DE10393475B4

DE10393475B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Identifizierung von Verbindungen in einer Probe

Info

Publication number: DE10393475B4
Application number: DE10393475.8T
Authority: DE
Inventors: Bruce Compton; Robert S. Plumb
Original assignee: Waters Technologies Corp
Current assignee: Waters Technologies Corp
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2014-09-25
Anticipated expiration: 2023-10-10
Also published as: GB2409038A; GB2409038B; US20050233464A1; JP4795688B2; GB0507026D0; AU2003284060A1; WO2004034049A1; CA2501861C; CA2501861A1; DE10393475T5; JP2006502414A

Abstract

Verfahren zum Identifizieren einer oder mehrerer Verbindungen in einer Probe, wobei die Probe auf eine Proteom-”[P]”, eine Metabonom-”[M]” oder eine Genom-”[G]”Komponente gerichtet ist, wobei die Probe zu ihren Bestandteilskomponenten äquivalent ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Trennen einer Probe in eine Vielzahl von Aliquote mittels Chromatographie, die durch Retentionszeitenbereiche definiert sind, wobei jeder Retentionszeitenbereich einer oder mehreren Verbindungen zugeordnet wird, um einen Retentionszeitwert für die Verbindungen zu erzeugen, b) Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse für jede Aliquote, wobei jede Massenspektrometrieanalyse einen oder mehrere Massenwerte aufweist, die einer oder mehreren Verbindungen innerhalb des Retentionszeitenbereichs zugeordnet werden, um einen Massenwert für jede Verbindung zu erzeugen, und c) Durchführen wenigstens eines weiteren Analysemodus mit jeder Aliquote, um einen weiteren analytischen Wert für jede Verbindung zu erzeugen, wobei die eine oder die mehreren Verbindungen in der Probe durch den Retentionszeitwert, den Massenwert und den weiteren analytischen Wert identifiziert sind, um das Vergleichen von Werten als Funktion der Zeit und von unterschiedlichen Proben zu erleichtern, wobei wenigstens ein Analysemodus einen Wert erzeugt, der mit der Konzentration oder der relativen Konzentration innerhalb der Probe in Beziehung gesetzt werden kann, ...

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Analyse und insbesondere der pharmazeutischen Analyse, bei der versucht wird, den Stoffwechsel bzw. Metabolismus von Medikamenten im Körper zu verstehen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Forscher und medizinisches Fachpersonal streben danach, die Art und Weise zu verstehen, in der der Körper Verbindungen im Wege des Stoffwechsels umsetzt, die einen biologischen Effekt aufweisen. Mit diesem Wissen können Forscher und medizinisches Fachpersonal toxische und/oder therapeutische Wirkungen verstehen. Ferner können mit diesem Wissen Forscher und medizinisches Fachpersonal weitere aktive Verbindungen und weitere chemische Pfade identifizieren, die die Möglichkeit der Kontrolle oder Modifizierung mittels geeigneter Medikamente aufweisen oder mögliche Medikamentwechselwirkungen mit anderen Medikamenten und Chemikalien nahelegen.
Der Stoffwechsel lebender Organismen ist jedoch komplex. Ferner kann das Markieren von Verbindungen, die einem Organismus verabreicht werden, unvollständige Ergebnisse liefern. Es ist wünschenswert, Informationen bezüglich der Veränderungen der Konzentrationen der Verbindungen zu haben, die nicht notwendigerweise markiert sind, jedoch eine Rolle im Stoffwechselpfad haben können.
Die internationale Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 00/63683 A1 beschreibt Fingerprinting-Verfahren für Polypeptide, Verfahren zum Erstellen von Proteom- und metabolischen Profilen biologischer Proben sowie ein computergesteuertes Datenabfragesystem zum Erstellen von Proteom- und metabolischen Profilen biologischer Proben. Die US-Patentanmeldung Nr. US 2002/0098595 A1 beschreibt mehrphasige Proteintrennungsverfahren, mit denen es möglich ist, eine große Anzahl von zellulären Proteinen zu charakterisieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen Verfahren und Vorrichtungen zum Identifizieren einer oder mehrerer Verbindungen in einer Probe. Eine Ausführungsform, die ein Verfahren betrifft, umfasst die Schritte des Trennens einer Probe mittels Chromatographie in eine Vielzahl von Teile bzw. Aliquote, die durch Retentionszeitenbereiche definiert sind. Jeder Retentionszeitenbereich ist einer oder mehreren Verbindungen zugeordnet, um einen Retentionszeitenwert für Verbindungen in der Probe zu erzeugen. Anschließend wird eine Massenspektrometrieanalyse für jede der Aliquote durchgeführt. Jede Massenspektrometrieanalyse ordnet einen oder mehrere Massenwerte einer oder mehreren Verbindungen innerhalb des Retentionszeitenbereichs zu, um einen Massenwert für jede Verbindung zu erzeugen. Anschließend wird jede Aliquote wenigstens einem weiteren Analysemodus unterzogen, um einen weiteren analytischen Wert für jede Verbindung zu erzeugen. Somit werden die eine oder die mehreren Verbindungen in der Probe durch einen Retentionszeitwert, einen Massenspektrometriewert und den weiteren analytischen Wert definiert bzw. identifiziert. Diese Werte erleichtern Vergleiche als Funktion der Zeit und zwischen unterschiedlichen Proben und mit Normalwerten.
