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment tritt auf.
B. Bennett-Agar: Die gelblicholivbraune Kultur ist mäßig, das pulverige oder samtartige Luftmycel ist weiß oder leicht braun überzogen; es wird ein gelblicholivbraunes Pigment gebildet.
9. Hafermehl-Soyton-Agar: Die gelblicholivbraune Kultur ist mäßig, das weiße Luftmycel ist pulverig oder samtartig; es wird ein gelblicholivbraunes lösliches Pigment gebildet.
10. Kartoffelpfropf: Die blaßgelbbraune Kultur ist glänzend, aber klein, und es wird weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment gebildet.
11. Gelatinestich: Eine weiße Kolonie wächst auf der Oberfläche, und es wird weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment gebildet; die Verflüssigung der Gelatine ist mäßig.
12. Tyrosin-Hefe-Gelatinestich : Blaßgelbe runzlige Kolonie, dürftige Luftmycel und gelbes lösliches Pigment wurden beobachtet.
13. Milch: Blaßbraunes Ringwachstum, kein Luftmycel und kein Pigment wurden beobachtet; Milch wird nicht verdaut.
14. Nitratlösung: Eine kugelige, farblose Masse wächst an der Oberfläche, und es wird weder ein Luftmycel noch ein lösliches Pigment gebildet. Die Rediktion von Nitrat zu Nitrit ist negativ.
15. Melaninmedium: Das blaßgelbe Wachstum ist dürftig und dringt in den Agar ein; ein Luftmycel oder ein lösliches Pigment werden nicht gebildet.
16. Die Assimilation von Kohlenstoffverbindungen wurde nach dem Verfahren von P r i d h a m geprüft; folgende Ergebnisse wurden erhalten: Gute Kohlenstoffverwertung wurde beobachtet bei Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Fructose, Cellobiose, Lactose, Maltose, Raffinose, Sorbito, Inositol, Mannitol, Rhamnose, Natriumcitrat und Natriumsuccinat. Die,Verwertung von Sorbose, Sucrose und Inuline war zweifelhaft oder negativ. Beim Vergleich mit einer Anzahl von Streptomycesarten -ähneln einige dem S. albaduncus in mancher Beziehung, so beispielsweise S. albofiavus, S. pseudogriseolus und S. griseolus. Diese Arten können jedoch von dem vorliegenden Stamm durch die Morphologie der Sporenträger auf Grund der Oberflächenstruktur der Sporen, der Wachstumsstellen der Kulturen und der physiologischen oder biochemischen Eigenschaften unterschieden werden, wie nachstehend genauer beschrieben wird.
Der S. alboflavus zeigt gerades und verzweigtes Luftmycel und bildet kaum Spiralen; die Farbe des Luftmycels auf Czapek-Agar ist gelblichweiß, während auf Glucose-Asparagus-Agar kein Luftmycel gefunden wurde. Er reduziert Nitrat zu Nitrit, und die Peptonisation der Milch ist positiv ohne Koagulation. Diese Eigenschaften unterscheiden ihn von dem vorliegenden Stamm.
S. pseudogriseolus weist zahlreiche Spiralen in den Sporenträgern auf, die Farbe des Luftmycels ist mit Grau überzogenes dumpfes Gelb. Sowohl die Koagulation als auch die Peptonisation ist bei Milch positiv. Außerdem wurden Unterschiede in der Verwertung von Natriumcitrat, Raffinose und Sorbitol festgestellt. S. griseolus zeigt kurze gerade Sporenträger mit welligen Verzweigungen und weist keine typischen, dem vorliegenden Stamm ähnliche Spiralen auf; Unterschiede sind in der glatten Sporenoberfläche, der grauen oder dunkelgrauen Farbe des Luftmycels auf Czapek- und Glucose-Asparagin-Agar und besonders bei der Bildung eines braunen, löslichen Pigments beim Wachstum auf organischen Medien festzustellen.
Es ist eine allgemeine Eigenschaft der Streptomyceten, daß ihr Verhalten auf dem Kulturmedium sich plötzlich ändert oder künstlich verändert werden kann. Deshalb werden manchmal Mutanten oder Varianten aus dem Boden oder durch Konservierung erhalten, die beträchtlich vom ursprünglichen Stamm abweichen. Diese Eigenschaften wurden gleichfalls bei den Stämmen gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden.

