DE1038241B

DE1038241B - Herstellung und Gewinnung von Humidin

Info

Publication number: DE1038241B
Application number: DET14202A
Authority: DE
Inventors: Koiti Nakaza Amagasak Yamamoto; Shibata Toyonaka Toshihi Motoo
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1957-09-27
Filing date: 1957-09-27
Publication date: 1958-09-04

Description

Herstellung und Gewinnung von Humidin Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung des neuen und wertvollen Antibiotikums Humidin, das für landwirtschaftliche Zwecke geeignet ist und zusammen mit anderen Agrikulturmitteln angewandt werden kann.
Durch Untersuchungen von Streptomyces humidus Nov. Sp. Nakazawa et Shibata (IFO 3520, ATCC-12760) wurde festgestellt, daß dieser Stamm nicht nur, wie von Nakazawa, Shibata u. a. beschrieben, zur Herstellung von. Dihydrostreptomycin geeignet ist, sondern darüber hinaus noch ein neues Antibiotikum erzeugt, dessen Eigenschaften sich von denen bekannter Antibiotika unterscheiden Dieses Antibiotikum wurde Humidin genannt. Da es leicht in großen Mengen aus Kulturlösungen von Streptomyces humidus isoliert werden kann und auf Grund seines antibakteriellen Spektrums anzunehmen war, daß Humidin eine starke antibiotische Wirksamkeit gegen Hefe, Saprophyten und andere phytopathoge.ne Pilze hat, wurde es auf seine Eignung als Schutzmittel gegen Pflanzenkrankheiten untersucht und Agrikulturmittel hergestellt, die Humidin enthalten.
Die Erfindung beruht auf den vorstehenden Feststellungen und bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Humidin durch Isolierung des Antibiotikums aus Kulturbrühen, seine Verwendung als Agrikulturmittel sowie auf Pflanzenschutzmittel, die Humidin enthalten.
Gemäß der Erfindung kann zur Herstellung von Humidin beispielsweise der obenerwähnte Streptomyces humidus verwendet werden. Dieser Pilzstamm wurde beim Institut für Fermentation, Osaka (einer japanischen Kultursammlung), unter der Nummer IFO-3520 und bei der American Type Culture Collection (einer Kultursammlung in den USA) unter der Nummer ATCC-12760 hinterlegt. Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes sind in Tabelle 1 aufgeführt (die mit Rdg. bezeichneten Farbennamen beziehen sich auf »Ridgways Color Standards anal Color Nomenclature«).
Die Kohlenstoffverwertung des Stammes wurde nach dem Verfahren von P r i d h a m gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Wie andere Streptomyces kann sich der Stamm verhältnismäßig leicht natürlich oder künstlich verändern, so daß die vorstehend aufgeführten Eigenschaften nicht unbedingt definitiv sind. So gibt es beispielsweise viele Varianten und Mutanten des Stammes, die aus dem Boden isoliert oder künstlich durch Bestrahlung mit Röntgen- oder Ultraviolettstrahlen -oder durch Einwirkung von Chemikalien erzeugt werden. Gemäß der Erfindung können diese Stämme, selbst wenn sich ihre Eigenschaften von denen des ursprünglichen Stammes unterscheiden, ebenfalls verwendet xverden. vorausgesetzt, daß sie Humidin bilden. Bei aerober Züchtung dieser Stämme in einem wäßrigen Medium unter bestimmten Bedingungen bilden sie Dihy drostreptomycin und auch Humidin. Unabhängig von der Fähigkeit der Stämme, gleichzeitig Dihydrostreptomycin und Humidin zu erzeugen, hängt das Mengenverhältnis der beiden Produkte und die zu ihrer Bildung erforderliche Zeit jeweils von den Kulturbedingungen und der Art der Pilzstämme ab. Im allgeineinen ist das Dihydrostreptomycin hauptsächlich im flüssigen Teil, das Humidin im Mycel angereichert.

Tabelle 1

Kultureigenschaften von Streptomyces humidus Nov. Sp. IOF-3520

Kultureigenschaften

Medium Lösliche Bemerkungen

Wadistumsmycel Luftmycel + Sporen Pigmente

I

Czapek-Agar Farblos Weiß Keine Reichlich

Glucoseasparagin- Farblos Weiß bis rauchgrau (Rdg Keine Durchsetzt

Agar XLVI, 21'-d) oder Vi- mit kleinen feuchten schwar-

naceous-buff (Rdg XL, zen Pünktchen, die sich

17"'-d) langsam über die ganze

Oberfläche verteilen.

Rückseite Creambuff (Rdg

XXX, 19"-d) oder Car-

tridgebuff (Rdg XXX,

19"-f), das später zu cha-

mois wird (Rdg XXX,

19"-b)

Stärke-Agar Farblos Weiß bis hell rauchgrau (Rdg Keine Rückseite Creambuff (Rdg

XLVI, 21""-f) XXX, 19"-b). Geringe

i Hydrolyse

Calcium-malat-Agar Farblos, später Nahezu weiß Keine

buff-gelb wer-

dend (Rdg IV,''

19-d)

Glycerin-nitrat-Agar Farblos Nahezu weiß Keine

Bouillon-Agar Farblos Keine Keine

Gelatine Farblos Keine Keine

Dextrose-nitrat-Agar Farblos Nahezu weiß Keine Geringe Verflüssigung

Kartoffelstückchen Farblos Weiß bis rauchgrau (Rdg Keine Feuchte schwarze Pünktchen

XLVI, 21""-d) beobachtet

Karottenstückchen Farblos Weiß bis rauchgrau (Rdg Keine

XLVI, 21""-d)

Hefeextrakt-Agar Farblos Weiß bis Light db (Rdg Keine Teilweise feuchtend

XLV I, 17""-b)

Ganzes Ei Farblos Weiß Keine

Milch Farblos Weiß Keine Peptonisation langsam

Glycerinasparaginat- Farblos ' Weiß bis rauchgrau (Rdg Keine

Agar XLVI, 21""-d)

Pepton-nitrat-Lösung N itratreduktion

Das Luftmycel dieses Stammes zeigt Spiralen von So 0,8 bis 1,21i und ovale Konidien von 1,0 bis 1,5 1,5 bis 2 u.

Tabelle 2

Kohlenstoff verwertung von Streptomyces humidus

Nov. Sp. IFO-3520

d(+)-Xylose . .. .. .... .. . . . . . .. .. . + +

1(+)-Arabinose ................. +++

1(+)-Rhamnose . . . . . . . . . . . . . . . . . + . +

d-Fructose ....................... + . +

d-Galactose ...................... + + +

Sucrose .......................... -

Maltose ......................... + + +

Lactose . ........................ + +

d(+)-Rafflnose .................. -

Inulin ........................... -

d-1Zannitol ...................... + + +

d-Sorbitol ....................... -

Dulsitol ......................... -

d,1-Inositol ....................... -

Salicin .......................... +-!-

Natriumacetat ................... -

Natriumcitrat .................... ±

Natriumsuccinat ................. -

Kontrolle ........................ -

- : kein Wachstum.

± : Wachstum zweifelhaft.

+ : langsames Wachstum.

+ + : mittleres Wachstum

+++: gutes Wachstum.

Die Wirksamkeit von Humidin bei einem Kulturverfahren wurde wie folgt untersucht: Ein Stamm von Streptomyces humidus (IFO-3520) wird beispielsweise in einem Tank in dem nachstehend beschriebenen Medium gezüchtet. Während der Zucht werden Proben von jeweils 100 ccm in Abständen von 12 Stunden aus der Kulturflüssigkeit entnommen. Die Probe wird filtriert. das nasse Mycel mit der doppelten Menge seines Gewichts an Aceton bei 60° C 1 Stunde extrahiert und der Acetonextrakt untersucht. Der erhaltene Wert wird als Wirksamkeit des Humidins in 100 ccm der gesamten Kulturflüssigkeit angenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Die Einh°iten der Wirksamkeit von Humidin werden auf folgende Weise bestimmt: Kristallines Humidin wird in Aceton in einer Verdünnung von 1 mg/ccm gelöst, die Lösung mit Wasser verdünnt und die erhaltene Suspension dem Agar-Verdünnungsverfahren unterworfen, wobei Saccharomyces cerevisiae als Test-Mikroorganismus verwendet wird. Die zur vollständigen Wachstumsverhinderung des Mikroorganismus bei Beobachtung mit dem bloßen Auge erforderliche -Mindestmenge (; /ccm) wird als eine Einheit angesehen. Bestandteile der Probegrundmischung Glucose .......................... log Pepton ........................... 5 g Ehrlich-Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . a g Natriumchlorid .. . .. .... *'"* ...... 5 g Agar ......................... 17 bis 20 g Leitungswasser ................... 11 (Der PH-Wert wird vor der Sterilisation mit Na O H auf 7 eingestellt.)