Der hier verwendete Begriff ”Aliquote” wird im üblichen chemischen Sinne als Teil einer größeren Probe gebraucht. Der Begriff ”Chromatographie” bezeichnet die Trennung eines Gemisches in seine Verbindungsbestandteile, und zwar als Folge der unterschiedlichen Geschwindigkeiten, mit denen sich die Verbindungen durch oder entlang einer stationären Phase bewegen. Der hier verwendete Begriff ”Retentionszeitenbereich” bezeichnet den Zeitraum, der durch einen Peak oder eine Bande einer untersuchten Verbindung definiert wird, der bzw. die einen Punkt in einem Fluss eines Gemisches durch eine chromatographische Vorrichtung passiert.
Der Begriff ”Massenspektrometrie” bezeichnet Verfahren und Prozesse zum Bestimmen der Masse einer Verbindung. Eine Massenspektrometrieanalyse liefert üblicherweise eine oder mehrere Massen, die einer Aliquote oder einer Probe zugeordnet sind. Das bedeutet, dass eine Verbindung aufgrund einer Fragmentierung der Verbindung mehr als einen Massenwert aufweisen kann. Die Massenspektren einer solchen Verbindung können mehr als einen Massenwert aufweisen.
Weitere analytische Werte können mittels irgendeiner Technik aus einer Vielzahl von Techniken bereitgestellt werden, die einen charakteristischen Wert oder Werte für eine Verbindung erzeugen. Vorzugsweise erzeugt wenigstens ein Analysemodus, bei dem es sich um den weiteren Analysemodus handelt, einen Wert, der mit der Konzentration oder der relativen Konzentration innerhalb der Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Falls eine Vielzahl von Proben zeitlich untersucht werden, werden eine oder mehrere Verbindungen, die durch einen Massenwert und einen Retentionszeitwert identifiziert sind, vorzugsweise ferner durch Veränderungen der Konzentration als Funktion der Zeit identifiziert.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet insbesondere beim Vergleich von Werten einer oder mehrerer Verbindungen in der Probe mit einer Datenbank von ähnlichen Werten Anwendung, um eine vermeintliche Identität der Verbindungen zu bestätigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet ferner dort Anwendung, wo die Proben aus biologischen Geweben einer oder mehrerer Personen gewonnen werden, denen ein Medikament verabreicht worden ist, oder um den Fortgang einer Erkrankung zu verfolgen. Das vorliegende Verfahren ermöglicht es, wenigstens eine Verbindung, ein Medikament, einen Metaboliten oder ein Protein mittels des Retentionszeitwerts, des Massenwerts und der relativen Konzentration zu identifizieren. Für den Fall, dass das Medikament metabolisiert ist, um einen Metaboliten auszubilden, erlaubt das vorliegende Verfahren die Identifizierung des Metaboliten mittels einer erhöhten Konzentration als Funktion der Zeit, wenn das Medikament metabolisiert wird. Für den Fall, dass ein Erkrankungszustand durch ein bestimmtes Metabolit oder Protein oder durch dessen Fehlen charakterisiert wird, kann ein derartiges Metabolit oder Protein als Funktion der Zeit verfolgt werden.
Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens ermöglichen die Erfassung der metabolischen Gesamtverfassung eines Organismus (Metabonom) oder der Gesamtproteinverfassung eines Organismus (Proteom) mittels Identifizierungen und Konzentrationsbereichen. Somit handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung um ein nützliches Werkzeug bei proteomischen und metabonomischen Forschungen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Identifizieren wenigstens einer Verbindung in einer Vielzahl von Proben bereit. Die Vorrichtung umfasst Mittel zum Trennen einer Probe in eine Vielzahl von Aliquote mittels Chromatographie. Die Mittel zum Trennen der Probe in Aliquote setzen dies mittels des Retentionszeitenbereichs um, der mit einer oder mehreren Verbindungen in der Probe im Zusammenhang steht. Der Trennvorgang erzeugt einen Retentionszeitwert für jede Verbindung. Die Vorrichtung umfasst ferner Mittel zum Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse mit jeder Aliquote. Die Mittel zum Erhalten einer Massenspektrometrieanalyse erzeugen einen oder mehrere Massenwerte, die einer Verbindung zugeordnet werden. Die Vorrichtung umfasst ferner Mittel, um jede Aliquote wenigstens einem weiteren Analysemodus zu unterziehen. Der wenigstens eine weitere Analysemodus erzeugt einen weiteren analytischen Wert, der der Verbindung zugeordnet wird. Die Vorrichtung umfasst ferner Computermittel um den Retentionszeitwert jeder Verbindung dem Massenwert und einem oder mehreren weiteren analytischen Werten zuzuordnen, um den Vergleich von Werten zu erleichtern. Das Vergleichen von Werten bedeutet in diesem Zusammenhang Vergleiche mit Standard- oder Normalwerten oder Werten, die mit Erkrankungszuständen konsistent sind, oder mit Werten von derselben Person als Funktion der Zeit oder mit Werten aus verschiedenen Proben.