Beim Hervorrufen künstlicher Mutationen im ursprünglichen Stamm zur Verbesserung der Produktivität treten wesentliche Veränderungen in den Eigenschaften der Kulturen und in der Farbe des Luftmycels auf, wobei die Mutanten gleichfalls Danomycin bilden. Zur Erzeugung künstlicher Mutationen gibt es zahlreiche physikalische oder chemische Möglichkeiten, wie die Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen oder die Behandlung mit Chemikalien wie Dichlordiäthylsulfid. Die folgenden beiden Stämme sind Beispiele für durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV-Strahlen hervorgerufene Mutationen:

Stamm Nr. 13246-29 Stamm Nr. 13246-28-4-27

Mutationsverfahren

UV-Strahlen 1 Röntgenstrahlen

Mikroskopische Beobachtupg

(wie beim ursprünglichen Stamm)

Glucose-Asparagin-Agar

gelblichbraune Kultur, altgoldfarbene Kultur,

weißes Luftmycel, braunweißes Luftmycel,

blaßgelblichbraunes lös- altgoldfarbenes lösliches

liches Pigment Pigment

Stärke-Agar

dunkelgraue Kultur, hellolivfarbene Kultur,.

weißes Luftmycel, hellgraues Luftmycel,

kein lösliches Pigment hellolivfarbenes lösliches

Pigment

Bennett-Agar

dunkle, gelbgraubraune gelbbraune Kultur, hell-

Kultur, graues Luft- graubraunes Luft-

mycel, gelbbraunes mycel, gelbbraunes

lösliches Pigment lösliches Pigment

Kartoffel-Glucose-Agar

gelbgraubraune Kultur, gelbolivbraune Kultur,

graues Luftmycel, weißes Luftmycel,

hellgelbbraunes lös- altgoldfarbenes lös-

liches Pigment liches Pigment

Somit sind in die vorliegende Erfindung auch außer den obenstehenden Arten deren Varianten aus dem Boden, die durch Mutationsagenzien wie Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Chemikalien usw. hervorgerufenen Mutanten und sämtliche aus Bodenproben isolierten Stämme eingeschlossen, soweit sie den notwendigen Erfordernissen entsprechen. Danomycin ist ein Antibiotikum, das Eisen in Molekül enthält, wie oben beschrieben wurde. Deshalb wurde der Danomycin erzeugende Stamm mit verschiedenen Streptomycetenstämmen verglichen, die ebenfalls eisenhaltige Antibiotika, wie Grisein, Albomycin, EHT-22765 und Ferrimycin, bilden.