Tabelle 3

Filtrat Mycel Gesamte

Dauer Einheiten

der Züchtung 1 Mycel Aceton Extrakt-

P.-Wert in 100 ccm

Einheiten I#ermentations-

(Stunden) ! (Einhei(Einheit./ccm) in 100 ccm Für Extraktion i Einheiten

(naß) (g) (ccm) (ccm) flüssigkeit

i

14 6,0 <10 5,4 11,8 35 400

26 6,2 <10 8,0 16,0 100 1600

38 7,0 < 10 8,9 17,8 1000 17800

50 7,6 <10 6,2 12,4 3500 43500

62 7,6 < 10 8,2 16,4 15000 246000

74 7,0 < 10 8,0 16,0 15000 240000

86 7,0 < 10 7,9 15,8 I 15000 238000

98 7,0 < 10 9,1 18,2 15000 273000

110 7,0 <10 6,6 13,2 20000 264000

122 7,0 <10 7,5 15,0 15000 225000

134 7,2 <10 7,0 14,0 20000 280000

136 7,2 <10 7,0 14,0 20000 280000

Zur Herstellung von Humidin können zahlreiche, zur Züchtung von Mikroorganismen im allgemeinen geeignete Nährquellen angewendet werden. Als Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Stärke, Lactose, Dextrin, Glycerin und Maltose, als Stickstoffquelle die verschiedenen organischen und anorganischen stickstoffhaltigen Substanzen, wie beispielsweiseSojabohnenprotein, Fleischextrakt, Pepton, Kasein, Hefe, Flüssigkeit aus gequollenem Mais, gepulverte Erdnüsse, Nitrate, Harnstoff und Ammoniumsalze verwendet werden. Wenn erforderlich, können auch geringe Mengen von anorganischen Salzen oder Spurenelementen zugegeben werden. Neben diesen Stoffen können auch T'#lycele von Penicillin bildenden Mikroorganismen oder daraus hergestellte Produkte als Nährquelle verwendet werden.

Bei der industriellen Herstellung von Humidin erfolgt die Züchtung vorzugsweise in einem aus den vorstehenden Nährquellen hergestellten Medium mit einer aeroben, submersen Kultur. Es kann aber auch mit einem festen Medium oder mit einer Oberflächenkultur gearbeitet werden. Ein annähernd neutraler p11-Wert, Temperaturen von 23 bis. 30° C und Züchtungszeiten von 2 bis 7 Tagen sind zur Herstellung des Antibiotikums besonders geeignet.
In diesen Kulturflüssigkeiten liegt das Dihydrostreptomycin hauptsächlich im flüssigen Teil und das Humidin vorwiegend im Mycel vor. Im allgemeinen werden beide Substanzen gleichzeitig gebildet, wobei aber ihr Mengenverhältnis, je nach Auswahl des verwendeten Mikroorganismus oder bei Änderung der Zuchtbedingungen merklich schwanken kann. Wie bereits erwähnt, ist für Humidin kennzeichnend, daß es im Mycel angereichert wird, aber kaum im flüssigen Anteil enthalten ist. Es scheint keine Abhängigkeit zwischen dem Anteil des Myoel und dem des gebildeten Dihydrostreptomycins zu bestehen.
Humidin wird aus der Kulturflüssigkeit, insbesondere aus dem Mycel, isoliert. Es ist deshalb für die Isolierung von Humidin vorteilhaft, zuerst das Mycel abzutrennen und anschließend das Humidin aus dem Mycel zu isolieren. Die Isolierung von Humidin aus dem Filtrat erfolgt auf Grund der verschiedenen Eigenschaften, durch die sich die Antibiotika und Verunreinigungen z. B. bezüglich Löslichkeit, Verteilungskoeffizienten, Adsorptionsfähigkeit oder Stärke der ionischen Bindung usw. voneinander unterscheiden.
Humidin ist in Aceton, Dioxan, Essigsäureestern, heißem Alkohol usw. leicht löslich, insbesondere bei saurem p$. Humidin wird beispielsweise in folgender Weise isoliert: Das Mycel wird mit einem der vorstehend aufgeführten Lösungsmittel extrahiert, der Extrakt nach dem Konzentrieren angesäuert und mit einem hydrophylen, organischen Lösungsmittel, z. B. Essigsäureestern, behandelt, in denen Humidin leicht löslich ist, und die Lösung dann im Vakuum konzentriert oder mit Alkalihydroxyd alkalisch gemacht, wobei sich Humidin abscheidet. In dieser Weise kann rohes oder ziemlich reines Humidin verhältnismäßig leicht durch Ausnutzung der Unterschiede zwischen Substanz und Verunreinigungen hinsichtlich Löslichkeit und Verteilungskoeffizient zwischen zwei Lösungsmitteln isoliert werden. Im allgemeinen ist das vorstehend beschriebene Verfahren zur Reinigung von Humidin am besten geeignet. Humidin kann aber auch von den Verunreinigungen durch Absorption an einen Absorbenten und anschließende Eluierung abgetrennt werden. Als Absorbens kann beispielsweise Aktivkohle, Diatomeen-Erde, Aluminiumoxyd usw. verwendet werden. Inonenaustauscher sind gleichfalls für diesen Zweck geeignet.
Die vorstehend beschriebenen Verfahren werden absatzweise in Form von Adsorptionschromatographie, Teilungschromatographie, Gegenstromverteilung u. dgl. durchgeführt. Außerdem kann die Abtrennung auch durch Ausfällen mit geeigneten Fällmitteln, durch Aussalzen oder Dialyse erfolgen. Alle diese Verfahren können getrennt oder in Verbindung miteinander verwendet werden und mehrmals wiederholt werden. Eine Einstellung des pH-Wertes der Lösung erleichtert außerdem die Abtrennung von Humidin.
Das so .,erhaltene und durch Umkristallisieren aus einem Lösungsmittel, wie Äthanol, gereinigte Humidin hat folgende Eigenschaften: 1. Schmelzpunkt: 145 bis 146° C (unter Zersetzung) , 2. Kristallform: sechseckige Platten (farblos), 3. die nachstehend angegebenen analytischen Werte, wobei durch qualitative Analyse weder Stickstoff, noch Halogen oder Schwefel festgestellt wurden:

C 0/0 H 0/0

Nr. 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63,51 8,66

Nr.2 ..................... 63,42 8,52

Nr.3 ..................... 63,36 8,32

Nr.4 ................ . .... 63,03 8,31

4. Molekulargewicht: 550±50 (nach dem Barger-Verfahren) 823 ± 10 (durch Röntgenanalyse und Dichtebestimmung) Aus den vorstehenden Daten wird die empirische Formel (C12 H20 04) n angenommen. 5. Optische Drehung: [a] D = -6° (c= 1, Äthanol) [a]" = -10° (c = 1, Aceton) [a]D = -8' (c= 1, Dioxan) 6. Infrarotspektrum: Das Spektrum wird in Nujol-Mull mit Natriumchloridprismen gemessen. Die Kurve ist in der Zeichnung dargestellt.
Ultraviolettspektrum: Das Spektrum wird in alkoholischer Lösung gemessen. Die Absorptionsmaxima liegen bei 245 und 285 m[.
7. Farbreaktion (I) Die wäßrige oder alkoholische Humidinlösung wird durch Eisenchlorid nicht gefärbt.
(1I) Mit konzentrierter Schwefelsäure erhält man eine orangerote oder purpurrote Färbung. (11I) Humidin ist in der Kälte und in der Wärme gegenüber Fehlingscher Lösung negativ.
(IV) Die Acetonlösung von Humidin entfärbt eine Kaliumpermangatlösung und die ätherische Lösung entfärbt allmählich Brom.
B. Löslichkeit: Es ist leicht in Aceton und Dioxan löslich, in Äthylacetat und heißem Äthanol löslich, in n-Butanol, Äther und kaltem Äthanol schwer löslich, in Methanol, Benzol und kaltem Wasser kaum löslich und in Petroläther und Tetrachlorko'hlenstoff fast unlöslich.

9. Durch Papierchromatographieerhaltene Rf-Werte (nach dem aufsteigenden Verfahren, unter Verwendung von 2,0 - 45 cm breiten Streifen aus Toyo-Filterpapier Nr. 51)

Lösungsmittel Zeit Rf-Wert

(Stunden)

Mit Wasser gesättigtes

n-Butanol . . . . . . . . . 15 0,88 bis 0,94

n-BuOH#AcOH-

H20 (2: 1 :1) .... 15 0,96 bis 0,97

n-Bu O H # Pyrindin

H20 (1 : 0 - 6 : 1) .. 15 0,92 bis 0.97

311/o N H4 CI-Lösung . . 3 0,00

50%iges wäßriges

Aceton . . . . . . . . . . . 7 0,79 bis 0,80

Benzol - Ac O H - H? o

(2: 2:1) . . . . . . . . . 7 0,92 bis 0,93

Mit n-Bu O H gesättig-

tes Wasser . .. ... . . 8 0.13

10. Antimikrobenspektrum: Das Antimikrobenspektrum wurde nach dem sogenannten Agar-Verdünnungsverfahren wie folgt geniessen:

Temperatur Medium verwendeter

Testorganismus

37° C Nähragar Bakterien

37° C Agar mit einem Ge- Mycobakterien

halt von 1% Gly-

cerin

27° C Agar mit einem Ge- Pilze *)

halt von 1% Glu-

cose

Candida, Cryptococcus und Trichophyton wurden eben-

falls bei 37° C bebrütet, obgleich sie zu den Pilzen gehören.

