DE1158063B - Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Steroidverbindungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Steroidverbindungen Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Steroidverbindungen der allgemeinen Formel in der Y Wasserstoff oder Fluor, X Ketosauerstoff oder (H, ß - OH) und R Wasserstoff oder den Acylrest einer Carbonsäure mit 1 bis 12 Kohlenstof atomen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel in der X, Y und R die obige Bedeutung haben, mit Streptomyces argenteolus ATCC 11009 fermentativ hydroxyliert, gegebenenfalls die 16- und 21-ständige Hydroxylgruppe mit dem Halogenid oder Anhydrid einer organischen Carbonsäure mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen acyliert, gegebenenfalls die 11-ständige Hydroxylgruppe mit einem Chromsäureoxydationsmittel oxydiert und gegebenenfalls die 16- und 21-ständige Acylatgruppe des erhaltenen 11-Ketoderivates mit einer Base hydrolysiert.
• Man hat zwar schon mittels der Actinomycetenart ATCC 11009 in 11-Desoxysteroidverbindungen eine 16a-ständige Hydroxylgruppe eingeführt. Auf Grund der außerordentlichen Substratspezifität von Mikroorganismen konnte man jedoch nicht annehmen, daß Streptomyces argenteolus auch in Steroidverbindungen, die einen 6a-ständigen Fluorsubstituenten enthalten, eine 16a-ständige Hydroxylgruppe einführen würde, ohne dabei gleichzeitig die einer Oxydation zugänglichen Hydroxylgruppe in llß-Stellung zu beeinträchtigen.
• Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen besitzen stärkere glucocorticoide und entzündungswidrige Wirkung als Hydrocortison und Cortison. Sie erhöhen ferner die Salz- und Wasserausscheidung und sind daher besonders für die Behandlung von chronischen kongestiven Herzbeschwerden, Lebercirrhose, Nieren- und Nebennierensyndromen sowie Eklampsie und Präeklampsie geeignet.
• Zur therapeutischen Anwendung können sie in den üblichen Dosierungsformen oral, parenteral und örtlich verabreicht werden. Für die orale Anwendung eignen sich Pillen, Tabletten und Kapseln, für die parenterale Verabfolgung flüssige Präparate, wie sie bei natürlichen und synthetischen Corticosteroidhormonen üblich .sind, und für die örtliche Anwendung Salben, Cremes, Lotionen u. dgl. Gegebenenfalls können noch andere Wirkstoffe, wie Antibiotica, Germicide u. dgl., zugesetzt werden.
• Die Einführung der 16a-ständigen Hydroxylgruppe -kann unter den in der USA.-Patentschrift 2602 769 angegebenen Bedingungen- erfolgen. Der Streptomyces argenteolus wird hierzu auf einem Medium gezüchtet, das assimilierbaren, nichtsteroidalen Kohlenstoff, z. B. Kohlenhydrate, wie Dextrose, assimilierbaren Stickstoff, wie lösliche oder unlösliche Proteine, Peptone oder Aminosäuren, sowie mineralische Bestandteile, wie Natrium- oder Ammoniumphosphat und Magnesiumsulfat, enthält. Vor der Beimpfung mit den Mikroorganismen weist das Medium vorzugsweise einen pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 7,8 auf, doch kann der pH-Wert auch höher oder niedriger sein. Für das Wachstum der Mikroorganismen wird ein pH-Wert zwischen etwa 6,8 und 7,4 bevorzugt sowie ein Temperaturbereich von etwa 20 bis 35°C, vorteilhaft von etwa 20 bis 32°C.
• Die Wachstumsperiode vor dem Zusatz des zu fermentierenden Steroids scheint nicht kritisch zu sein. Das Steroid kann z. B. vor der Sterilisation des Mediums, zum Zeitpunkt der Beimpfung mit dem Mikroorganismus oder später, z. B. 24 bis 48 Stunden danach zugesetzt werden. Der Zusatz des Steroidsubstrates kann auf jede geeignete Weise erfolgen, z. B. durch Dispergieren, gegebenenfalls mit einem Dispergiermittel, oder gelöst in einem organischen Lösungsmittel. Submerse und Oberflächenkulturen sind in gleicher Weise geeignet, doch wird eine submerse Kultur bevorzugt.
• Die Temperatur während der Fermentation kann die gleiche sein, wie sie für das Wachstum des Mikroorganismus angewendet wurde. Sie muß nur innerhalb eines Bereiches liegen, in dem der Mikroorganismus leben und wachsen bzw.. das von ihm erzeugte Enzym wirksam sein kann.
• Die zur Einführung der 16a-ständigen Hydroxylgruppe erforderliche Zeit hängt etwas vom angewandten Verfahren ab. Wird das Steroid nach wesentlichem Wachstum des Mikroorganismus zugesetzt, z. B. nach 16 bis 24 Stunden bei optimaler Temperatur, so beginnt die Umwandlung des Steroids sofort und ist nach 2 bis 10 Tagen praktisch beendet. Meist werden innerhalb von 5 Tagen befriedigende Ergebnisse erhalten.