Vorzugsweise weist die Vorrichtung wenigstens eine Einrichtung auf, um die Probe einem Analysemodus zu unterziehen, der einen Wert erzeugt, der mit der Konzentration oder der relativen Konzentration innerhalb der Probe in Beziehung gesetzt werden kann. Falls die Vorrichtung eine Vielzahl von Proben als Funktion der Zeit aufnimmt, dann werden die eine oder die mehreren Verbindungen, die durch Massen und Retentionszeiten identifiziert sind, ferner durch zeitliche Veränderungen der Konzentration identifiziert.
Der Begriff ”Computermittel” wird in einem allgemeinen Sinn verwendet, unter den Arbeitsplatzrechner und Großrechner fallen. Die Computermittel vergleichen die eine oder die mehreren Verbindungen mit einer Datenbank ähnlicher Werte, um eine vermeintliche Identität der Verbindung aufzuzeigen.
Vorzugsweise ist die Chromatographie ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Flüssigkeitschromatographie, superkritische Fluidchromatographie und Gaschromatographie. Die Flüssigkeitschromatographie umfasst beispielsweise die Größenausschluss-Chromatographie, die Ionenaustausch-Chromatographie, die Umkehrphasen-Chromatographie und die Normalphasen-Chromatographie.
Die Massenspektrometrie umfasst beispielsweise MALD-TOF, EI-MS, ESI-MS und ESI-MS/MS, APCI-MS und APCI-MS/MS, Photoionisation-MS und MS/MS.
Vorzugsweise umfasst der weitere Analysemodus Massenspektrometrie, Kernspinresonanz, FT-IR, UV/VIS-Spektrophotometrie, Fluoreszenz und Chemilumineszenz.
Die Vorrichtung findet insbesondere dort Anwendung, wo die Proben aus biologischen Geweben einer oder mehrerer Personen gewonnen werden, denen ein Medikament verabreicht worden ist, oder wo derartige Personen Symptome einer Erkrankung aufweisen.
Die Vorrichtung findet eine besondere Verwendung bei der Identifizierung von Verbindungen, die mittels der Retentionszeit, dem Massenspektrum und der relativen Konzentration identifiziert sind. Bei der Verbindung kann es sich um ein Medikament, einen Medikamentmetaboliten, ein normales oder abnormales Protein oder einen Metaboliten handeln.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung und den Beispielen in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f und 2g zeigen Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
3 zeigt das erfindungsgemäße Massenionisierungsmerkmal.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zum Durchführen globaler, d. h. großangelegter, Vergleiche des Proteoms und des Metabonoms eines Organismus. Die Verfahren und die Vorrichtungen gemäß der vorliegenden Erfindung erleichtern Untersuchungen von einer oder mehrerer Veränderungen oder die Entwicklung von Standards oder Kontrollen in dem Proteom und Metabonom eines Organismus mit der Zeit sowie Veränderungen der physischen Umwelt, der der Organismus ausgesetzt ist, oder der Medikamente, die dieser einnimmt.
Die vorliegende Erfindung wird im Detail hinsichtlich einer Vorrichtung beschrieben, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert. Der Fachmann erkennt, dass die nachstehende Beschreibung und die Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen betreffen. Die Erfindung kann verändert und modifiziert werden und sollte nicht auf die konkreten Details der Beschreibung und der Zeichnungen beschränkt werden.
1 zeigt eine Vorrichtung zum Identifizieren wenigstens einer Verbindung in einer Vielzahl von Proben, die im allgemeinen mit der Bezugsziffer 11 gekennzeichnet ist. Die Vorrichtung 11 umfasst die folgenden Hauptkomponenten: eine Chromatographie-Anordnung 15, eine Massenspektrometer-Anordnung 17, ein drittes analytisches System, wie beispielsweise eine UV-Detektor-Anordnung 19, sowie einen Computer 21.
Die Chromatographie-Anordnung 15, die Massenspektrometer-Anordnung 17 und die UV-Detektor-Anordnung 19 stehen über die Leitungen 23 und 25 in fluider Kommunikation. Man erkennt, dass die Reihenfolge der Massenspektrometer-Anordnung 17 und dem UV-Detektor 19 eine Frage des persönlichen Geschmacks ist und umgekehrt werden kann. Retentionswerte, Massenwerte und UV-Datenwerte werden über die Leitungen 31, 33 und 35 an den Computer 21 kommuniziert. Man erkennt, dass Computer und die Analysegeräte ebenso über drahtlose Netzwerke und dergleichen kommunizieren können und die Leitungen 31, 33 und 35 können jedwede Form von Kommunikation repräsentieren.