Der Grisein erzeugende S. griseus unterscheidet sich deutlich vom vorliegenden Stamm, da das Luftmycel eine charakteristisch wassergrüne Farbe aufweist, die Sporenträger gerade sind und Haarbüschel besitzen und keine typischen Spiralen gebildet werden.
Verschiedene Streptomycesarten wie S. griseoflavus, S. galilaeus, S. lavendulae, S. pilosus, S. viridochromogenes, S. olivaceus, S. aureofaciens und S. polychromogenes bilden eisenhaltige Antibiotika, und die einzelnen Arten unterscheiden sich folgendermaßen S. griseoflavus zeigt gerade und monopodial verzweigte Sporenträger und bildet keine typischen Spiralen. Die Farbe der Kultur ist rötlichbraun auf Czapek-Agar und zitronengelb auf Glucose-Asparagin-Agar.
S. galilaeus besitzt monopodial verzweigte Sporenträger mit unregelmäßigen offenen Spiralen. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, und die Kultur ist auf Glycerol-Czapek-Agar karminrot.
S. lavendulae weist lange, monopodial verzweigte Sporenträger mit kurzen, kompakten, rechts gerichteten Spiralen auf, und das Luftmycel ist auf den meisten Medien lavendelfarben.
S. pilosus besitzt eine haarige Sporenoberfläche und bildet ein braunes lösliches Pigment.
S. viridochromogenes hat zahlreiche Spiralen und bildet ein braunes lösliches Pigment.
S. olivaceus besitzt lange Spiralen und bildet ein aschgraues bis hellolivgraues Luftmycel auf Czapek-Agar.
S. polychromogenes weist ein hellkarminfarbenes bis karminrotes Luftmycel auf.
Wie oben beschrieben, wurde der Danomycin erzeugende Stamm mit verwandten Arten vom Standpunkt der Taxonamie oder der erzeugten Antibiotika verglichen, und es wurde festgestellt, daß der vorliegende Stamm eine neue Streptomycetenart darstellt, die als Streptomyces albaduncus nov. sp. bezeichnet wurde.
Streptomyces albaduncus erzeugt bei Züchtung unter geeigneten Bedingungen Danomycin.
Eine Danomycin enthaltende Fermentationsbrühe wird durch Impfen eines geeigneten Mediums mit Sporen oder dem Mycel des Danomycin erzeugenden Organismus und anschließender Züchtung unter aeroben Bedingungen hergestellt. Zur Herstellung von Danomycin ist die Züchtung auf einem festen Medium möglich, für die Herstellung größerer Mengen ist jedoch die Züchtung in einem flüssigen Medium vorzuziehen.
Die Bebrütungstemperatur kann zwischen 20 und 35°C betragen, liegt aber vorzugsweise zwischen 25 und 30°C bei neutralem pH. Bei der submersen aeroben Fermentation des Organismus zur Gewinnung von Danomycin enthält das Medium als Kohlenstoffquelle Glycerinöl oder ein Kohlenhydrat wie Glycerin, Glucose, Maltose, Sucrose, Lactose, Dextrin, Stärke usw. in reinem oder rohem Zustand und als Stickstoffquelle eine organische Substanz wie Sojabohnenmehl, Distillers' Solubles, Erdnußmehl, Hefeextrakt, Maisquellwasser usw. und, falls erwünscht, anorganische Stickstoffquellen wie Nitrate oder Ammoniumsalze sowie Mineralsalze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumsulfat und Puffermittel wie Calciumcarbonat oder Phosphate und Spuren von Schwermetallsalzen; diese Zusätze sind im kanadischen Patent 513 324, in den britischen Patentschriften 730 341 und 736 325 sowie in den USA.-Patentschriften 2 691619, 2 658 018, 2 653 899, 2 586 762, 2 516 080, 2 483 892, 2 609 329 und 2 709 672 genannt. Bei der belüfteten submersen Kultur wird ein Antischaummittel wie flüssiges Paraffin, Fettöl oder Silicon verwendet.
Es kann auch mehr als eine Art von Kohlenstoff oder Stickstoffquelle oder Antischaummittel bei der Gewinnung des Danomycins verwendet werden. Im allgemeinen wird die Bebrütung fortgesetzt, bis sich mindestens einige Hundert mcg/ml Danomycin in Medium angesammelt haben.
Zur Isolierung und Reinigung von geringen Mengen der aktiven Verbindung aus der Fermentationsflüssigkeit können die üblichen Verfahren angewendet werden. Beispielsweise kann Danomycin unter Verwendung eines verschiedenen Absorptions-, Löslichkeits- und Verteilungskoeffizienten zwischen der aktiven Verbindung und den vorhandenen Verunreinigungen isoliert werden. Das im Filtrat der Brühe enthaltene Danomycin wird z. B. durch Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser, wässerigem Methanol oder wässerigem Äthanol gewaschen und anschließend mit wässerigem Butanol oder wässerigem Aceton eluiert. Die Eluate werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, worauf das rohe Pulver erhalten wird. Bei Verwendung der Chromatographie an Aktivkohle und eines Fraktionssammlers kann die aktive Verbindung weitergereinigt werden. Durch Zusatz einer großen Menge eines geeigneten organischen Lösungsmittels wie Aceton zu dem wässerigen Konzentrat der aktiven Fraktionen kann Danomycin ausgefällt und abgetrennt werden. Die vorhandenen Verunreinigungen werden durch Zufügen eines organischen Lösungsmittels wie Methanol zu dem wässerigen Konzentrat ausgefällt und entfernt.
Die Extraktion durch organische Lösungsmittel kann gleichfalls zur Reinigung des Danomycins dienen.
Beispielsweise kann die aktive Verbindung durch Mischungen geeigneter Lösungsmittel wie Phenol-Chloroform oder Benzylalkohol-Butanol extrahiert werden. Die Extrakte können nach dem Waschen mit angesäuertem Wasser, alkalischem Wasser und reinem Wasser in das Wasser unter Zusatz geeigneter nichtpolarer organischer Lösungsmittel wie Äther oder Kohlenwasserstoffe übergeführt werden.
Auch die Methode der Gegenstromverteilung kann zur Reinigung des Danomycins angewendet werden; beispielsweise wird durch Verteilung in dem System Phenol-Chloroform-pH 6,0-Puffer (1 :9:10) oder Benzylalkohol-Butanol-n/100-HC1-20 °/o Salzwasser (20 : 10 : 3 : 30) Danomycin hoher Reinheit erhalten.