• Nach Beendigung der Fermentation wird das umgewandelte Steroid durch Extraktion mit einem organischen Steroidlösungsmittel, z. B. Methylisopropylketon, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Athylenehlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat, Benzol u. dgl. aus dem Fermentationsgemisch (Gärflüssigkeit -E- Mycel) gewonnen. Die Gärflüssigkeit und das Mycel können auch getrennt mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und die Extrakte .vor oder nach dem Waschen mit einer alkalischen Lösung, z. B. Natriumbicarbonatlösung, vereinigt werden. Anschließend wird z. B. über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Steroid durch Umkristallisation oder Verreiben mit organischen Lösungsmitteln oder durch Chromatographieren gereinigt-Anschließend kann die 16a- und 21-ständige Hydroxygruppe nach bekannten Verfahren verestert und die llß-ständige Hydroxygruppe oxydiert werden. Falls. 11-Ketoverbindungen mit freier 16a- und 21-ständiger Hydroxygruppe gewünscht werden, schließt sich daran noch eine Hydrolyse, zweckmäßig mit Alkalibicarbonat unter Sauerstoffausschluß an.
• Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 a) 6a-Fluor-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion 100m1 2%iges Maisquellwasser Feststoffgehalt 60% wurden mit Natronlauge auf pH 6,8 bis 7,4 eingestellt und 30 Minuten bei einem Druck von etwa 1 kg(cm2 sterilisiert. Dann wurde eine auf ähnliche Weise sterilisierte Lösung von 2 g technischer Dextrose, die unter der Handelsbezeichnung »Cerelose« bekannt ist, in 4 ml Wasser zugesetzt. Das sterile Medium wurde mit einer Suspension von Sporen und Mycel von Streptomyces argenteolus ATCC 11009 geimpft und 24 Stunden auf einen Rotationsschüttler gebracht. In dieser Zeit entstand eine gute Kultur des Mikroorganismus. Der 24 Stunden alten Kultur wurden 20 mg 6a-Fluor-l lß,17a,-21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion (6a-Fluorhydrocortison), gelöst in 0,2m1 Dimethylformamid, zugesetzt. Die Bebrütung des Steroids erfolgte unter Bewegung 5 Tage lang. Darauf betrug der pH-Wert 8,6. Durch Zentrifugieren wurden sodann Mycel und Gärflüssigkeit getrennt. Das Mycel wurde zuerst zweimal mit je 25 ml Aceton und anschließend viermal mit je 25 ml Methylisopropylketon extrahiert. Die Gärflüssigkeit wurde viermal mit je 25 ml Methylisopropylketon extrahiert. Alle Extrakte wurden vereinigt, mit 20/0iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und danach mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand, der auf Grund einer papierchromatographischen Analyse das 6a-Fluor-l1ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion enthielt, wurde durch Chromatographieren über synthetisches Magnesiumsilikat, das unter der Handelsbezeichnung »Florisil« bekannt ist, und Kristallisation aus Aceton gereinigt. F. = 234 bis 236°C.
• b) 6a-Fluor-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat Eine Lösung von 1,2 g 6a-Fluor-1 1ß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion -in 20m1 pyridin und 20m1 Essigsäureanhydrid wurde 17 Stunden bei Zimmertemperatur (etwa 25°C) stehengelassen und anschließend in 200m1 Eiswasser gegossen. Das erhaltene Gemisch wurde mit Methylenehlorid extrahiert und der Extrakt nacheinander mit verdünnter Salzsäure, verdünntem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Chromatographieren über synthetischem Magnesiumsilikat und Kristallisation aus Aceton gereinigt. Man erhielt 6a-Fluor-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16,21-diacetat vom Schmelzpunkt 187 bis 192°C. Beispiel 2 Unter Anwendung der im Beispiel 1, a) beschriebenen Verfahrensweise erhielt man aus 6a,9a-Difluorllß,17a,21-trihydroxy-4-pregnen-3,20-dion das entsprechende 16a-Hydroxyderivat vom Schmelzpunkt 242 bis 248'C, das nach dem Verfahren des Beispiels 1, b) in 6a, 9a-Difluor-llß,16a,17a,21-tetraoxy-4-pregnen-3,20-dion-16a,21-diacetatumgewandelt wurde. F. = 182 bis 185'C.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wirksamen Steroidverbindungen der allgemeinen Formel in der Y Wasserstoff oder Fluor, X Ketosauerstoff oder (H, ß -OH) und R Wasserstoff oder den Acylrest einer Carbonsäure mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Verbindung der allgemeinen Formel in der X, Y und R die obige Bedeutung haben, mit Streptomyces argenteolus ATCC 11009 fermentativ hydroxyliert, gegebenenfalls die 16-und 21-ständige Hydroxylgruppe mit dem Halogenid oder Anhydrid einer organischen Carbonsäure mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen acyliert, gegebenenfalls die 11-ständige Hydroxylgruppe mit einem Chromsäureoxydationsmittel oxydiert und gegebenenfalls die 16- und 21-ständige Acylatgruppe des erhaltenen 11-Ketoderivates mit einer Base hydrolysiert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ausgangsmaterial 6a-Fluor-11 ß,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion oder 6a,9a-Difluor-llß,17a,21-trioxy-4-pregnen-3,20-dion verwendet. In Betracht gezogene Druckschriften: J. Amer. Chem. Soc., 74, S. 2126 (1952); Journ. Bacteriol., 69, S. 347 (1955); Rec. Progr. Horm. Res., 11, S. 149 bis 180.