Die zur Wachstumsverhinderung von Mikroorganismen erforderlichen Mindestkonzentrationen (y/ccm) sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt. Wie aus der Tabelle ersichtlich, zeigt Humidin eine starke Wirksamkeit gegenüber Hefen, wie Saccharonlyces. Torula und R'hodotorula, einigen Saprophyten, wie Penicillium und Rhizopus und einigen Phytopathogenen, wie sclerotischen Pilzen, Anthraknosepilzen und Faulbrand, ist aber gegen Bakterien, Tuberkelbazillen, pathogenen Pilzen, Aspergillus species, Piricularia oryzae, Fusarium-Species usw. nicht wirksam. Humidin verhindert außerdem das Wachstum von aus F-Bouillon bei 37° C 48 Stunden in einer Verdünnung von 1 : 1280000 (0,76 ;,/ccm) gezüchteten Trichomonas vaginalis No. 1099, und das Wachstum von Tetrahymena pyriformis, Eugleuna gracilis und Influenza-Viren, jeweils in Verdünnungen von 1 :1280 000, 1 :320 000 bzw. 0,05 y/ccm.

11. Einfluß des pH-Wertes der Grundmischung auf die antibiotische Wirksamkeit: Untersuchungen der Wirksamkeit von Humidin nach dem Agar-Verdünnungsverfahren bei Saccharomyces cerevis.iae, die in einer 1% Glucose (pH-Wert 6,7 bis 8) enthaltenden Agar-Substanz gezüchtet wurden, zeigen eine starke antibiotische Wirksamkeit bei einem alkalischen p11-Wert, wie nachfolgend gezeigt wird:

P.-Wert des Mediums

6 7 8

o Einheiten/mg... I 5000 j 15,000 @i, 50,000

Tabelle 4

Antibakterielles Spektrum von Humidin

Zur völligen Wachstumsverhinderung erforderliche

Mindestmenge

Mikroorganismus Bestimmungsdauer

24 Stunden i 48 Stunden 120 Stunden

y/ccm /ccm ;"/ccm

Bacillus subtilis . .. .. ... . . .. .. .. .. .. . > 100 i Bakterien

Staphylococcus aureus ............... > 100 Bakterien

Escherichia coli . . . .. .. .. . . . . . . . .. . . . > 100 Bakterien

Proteus vulgaris . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . > 100 Bakterien

Mycobacterium IFO-3207 . . . .. .. . . .. . > 100 Bakterien

Mycobacterium av ium . . . . . . . . . . . . . . . > 100 ; Bakterien

Candida albicans .................... > 100 > 100 Hefe

Candida tropicalis . .. .. .. .. .. ... .. .. . 100 > 100 Hefe

Candida pseudotropicalis . .. .. .. .. .. . 100 > 100 Hefe

Candida krusei ...................... 100 > 100 Hefe

Candida parakrusei ................. > 100 i > 100 Hefe

Cryptococcus neoformans . .... .. .. .. . 50 100 Hefe

Trichophyton interdigitale . ..... .. .. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Trichophyton mentagrophytes . .. .. .. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Trichophyton rubrum . .... ... .. .. .. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Saccharomvces cerevisiae ............ 0,2 1 5 Hefe

Saccharomvces Bake ................. 0.2 10 10 IIefe

Torula rubra ....................... - 1 1 Hefe

Torula utilis . . . .. .. .. .. .. .. .. . > 100 > 100 > 100 Hefe

Hansenula anomala.................. > 100 > 100 > 100 Hefe

Rhodotorula gracilis ..... .. ... .. .. .. . < 0,1 0,2 I 1 Hefe

Aspergillus niger ... .. .. ... .. .. .. .. . > 100 > 100 > 100 Schimmelpilz

Aspergillus oryzae . .. .. .. .. .. .. .. .. . > 100 > 100 > 100 Schimmelpilz

Penicillium chr_vsogenum .... . ... .. .. . 5 10 100 Schimmelpilz

Schimmelpilz

Vlucor mucedo ... .. .. ............... > 100 > 100 > 100

Rhizopus nigricans . .. .. .. .. .. .. .. .. . 5 5 5 Schimmelpilz

Phytophthora infestans . .. .. . . .. .. .. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Ophiobolus miyabeanus . .. .. .. .. .. .. . > 100 100 100 Schimmelpilz

Gibberella sanbinetti ... .......... .. . > 100 Schimmelpilz

Gibberella fujikuroi . ...... .. ...... .. > 100 ! > 100 Schimmelpilz

Fusarium oxysporium F. lycoperesici. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Fusarium bulbigenum ... ... ........ . > 100 > 100 Schimmelpilz

Beauveria bassiana . .. .. .. .. .. .. .. .. . > 100 > 100 Scliinnnelpilz

Piricularia or_vzae . . .. .. .. .. .. .. .. .. . > 100 > 100 Schimmelpilz

Ustilago zeae . . . . . . . .. .. . . . . .. .. .. . . . 0.2 0,5 Schimmelpilz

Colletotrichum lagenarium ........... 0,5 ! 0,5 Schimmelpilz

Gloeosporium laeticolor ..... .. .. ..... 0,5 Schimmelpilz

Glomerella cingulata . .. ... .. .. .. . . .. . 100 100 Schimmelpilz

Sclerotinia sclerotiorum . .. .. .. .. .. .. . 0,35 2 Schiininelpilz

Tabelle 5

Mikroorganismus y Humidin , Oligomycin') ` Mycolutein=) ` Blasticidin A')

Aspergillus niger . .. ... . . .. .. .. .. .. . > 100 0##) 4# - 20

Aspergillus oryzae ......,........... > 100 > 80 - > 100

Penicillium chrysogenum ............ 10 - - 10

Penicillium notatum . .. .. ... .. .. .. .. . > 100 5 - > 100

Rhizopus nigricaus .................. 5 - - > 100

Saccharamyces cerevisiae ... .. .. .. ... 1 - -

Saccharomyces sake ................. 1 - - -

Hansenula anomala . . . . . .. .. . . . . . . .. . > 100 > 80 - -

Candida albicans .................... > 100 - 12,5 -

Cryptococcus neoformans ............ 100 > 80 12,5 -

Trycophyton ruburum ............... > 100 - < 0,14 -

i) Antibiotics and Chemotherapy, 4, S. 962 (1954).

p) Antibiotics and Chemotherapy,, 5, S. 652 (1955).

') Bulletin of Agricultural Chemical Society of Japan, 19, S. 181 (1955).

') Aspergillus fumigatus.

5) Aspergillus parasiticus.

12. Einfluh anderer Faktoren auf die antibiotische @Vi rk.amke it Durch den Zusatz von Dihydrostreptonrycinsulfat in eirar Verdünnung von 10 y/ccnr oder von Cystein irr ein;r V-°rdünnung von 'hoo Mol zum Reaktionsmedium wird die antibiotische Wirksamkeit nicht verändert, während ein Zusatz von 1-Ascorbinsäure in einer Verdünnung von '/ree @lol die Wirksamkeit auf etwa ein Siebentel verringerte.

13. Toxizität: Die Giftigkeit von Humidin für Mäus< mit einem G;#wicht von 1-1 bi. 15 g ist folgende: Bei subkutaner Injektinn reit 50 bis 100 rng/kg Humidin sterben alle Tiere. während 4~i einer Injektion von 25 mg/kg 500;o überleben. Die LD 50 beträgt weniger als 1 rng/kg bei itrtralaeritorr-ealer Injektion, und 50 mg/kg lre: oraler Anwendung.
\Vie bereit: erwähnt, hat Humidin völlig andere Eigc,rrschaften als bekannte Antibiotika, so daß es als rretr,-s Antibiotikum angesehen werden kann. Bei einem Vergleich des antibakteriellen Spektrums von Humidin mit den Spektren ähnlicher Antibiotika erhält man die in Tabelle 5 angeführten Ergebnisse.
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich, ähnelt Humidin Blasticidin A, unterscheidet sich davon jedoch völlig mit Bezug auf seine antibiotische Wirksamkeit gegen Aspergillus niger, und auch in anderen Punkten. Außerdem ist Blasticidin A gegen phytopathogene Pilze, wie Piricularia oryzae. Fusarium oxysporium und Glomerella cingulata wirksam. Während Humidin dies nicht ist, unterscheidet sich Humidin deutlich auch von sauren pilzbekämpfenden Antibiotika, wie Antinrycirr-A, Virosin, Seligocidin und Antipiriculin.