Beim Vergleichen der obenerwähnten physikochemischen und biologischen Eigenschaften des Danomycins mit denen anderer bekannter Antibiotika erweist sich Danomycin als ein neues Antibiotikum. Danomycin ähnelt Grisein, Albomycin, Ferrimycin, LA-5352 und anderen eisenhaltigen Antibiotika in seinen Eigenschaften bezüglich der Löslichkeit in Wasser und der orangeroten Farbe. Vergleicht man jedoch das. antibakterielle Spektrum mit dem der anderen, so unterscheidet sich Danomycin von Grisein und Albomycin in seiner Aktivität gegen gramnegative Bakterien, vom Ferrimycin gegen Bacillus sphericus und vom LA-5352 gegenüber Hemolytic streptococci: Da Danomycin hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam ist, wurde es papierchromatographisch mit anderen eisenhaltigen Antibiotika wie Ferrimycin und LA-5352 verglichen, die gleichfalls hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam sind. Wie nachstehend gezeigt wird, unterscheidet sich Danomycin von diesen Antibiotika.

Lösungssystem Rr-Werte

Danomycin Ferrimycin LA-5352

3 °/o NH,CI-Lösung ............................. 0,95 0,60 0,00 bis 0,35

50°/o wässeriges Aceton .... ................... 0,85 0,65 0,60

Wasser ......................................... 1,00 0,05 0,05

Butanol-Essi8Mure-H,%0. (4 : 1 : 5) ............ 0,23 0,40 0,40

Butanol-Fsdgsäure-H,Cl (2 : 1 : 1) ............ 0,50 0,73 0,75

Äthanol-H1,0 (3 : 1) mit 2°/o NaCI ............. 0,65 0,45 0,45

In seinem Infrarotspektrum zeigt Danomycin charakteristische Absorptionsmaxima bei 1160 bis 1165, 865 bis 880 und 680 bis 690 cm-', die im Spektrum von Ferrimycin oder LA-5352 nicht gefunden wurden. Vergleicht man das UV-Spektrum des Danomycins mit dem gewisser anderer Antibiotika, so unterscheidet sich Danomycin davon wie folgt: Lage der Maxima

Grisein .................... 265 m#L 420 m#t

Albomycin ............ ..... 270 m#t 440 mi.

