DE10350248A1

DE10350248A1 - Thermosensitive, biokompatible Polymerträger mit veränderbarer physikalischer Struktur für die Therapie, Diagnostik und Analytik

Info

Publication number: DE10350248A1
Application number: DE10350248A
Authority: DE
Inventors: Detlef Dr. Müller-Schulte
Original assignee: MagnaMedics GmbH
Current assignee: MagnaMedics GmbH
Priority date: 2003-10-28
Filing date: 2003-10-28
Publication date: 2005-06-16
Also published as: WO2005042142A3; EP1680142A2; US20070148437A1; WO2005042142A8; WO2005042142A2

Abstract

Die Erfindung betrifft biokompatible, thermosensitive Polymere, die durch Einkapselung magnetischer und/oder metallischer Kolloide bzw. magnetischer Nanopartikel mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufgeheizt werden können. Infolge der induktiven Erwärmung der Polymermatrix werden physikalische Strukturveränderungen in der Polymermatrix ausgelöst, die dazu führen, dass in der Polymermatrix eingekapselte bioaktive Substanzen in kurzer Zeit freigegeben werden. Dieses "Stimulus-Response"-Prinzip wird zur Herstellung steuerbarer Medikamentendepots, kontrastverstärkender Mittel für die NMR-Diagnostik, manipulierbarer Mikrowerkzeuge, als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen und als steuerbare Porogene bei der Membranherstellung verwendet.

Description

Die Erfindung betrifft biokompatible und thermosensitive Polymerträger verschiedener Teilchengrößen, die eine in vivo Applikation zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken ermöglichen. In die Polymermatrix sind magnetisierbare Substanzen in Form magnetischer- und/oder metallischer Kolloide eingekapselt, die sich durch Wärmezufuhr mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufheizen lassen, woraus eine physikalische Strukturveränderung in Form einer Konfigurationsänderung resultiert.
Die Erfindung betrifft ferner die Herstellung und Verwendung der Polymerträger.

Induktiv aufheizbare magnetische Polymerpartikel sind aus diversen Veröffentlichungen und Patenten bekannt. So sind in DE-OS 3502998, DE-OS 4201461, DE-OS 4412651 und DE-OS 19800294 induktiv aufheizbare magnetische Polymerpartikel für die Tumortherapie, für die AIDS-Therapie sowie für molekularbiologische Anwendungen beschrieben.

Jordan et al., J. Magnet. Mag. Mat., Vol. 225, 118, 2001, sowie Int. J. of Hyperthermia, Vol 9, 51, 1993 verwenden verschieden beschichtete, induktiv aufheizbare magnetische Kolloide zur hyperthermischen Behandlung von Tumoren. In ähnlicher Weise verwenden Mitsumori et al., Int. J. of Hyperthermia, Vol. 10, 785, 1994, und Masuko et al., Biol. Pharm.Bull., Vol. 18, 1802, 1995, induktiv aufheizbare magnetische Partikel bzw. Magnetliposome zur Überwärmung (Hyperthermie) von Tumorzellen.

In den US-Patentschriften 4.735,796 und 4.662.359 werden Magnetpartikel beschrieben, die ebenfalls für die Hyperthermie im Rahmen der Tumortherapie verwendet werden.

Den hier zitierten Mitteln und Verfahren ist gemeinsam, daß die magnetische Induktion ausnahmslos zur Erwärmung der Partikel dient, um Zellen oder biologische Organismen per Überwärmung zu zerstören. Eine Änderung der physikalischen Struktur oder der Form des Polymerträgers mit Hilfe der Induktion kann mit den bekannten Trägern nicht realisiert werden.