Das vorstehend beschriebene intibakterielle Spektrum läßt darauf schließen, daß sich Humidin zur Herstellung von landwirtschaftlichen Chemikalien eignet. Es wurde festgestellt, daß Humidin tatsächlich als Schutzmittel gegen Pflanzenkrankheiten geeignet ist. Folgende Versuche wurden durchgeführt: Agar-Medien mit einem Gehalt von 111/o Glucose und verschiedenen Verdünnungen von Humidin werden in Petrischalen erstarren gelassen. Außerdem werden verschiedene zu untersuchende Mikroorganismen, die auf Kartoffel-Saccharose-Agar-Medium bebrütet wurden, mit einem sterilisierten Lappen abgewischt und jeweils 3 ccm destilliertes Wasser zugesetzt. Die derart hergestellten Mischungen werden auf dem festen Medium in den Petrischalen ausgebreitet und hei 27° C in einem Brutapparat bebrütet. Die nach 48 bis 120 Stunden erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 6 angeführt. In der Tabelle bedeutet die Minimalkonzentration die Menge Humidin (mg/ccm), die in 1 ccm des Abschnittes, in dem das Wachstum der :Mikroorganismen gemäß Feststellung reit dem bloßen Auge vollständig verhindert worden ist.

Tabelle 6

Zur vollständigen

Mikroorganismus Wachstumsverhinderung Durch den Mikroorganismus

erforderliche verursachter Schaden

Mindestkonzentration

48 Stunden 120 Stunden

Nr. Name ;./ml ;/ml Wirtpflanze Krankheitsbezeichnung

i

I Hvpochnus sasakii . . . . . .. 5 10 Reispflanze I; Flecken

11 Piricularia oryzae . .. .. .. .. 100 > 100 Reispflanze Brand

111 Helminthosporium

sigmoideum . .. .. . . .. .. 100 > 100 Reispflanze Stammfäule

IV Rhizoctonia solani . .. .. .. > 100 > 100 Eierpflanze Abfaulen

V Corticium centrifugum .... > 100 > 100 Bohne Mehltau

VI Sclerotinia sclerotiorum . . 10 Kruciferen rote Gewebefäulnis

VII Rhizopus nigricans . . . . . . . . 5 5 süße Kartoffeln schwachrote Gewebe-

fäulnis

VIII Ustilago zeae .. .. .. .. .. .. 0.2 0,5 Mais ' Getreidebrand

I1 Glomerella cingulata . .. .. .. 100 100 Weintraube Anthraknose

1 Gleosporium laeticolor . . . 0.5 Pfirsich Anthraknose

XI Colletotrichum lagenarium . 0,5 ! 0.5 Gurke Anthraknose

1II Colletotrichum glycines .... < 0.1 0,5 Sojabohnen Anthraknose

1III Colletotrichum atra-

mentarium . . . . . . . . . . .. 100 > 100 Kartoffel j Anthraknose

Unter den vorstehend angeführten Bedingungen ist Humidin also außerordentlich wirksam gegen Colletotrichunr species und Ustilago zeae, verhältnismäßig wirksam gegen Hypochnus sasakii, Sclerotinia sclerotiorurn und Rhizopus nigricans, weniger wirksam jedoch gegen andere phytopathogene Pilze. Der gleiche Test wurde mit den in Tabelle 7 aufgeführten Medien bei einem pH Wert von 7 mit den in Tabelle 8 angeführten Ergebnissen durchgeführt.

Die Bezeichnungen der Mikroorganismen in der Tabelle 8 entsprechen denen der Tabelle 6. Die Mikroorganismen Nr. XIV und nachfolgenden sind:

Nr. Mikroorganismus I Wirtpflanze I Name der Krankheit

XIV ..... Alternaria kikuchiana Birne schwarze Flecken

XV ...... Gibberella fujikuroi Reispflanze Fäule

X'\'1 .... . Phytophthora infestatrs Kartoffel Brand

Tabelle 7

Bestandteile des Mediums

Zeichen für An- Fleisch- I Hefe- In Mais

das Medium Glucose organische 1 Na Cl I Pepton extrakt extrakt gequollene Agar

Salze Flüssigkeit

°/o °/o o/0 0/0 0/0 0/0 o/'

A ............ 1 I 4-

2

B ............ 1 + 0,5 ' 2

C ............ 1 0,2 1,0 2

D ............ 1 + 0,5 I i 2

E ............ 1 + 2,0 2

F ............ 1 + 2,0 2

G ............ 1 0,2 0,5 0,5 r 2

H . . . . . . . . . . .. 1 0,2 0,5 0,5 j 0,5 0,5 j 2

I . . . . . . . . . . . . . 1 Kartoffelflüssigkeit 200 gll 2

") Anorganische Salze: Na N 0a 0,2%, K2 H P 04 0,10/0, K C1 0,05 %, Mg S 04 - 7 HE O 0,05 0/0, Fe S 04 7 H2 O 0,0010/0.

Tabelle 8

Mikroorganismus Medium

A B I C j D j E F G H I I

I

Il........ ........... - 100 5

- 0,2 0,5@ 100 5 20

100 10 j 50 0,5 1 > 100 10 100

III . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 i 10 I 1 1 10 G. 0,2 100 5 10

100 50 1 5 10 100 > 100 j 10 20

VI ... .. .. .. ........ - 10 - 1 - - - - I 2 20

- > l00 10 ! 20 1 < 0,2I 10 5 50

XIV . .. .. .. ...... .. . > 100 > 100 50 50 > 100 > 100 100 100 50

>100 >100 >100 >100 >100 I>100 >100 >100 >10D

XV ...... ........... 50 > 100 50 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100

> 100 > 100 50 I > 100 > 100 > 100 > l00 > 100 > 100

XI . .. .. . . . . . . .. .. . . . 20 > 100 20 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100

100 > 100 ' 50 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100

IV ................. - - j 0.5 l00 - 20 > 100 > 100 -

100 > 100 10 > 100 100 I > l00 > 100 > 100 > 100

XVI ... ............ 50 > 100 20 > 100 20 >100 > 100 > 100 j > 100

> 100 > 100 j 50 j > 100 I > 100 ! > 100 > 100 1 > 100 ' > l00

In Tabelle 8 bezeichnen die oberen Zahlen die nach 72 Stunden, die unteren Zahlen die nach 120 Stunden erhaltenen Ergebnisse.

Wie die Ergebnisse zeigen, schwankt die zur vollständigen Wachstumsverhinderung von Mikroorganisinen erforderliche Mindestkonzentration von Humidin in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Medien.
Bei Durchführung eines Mindestkonzentrationstestes in vitro ist die Art der zu untersuchenden 1\-likroorganismen natürlich beschränkt, und außerdem wird die Wirksamkeit der Proben durch die Zusaminensetzung der Medien sehr beeinflußt. Aus diesen Versuchen kann man daher schwer auf die Wirksamkeit von Humidin bei Anwendung in vivo schließen.
Außerdem wurden Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob Humidin die für Schutzmittel gegen Pflanzenkrankh-eiten erforderliche hindernde Wirkung auf das Keimen der Sporen von phytopathogenen Pilzen ausübt. Beispielsweise wurden Testversuche mit den Konidien von. Colletotrichum lagenarium durchgeführt. Die Konidien wurden in Humidinlösungen verschiedener Verdünnung suspendiert und die Suspensionen in einer hinreichend feuchten Kammer bei 27° C nach dein Tropfen-Kulturverfahren behandelt. Nach 24 Stunden wurde die Zahl der keimenden und nichtkeimenden Konidien und die Bildung der Appressorien unter dem Mikroskop festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt.
Wie aus Tabelle 9 ersichtlich, beträgt die zur völligen Verhinderung der Keimung der Konidien von Colletotrichum lagenarium erforderliche Mindestkonzentration 6,25 y/ccm. Bei einer Konzentration von 3,13 i,/ccm keimten zwar viele Konidien., aber die Länge der röhrenförmigen Keimlinge blieb kurz. Bei Konzentrationen von 1,56 y/ccm keimten mehr Konidien und die Keimlinge wurden etwas länger, aber die Zahl der Appressorien, die bei allen Konidien bei der Kontrollprobe gefunden wurden, war sehr gering.

Wenn die Konidien von phytopathogenen Pilzen dieser Art auf die Wirtpflanze fallen, keimen sie unter Bildung von Appressorien, mit denen sie sich an der Wirtpflanze festhalten. Anschließend strecken sie die Infektions'hyphen aus, die in das Pflanzengewebe eindringen und die Krankheit bewirken. Es ist daher wichtig, daß Agrikulturmittel eine wachstumsverhindernde Wirkung auf die Bildung von Appressorien ausüben. Nachdem festgestellt wurde, daß Humidin

Tabelle 9

Humidin- Zahl der Zahl der

konzentration beobachteten keimbildenden Keimung in °/o Präventivwert Beobachtungen

(7/CCM) Sporen Sporen

Kontrolle 791 178 22,5 0 Normale Keimung

Appressorium gebildet

0,39 530 98 18,5 17,8 Normale Keimung

Appressorium gebildet

0.78 480 74 15,4 31.2 Normale Keimung

Appressorium gebildet

1,56 557 51 9,2 59,0 Normale Keimung

`'Wenige Appressorien

3,13 406 26 6,4 71,5 Normale Keimung

Sehr wenig Appres-

sorien

6,25 532 0 0 100 Keimbildung voll-

ständig verhindert

diese X\"irkung hat, wurden Versuche an lebenden Pflanzen durchgeführt.