Eine oder mehrere Proben werden von der Chromatographie-Anordnung 15 aufgenommen. Die Chromatographie-Anordnung 15 trennt eine Probe mittels Chromatographie in eine Vielzahl von Aliquote. Vorzugsweise handelt es sich bei der Chromatographie um eine Flüssigkeitschromatographie, eine superkritische Fluidchromatographie oder Gaschromatographie. Bei einer Flüssigkeitschromatographie kann es sich beispielsweise um eine Größenausschluss-Chromatographie, eine Ionenaustausch-Chromatographie, eine Umkehrphasen-Chromatographie oder eine Normalphasen-Chromatographie handeln. Eine bevorzugte Chromatographie-Anordnung 15 ist eine ALLIANCE^® Autosampler- und Pumpenanordnung (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, USA), die mit geeigneten Säulen und Detektoren ausgestattet ist.
Die Chromatographie-Anordnung 15 empfängt Proben und trennt jede Probe in Aliquote mittels eines Retentionszeitenbereichs, der einer oder mehreren Verbindungen zugeordnet wird. Mit anderen Worten: die Bestandteile der Probe werden in Banden oder Peaks getrennt, die durch Retentionszeiten definiert sind. Der Fachmann erkennt, dass derartige Retentionszeiten je nach Solvenzzusammensetzung und je nach Unterschieden der festen Phase variieren, in der die Trennung durchgeführt wird, d. h. der festen Phase in der Säule. Bei einer gegebenen Verbindung, einem gegebenen Solvenz und einer gegebenen festen Phase kann jedoch die Retentionszeit sehr gut definiert und reproduziert werden. Somit erzeugt die Chromatographie-Anordnung 15 einen Retentionszeitwert für jede Verbindung, wobei die Retentionszeit vom Computer 21 empfangen wird.
Die Vorrichtung umfasst ferner Mittel zum Durchführen einer Massenspektrometrie-Analyse von jeder Aliquote. Die Mittel zum Durchführen einer Massenspektrometrie-Analyse sind das Massenspektrometer 17. Massenspektrometer werden von zahlreichen Firmen vertrieben und können MALD-TOF, EI-MS, ESI-MS und ESI-MS/MS, APCI-MS und APCI-MS/MS, Photoionisation-MS und MS/MS umfassen. Bevorzugte Massenspektrometer sind die Massenspektrometer mit den Markennamen QUATTRO MICRO^TM, Q-TOF^TM, QUATTRO PREMIER^TM und ZQ^TM, die von der Firma Waters Corporation (Milford, Massachusetts, USA) vertrieben werden.
Das Massenspektrometer 17 erzeugt einen oder mehrere Massenwerte, die einer Verbindung zugeordnet werden. Der eine oder die mehreren Massenwerte werden zu einem Computer 21 übertragen, um mit dem dazugehörigen Retentionszeitwert im Speicher gespeichert zu werden. Die Vorrichtung umfasst ferner Mittel, um jede Aliquote wenigstens einem weiteren Analysemodus zu unterziehen.
Die Vorrichtung 11 weist wenigstens einen weiteren Analysemodus auf, der einen weiteren analytischen Wert erzeugt, der dieser Verbindung zugeordnet wird. Wie dargestellt, handelt es sich bei diesem weiteren Analysemodus um einen UV-Detektor 19. Andere Analysemoden könnten jedoch den UV-Detektor 19 ersetzen, wie beispielsweise, Massenspektrometrie, Kernspinresonanz, FT-IR, UV/VIS-Spektrophotometrie, Fluoreszenz und Chemiluminiszenz. Ein bevorzugter UV-Detektor ist der UV-Detektor 2996^TM, der von der Firma Waters Corporation (Milford, Massachusetts, USA) vertrieben wird.
Der UV-Detektor 19 steht über Leitung 25 in Kommunikation mit dem Massenspektrometer 17, um eine Probe oder eine Aliquote der Probe zu empfangen. Der UV-Detektor 19 gibt die Aliquote oder die Probe über eine Abgabeleitung (nicht gezeigt) ab.
Der UV-Detektor 19 erzeugt einen weiteren analytischen Wert, nämlich die UV-Absorption, der für die Verbindung charakteristisch ist, die untersucht wird. Dieser zweite Wert, der der Ausleseintensität entspricht, kann ein Anzeichen für die Konzentration oder die relative Konzentration als Funktion der Zeit oder bei unterschiedlichen Proben sein. Die relativen Konzentrationen können ebenso mittels herkömmlicher Chromatographiewerte ermittelt werden, die mit der Größe und der Fläche eines Peaks zusammenhängen. Diese Werte werden an den Computer 21 gesendet.