Magnetische Mikro- und Nanopartikel vorzugsweise für analytische, diagnostische oder medizinische Zwecke sind aus den Patentschriften PCT/WO 97/04862, PCT/WO 89/11154, PCT/WO 92/22201, PCT/WO 90/07380, PCT/WO 99/62079 sowie den US-Patentschriften 6,020,210, 5,141,740, 4,827,945, 4,647,447, 3,917,538, 4,628,037, 4,827,945, 4,861,705, 4,169,804, 4,115,534, 4,345,588, 4,070,246, 3,970,518, 4,230,685, 4,654,267, 4,452,773, 4,369,226, 4,357,259, 4,861,705, 4,247,406, 4,267,234, 3,652,761, 4,675,173, hier als Referenz beigefügt, allgemein bekannt. Als Polymermatrix kommen bei den vorgenannten Verfahren und Produkten Dextran, Agarose, Dextrin, Albumin, Silicagel, Polystyrol, Gelatine, Polyglutaraldehyd, Agarose-Polyaldehyd-Komposite, Liposome, Polyethylenimin, Polyvinylalkohol, Polyacrolein, Proteine und Polyoxyethylene zum Einsatz, die über gekoppelte Bioliganden bzw. Rezeptoren gemäß dem Affinitätsprinzip Analyten in Form von Antigenen, Antikörpern, Proteinen, Zellen, DNA-Fragmenten, Viren oder Bakterien im Rahmen der biochemisch-medizinischen Analytik und Diagnostik binden können.

Eine Übersicht über weitere mit verschiedenen Polymeren beschichtete Magnetpartikel und deren Anwendung im biomedizinischen Bereich sind in „Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers", Häfeli et al. Hrsg., Plenum Press, New York, 1997, beschrieben.

Allen vorgenannten Produkten ist gemeinsam, daß sie ihre Funktion ausschließlich aus der komplementären Wechselwirkung eines auf der Matrix gebundenen Bioliganden bzw. -rezeptoren mit der zu analysierenden Substanz ableiten. Ihre Einsatzgebiete beschränken sich somit auf die bekannten Felder der Auftrennung und Analyse von Biomolekülen oder der Markierung bestimmter Zellen unter Ausnutzung des klassischen Affinitätsprinzips.

Die hier als Referenz zitierten magnetischen Polymerträger unterscheiden sich ferner von den erfindungsgemäßen Mitteln dadurch, daß sie, bedingt durch ihre chemische Struktur, nicht thermosensitiv sind, d.h. aufgrund eines äußeren Wärmestimulus ihre physikalische Struktur bzw. geometrische Form nicht in der Lage sind zu ändern. Diese Eigenschaft stellt jedoch die Grundvoraussetzung dar, Polymerträger als manipulierbare oder steuerbare Mikro- oder Nanoträger bzw. -werkzeuge nutzen zu können.

Das meist verwandte Polymer mit thermosensitiven Eigenschaften ist Poly-N-Isopropylacrylamid, das bei Temperaturen oberhalb 27°C eine Phasenentmischung aufweist, die mit einem Schrumpfungsprozess einhergeht. Diese Schrumpfung ist reversibel, d.h., beim Abkühlen unter 30°C nimmt das Polymer seine ursprüngliche Form praktisch wieder an. Diese spezielle Eigenschaft des Poly-N-Isopropylacrylamids sowie die sich daraus ableitenden interessanten Anwendungen als Medikamentendepot, Biosensor, Zellkultursubstrat, Zelleinkapselungsmatrix, Aktuator oder Ventil sind seit langem bekannt und haben ihren Ausdruck in einer Reihe von Publikationen und Patentschriften gefunden.