Ferrimycin ................. 228 mi., 319,425 m#L

LA-5352 ................... keine

Danomycin ............ .... - 270 mt., 325,430 mp.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1 Zusammensetzung des Mediums Sojabohnenmehl ....................... 15 g Trockenes Pferdeblut .................. 5 g Lösliche Stärke ....................... 50 g Kaliumphosphat, zweibasisch . . . . ....... 1 g. Natriumchlorid .......................... 0,5 g Magnesiumsulfat ...................... 0,5 g Calciumchlorid . ... . .................. 0,59 Leitungswasser ........................ 1000 ml pH .................................. = 6,8 Ein die obenstehenden Bestandteile enthaltendes Nährmedium (100m1) wird in einem Kolben von 500m1 Inhalt -sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces albaduncus geimpft und bei 27 -f- 1 ° C 8 Tage unter Schütteln wachsen gelassen, wobei die Danomycinbildung in der Fermentationsbrühe 240 mcg/ml erreicht. Beispiel 2 Zusammensetzung des Mediums Sojabohnenmehl ....................... 25 g Lösliche Stärke ....................... 65 g Kaliumphosphat, zweibasisch ........... 1 g Natriumchlorid ......................... 1 g Magnesiumsulfat ...................... 0,5 g Calciumchlorid ........................ 0,5 g Leitungswasser ........................ 1000 ml pH .................................. = 6,8 Ein die obenstehenden Bestandteile enthaltendes Nährmedium (100 ml) wird in einen Kolben von 500 ml Inhalt sterilisiert, mit einer Kultur von Streptomyces albaduncus geimpft und bei 27 ± 1 ° C 8 Tage unter Schütteln wachsen gelassen, wobei die Danomycinbildung in der Fermentationsbrühe 440 mcg/ml erreicht.
Beispiel 3 Die Fermentationsbrühe wurde gefiltert, das pH auf 7 bis 8 eingestellt und durch 0,5010 Aktivkohle adsorbiert. Die Kohle wurde mit Wasser und anschließend mit einer 50°/oigen wässerigen Methanollösung gewaschen und das Danomycin mit Wasser, gesättigt mit n-Butanol, eluiert. Das aktive Eluat wurde zur Trockne eingeengt und das rohe, feste Danomycin in Wasser gelöst und durch Aktivkohlechromatographie gereinigt. Die Säule wurde mit Wasser und 50°/oiger wässeriger Methanollösung gewaschen und dann fraktioniert mit 60°/oigem wässerigem Aceton eluiert. Die so erhaltene reine Zubereitung wurde wiederum in etwas Wasser gelöst; durch Zufügen von 10 Volumteilen Aceton wurde das Danomycin ausgefällt und weiter mit 950/, Äthanol zur Entfernung geringer Verunreinigungen extrahiert. Das rötlichbraune Danomycin wurde in Wasser gelöstund miteinerMischungvon Phenol-Chloroform (1 : 1) extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer 0.5°,!oigen wässerigen Lösung von Natriumbikarbonat, n/100-Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen und anschließend unter Zusatz von Äther und Petroläther in Wasser gegeben. Durch Gefriertrocknung wurde eine reine Zubereitung von Danomycin erhalten. Beispiel 4 Danomycin kann durch Gegenstromverteilung gereinigt werden. Zwischen dem Lösungsmittelsystem Benzylalkohol - n-Butanol - n/ 100-Chlorwasserstoffsäure-20°/oiger wässeriger Natriumchloridlösung (20: 10: 3 : 30) wurde Danomycin rund um ein Spitzrohr Nr. 9 in 35 Übertragungen verteilt. Der Inhalt der aktiven Rohre wurde gesammelt und eine reine Zubereitung von Danomycin durch Gefriertrocknung erhalten. Das so erhaltene Danomycin wurde als rein durch die gute Übereinstimmung der Verteilungskurven, aufgetragen als biologische Testwerte, und der Absorption bei 420 m#L mit der theoretischen Kurve ermittelt. Danomycin ist ein orangerötlichgefärbtes Antibiotikum, welches Eisen im Molekül enthält. Es ist löslich in Wasser, 50°/oigem wässerigem Äthanol, 50°/oigem wässerigem Methanol und Lösungsmittelgemischen von Phenol-Chloroform (1 : 1), mäßig löslich in 95°/oigem Methanol und 95°/oigem Äthanol, aber unlöslich in Aceton und anderen organischen Lösungsmitteln. Die Ninhydrin-, Tollen- und Fehlingreaktionen sind sämtlich negativ, jedoch konnten einige ninhydrinpositive Substanzen bei der sauren Hydrolyse des Danomycins durch Papierchronomatographie festgestellt werden. Die Gegenstromverteilung unter Verwendung von Benzylalkohol-n-Butanoln/100 HCl-20°/oige wässerige NaCI-Lösung (20 : 10 3 : 30) wurde zur Gewinnung der reinen Zubereitung angewendet. Das so erhaltene Danomycin schmilzt bei 135 bis 138°C unter Zersetzung.
Analyse: Gefunden: C 48,82, H 7,05, N 7,81, Fe 3,13. Auf Grund dieser analytischen Daten und der Annahme, daß nur ein Eisenatom vorliegt, wurden die Summenformel und das Molekulargewicht mit C7aHias0avNioFe und 1791 berechnet.
Das ultraviolette Absorptionsspektrum des Danomycins in Wasser zeigt Absorptionsmaxima bei 270 m#L (Eil = 48), 325 m;.L (El l' = 12,6) und 430 mu. (E,11 = 15,6). Das infrarote Absorptionsspektrum des Danomycins in Kaliumbromid weist charakteristische Absorptionsbande bei folgenden Wellenzahlen auf 3200 bis 3280, 2920, 1720 bis 1725, 1630 bis 1640, 1570 bis 1580, 1490 bis 1500, 1455 bis 1470, 1220 bis 1230, 1160 bis 1165, 1010 bis 1040, 865 bis 880, 810, 755 und 680 bis 690 cm-'. Bei Durchführung der Papierstreifenchromatographie in verschiedenen Lösungsmittelsystemen wurden folgende RT-Werte erhalten: Nasses n-Butanol .......................... 0,05 3°/oiges wässeriges Ammoniumchlorid ....... 0,95 80°/oiges Phenol........................... 0,95 50°/oiges wässeriges Aceton ................. 0,85 n-Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) -f- 1,501, Methylorange ................... 0,50 n-Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) .... 0,30 Benzol-Methanol (4 : 1) .................. 0,05 Wasser ................................... 1,0 n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 5) ... 0,23 n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 2) ... 0,35 n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2 : 1 : 1) ... 0;50 Äthanol-Wasser (3 :1) + 2°/a Natriumchlorid 0,65 n-Butanol-Äthanol-Essigsäure-Wasser (25 : 25 : 3 : 47) ......................... 0,85 Danomycin zeigt die vorstehenden Eigenschaften; und beim Vergleich dieser Eigenschaften mit denen anderer eisenhaltiger Antibiotika wie Grisein, Albomycin, LA-5352 und Ferrimycin kann es von diesen unterschieden werden.