Der Computer 21 empfängt Signale, die dem Retentionswert, dem Massenwert, der UV-Absorption und der Intensität entsprechen, und ordnet den Massenwert, die UV-Werte und den Intensitätswert einem Retentionswert zu. Der Retentionswert, der Massenwert und der UV-Wert charakterisieren eine Verbindung. Der Intensitätswert ermöglicht es dem Computer 21, eine solche Verbindung zeitlich zu verfolgen. Die Retentionszeit, der Massenwert und der UV-Absorptionswert ermöglichen es, die Verbindung in unterschiedlichen Proben zu verfolgen und diese mit Standard- bzw. Durchschnittswerten zu vergleichen, die in einer Datenbank gespeichert sind. Das Vergleichen von Werten umfasst das Vergleichen mit Standard- oder Normalwerten oder mit Werten, die mit Erkrankungszuständen konsistent sind, oder mit Werten derselben Person als Funktion der Zeit oder mit Werten von unterschiedlichen Proben. Vorzugsweise weist der Computer 21 einen Monitor oder einen Drucker auf, um Werte und Ergebnisse darzustellen.
Der Betrieb der Vorrichtung 11 wird unter Bezugnahme auf das Betriebsverfahren und die Verwendung beschrieben. Die Chromatographie-Anordnung 15 empfängt eine Probe und erzeugt einen Retentionszeitwert mittels chromatographischer Prozesse. Die Aliquote, die dem Retentionszeitwert zugeordnet ist, wird sodann vom Massenspektrometer 17 empfangen. Das Massenspektrometer 17 erzeugt einen Massenwert. Der Retentionszeitwert und der Massenwert werden an den Computer 21 geschickt und als Identifizierung für die eine oder die mehreren Verbindungen verwendet, die derartigen Werten zugeordnet sind. Beispielweise wird der Computer 21 den Retentionszeitwert eines Peaks einem Massenwert zuordnen. Eine Art und Weise der Zuordnung ist nachstehend aufgezeigt:
[A, B].
Wie diese vorstehend verwendet werden, handelt es sich bei A oder B um einen Retentionszeitwert und bei dem anderen Wert um einen Massenwert. Der Fachmann erkennt, dass unterschiedliche Chromatographiebedingungen zu unterschiedlichen Retentionswerten führen können. Der zugeordnete Massenwert stellt ein Mittel bereit, um identifizierende Charakteristiken bei unterschiedlichen Retentionswerten von unterschiedlichen Chromatographiebedingungen mit einem Massenwert einer einzelnen chemischen Entität oder Verbindung abzugleichen zuzuordnen.
Die Aliquote, die dem Retentionszeitwert und dem Massenwert zugeordnet ist, wird sodann von einer weiteren analytischen Einrichtung, wie beispielsweise einem UV-Detektor 19, empfangen. Der UV-Detektor 19 erzeugt einen weiteren charakteristischen Wert, der der Verbindung der Retentionszeit zugeordnet ist. Dieser UV-Absorptionswert ist der Retentionszeit und dem Massenwert als ein weiteres identifizierendes Charakteristikum zugeordnet. Eine Art und Weise der Zuordnung ist nachstehend aufgezeigt:
[A, B, C].
Wie diese vorstehend verwendet werden, handelt es sich bei A, B oder C um einen Retentionszeitwert, bei einem der verbleibenden Werte um einen Massenwert und bei dem anderen Wert um den UV-Absorptionswert. Der Fachmann erkennt, dass die Reihenfolge, in der diese Werte aufgezeichnet, gespeichert und verarbeitet werden, willkürlich ist. Ferner erkennt der Fachmann, dass die Anzahl weiterer Detektoren und charakteristischer Werte unzählig ist.
Vorzugsweise handelt es sich bei einem Wert um einen Konzentrations- oder einen relativen Konzentrationswert. Beispielsweise kann der UV-Detektor einen Wert einer Signalintensität bereitstellen, die mit der Konzentration einer Verbindung in Zusammenhang steht, die dem Retentionswert zugeordnet ist. Eine Art und Weise der Zuordnung ist nachstehend aufgezeigt:
[A, B, C, D].
Wie diese vorstehend verwendet werden, handelt es sich bei A, B, C oder D um einen Retentionszeitwert, bei einem der verbleibenden Werte um einen Massenwert, bei einem der weiter verbleibenden Werte um den UV-Absorptionswert und bei einem der Werte um einen Konzentrationswert oder um einen relativen Konzentrationswert.
Falls es erwünscht wird, den Stoffwechsel oder Veränderungen im Proteom oder Genom zeitlich zu verfolgen, ist es nützlich, einen Zeitwert zu den zugeordneten Werten hinzuzufügen. Dieser Zeitwert ermöglicht die zeitliche Verfolgung der Retentionszeitverbindung. Beispielweise kann eine Retentionszeit der Verabreichung eines Medikaments zugeordnet werden. Das Medikament kann im Körper mit der Zeit abgebaut werden, was zu Veränderungen der Konzentration führt, die verfolgt werden können. Bei der Verbindung kann es sich um einen Metaboliten handeln, der in einem Probenlauf vorkommt, der einer Retentionszeit zugeordnet ist. Der Metabolit kann zeitlich verfolgt werden. Eine Art und Weise der Zuordnung ist nachstehend aufgezeigt:
[A, B, C, D, E].