Die Polymerisation und das Quellverhalten von N-Isopropylacrylamid oder Copolymerisaten mit beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure, Polyethylenoxid oder Chitosan sowie die Pfropfcopolymerisation mit Silicongummi oder Polyvinylalkohol werden von Park und Hoffman, J. Biomed. Mat. Res., Vol. 24, 21, 1990, Zhang et al., Langmuir, Vol. 18, 2013, 2002, Lee und Chen, J. Appl. Polymer Sci., Vol. 82, 2487, 2001, Zhu und Napper, Langmuir, Vol. 16, 8543, 2000, Li et al., Radiat. Phys. Chem., Vol. 55, 173, 1999, Zhang und Zhuo, Eur. Polym J., Vol. 36, 2301, 2000, Serizawa et al., Macromolecules, Vol. 35, 10, 2002, Kanazawa et al., Anal. Sci., Vol. 18, 45, 2002, Asano et al., Polym. Gels & Network, Vol. 3, 281, 1995, Sayil und Okay, Polym. Bull., Vol. 45, 175, 2000, Xue et al., Polymer, Vol. 42, 3665, 2001, Maolin et al., Radiat. Phys. Chem., Vol. 57, 481, 2000, sowie Ebara et al., J. Appl. Polymer Sci., Vol. 39, 335, 2001, beschrieben. Entsprechende Nanopartikel oder Mikropartikel aus Poly-N-Isopropylacrylamid als Grundpolymer werden von Gan und Lyon, J. Am. Chem. Soc., Vol. 123, 7517, 2001, Wang et al., J. Am. Chem. Soc., Vol. 123, 11284, 2001, Gilányi et al., Langmuir, Vol. 17, 4764, 2001, West und Halas, Curr. Opinion. Biotechn., Vol. 11, 215, 2000, Matsuoka et al., Polym. Gels & Networks, Vol. 6, 319, 1998 und Jones und Lyon, Macromolecules, Vol. 33, 8301, 2000, beschrieben.

Gegenstand der Arbeit von Kondo und Fukuda, J. Ferment. Bioeng., Vol. 84, 337, 1997, sind magnetische Nanopartikel enthaltende N-Isopropylacrylamid-Copolymere. Das dort beschriebene Verfahren liefert jedoch weder eindeutige Magnetpartikel-Einkapselungen noch sphärische Partikel. Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol. 41, 99, 1994, beschreiben magnetische Polystyrolpolymere, die in einer zeitaufwendigen Zweistufenpolymerisation mit Poly-N-Isopropylacrylamid-Methacrylsäure-Copolymeren umhüllt werden. Die Produkte sind ausschließlich zur Separation von Antikörpern geeignet. Eine Wirksubstanz-Applikation in Verbindung mit einer induktiv gesteuerten Freigabe derselben, wie es Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, sind bei beiden Produkten nicht realisierbar.

Edelmann et al., J. Biomed. Mat. Res., Vol. 21, 339, 1987, beschreiben ein Ethylen-Vinylacetat Copolymer, in das millimetergroße Magnete eingebettet sind. Durch ein oszillierendes Magnetfeld wird eingekapseltes Serum Albumin freigesetzt. Da es sich bei dem Polymeren und den eingekapselten Magneten um relativ große makroskopische Gebilde handelt, die nur per Implantation appliziert werden können und danach auch nicht aus dem Körper von selbst ausgeschieden werden, bleiben diesem Verfahren breite in vivo Anwendungen verschlossen.

In den US Patenten 4,832,466, 6,165,389, 6,187,599, 5,898,004, 5,854,078, 6,094,273, 6,097,530, 5,711,884 und 6,014,246 werden thermosensitive optische Systeme in Form von Filtern oder Schalter u.a. unter Verwendung von Poly-N-Isopropylacrylamid Nanopartikeln offenbart.

In den US Patentanmeldungen 20020032246, 20020031841, 20010026946 werden u.a. thermosensitive Hydrogele u.a. auf der Basis von N-Isopropylacrylamid für die Separation von Makromolekülen, zur colorimetrischen Detektion von Analyten oder als Sensoren zur Bestimmung chemischer Verbindungen beschrieben.

