DE1164022B - Verfahren zum Konservieren von Sperma - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. KL: A 61k

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

Deutsche KL: 30 h-2/04

R 30419 IV a/30 h
27. Mai 1961
27. Februar 1964

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Konservierung von Sperma mit Zuckeralkoholen und cyclischen Polyolen sowie Monoäthern der cyclischen Polyole mit niederen Alkoholen.

Die künstliche Besamung von Tieren, vor allem von Milchvieh, wird in großem Ausmaß durchgeführt. Zahlreiche Zuchtverbände verfolgen das Ziel, hochwertigen Zuchtbestand in bestmöglicher Weise zu nutzen, so daß die Qualität der Herden erhalten bleibt und noch verbessert wird. Bei normaler Aufbewahrung in gekühltem Zustand hat Tiersamen eine verhältnismäßig kurze Lebensdauer. Die Bewegungsfähigkeit der Samenzellen und damit die Fähigkeit zur Befruchtung nimmt so schnell ab, daß man den nicht gebrauchten Bullensamen 48 Stunden nach der Ejakulation wegzuwerfen pflegt. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch der Samen bedeutend länger aufbewahrt werden, ohne daß die Bewegungsfähigkeit in wesentlichem Maße nachläßt.

Bisher war die künstliche Besamung weitgehend auf Rinder beschränkt, da es nicht möglich war, die Wirksamkeit des Samens anderer Tierarten so lange zu erhalten, daß seine Verwendung zur künstlichen Besamung praktischen Wert hatte. Mit dem erfindtungsgemäßen Verfahren ist nunmehr auch diekünstliehe Besamung anderer Tierarten möglich geworden.

Man hat früher schon vermutet, daß das Samenplasma bestimmter Säugetierarten kleine Mengen des Zuckeralkohols Sorbit und des cyclischen Alkohohls Inosit enthält. Es war jedoch nicht bekannt, daß durch Zugabe dieser und anderer Polyalkohole eine überraschende, stabilisierende Wirkung auf Samenzellen erreicht wird, die die Zeitspanne, während welcher Sperma zur künstlichen Besamung verwendet werden können, bedeutend verlängert.

Zuckeralkohole, die sich erfindungsgemäß für die Verlängerung der Lebensdauer von Tiersamen als geeignet erwiesen, sind Zuckeralkohole der Formel C_nH_n+2(OH)_n, worin η eine ganze Zahl von 4 bis 7 ist. Beispiele für derartige Alkohole sind Erythrit, Threit, Arabit, Ribit, Xylit, Minnit, Sorbit (Glucit), Dulcit, Idit und Sedoheptit. Die verwendbaren cyclischen Polyole haben die Formel C₆H₆(OH)₆. Beispiele hierfür sind meso-Inosit und dessen Isomere, Pinit (der dextro-Monomethyläther von Mesoinosit) Quebrachit (der lävo-Monomethyläther von Mesoinosit), Condurit, Scyllit, Epimesoinosose, Dextroquercit, Betit und Mytit.

Die stabilisierenden Alkohole werden gewöhnlich in wäßriger Lösung verwendet.

Zur Besamung können als Lösungsmittel für die Alkohole auch Milch oder andere im wesentlichen Verfahren zum Konservieren von Sperma

Anmelder:

Regents of the University of Minnesota,

Minneapolis, Minn. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Beil, A. Hoeppener

und Dr. H. J. Wolff, Rechtsanwälte,

Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Als. Erfinder benannt:

Fred Smith, Groveland, Lake Minnetonka, Minn., Edmund Fay Graham, St. Paul, Minn. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 31. Mai 1960 (Nr. 33 020)

V. St. v. Amerika vom 20. März 1961 (Nr. 99 007)

wäßrige Flüssigkeiten verwendet werden. Die stabilisierenden Alkohole können für sich oder im Gemisch eingesetzt werden. Die Konzentration der Alkohollösungen liegt zwischen etwa 0,1% (100 Milligrammprozent) und dem isotonischen Grenzwert des zu stabilisierenden tierischen Materials. Im allgemeinen macht der zugesetzte Alkohol nicht mehr als etwa 1,5 bis 2% (1500 bis 2000 MiUigrammprozent) aus. Vorzugsweise werden die Alkohole in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 1,5 «/0 (500 bis 1500 Milligrammprozent) verwendet.