A. Versuche mit Hypochnus sasakii Shurat (i) Flecken bei Reispflanzen. Hypochnus sasakii ist ein als Erreger von Flecken bei Reis bekannter Mikroorganismus. Außerdem lebt er als Parasit in Nutzpflanzen. wie Hirse, Gerste, Sojabohnen, roten Bohnen, Welschen Bohnen, Kletten, Kampfer, Mais, Pfefferminz und Erdnüssen. Die Symptome sind zwar je nach Art der Wirtpflanze verschieden, aber im allgemeinen werden Blätter und Stengel vernichtet.
Es wurde ein Versuch mit dem Mikroorganismus unter Verwendung von Reis durchgeführt. Folgende Reisarten wurden untersucht: A: Norin-22.
B: Higashiyama-41. C: Asahi-4.
D: Senbon-Asahi.
Von den vier Arten sind A und B für Flecken anfällig. während C und D widerstandsfähig sind. Prüfverfahren: Die Versuchspflanzen wurden in nichtglasierte Töpfe mit einem Durchmesser von etwa 7:5 cm gepflanzt und nach Erreichen einer Höhe von 50 bis 60 cm jeweils in Gruppen von 10 bis 30 Töpfen aufgeteilt. Die Pflanzen wurden mit der Testchemikalie besprüht, an der Luft getrocknet und anschließend mit dem Krankheitserreger geimpft. Es wurde 5 bis 7 Tage beobachtet. Die Impfung wurde wie folgt durchgeführt: Hyphen oder Sclerotia von Hypochnus sasakii werden auf Teilchen von Reisstroh geimpft und etwa 1 Woche in einem Thermostaten bei 30° C ± 1° C bebrütet. Diese Fragmente werden in die Blattrillen der Versuchspflanzen eingeführt und diese nach einem Aufenthalt von 48 Stunden in einem feuchten Zimmer bei 30° C ± l° C in ein Gewächshaus mit einer Temperatur von 24 bis 35° C gegeben, um die Krankheit zum Ausbruch zu bringen. In einigen Fällen «erden Agarblöcke, auf denen Hypochnus sasakii 2 bis 3 Tage ausgebrütet worden war, an Stelle der Reisstrohteilchen verwendet.

Der Humidingehalt in dein 'Mittel betrug 10 bzw. 100 ;"/ccm, und jeder Topf wurde mit 5 bzw. 10 ccm des Mittels besprüht. Bei dem 1/soooo-Wagner-Topftest wurden 50 ccm von 10 ;Y/ccm und 50 "/ccm und 100 ;,/ccm je Topf versprüht.

Ergebnisse

Tabelle 10

Higashiyama-41 Art B

Behandlung Sprühvolumen Höhe der Pflanze Zahl der Zahl der

infizierten nicht infizierten Schutzwirkung

(ccm pro Topf) (cm) Pflanzen Pflanzen %)

Kontrolle . . . . . . . . . . . . - 68,5 6 1 0

10 ;,/m1 . . . . . . . . . . . . . . 10 66,2 1 9 88.3

100 7/m1 ............ 5 66,4 0 0 100.0

Tabelle 11

Norin-22 Art A

Sprühvolumen Zahl Zahl

Behandlung (ccm pro Topf) der infizierten der nicht infizierten Sdiutzwirkun

Pflanzen Pflanzen

Kontrolle . . . . . . . . . . . . - 19 8 0

10 7/m1 . . . . . . . . . .. .. . 5 8 20 59.8

100 ;,/ml . . . . . . . . . .. . . 10 3 25 84,8

Tabelle 12

Senbon-Asahi Art D

Sprühvolumen Höhe der Pflanze Zahl der Zahl der . Vorbeugende

Behandlung infizierten nichtinfiziertem

(ccm pro Topf) (cm) Pflanzen. Pflanzen , Schutzwirkung

Kontrolle............ - 60,2 18 2 0

10 y/ml . . . . . . . . . .. . . . 10 60,5 10 10 44,4

100 7/m1 . . . . . . . . . . . . . 10 59,4 2 18 .. 88,9

Tabelle 13

Senbon-Asahi Art D

Ergebnisse des 1/soooo-Wagner-Topf-Tests 2 Tage nach Besprühen mit Humidin

Sprühvolumen Nr. Zahl Zahl der Infiziert Vorbeugende

Behandlung des Topfes der infizierten beobachteten Wirkung

(ccm pro Topf) Pflanzen Pflanzen (0!o)

Kontrolle ....... . . . . . - 6 133 246 54,1 0

10 y/ml.............. 50 6 74 255 29,0 46,4

50 y/ml . . . . . . . . . . . . . . 50 6 58 233 24.9 54,0

100 y/ml . . . . . . . . . . . . . 50 6 42 242 17,4 67,8

Wie aus diesen Tabellen hervorgeht, verhinderten zwar 10 ccm je Topf einer 10 y/ccm Humidinlösung die Infektion in B, 5 ccm reichen jedoch nicht aus. Das ist eher auf die geringe Menge des verwendeten Mittels als auf die geringe Humidinkonzentration zurückzuführen, da 5 ccm nicht ausreichen, um die ganze Pflanze zu benetzen.

Das Mittel war jedoch bei D, das gegenüber Flecken widerstandsfähig ist, nicht so wirksam. Wie aus Tabelle 13 hervorgeht, wurde aber die Krankheit in der 100-y/ccm-Gruppe bei dem Wagner-Topfversuch, bei dem die Prüfpflanze mit Hypochnus sasakii 2 Tage nach Behandlung mit dem Mittel geimpft wurde, verhindert.

(ii) Kosaka-Testverfahren: Bei diesem Verfahren wird das Mittel auf die Oberfläche eines Sojabohnenblattes aufgesprüht, Hypochnus sasakii eingeimpft und der Durchmesser der infizierten Stelle gemessen. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt: Das Blatt einer Sojahohnenpflanze-wird mit dem Mittel besprüht und nach dem Trocknen an der Luft auf ein feuchtes Filterpapier in eine Petrischale mit einem Durchmesser von etwa 9 cm gegeben. Auf die Mitte des Blattes wird eine kleine Glasplatte gelegt, auf der sich ein Agarblock befindet, auf dem vorher Hypochnus sasakii gezüchtet wurde. Die Glasplatte wird hei 28 bis 30° C in einem Thermostaten s,tehengelassen. Nach 24 Stunden wird der Durchmesser der infizierten Stelle gemessen. Die Wirksamkeit des Mittels geht , aus folgenden Koeffizienten 'hervor:

Durchmesser der Stelle Faktor

(D cm)

D = 0 .................... I 0

1 > D > 0 .................... 1

2 > D > 1 ......... . .......... 2

3 >_ D>2 ... .. ............... 3

4 D > 3 ... .. ............... 4

D>4 .................... 5

Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 14 enthalten: - ,

Tabelle 14

Versprühte Präventiv-

Behandlung Menge Faktor- wirksanik6it. Beobachtung -

in ccm 0 1 I 2 I 3 _ 1 4 5 010 Kontrolle . . . , . . . . . - 3 j .17 0 ?@..

10 7/ml . : . . . . : :. . . 25 8 1 6 3 -@ 2- - 691.- ` . Auf der Blattoberfläche

aufgesprüht

10-y/ml . . . . . . . .. . .25 2 ` 1 ` 2 3 3 9 26,8 , Auf der Blattunterseite

aufgesprüht

100 y/ml . . . . . .-. .-. . 25 13 1 3 3 $3,5-; Auf der Bl'atiöberfläcl-#d

i- aufgesprüht

1(l0 y/ml . . . . . . . . . . 25 1 3 3 3 2 i 11- 19,6-. - Auf der Blattunterseite

I aufgesprüht

Diese Resultate zeigen, daß Humidin bei Pflanzenkrankheiten, die durch Hypochnus sasakii verursacht werden, wirksam ist.

B. Test mit Colletotrichum lagenarium (Pass) E11. und Halst. Calletotrichum lagenarium ist ein bei den verschiedenen Kürbispflanzen weit verbreiteter Schmarotzer und der Erreger von Anthraknose. wo, durch Flecken, Blattzerstörungen und Erweichung der Blätter, Ranken und Früchte hervorgerufen werden.
Da auf Grund des Aritipilzspektrums anzunehmen war, daß Humidin eine -starke änti.bi:otische Wirksamkeit gegen Colletotrichum lagenarium hat. wurde diese Wirksamkeit gegen durch Mikroorganismen hervorgerufene Krankheiten an Gurken als Testpflanzen untersucht.