Wie diese vorstehend verwendet werden, handelt es sich bei A, B, C, D oder E um einen Retentionszeitwert, bei einem der verbleibenden Werte um einen Massenwert, bei einem der weiter verbleibenden Werte um den UV-Absorptionswert, bei einem der Werte um einen Konzentrationswert oder um einen relativen Konzentrationswert und bei einem der Werte um einen Zeitwert.
Zusätzlich können die gewonnen Werte außerdem mit Normalwerten oder mit einem Durchschnittswert verglichen werden, der in dem Computer 21 von einer Datenbank von einer großen Anzahl von vergleichbaren Proben gespeichert ist.
In den 2a bis 2d ist eine Ausführungsform der Erfindung dargestellt. In 2a ist die ursprüngliche biologische Probe [S₀] gezeigt (die aus einem Probensatz bestehen kann, der als Standard definiert ist, oder aus einer Zusammensetzung von Standardproben). Diese Probe [S₀] weist Verbindungen auf, die eine Retentionszeit, einen Massenwert, einen UV-Wert und eine relative Konzentration definieren. Wenn der Ursprung der Probe einer Pertubation unterzogen wird, indem beispielsweise ein pharmazeutisches Mittel oder ein chemisches Mittel verwendet wird oder indem die physischen Umgebungsbedingungen (Wärme, Kälte, usw.) verändert werden, dann können dem Ursprung weitere Proben entnommen werden, um zeitliche Veränderungen zu verfolgen, was eine erste Probe [S₁], eine zweite Probe [S₂] sowie irgendwelche weiteren Proben liefert, die mit dem Index ”x” gekennzeichnet werden [S_x]. Neue Verbindungen, die neue Retentionszeiten (R_x1, R_x2, R_xx) definieren, können nach und nach identifiziert werden. Die Probe einschließlich der ursprünglichen Probe [S₀] kann auf eine Proteom-”[P]”, eine Metabonom-”[M]” oder eine Genom”[G]”-Komponente gerichtet sein, wobei eine Probe zu ihren Bestandteilskomponenten äquivalent ist, so dass [S] = [G], [P], [M], wobei [G) ↔ [P] ↔ [M]. Die jeweiligen Probenbestandteile werden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verbindungsbezeichnungssystems analysiert und identifiziert.
Bei alternativen Ausführungsformen werden Kombinationen der drei Klassen biochemischer Moleküle analysiert. Beispielsweise betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung lediglich die Analyse des Proteoms und des Metabonoms. Weitere Permutationen der Analyse biochemischer Klassen können vom Fachmann erkannt und realisiert werden. Bei anderen Ausführungsformen wird lediglich eine biochemische Klasse analysiert, beispielsweise wird lediglich das Proteom oder das Metabonom analysiert.
Sobald Werte für die Proteome (”P”) von den verschiedenen Proben bestimmt worden sind, kann sodann eine vergleichende Analyse unter Verwendung eines geeigneten statistischen Verfahrens, wie beispielsweise der Hauptkomponentenanalyse (principle component analysis; PCA), durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die PCA für Vergleiche eins zu eins verwendet. Die geeignetste Anwendung einer PCA ist jedoch die Verwendung eines ”Lernsatzes” einer Anzahl von Proben, um einen Bezugsdatensatz zu entwickeln und sodann Testdatensätze mit dem Lern- bzw. Bezugsdatensatz zu vergleichen. Dies ermöglicht es, zu bestimmen, ob ein gegebener Testsatz sich signifikant von einer Verteilung von ”Standards” unterscheidet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht es das Verbindungsbezeichnungssystem, dass ein Anwender verschiedene proteomische Elemente, beispielsweise zwischen den verschiedenen untersuchten Proben, verfolgt.
In 2e werden die Proteome der verschiedenen Proben miteinander verglichen, einschließlich der ursprünglichen Probe (oder dem ursprünglichen Probensatz). Diese vergleichende Analyse erleichtert die Detektion detektierbarer Veränderungen des Proteoms zwischen beispielsweise der ursprünglichen Probe oder dem ursprünglichen Probensatz (S₀) und einer oder mehreren der behandelten Proben (S₁, S₂, usw.). Wie dies in 2f bzw. 2g dargestellt ist, gilt dasselbe für das Metabonom (”M”) und das Genom (”G”).