Diese Mengen stellen ein Vielfaches der von Natur aus im Samen enthaltenen Alkohols dar. Bullensamen z. B. enthält Alkohole in einer durchschnittlichen Menge von etwa 0,1 °/o (100 MMgrammprozent). Zur Besamung wird der Bullensamen normalerweise im Verhältnis 1:100 verdünnt. Dadurch wird die natürliche Alkoholkonzentration auf ein Hundertstel der ursprünglichen Konzentration, also auf 0,001 % (1 MiUigrammprozent) herabgesetzt. Enthält das Verdünnungsmittel den zugegebenen Alkohol in einer Konzentration von 1%> (1000 MiUigrammprozent), so ist dieser in der zur Besamung verwendeten Lösung in einer Menge vorhanden, die tausendmal größer ist als die nach der Verdünnung von Natur aus vorliegende.

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Bevorzugte Zuckeralkohole sind Sorbit (d-Glucit) Bullensamen normalerweise ungefähr 600 bis und Mannit, die einzeln oder im Gemisch verwendet 1200 Millionen Spermazellen je Kubikzentimeter, werden können. Die Gesamtkonzentration dieser Man nimmt an, daß etwa 10 Millionen Spermazellen Zuckeralkohole sollte in den meisten Fällen etwa 1,5 und ein Volumen von mindestens 1 cm³ Samen notbis 2,0 % (1500 bis 2000 Milligrammprozent) nicht 5 wendig sind, um eine Befruchtung zu gewährleisten, wesentlich überschreiten. Eine Gesamtkonzentration Dementsprechend kann der reine Bullensamen so von nur etwa 0,1 bis 0,5°/o (100 bis 500 Milligramm- weit mit dem den stabilisierenden Alkohol enthaltenprozent) ist möglich, doch ist es vorteilhaft, wenn die den Verdünnungsmittel versetzt werden, bis jeKubikgenannten Zuckeralkohole in Konzentrationen von Zentimeter mindestens 10 Millionen Spermazellen ungefähr 1% (1000 Milligrammprozent) vorliegen. io vorhanden sind. Vorsichtshalber stellt man jedoch Im Gemisch verwendet man sie am besten in glei- ein Samenpräparat her, dessen Spermazellenkonzenchen Teilen. Sie können aber auch unter Erzielung tration mindestens doppelt so hoch ist. guter Ergebnisse in einem Mengenverhältnis von Widdersamen enthält normalerweise etwa 800

70% Sorbit zu 30% Mannit bis 30% Sorbit zu bis 4000 Millionen Spermazellen je Kubikzentimeter. 70 % Mannit eingesetzt werden. Die Unterschiede in 15 Für eine Befruchtung werden mindestens 25 Millionen den Ergebnissen sind nur gering, wenn die Mengen- Spermazellen in ^] '2 cm³ für notwendig erachtet. Eberanteile innerhalb dieser Grenzen variiert werden. samen enthält normalerweise etwa 25 bis 1000 Mil-Die alkoholhaltige Lösung zum Verdünnen von Honen Spermazellen, d. h. im Durchschnitt etwa Tiersperma enthält im allgemeinen auch eine Puffer- 400 Millionen Spermazellen je Kubikzentimeter. Um substanz, um die Lösung gegen schnelle, starke 20 eine Befruchtung zu gewährleisten, werden 50 Änderungen der Wasserstoffionenkonzentration zu bis 70 cm³ Samen, die mindestens 2 Billionen schützen. Als Puffersubstanzen können die für diesen Spermazellen enthalten, für notwendig gehalten. Der Zweck allgemein gebräuchlichen Stoffe verwendet Samen des Hahnes enthält normalerweise bis zu etwa werden, z. B. lösliche Salze, wie Alkalimetallcitrate, 60 Millionen Spermazellen je Kubikzentimeter. Da- -phosphate, -acetate, -carbonate u. dgl. Man kann 25 mit die Befruchtung sicher eintritt, wird ein Volumen diese Stoffe einzeln oder im Gemisch zusetzen. Zum von etwa V10 cm³ mit einem Gehalt von mindestens Beispiel kann man ein Alkalimetallcitrat mit einem 6 Millionen Spermazellen für erforderlich gehalten. Alkalimetallphosphat oder Natriumeitrat zusammen Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann mit Kaliumeitrat verwenden. Die Puffersubstanz ist das Gemisch zur Konservierung von Sperma in normalerweise in einer Menge von 0,025 bis 1,5% 30 trockener, pulverisierter Form in verschlossenen Be-(250 bis 1500 Milligrammprozent) vorhanden. hältern für Versand und Lagerung hergestellt werden. Der erfindungsgemäßen Lösung zum Verdünnen Vor Gebrauch wird der Inhalt mit einem bestimmten von Sperma kann außerdem eine der in den bisher Volumen Verdünnungsflüssigkeit, z. B. destilliertem gebräuchlichen Samenverdünnungsmitteln verwende- Wasser, versetzt und dann der Samen zugegeben, ten Substanzen zugesetzt werden, z. B. Vollmilch, 35 Wie oben bereits erwähnt, enthält das Gemisch außer Magermilch, Glycerin, Eigelb, Gelatine, Trauben- dem konservierenden Alkohol vorteilhaft eine Pufferzucker, Fruchtzucker (zur Ergänzung des von Natur substanz, einen Zuckernährstoff und ein Kolloidaus im Samen vorkommenden Fruchtzuckers), Leci- stabilisierungsmittel. Derartige Gemische können thin, Lipoproteine, Antibiotika, wie Streptomycin z. B. enthalten: 0,25 bis 0,75 Gewichtsteile Sorbit, und Penicillin u. dgl. Die Zuckernährstoffe können 4° 0,25 bis 0,75 Teile Mannit, 0,25 bis 0,75 Teile in Mengen von etwa 0,125 bis 0,75% (125 bis Fruchtzucker, 0,05 bis 0,15 Teile Natriumeitrat, 750 Milligrammprozent) zugegeben werden. 0,05 bis 0,15 Teile Kaliumeitrat, 0,05 bis 0,15 Teile Bekanntlich wirken bestimmte Polyalkohole hem- prim.Kaliumphosphat und 0,1 bis 0,5 Teile kolloidamend auf Antibiotika. Es ist daher ratsam, den Ies Stabilisierungsmittel. Gegebenenfalls können noch Samen zunächst etwa 6 Stunden mit dem Antibio- 45 etwa 1 bis 3 Teile Trockenmilch und/oder etwa 8 tikum zu behändem und erst anschließend den stabi- bis 10 Teile Trockeneigelb enthalten sein. Zum Gelisierenden Alkohol zuzugeben, wenn der Verdacht brauch wird das Gemisch einfach in 100 Teilen besteht, daß Krankheitskeime im Samen enthalten destilliertem Wasser gelöst und mit dem Samen versind, mischt, wodurch die gewünschte Verdünnung erhal-Da die Spermazellen gegen mechanische Erschüt- 5° ten wird.