\'erfahr-cn: Vier Blätter einer zu dieser Krankheit neigenden Gurkenart mit vier oder fünf Hauptblättern dienen als Versuchsobjekt. Die vier Blätter werden mit dem :Mittel besprüht und nach dem Trocknen mit dem -Nilikroorganismus geimpft. Die Pflanze wird in einem feuchten Raum bei 30° C über Nacht stehengelassen und anschließend in ein Gewächshaus mit @:n,r Temperatur von 24 bis 35° C gebracht und l 'Woche beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 aufgeführt.

Tabelle 15

Versprühtes Zahl der infizierten Stellen Infektion Verhältnis Schutzwirkung

Beobachtung Volumen je Blatt

ccm/Topf z. Blatt ! 3. Blatt ! 4. Blatt 5. Blatt °/o °/o °/o

Kontrolle ..... - 2,3 5,4 4,9 0,8 54,0 100 0

(6) (12) (16) (4)

10 ;,/ml . .. .. .. . 10 (#) (14) ( j <08) 9,0 16,7 83,3

l

100 y/ml ....... 10 0,3 ! 0,3 0,1 0 3.0 5,6 94.4

(4) (15) (18) (8)

(In der Tabelle ist der Prozentsatz der Infektion der Wert, der durch Multiplizieren der Anzahl von Flecken auf dem dritten Blatte mit 10 erhalten wurde. Die eingeklammerten Zahlen zeigen die Anzahl der untersuchten Blätter an. Das Verhältnis bezeichnet den Prozentsatz der Infektion in jeder Gruppe, wenn die Kontrollgruppe als 100 angenommen wird. Die Blätter werden von unten gezählt.) Aus der Tabelle geht hervor, daß Humidin gegen Colletotrichum lagenarium wirksam ist.

Die Ergebnisse der vorstehenden Experimente bestätigen die Wirksamkeit von Humidin gegen Pflanzenkrankheiten, insbesondere Krankheiten; die durch Hypochnus sasakii und Colletotrichum lagenarium verursacht werden, und beweisen, daß es sich als Agrikulturmittel gegen diese Krankheiten verwenden läßt, wenn es in geeigneter Form hergestellt wird, um auf die Oberfläche dies Pflanzenkörpers aufgetragen werden zu können. Um ein Rezept für Humidin enthaltende Pflanzenschutzmittel zu finden, wurde zunächst die Stabilität dies Humidins untersucht und festgestellt, daß Humidin zwar bei hohen Temperaturen in alkalischem Medium instabil ist, bei Raumtemperatur dagegen unabhängig vom pH-Wert stabil; bei direkter Sonnenbestrahlung ist es beständig. Wenn ein Phosphatpuffer (pes Wert 5,7 oder 8) mit einem Gehalt von 1 y/ccm Humidin 2 Monate am Fenster stehengelassen wird, verringert sich seine Wirksamkeit überhaupt nicht. Auch durch Zusatz von üblicherweise bei der Herstellung von Agrikulturmitteln verwendeten Netzmitteln, Verteilungsmitteln oder Haftmitteln wird diese Wirksamkeit nicht verringert.
Als Mittel für die Landwirtschaft kann Humidin in rohem und. selbstverständlich in reinem Zustand verwendet werden. Unter Umständen ist auch der Extrakt der Kulturflüssigkeit brauchbar. Bei Verwendung von Rohprodukten oder Extrakten spielt die Reinheit keine Rolle, vorausgesetzt, daß die vorliegenden Verunreinigungen für die Pflanzen nicht. schädlich sind und den Kontakt zwischen Humidin und den Pflanzen nicht verhindern. Der Humidingehalt in den Präparaten wird der Art der Pflanzen, den pathogenen Mikroorganismen und dem Wetter angepaßt. Bei Verwendung von Humidinpräparaten in flüssiger Form beträgt der Humidingehalt vorzugsweise mehr als 10 y/cem. Die Humidinpräparate werden entweder auf die Pflanzenoberfläche aufgetragen oder in das Pflanzengewebe eingeführt. Beim Auftragen auf die Pflanzenoberfläche muß das Präparat in einem ausreichenden Volumen vorliegen, um die ganze Pflanze zu bedecken. Wenn dagegen das Pflanzengewebe durchdrungen werden soll, werden die Präparate mit den Wurzeln, Blattoberflächen, Stengeln usw. in Berührung gebracht. Zur gleichmäßigen Verteilung auf den Pflanzenkörpern wird- die Verwendung von Staub-oder Nebelsprühern empfohlen. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Präparate auf die Oberfläche der Pflanze aufgebracht, um einen hohen Humidingehalt auf der Oberfläche zu erzielen, sie können aber auch in das Pflanzengewebe eingeführt werden. Die Präparate können auch zur Behandlung von Früchten verwendet werden. In allen Fällen haben sich die Präparate als. sehr wirksam erwiesen. Humidin kann außerdem auch in Form von Pulvern oder Tabletten verwendet werden. Bei Verwendung in flüssiger Form wird Humidin mit Wasser oder einem organischen Lösungsmittel zu einer Lösungsemulsion oder Suspension verdünnt.
Geeignete organische Lösungsmittel sind hydrophyle Lösungsmittel, wie Aceton und Alkohol, in vielen Fällen können aber auch nichthydrophyle Lösungsmittel, wie Cyclohexanol, Xylol und Erdölkohlenwasserstoffe verwendet werden. Bei Verwendung von nichthydrophylen Lösungsmitteln werden häufig oberflächenaktive Mittel oder Verteilungsmittel zugegeben. Lösungen organischer Lösungsmittel als solche können verwendet werden, sind aber im allgemeinen zu teuer. Bei Verdünnung einer Lösung von Humidin in einem organischen Lösungsmittel mit Wasser entsteht meist eine Emulsion. Da diese Emulsionen zum größten Teil aus Wasser bestehen, sind sie billig, außerdem sind sie als Agrikulturmittel geeignet.
Bei Verwendung von Humidin in Pulverform werden mineralische oder pflanzliche Pulver als Verdünnungsmittel oder Träger verwendet. Geeignete mineralische Pulver sind Talk, Ton, Diatomeenerde, saurer japanischer Ton, aktive Tonerde, Aleuron; Vulkanasche, Borsäure, Caleiumcarbonat, Magnesiumcarbonat u. dgl. Als pflanzliches Pulver wird beispielsweise Sägemehl verwendet. Diese Pulverzusammensetzungen können zu Tabletten verarbeitet werden. Bei der Herstellung der Tabletten werden geeigneterweise Mittel zur Verteilung der Bestandteile in dem Lösungsmittel zugegeben. Wenn die Tabletten nach dem Auflösen in Wasser angewandt werden sollen, sind lösliche Stärke, Pectin, Natriumalginat. Polyvinylalkohole, Methylcellulose, das Natriumsalz der Carboxymethylcellulose, Zucker, mehrwertige Alkohole, Casein usw. als solche Füllstoffe geeignet.
Bei allen diesen Präparaten können andere Substanzen, wie bindende Substanzen, Löslichkeitsbeschleuniger, Düngemittel, wachstumsfördernde Mittel, Farbstoffe und Desinfektionsmittel in geeigneten Mengen zugegeben werden.
Die Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen beschrieben Beispiel 1 Flüssigkeit aus gequollenem Mais . . 3,0% Stärke ... .. ... .. ................. 3,0% Pepton ........................... 0,5% Calciumphosphat .................. 0,1"/o Magnesiumsulfat ................. 0,05"/o Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,311/o 100 1 eines aus dien vorstehenden Bestandteilen hergestellten Reaktionsmediums mit einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0 werden in einen Behälter gegeben und nach dem Sterilisieren durch Erwärmen mit einem Stamm Streptomyces-Humidus (IFO-3520) geimpft. Die Züchtung wird aerob bei 27° C ± 1° C 4 Tage unter Rühren durchgeführt. Das gebildete Myoel wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und so trocken wie möglich gepreßt (20 kg). Das feuchte Mycel wird mit etwa 401 Aceton bei. 40° C 1 Stunde unter Rühren extrahiert, abfiltriert und das Aceton aus dem Extrakt (etwa 401) bei niederer Temperatur abdestilliert, wobei etwa 71 einer konzentrierten wäßrigen Lösung zurückbleiben. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Salzsäure auf 2,3 und 3,0 eingestellt und anschließend die wäßrige Lösung zweimal mit einem Viertel und einem Achtel ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert. Zu den vereinigten Extrakten wird dann so lange normale Natronlauge zugegeben, bis sich keine aktive Substanz mehr in Form einer Emulsion abscheidet, Danach wird die Äthylacotatschicht abgetrennt und der p11-Wert der Emulsion mit Salzsäure auf 2,3 bis 3,0 eingestellt, wobei sich das Humidin in kristalliner Form abscheidet. Das Produkt kristallisiert aus Athylalkohol in hexagonalen Plättchen aus, Schmelzpunkt 145 bis 146° C unter Zersetzung. Die Ausbeute beträgt 9,7 g.
Beispiel 2 Wenn der Humidingehalt der Kulturflüssigkeit zu niedrig ist, um Glas Antibiotikum nach dem Verfahren des Beispiels 1 zu isolieren, wird Humidin wie folgt abgetrennt: 500 ccm der nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellten konzentrierten Äthylacetatlösung (mit einem Humidingehalt von etwa 3 ing/ccm) werden in eine mit 100 g Aktivkohle gefüllte Glaskolonne mit einem Durchmesser von 5 cm gegeben und die Aktivkohle mit 1500 ccm Äthylaöetat eluiert. Das Eluat enthält kein Humvdin. Die Aktivkohle wird nochmals mit 2000 ccm 95%igem Äthanol eluiert und das Eluat im Vakuum bei niedriger Temperatur konzentriert, wobei das Humidin abgeschieden wird. Es kristallisiert aus Äthanol in Platten aus. Schmelzpunkt 145 bis 146° C. Die Ausbeute beträgt etwa 200 mg (40%). Bei Verwendung geringer Mengen Aktivkohle kann die Humidinausbeute steigen.