Die biologischen Eigenschaften des Danomycins sind folgende: 1. Antimicrobielles Spektrum Die minimalen Hemmungsdosen von Danomycin gegenüber grampositiven, gramnegativen, säurefesten Bakterien und Pilzen wurden durch eine serienmäßige Verdünnungstechnik mit Agar bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Danomycin ist gegenüber koagulasepositiven Staphylokokken einschließlich der gegenüber den meisten Antibiotika resistenten Stämmen wirksam.

Tabelle 1

Minimale

Test-Organismus Hemmungs-

konzentration

(mcg/ml)

Escherichia coli NIHJ ............. > 50

Klebsiella pneumonia Julianelle, Typ A > 50

Salmonella typhi .................. > 50

Shigella dysenteriae A ............. > 50

Neisseria sp. (CP-R) ............... > 50

Staphylococcus aureus

FDA 209-P ..................... 0,039

Staphylococcus aureus

FDA 209-P (ST-R) .............. 0,039

Staphylococcus aureus

FDA 209-P (NB-R) ............. 0,078

Staphylococcus aureus

Nr. 52-34 (TC, EM, CM, Pc, SM-R) 0,078

Staphylococcus aureus

Smith strain .................... 0,078

Staphylococcus aureus 193

(Pc, SM-R) ..................... 0,078

Staphylococcus aureus 193

(Pc, SM, EM-R) ................ 0,078

Staphylococcus albus PCI 1200 A ... > 50

Sarcina lutea PCI 1001 ............ 0,313

Micrococcus flavus ................ 0,019

Bacillus subtilis PCI 219 ........... 0,039

Bacillus sphericus 122 ............. 0,02

Bacillus anthrasis 115 .............. 0,02

Bacillus cereus ATCC 10702 ........ > 50

Corynebacterium xerosis 53-K-1 .... 0,01

Streptococcus faecalis B-40203 ...... > 50

Streptococcus hemolyticus

Dick strain ..................... > 50

Diplococcus pneumonia DP-3-5A ... 0,0024

Diplococcus pneumoniae Type II ... 0,0024

Mycobacterium tuberculosies

v. hominis H"Rv ............... > 50

Mycobacterium tuberculosis 607 .... > 50

Aspergillus niger .................. > 50

Candida albicans .................. > 50

Abkürzungen: TC = Tetracyclin

-R = resistent EM = Erythromycin

CP = Chloramphenicol CM = Carbomycin

ST = Streptothricin Pc = Penicillin

NB = Novobiocin SM = Streptomycin

2: Wirkung des pH auf die antibakterielle Aktivität Die Wirkung wurde durch ein Verdünnungsverfahren in flüssigen Medien geprüft, wobei eine Kultur des Testorganismus nach einer Nacht bei 10'-facher Verdünnung geimpft wurde. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, wird die Aktivität des Danomycins durch eine mittlere pH nicht beeinflußt.