terungen empfindlich sind, ist es vorteilhaft, dem Vielfach wird Samen zur künstlichen Befruchtung

Verdünnungsmittel auch ein in Wasser lösliches, durch Einfrieren konserviert. Nach dem Auftauen gegen Erschütterungen schützendes Kolloid zu- ergibt sich jedoch das gleiche Problem wie bei zusetzen, z. B. Gelatine, Agar, Guargummi, Traga- frischem Samen, wobei die Lebensdauer des eincanthgummi, Gummiarabikum, Dextrin, Ghatti- 55 gefrorenen Samens nach dem Auftauen noch geringummi u. dgl. Diese Kolloide werden vorzugsweise ger ist. Wenn eingefrorener Samen nach dem Aufin einer Menge von etwa 0,1 bis 1,0 % (100 bis tauen mit den üblichen Verdünnungsmitteln versetzt Milligrammprozent) verwendet. Der osmotische wird, beträgt seine Lebensdauer nur noch etwa Druck in dem verdünnten Samengemisch beträgt 6 Stunden. Mit dem erfindungsgemäßen Verdünvorzugsweise etwa 200 bis 350 Milliosmol, am besten 60 nungsmittel ist es möglich, die Fähigkeit des Samens etwa 300 Milliosmol. zur Befruchtung auf 4 bis 5 Tage zu verlängern.

Der Samen wird im allgemeinen mit etwa 10 Außer als Verdünnungsmittel des Samens bei der

bis 200 Teilen Lösung verdünnt. Der Grad der Ver- künstlichen Besamung können die erfindungsgemädünnung richtet sich nach bestimmten Faktoren, z. B. ßen Gemische auch dazu dienen, bei der natürlichen der Konzentration der Spermazellen im Samen bzw. 65 Besamung günstigere Bedingungen zu schaffen. Beder Konzentration der Spermazellen, die normaler- kanntlich ist bei vielen weiblichen Tieren der Zeitweise für die Befruchtung erforderlich ist. Dies ist raum, in dem eine Befruchtung möglich ist, nur kurz. bei den einzelnen Arten verschieden, z. B. enthält Die Befruchtung hängt von der Gegenwart lebens-

fähigen Samens während dieses Zeitraumes in der Fallopischen Röhre ab. Um die Zeitspanne zu verlängern, während welcher der Samen für die Befruchtung wirksam bleibt, kann die gepufferte Lösung des Zuckeralkohols vor der natürlichen Besamung in die weiblichen Organe eingeführt werden.