Die 2e, 2f und 2g zeigen den Mechanismus, der den 2b bis 2d zugrunde liegt. Um Veränderungen in irgendeiner Komponente der Proben zu entdecken, wird die individuelle Komponente mit ihrem jeweiligen normierenden Wert, d. h. [P₀], [G₀] oder [M₀], verglichen. Veränderungen in einer Probenkomponente können Veränderungen in anderen Probenkomponenten widerspiegeln. Beispielsweise können Veränderungen des Genoms [G₀) zu Veränderungen des Proteoms [P₀] führen, die das Metabonom [M₀] beeinflussen können.
Das vorstehend beschriebene analytische Verfahren befördert das Verständnis auf dem zellulären und biochemischen Level. Indem das Proteom und das Metabonom auf die hierin beschriebene Art und Weise untersucht werden, kann der Anwender beispielsweise Veränderungen des Metabonoms mit Veränderungen in Beziehung setzen, die im Proteom beobachtet werden. Somit wird das Verständnis befördert, welche Elemente des Proteoms Veränderungen beeinflussen, die im Metabonom beobachtet werden. Und, wie jeder Biologe weiß, können Veränderungen des Genoms (”G”) einen dramatischen Einfluss auf das Proteom haben.
Beispiel 1

3 ist Massenionisation für Probenidentifizierung: 1.3.2.5.40 [Brustkrebspatientenurinprobe], Verbindungsbezeichnung: RT 27.72–28.64 Individuelle Datenaufzeichnung für Probe 1.3.2.5.40:

RRT	M/z	1. Bezeichnung (MS)	2. Bezeichnung* (MS/MS)	Intensität	Identifizierung
-	-	-	-	-	1.3.2.5.40
-	-	-	-	-	1.3.2.5.40
27.72	651.183	27.72.651.183	27.72.651.183.354	23434	1.3.2.5.40
27.83	769.274	27.83.769.274	-	3432134	1.3.2.5.40
27.98	705.323	27.98.705.323	-	34234	1.3.2.5.40
28.11	662.222	28.11.662.222	-	343	1.3.2.5.40
28.34	783.251	28.34.783.251	-	213434	1.3.2.5.40
28.54	654.355	28.54.654.355	-	3424	1.3.2.5.40
28.64	754.324	28.64.754.324	-	23443	1.3.2.5.40
-	-	-	-	-	-
-	-	-	-	-	-
-		-	-	-	-

*2. In diesem Beispiel wird die Bezeichnung mittels MS/MS-Daten erstellt, wenn eine Mehrdeutigkeit in der 1. Bezeichnung auftritt, aufgrund der Redundanz in der auf RRT und MS basierenden Bezeichnung. Diese Bezeichnung basiert auf der Masse des primären Sekundärions.

Somit fördern die hierin beschriebenen Verfahren das Verständnis der Beziehungen zwischen dem Metabonom, dem Proteom und dem Genom. Es sollte erwähnt werden, dass die Erforschung des Genoms, obgleich diese ebenso mit den hierin beschriebenen Verfahren möglich ist, ohne weiteres unter Einsatz bekannter molekularer Techniken durchgeführt werden kann, wie dies der Fachmann erkennt.
Diese und andere Merkmale und Vorteile ergeben sich dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen. Daher sollte die vorliegende Erfindung nicht auf die besonderen Details beschränkt werden, sondern solle vielmehr den Gegenstand der folgenden Ansprüche umfassen.

Claims

Verfahren zum Identifizieren einer oder mehrerer Verbindungen in einer Probe, wobei die Probe auf eine Proteom-”[P]”, eine Metabonom-”[M]” oder eine Genom-”[G]”Komponente gerichtet ist, wobei die Probe zu ihren Bestandteilskomponenten äquivalent ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Trennen einer Probe in eine Vielzahl von Aliquote mittels Chromatographie, die durch Retentionszeitenbereiche definiert sind, wobei jeder Retentionszeitenbereich einer oder mehreren Verbindungen zugeordnet wird, um einen Retentionszeitwert für die Verbindungen zu erzeugen, b) Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse für jede Aliquote, wobei jede Massenspektrometrieanalyse einen oder mehrere Massenwerte aufweist, die einer oder mehreren Verbindungen innerhalb des Retentionszeitenbereichs zugeordnet werden, um einen Massenwert für jede Verbindung zu erzeugen, und c) Durchführen wenigstens eines weiteren Analysemodus mit jeder Aliquote, um einen weiteren analytischen Wert für jede Verbindung zu erzeugen, wobei die eine oder die mehreren Verbindungen in der Probe durch den Retentionszeitwert, den Massenwert und den weiteren analytischen Wert identifiziert sind, um das Vergleichen von Werten als Funktion der Zeit und von unterschiedlichen Proben zu erleichtern, wobei wenigstens ein Analysemodus einen Wert erzeugt, der mit der Konzentration oder der relativen Konzentration innerhalb der Probe in Beziehung gesetzt werden kann, wobei eine Vielzahl von Proben als Funktion der Zeit genommen werden und eine oder mehrere Verbindungen, die durch Massenwert und Retentionszeitwert identifiziert sind, ferner durch Veränderungen der Konzentration als Funktion der Zeit identifiziert sind, um den Stoffwechsel oder Veränderungen im Proteom oder Genom zeitlich zu verfolgen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die eine oder die mehreren Verbindungen mit einer Datenbank ähnlicher Werte verglichen werden, um eine vermeintliche Identität der Verbindung zu bestätigen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Chromatographie aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Flüssigkeitschromatographie, superkritische Fluidchromatographie und Gaschromatographie.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Flüssigkeitschromatographie aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Größenausschluss-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie und Normalphasen-Chromatographie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Massenspektrometrie aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus MALD-TOF, EI-MS, ESI-MS und ESI-MS/MS, APCI-MS und APCI-MS/MS, Photoionisation-MS und MS/MS.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der weitere Analysemodus aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Massenspektrometrie, Kernspinresonanz, FT-IR, UV/VIS-Spektrophotometrie, Fluoreszenz und Chemilumineszenz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proben aus biologischen Geweben einer oder mehrerer Personen gewonnen werden, an die ein Medikament verabreicht worden ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei wenigstens einer Verbindung, die durch Retentionszeitwert, Massenwert und relative Konzentration identifiziert ist, um das Medikament handelt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Medikament metabolisiert ist, um einen ersten Metaboliten auszubilden, und der erste Metabolit eine erhöhte Konzentration mit der Zeit aufweist, wenn das Medikament metabolisiert wird.