Thermo- und pH-sensitive Polymergele u.a. aus N-Isopropylacrylamid, Hydroxyalkylcellulose, Polyethylenoxid, Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Dextran, Alkylcellulose, Block-Polymeren aus Polyoxyethylen, Polyoxypropylen, Polyacrylsäure, Ethylendiamin z.B. als Träger für biologisch-aktive Substanzen gehen aus den US-Patenten 5,674,521, 5,441,732, 5,252,318, 5,599,534, 5,618,800 und 5,840,338 hervor.

Temperatur- und pH-sensitive Polymere aus sich durchdringenden Polymernetzwerken, die u.a. aus Acrylaten, Acrylamiden, Urethanen oder Methacrylaten und Blockcopolymeren aus Polyoxyethylen oder Polyoxypropylen bestehen, sind Gegenstand des US Patentes 5,939,485. Im US-Patent 5,998,588 werden licht-, tmperatur- und pH-sensitive interaktive Stimulus-Response Molekülkonjugate aus Poly-N-Isopropylacrylamid für assays oder Separationen beschrieben.

Ebenfalls pH-, licht und temperaturempfindliche Lipid beschichtete Mikropartikel sowie Mikroteilchen und Liposome aus N-substituierten Polyacrylamiden als Medikamentendepot sind in den US-Patenten 5,753,261, 5,226,902 und 5,053,228 offenbart.

Einen thermisch induzierten Phasen-Separations-Immunoassay unter Verwendung von Poly-N-isopropylacrylamid-Copolymeren zur Detektion von Medikamenten, Hormonen, Vitaminen, Proteinen, Metaboliten, Zellen, Viren, Mikroorganismen und Antikörpern wird in US-Patent 4,780,409 offenbart.

Die Synthese und Anwendung von Antikörper-Polymer-Konjugaten ausgehend von N-Hydroxysuccinimid-Acrylaten im Rahmen des Immunoassays sowie für analytische Zwecke werden in den US-Patenten 4,752,638 und 4,609,707 veröffentlicht.

Rezeptoren, Antikörper, Proteine, Medikamente oder Nukleinsäure enthaltendes temperatursensitives Poly-N-Isopropylacrylamid oder Poly-N-Isopropylacrylamid-Copolymere, die in der Lage sind, u.a. Wirkstoffe freizugeben sind Gegenstand des US-Patentes 4,912,032. Alginat-Beads als orale Medikamentendepot wird in US-Patent 5,451,411 beschrieben. Bioabbaubare Form-Gedächtnis-Polymere („shape-memory-polymer"), die aus Hart- und Weichpolymersegmenten bestehen und deren ursprüngliche Form durch Erwärmen auf oberhalb der Glastemperatur wiederhergestellt werden können, gehen aus dem US Patent 6,160,084 hervor.

Allen vorgenannten, hier als Referenz aufgeführten Mitteln bzw. Produkten ist gemeinsam, daß diese, soweit es sich um nicht-magnetische Polymerträger handelt, nur durch direkt von außen zugeführte Wärme zu einer Änderung der physikalischen Struktur oder Form veranlaßt werden können oder, sofern es magnetische Träger sind, weder durch einen äußeren Stimulus noch durch von außen zugeführte Energie strukturell in irgendeiner Weise veränderbar sind. Weiterhin handelt es sich bei den aus dem Stand der Technik bekannten "stimulus-response"-Trägern entweder um unregelmäßige Nanopartikel oder größervolumige Massepolymerisate, die sich nicht als Träger von Wirksubstanzen (Pharmaka), als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik (Magnetresonanztomograph), als Medien für die Molekülauftrennung oder als steuerbare Mikrowerkzeuge für in vivo Applikationen eignen.

In der Anmeldung PCT/EP 03/05614 sind induktiv aufheizbare thermosensitive Polymerträger auf der Basis von N-Isopropylacrylamid und Acrylamid-Derivaten beschrieben, die aufgrund eines induktiven Stimulus dazu veranlaßt werden, eingekapselte Biosubstanzen oder Pharmaka freizugeben.