Die Überlegenheit des bevorzugten erfindungsgemäßen Konservierungsmittels bei seiner Verwendung zur Verdünnung von Bullensamen gegenüber üblichen Verdünnungsmitteln ist in der Zeichnung dargestellt. Sie wurde in der Weise festgestellt, daß man den Einfluß tagelanger Lagerung bei 5⁰C auf die Bewegungsfähigkeit der Spermazellen ermittelte. Die Bewegungsfähigkeit der Spermazellen nimmt rasch ab und beträgt um den 2. bis 5. Tag weniger als 50%, wenn die bisher üblichen Verdünnungsmittel, wie mit Glycerin versetzte Vollmilch, Eigelbcitrat, Buttermilch, Vollmilch- oder Mischungen aus Magermilch—Eigelb—Glycerin verwendet werden. Wenn die Bewegungsfähigkeit der Spermazellen weniger als 50% beträgt, ist der Anteil an den Tieren, die ein zweites Mal behandelt werden müssen, so hoch, daß eine Verwendung des Samens praktisch wertlos ist. Wie aus der Zeichnung ersichtlich ist, sind am 7. bis 11. Tag praktisch alle in den üblichen Verdünnungsmitteln suspendierten Spermazellen nicht mehr bewegungsfähig. Die mit den üblichen Verdünnungsmitteln erhaltenen Ergebnisse stellen Durchschnittsergebnisse aus sechs Ejakulationen dar.

Hingegen zeigt der mit einer Lösung von Zuckeralkoholen (vor allem mit einer Lösung, die zu gleichen Teilen Mannit und Sorbit in einer Gesamtkonzentration von 1% enthält) verdünnte Samen bei kühler Lagerung noch nach mehr als 2 Wochen eine praktisch unverminderte Bewegungsfähigkeit. Wenn schließlich die Bewegungsfähigkeit nachläßt, geht die Veränderung so langsam vor sich, daß am 26. und 27. Lagerungstag noch 50% der Zellen bewegungsfähig sind. Die Kurve, die die durch den Zuckeralkohol erzielte konservierende Wirkung zeigt, stellt das Durchschnittsergebnis aus 26 Ejakulatproben dar.

Die Erfindung wird an Hand des folgenden Beispiels erläutert.

Beispiel

30 Gewichtsteile Eigelb wurden mit 25 Teilen Vollmilch vermischt und dann 2 Minuten auf 90° C erhitzt. Anschließend wurden 0,25 Teile Gelatine, 0,5 Teile d-Glucit, 0,5 Teile d-Mannit, 0,5 Teile d-Fruktose, 0,1 Teil Kaliumeitrat, 0,1 Teil Natriumcitrat, 0,1 Teil prim.Kaliumphosphat, 45 Teile Wasser, 500 y/cm³ Streptomycin und 500 Einheiten/cm³ Penicillin zugegeben. Der p_H-Wert der so hergestellten Lösung betrug 6,4, der osmotische Druck 300 MiI-liosmol. Eine mit dieser Lösung im Verhältnis 1: 71 verdünnte Probe Bullensamen führte bei der künstlichen Besamung von Kühen zu einem um 13,2% besseren Ergebnis als Samen, der mit 10% Glycerin enthaltender, zuvor erhitzter Vollmilch verdünnt worden war. Selbst nach 5 Tagen wurde noch eine zu 84,3% erfolgreiche Besamung erzielt. Normalerweise ist 5 Tage alter Samen wertlos.

Der gleiche Erfolg wird erreicht, wenn man in dem oben beschriebenen Verdünnungsmittel den Mannit durch Sorbit oder den Glucit durch Mannit ersetzt.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Konservieren von Sperma, dadurch gekennzeichnet, daß man diese mit einer Lösung vermischt, die neben üblichen Puffersubstanzen, Nährstoffen und Schutzkolloiden mindestens einen Zuckeralkohol der Formel C_nH_n+2(OH)_n, worin η eine ganze Zahl von 4 bis 7 ist, und/oder ein cyclisches Polyol der Formel C₆H₆(OH)₆ bzw. einen Monoäther des cyclischen Polyols mit einem niederen Alkohol in einer Konzentration von 0,01% bis zum isotonischen Grenzwert der Spermazellen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung als Zuckeralkohol Erythrit, Arabit, Ribit, Xylit, Dulcit, vorzugsweise Mannit und/oder Sorbit und als cyclisches Polyol einen Inosit enthält.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 068 862.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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