Tabelle 2

Minimale

Testorganismus Hemmungskonzentration

(mcg/ml)

PH = 6,2IPH = 7,2IpH = 8,2

Staphylococcus sureus

209-P ................. 0,039 0,039 0,078

Staphylococcus aureus 193 0,078 0,078 0,078

Staphylococcus sureus

Smith strain ........... 0,078 0,078 0,078

Bacillus subtilis .......... 0,039 0,039 0,078

3. Wirkung von Serum auf die antibakterielle Aktivität Die Wirkung wurde durch Verdünnung der Brühe festgestellt. Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, übt das Serum keine Wirkung auf die Aktivität des Danomycins aus.

Tabelle 3

Minimale

Hemmungskonzentration

Testorganismus (mcg/ml)

Kontrolle mit 50 °/o

Serum

Staphylococcus aureus 209-P 0,078 0,078

Staphylococcus aureus 193 0,078 0,078

Staphylococcus aureus

Smith strain ............ 0,039 0,078

4. Antibakterielle Aktivität des Danomycins gegenüber klinisch isolierten, koagulasepositiven Staphylokokken Die Aktivitäten von Danomycin und sieben allgemein verwendete Antibiotika wurden gegenüber sechzig Stämmen von koagulasepositiven Staphylokokken geprüft, die von Patienten verschiedener Kliniken isoliert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaBt. Es wurde eine ziemlich weite Streuung der gegenüber allgemein angewandten Antibiotika beobachtet, während die Streuung von gegenüber Danomycin resistenten Stämmen nur 1,7°/0 betrug.

Tabelle 4
Minimale Streuung resistenter Staphylokokken (°/o)
Hemmungskonzentration Dang-
I myCin DSM I KM I TC CP PC EM I NB
I
100 .............. 1,7 55,2 0 52,5 0 30 0 0
100 .............. 0 10,4 0 6,8 1,7 43,5 3,3 1,7
10 .............. 0 22,4 3,3 1,7 98,5 11,7 0 1,7
1 .............. 10 12,1 93,5 32,2 0 3,3 97 52,5
0,1 .............. 87 0 3,3 6,8 0 0 0 44
0,01 .............. 1,7 0 0 0 0 11,3 0 0
Abkürzungen: DSM = Dihydrostreptomycm. TC = Tetracychn. Pc = Penicillin G.
KM = Kanamycin. CP = Chloramphenicol. EM = Erythromycin.
NB = Novobiocin.

5. Toxizität Die Toxizität von Danomycin ist äußerst gering, die intravenöse LD50 beträgt 3250 mg/kg bei Mäusen. Es ergaben sich bei einer interperitonealen Dosis von 5000 mg/kg keine toten Tiere. Die chronische Toxizität wurde bei Ratten geprüft; auch bei einer täglichen intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg Danomycin wurden nach 90 Tagen keine negativen Auswirkungen im Wachstum oder Verhalten festgestellt.

6. Chemotherapeutische Wirkung gegenüber experimenteller Infektion von Mäusen Mäuse wurden intraperitoneal mit Staphylococcus aureus Stamm Smith infiziert, wobei die Impfdosis das 100fache der LD" des Krankheitserregers betrug, und Danomycin wurde nach Eintreten der Infektion subkutan angewendet. Die mittlere heilende Dosis einer Einzelinjektion (CD") wurde mit 0,04 mg/kg ermittelt. Vergleichsweise wurde Natrium-Penicillin G geprüft, dessen CD")-Wert 0,3 mg/kg betrug.
Das Antibiotikum der vorliegenden Erfindung ist ein wertvolles Mittel zum Nachweis der Schädlichkeit von gramnegativen Bakterien, Pilzen, Hefe u. dgL bei der Gewinnung des Enzyms Amylase durch Fermentation von B. subtilis. So ermöglicht der Zusatz von 1 bis 1000 mcg/ml und vorzugsweise von 10 mcg/ml des Antibiotikums zu dem geimpften Medium das Wachstum der Schädlinge und ihren visuellen Nachweis.

Claims

Patentanspruch: Verwendung von Streptomyces albaduncus zur Herstellung des Antibiotikums Danomycin durch übliche biologische Züchtung unter submersen Bedingungen und Gewinnung aus der Gärflüssigkeit durch bekannte Verfahren.