Vorrichtung zum Identifizieren wenigstens eines Metaboliten in einer Vielzahl von Proben die mit der Zeit gewonnen werden, wobei ein Medikament einer Person verabreicht wird, wobei die Probe auf eine Proteom-”[P]”, eine Metabonom-”[M]” oder eine Genom-”[G]”Komponente gerichtet ist, wobei die Probe zu ihren Bestandteilskomponenten äquivalent ist, wobei die Vorrichtung umfasst: a) Mittel zum Trennen einer Probe in eine Vielzahl von Aliquote mittels Chromatographie, wobei die Mittel zum Trennen der Probe in Aliquote mittels Retentionszeitenbereichen, die einer oder mehreren Verbindungen in der Probe zugeordnet sind, geeignet sind, einen Retentionszeitwert für die eine oder die mehreren Verbindungen zu erzeugen, b) Mittel zum Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse für jede Aliquote, wobei die Mittel zum Durchführen einer Massenspektrometrieanalyse einen oder mehrere Massenwerte liefern, die einer Verbindung zugeordnet werden, c) Mittel, um jede Aliquote wenigstens einem weiteren Analysemodus zu unterziehen, wobei der wenigstens eine weitere Analysemodus einen weiteren analytischen Wert liefert, der der Verbindung zugeordnet wird, d) Computermittel, um den Retentionszeitwert jeder der Verbindungen den Massenwerten und dem einen oder den mehreren weiteren analytischen Werten zuzuordnen, um den Vergleich von Werten mit der Zeit und von unterschiedlichen Proben zu erleichtern, wobei wenigstens ein Mittel, um die Probe einem Analysemodus zu unterziehen, derart ausgebildet ist, dass es einen Wert erzeugt, der mit der Konzentration oder der relativen Konzentration innerhalb der Probe in Beziehung gesetzt werden kann, wobei die Vorrichtung derart ausgebildet ist, dass sie eine Vielzahl von Proben mit der Zeit aufnimmt und eine oder mehrere Verbindungen, die durch Masse und Retentionszeit identifiziert sind, ferner durch Veränderungen der Konzentration als Funktion der Zeit identifiziert sind, um den Stoffwechsel oder Veränderungen im Proteom oder Genom zeitlich zu verfolgen.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Computermittel derart ausgebildet sind, dass sie die eine oder die mehreren Verbindungen mit einer Datenbank ähnlicher Werte vergleichen, um eine vermeintliche Identität der Verbindung zu bestätigen.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Chromatographie Flüssigkeitschromatographie, superkritische Fluidchromatographie oder Gaschromatographie ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Flüssigkeitschromatographie Größenausschluss-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Normalphasen-Chromatographie ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Massenspektrometrie MALD-TOF, EI-MS, ESI-MS und/oder ESI-MS/MS, APCI-MS und/oder APCI-MS/MS, Photoionisation-MS und/oder MS/MS ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei der weitere Analysemodus Massenspektrometrie, Kernspinresonanz, FT-IR, UV/VIS-Spektrophotometrie, Fluoreszenz oder Chemilumineszenz ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei die Proben aus biologischen Geweben einer oder mehrerer Personen gewonnen werden, an die ein Medikament verabreicht worden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei es sich bei wenigstens einer Verbindung, die durch Retentionszeitwert, Massenwert und relative Konzentration identifiziert ist, um das Medikament handelt.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das Medikament metabolisiert ist, um einen ersten Metaboliten auszubilden, und der erste Metabolit eine erhöhte Konzentration mit der Zeit aufweist, wenn das Medikament metabolisiert wird.