Nachteil der dort beschriebenen Mittel ist die Verwendung von Acrylamid-Derivaten. Diese Verbindungsklasse ist physiologisch nicht unbedenklich, da bei der Polymerisation nicht auszuschließen ist, dass nicht vollständig abreagierte Monomere oder Oligomere in dem Polymeren noch vorhanden sind. Diese Monomeren vor allem, die als hochtoxisch gelten, können bei einer möglichen in vivo Applikation aus dem Polymeren heraus diffundieren. Insofern sind Pharmakaträger aus diesen Polymeren für in vivo Applikationen nur sehr eingeschränkt verwendbar.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, thermosensitive und biokompatible Polymerträger herzustellen, die sich durch hohe Bioverträglichkeiten oder Bioabbaubarkeiten auszeichnen und die durch Energiezufuhr in Form der magnetischen Induktion gezielt so stimuliert werden können, dass aufgrund der daraus resultierenden Erwärmung eine Änderung der physikalischen Struktur der Polymermatrix herbeigeführt wird. Unter „Änderung der physikalischen Struktur" wird dabei erfindungsgemäß die Veränderung der ursprünglichen Molekülkonfiguration einschließlich der Konformation aufgrund eines Quellungs- oder Entquellungsprozesses, der zu einer Veränderung der geometrischen Form, des Volumens oder der Teilchengröße des Polymerträgers führt, definiert. Die Volumenänderung kann sich z.B. in einem Schrumpfungs- oder Quellungsprozess mit paralleler Veränderung der Porengröße oder in einer Veränderung der äußeren Form (Geometrie) des Polymeren manifestieren. Veränderung der physikalischen Struktur kann auch die Rückkehr der Molekülkonfiguration in seine ursprüngliche Form bedeuten, die durch einen Erwärmungs- und Abkühlungsvorgang (Einfrierprozess) zwischenzeitlich verändert wurde (Form-Gedächtnis-Polymer, „shape-memory-polymer").

Da die Konfigurationsveränderung der erfindungsgemäßen Polymeren im Bereich von 27– 50°C liegt, also auch im Bereich der Körpertemperatur (37°C), können diese Träger in vivo angewendet werden. Um die Polymeren als Träger für therapeutische, analytische oder diagnostische Applikationen nutzbar zu machen, besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung darin, Wirksubstanzen oder Pharmaka in die Polymerträger einzukapseln und nach entsprechender in vivo Verabreichung mit Hilfe der magnetischen Induktion gezielt und steuerbar zu applizieren.

Die Kombination der magnetfeldinduzierten Erwärmung biokompatibler, thermosensitiver Polymerträger mit paralleler Änderung der physikalischen Struktur bzw. Trägergeometrie eröffnet ein Eigenschaftsspektrum, das über das bisheriger Polymerträgersysteme substantiell hinausgeht.

Die Aufgabe der gezielten Freigabe der eingekapselten bioaktiven Substanzen oder Pharmaka wird durch Erwärmung thermosensitiver Polymeren mittels magnetischer Induktion, d.h. durch ein von außen angelegtes hochfrequentes magnetisches Wechselfeld gelöst, indem in die Polymermatrix magnetische und/oder metallische Substanzen eingekapselt werden, die aus dem Magnetfeld Energie absorbieren und dadurch den Polymerträger über Körpertemperatur aufheizen können.

Die Aufgabe wird gemäß der Erfindung weiterhin dadurch gelöst, dass spezielle Polymere und Copolymere auf der Basis von Polyethern, Polyoxyethylenen, Polypropylenoxiden, Polyethylenglykolen, Polylactiden, Polyglycoliden, Gelatine, Chitosan, Polysacchariden oder Polysaccharid-Derivaten oder (Block)copolymeren dieser Substanzen synthetisiert werden, die auf den Wärmestimulus mit einer Veränderung ihrer Molekülkonfiguration reagieren, die sich beispielsweise in einer Teilchengrößenreduktion (Schrumpfung) manifestiert.