Beispiel 3 Es wird ein pulverförmiges Humi,dinpräparat durch Verdünnung von Humidinkristallen (7500 Einheiten/mg) mit einer Mischung aus Kalk und Kaolin im Verhältnis von 95 : 5 hergestellt.

Gehalt Antibiotische lrirksamkeit

Humidin (Einheiten/mg)

(mg/g) berechnet gefunden

100mal verdünnt 10,0 75.0 75,0

200mal verdünnt 5,0 37,5 38,0

400mal verdünnt 2,5 18,8 20,0

Beispiel 4 _

Es werden Emulsionen verwendet, die Humidin-

kristalle in Mengen von 7500Einheiten/mg als aktiven

Bestandteil enthalten.

Bestandteile

A B ! C

Humidin . .. .. .. ... .... . 5 5 5

Cyclohexanon .......... 25 25 35

Xylol .................. 50 60 50

Oberflächenaktives Mittel 20 10 10

Die Bestandteile werden vor ihrer Verwendung immer in der vorstehenden Reihenfolge vermischt und mit Wasser verdünnt. In den nachfolgenden Tabellen 16 bis 19 sind die Ergebnisse der Versuche aufgeführt, die durchgeführt wurden., um die Wirkung der Emulsionen auf die Anthraknose hei Gurken und Pfirsichen und auf Brand bei Weizen festzustellen.

Tabelle 16

Behandlung Konzentration. Zusatz Infektion Menge Schutzwirkung

Kontrolle ...... --- - 57,8 100,0 0

Nr. 1 ..... .. ... X 500 --- 33,1 57,2 42,8

Nr- 1 . . . . . . . . . . X 500 Kalk, Casein 16,8 29,1 70,9

0,10%

Nr. 2 .......... x 500 --- 17,7 30,6 69,4

Nr. 2 : . . . . . . . . . X 500 - Kalk, Casein 12,1 20,9 79,1

0,10l0

Nr. 3 . .. .. .. .. . X 500 --- 18,1 31,4 68,6

Nr. 3 . . . . . . . . . . X 500 Kalk, Casein 14,6 25,3 74,7

0,10/0

Nr. 4 . . . . . . . .. . X 500 - 13,8 23,9 76.1

Nr. 4 ..... .. ... X 500 Kalk, Casein 17,5 30.3 69,7

0,10/0

Nr. 5 ... .. .. .. . X 500 - 14,6 25,3 74,7

Nr. 5 . . . . . . . .. . X 500 Kalk, Casein 17,2 29,8 70,2

!\ 1 B/_

Tabelle 17

Infektion Schutzwirkung Ausdehnung

Behandlung

, Blattstellung,

ele

Menge

e!0

- ele

Blindprobe .......... I 9,8 100,0 0 100,0

1I 17,4 100,0 0 100,0

111 3,9 100,0 0 100,0

Nr. 2 X 1000 . .. .. .. . 1 7,0 71,4 28,6 90,9

11 4,3 24,7 75,3 89:Ö

111 0,8 21.3 78,7 66,9

Nr. 2 X 500 . .. .... .. 1 2,6 27,0 73,0 81,9

11 1,7 9,8 90,2 70,8

I I I 0,7 18,9 81,1 92,7

Tabelle 18

- Behandlung - Zahl der bbob-

Zahl der Zahl der

achteten Früchte infizierten Früchte infizierten Flächen

Blindprobe ... .. .. ... 5 4 43

Nr. 1 X 500 . .. .. . . . . 5 1 2

Nr. 3 X 500. . . . . . . . . 5 1 2

Tabelle 19

Datum

10. Juni I 12. Juni I 15. Juni

Behandelt .............( 2 2,5 2,6

Blindprobe ............. 5 5 4,9

In den Tabellen bedeutet: Nr. 1: Daß als oberflächenaktive Mittel in A ein nichtionisches und ein anionisches oberflächenaktives Mittel verwendet wurden.

N r. 2: Daß die gleichen oberflächenaktiven Mittel wie in 1 in B verwendet wurden.
Nr.3: Daß ein anionisches oberflächenaktives Mittel in A verwendet wurde.
N r. 4: Daß die gleichen oberflächenaktiven Mittel wie in 1 in C verwendet wurden.
Nr. 5: Daß ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel in A verwendet wurde.
1. Es wurden Testversuche über die Anthraknose bei Gurken in nichtglasierten' Töpfen. mit einem Durchmesser von etwa9 cm durchgeführt (Tabelle 16).
Die Versuchspflanzen gehören alle zu der für die Krankheit anfälligen Gattung und hatten jeweils zwei bis drei Blätter.
Alle Pflanzen werden mit 6 ccm Emulsion' besprüht und nach dem Trocknen an der Luft mit dem pathogeiien Mikroorganismus geimpft: Sie werden über Nacht in einem feuchten Raum bei 3b° C 5tehengelassen und anschließend in ein Treibhaus übergeführt.' Die Beobachtung wurde 1 Woche durchgeführt und der Fortschritt der Krankheit aus der Anzahl von Flecken auf dem zweiten Blatt berechnet.
2. Es' wurden Testversuche über die Ahthraknose bei Gurken. die in nichtglasierten Töpfen mit einem DurCimesser von etwa '15 cm gepflanzt 'sind (Tabelle 1T)Atirchgeführt. ' ' Al'#- Versuchspflanzen gehören zu der für die Krankheit anfälligen Gatttiüg und hatten jeweils acht bis zehn Blätter. ` Der Versuch wurde mit einem bis drei Blättern annähernd gleicher Größe durchgeführt. In del-' Tabelle bedeutet die »Ausdehnung«' die Ausl>reitüng der infizierten Ste'.1.@ nach Auftreten der Krankheit. 3. Es wurden Laboratoriumsversuche über die Anthraknose bei Pfirsichen (Tabelle 18) durchgeführt. Pfirsiche werden mit einer 100 y/ccm Humidin enthaltenden Lösung besprüht und am nächsten Tag mit den Konidien von Gloesporium laeticolor geimpft. Die Früchte werden bei geeigneten Temperaturen 7 Tage stehengelassen und die Zahl der infizierten Früchte und der Flecken untersucht.
4. Es wurden Zuchtbeetversuche über den Brand bei Weizen ("Tabelle 19) durchgeführt.
Man behandelte den Brand bei Weizenpflänzchen aus am 14. Mai gesäten Samen mit einer Emulsion, die durch Verdünnung von N r. 1 im Beispiel 4 um das 4250fache hergestellt wird (Humidingehalt 200 ;,/ccin). Die Setzlinge wurden am 29. Mai. 3. und 11. Juni jeweils mit 180ccm Emulsion pro m2 besprüht. Der Krankheitsgrad wurde dreimal am 10.. 12. und 15. Juni -beobachtet. Die in der Tabelle 19 aufgeführten Werte geben die Zahl für die Größe der Infektion. Null bezeichnet keine Infektion. 1 leichte Infektion, 3 eine klare Infektion und 5 eine erhebliche Infektion: Wie aus der Tabelle ersichtlich, kann die Krankheit zu etwa 50% durch die Behandlung mit der Humidinemulsion verhindert werden.
Humidin wurde als 'Mittel gegen Pflanzenkrankheiten untersucht, wobei folgende Ergebnisse (siehe Tabelle 1) erhalten wurden.-(I) Reispflanze (orvza sative L:)-a) Brand. Reissaaten werden 2 Tage in Wasser von 30° C getaucht und dann 12 Stunden in 125-, 250-und 500fach verdünnte 2,5% Humidin-A enthaltende Emulsionen und schließlich bei 301' C sprießen gelassen. Die keimenden Saaten wurden mit Phvtophthorainacrospora (Sacc.) Ito et Tanaka geimpft und auf ein. Feld gepflanzt. Beim Zählen der erkrankten Pflanzen zeigte sich ein bemerkbarer Unterschied bei den behandelten und nicht behandelten Anpflanzunge".

b) Flecken. Ein auf dein Feld gewachsener Wasserreis wurde mit der Pflanzenkrankheit durch Impfinn mit Hypochnus sasakii Shirai. das auf Reisstroh gezüchtet worden war, infiziert und dann , mit 300- bis 700fach verdünnter 5% Humidin-B enthaltenden Emulsionen besprüht. Die Pflanze zeigte danach keine Krankheitserscheinungen, aber eine bemerkenswerte statische Wirkung zur Entwicklung der

A I B- I C I D I E I F

Humidin ............................ 2,5 5 5 I 2,5 2.5 5

Cyclohexanon ....................... 25 25 25 ; 35 25 35

lylol .................,............. 62,5 50 50 52,5 52,5 ! 50

Oberflächenaktives Mittel (1) *) ...... 10 - - 10 - 10

Oberflächenaktives Mittel (2) *) ...... - 20 - - - -

Oberflächenaktives Mittel (3) *) ...... - - 20 - 20 -

") Oberflächenaktives Mittel (1); die Hauptbestandteile sind: ") Oberflächenaktives Mittel (2); die Hauptbestandteile sind:

Alkylarylsulfonat und Poly- Polyoxyäthylennonyl-

oxyäthylenalkylphenyl- phenyläther.

äther. *) Oberflächenaktives Mittel (3); der Hauptbestandteil ist:

Dialkalysulfosuccinat.

Krankheit wurde bei den behandelten im Gegensatz zu den unbehandelten Pflanzen festgestellt.

(II) Trauben (Vitis vinifera L.)-Anthraknose Gleichmäßig gereifte Trauben wurden von einem Traubenbündel ausgewählt, mit 100 v/ml einer 5%igen Ilumidin-C-Emulsion bespritzt und in einem Treibhaus 24 Stunden stehengelassen und dann mit Glomerella cingulata Spauld et Schr. geimpft. Es wurden nur 21% der Pflanzen von der Krankheit angegriffen, bei unbehandelten Früchten dagegen 710/0.
(11I) japanischer Persirnmon (Diopyros kaki Thumb. var. domestica Makino)-Anthraknose Reife Früchte wurden mit 200 2,/ml einer 5%igen Humidin-C-Emulsion besprüht und nach 24stündigem Trocknen an der Luft mit 10 bis 20 Tropfen je zwei Früchte einer Gloesporium kaki Ito-Emulsion geimpft. Die behandelten Früchte erkrankten nicht, während alle unbehandelten Früchte erkrankten.
(IV) Pfirsich (Prunus persica Rhed. and P. communis L.)-Anthraknose Als Versuchspflanzen wurden auf dem Feld gewachsene Pflanzen genommen. Nach Auslese der kranken Früchte wurden die Früchte bedeckt und die Pflanzen mit 6 1 je Pflanze einer auf das 250fache verdünnten 2,5%igen Humidin-D-1-ösung 7mal in 10 Tagen vom 26. April bis 10. Juli besprüht. Es erkrankten nur 28,90% dieser Pflanzen, während 39.1% der unbehandelten Pflanzen erkrankten. An den Früchten zeigten sich keine Beschädigungen.
(V) Gurke (Cucurbita sativus L.)-Anthraknose Die Versuchspflanzen wurden ohne Komposterde in einem Treibhaus gezüchtet und mit einer auf das 125-und 62,5fach verdünnten 2,5%igen Humidin-E-Emulsion besprüht. Bei zwei oder drei bzw. drei oder vier Blattstufen wurden 2,75 und 1,75 Symptome je Blatt festgestellt, während 4,10 Symptome je Blatt bei der Blindprobe gefunden wurden.

(VI) Sojabohnen (Phaseolus vulgaris L.)-Anthraknose Die auf einem Feld ohne Komposterde gezüchteten Pflanzen wurden mit einer 250-,125- und 62,5 fach verdünnten 2,5%igen Humidin-E-Emulsion besprüht und nach Trocknen an der Luft mit Colletotricum lindemuthianum (Sacc. et Magn) Br. et Can. besprüht. Die 10 Tage später festgestellten Symptome auf den Blättern und Hülsen sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt. Die Zahlen in der Tabelle zeigen die Symptomanzahl je Blatt und Hülse.

Tabelle 2

Konzentration I Blatt I Hülse

X 250 ................... 0,35 3,43

X 125 .... . ............... 0,10 2,39

X 62,5 ... .. .. .. .. .. .. .. 0,13 2,59

Blindprobe ... .. .. .. .. ... 0,57 5,12

(VII) Garten-Erbse (Pisum sativa L.) a) Wurzelfäule. Die über einen Meter hohen Pflanzen wurden mit einer Mycosphaella pinodes (B. et Blox.) Stone-Suspension und dann mit dem Mittel besprüht. Am sechsten Tage nach dem Besprühen mit dem Mittel wurden die Symptome je Blatt gezählt und dann das Mittel wieder versprüht. Eine Woche später wurden die in der Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse festgestellt:

Tabelle 3

1. Zählung I 2. Zählung

2,5%ige Humidin-E-

Emulsion X 300 . . . . . . . . 0,16 0,33

2,5%ige Humidin-E-

Emulsion X 500 . . . .. . . . 0,09 1,29

5%ige Humidin-F-

Emulsion X 500 . .. . . . . . 0,20 0,47

5%ige Humidin-F-

Emulsion X 600 . . . . . . . . 0,07 0,52

Blindprobe ... .. .. ....... 0,24 2,62

b) Botrvtisfäule. Blätter der in Töpfen, die mit sterilisierter Erde gefüllt waren, gezüchteten Pflanzen wurden mit einem Agarblock von Pathogen (botrytis cinerea Pers.) geimpft. Einen Tag später wurden die Pflanzen mit Humidin-E-Emulsionen besprüht. Die Wirkung der Pflanzenkrankheit ist in Tabelle 4 aufgeführt

Tabelle 4

Erkrankte

Pflanzen

(o/o)

2,50%ige Humidin-E-Emulsion X 300 44,5

2,5%ige Humidin-E-Emulsion X 500 77.8

Blindprobe .......................... 100,0

(VIII) Salat (Lactuca sativa L.)-Botrytisfäule Genau wie vorstehend wurden Blätter der in Töpfen mit sterilisierter Erde gewachsenen Pflanzen mit einem Agarblock von Pathogen (botrytis cinerea Pers.) geimpft und 1 Tag später mit Aumidin-E- oder Humidin-F-Emulsion geimpft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt:

Tabelle 5

Erkrankte

Pflanzen

(%)

2,5o/oige Humidin-E-Emulsion X 300 73,9

2,5o/oige Humidin-E-Emulsion X 500 68,6

5o/oige Humidin-F-Emulsion X 500 ... 60,8

Blindprobe .......................... 90,0

(IN) Tomate (Lvcopersicon esculentum Mill) a) Mehltau. Die Pflanzen wurden mit 5o/oiger Humidin-F-Emulsion in einer Verdünnung von 2001/m1 besprüht und am nächsten Tage mit Phytophthora parasitica Bary geimpft. Die Wirkung der Krankheitsunterdrückung konnte am dritten Tage mit dem bloßen Auge festgestellt werden.

b) Stamm- und Blattfäule (Fusarium wilt and Leaf mould). Tomatensetzlinge wurde in Töpfe mit einem Durchmesser von 15 cm eingepflanzt, die mit mit Fusarium lycopersici Sacc. geimpfter Erde gefüllt waren. Die Pflanzen wurde besprüht oder die Erde mit Humidin-E- oder -F-Emulsionen im Abstand von einer Woche dreimal behandelt. Die Wirkung der obengenannten Krankheit (Infektion durch Botrytis cinerea Pers.) ist in Tabelle 6 angeführt.

Tabelle 6

Stammfäule (°/o) Blattfäule

(fusarium wilt) (leaf mould

besprühte getränkter

Pflanzen I Boden ("/o)

2,5o/oige Humi-

din-E-

Emulsion

X 200 . .. . . . . 88,7 74,8 12,6

2,5o/oige Humi-

din-E-

Emulsion

X 300 55,0 24,8 14,0

5o/oige Humi-

din-F-

Emulsion

X 400 ....... 77,7 16,5 32.2

5o/oige Humi-

din-F-

Emulsion

X 600 ....... 88,7 8,3 13,3

Blindproben .... 100 83,0 37,6

Claims

PATENTANSPYL-CIl: Die Verwendung von Streptomyces humidus (IFO-3520, hinterlegt beim Institut für Fermentation Osaka, Japan) oder seiner natürlichen oder induzierten Mutanten oder Varianten zur Herstellung des Antibiotikums Humidin auf biologischem Wege unter den üblichen Bedingungen, vorzugsweise im submersen Verfahren, und Gewinnung des Antibiotikums durch bekannte Verfahren wie Extraktion oder Adsorption aus der Nährflüssigkeit.