Ausgangspunkt für die Synthese thermosensitiver Polymerträger sind magnetische Kolloide in Form ferromagnetischer, ferrimagnetischer oder superparamagnetischer Nano- oder Mikropartikel, die eine hohe Magnetisierung aufweisen und sich in einem magnetischen Wechselfeld induktiv aufheizen lassen. Die zu diesem Zweck vorzugsweise verwendete Substanz ist Magnetit (Fe₃O₄) oder γ-Fe₂O₃. Die Herstellung solcher Verbindungen ist aus dem Stand der Technik allgemein bekannt: Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 41, 99, 1994, Khalafalla und Reimers, IEEE Trans. Magn., Vol. 16, 178, 1980, Lee et al., IEEE Trans. Magn., Vol. 28, 3180, 1992, Buske et al., Colloids & Surfaces, Vol. 12, 195, 1984.

Kolloidale Dispersionen aus Magnetit oder γ-Fe₂O₃ ohne Anwendung irgendwelcher Stabilisatoren wurden von Kang et al., Chem. Mater., Vol. 8, 2209, 1996, beschrieben. Ähnliche magnetische Kolloide, die vorwiegend aus Magnetit, Eisenoxid (Fe₂O₃) oder Eisenoxyhydroxid (FeOOH) bestehen und eine Partikelgröße von 5–100 nm aufweisen und u.a. als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik, als Informationsspeichermedien, Abdicht- oder Dämpfmittel oder zur Zellmarkierung Verwendung finden, gehen aus den folgenden Patentschriften – hier als Referenz beigefügt – hervor: US Patente 5,492,814, 5,221,322, 4,647,447, 4,827,945, 4,329,241, 3,215,572, 3,917,538, DE-OS 350 8000, DE-OS 39 33 210, DE-OS 39 33 210, EP 0 275 285 , PCT/IL99/00275, EP 0 586 052 .

Weitere Substanzen, die die oben beschriebenen Eigenschaften erfüllen und damit für eine Einkapselung in eine Polymermatrix geeignet sind, sind z.B. Ferrite der allgemeinen Formel MOFe₂O₃, worin M ein zweiwertiges Metallion oder ein Gemisch aus zwei zweiwertigen Metallionen oder metallisches Nickel oder Kobalt ist.

Zur Herstellung von Magnetit oder γ-Fe₂O₃ wird durchweg von Eisen(III)- und Eisen(II)-Salzlösungen mit variierenden molaren Verhältnissen (2:1, 0,5:1 bis 4:1) ausgegangen, die anschließend durch Zugabe von Basen oder durch Hitzezufuhr in entsprechend kolloidale Magnetdispersionen („Magnetkolloide") überführt werden. Um eine besonders durch die vander-Waals'schen Kräfte bedingte Agglomeration der feinen Magnetpartikel zu verhindern, können oberflächenaktive Stoffe zugesetzt werden, die allgemein unter der Bezeichnung „Tenside", „Emulgatoren" oder „Stabilisatoren" bekannt sind, die ein Absetzen des Kolloids in einer wäßrigen Dispersion praktisch verhindert. Solche stabilisierten kolloidalen Dispersionen sind auch unter der Bezeichnung „Ferrofluide" bekannt (vgl. Kaiser und Miskolczy, J. Appl. Phys., 413, 1064, 1970). Sie werden heute auch kommerziell angeboten (Ferrofluidics Corp., USA; Advanced Magnetics, USA; Taibo Co, Japan; Liquids Research Ltd., Wales; Schering AG, Deutschland).

Die verwendeten Stabilisatoren sind entweder kationischer-, anionischer oder nicht-ionischer Natur. Geeignete Verbindungen hierfür sind z.B.: Ölsäure, Laurylsulfonat, Phosphatester, Alkoholethersulfate, Alkylarylpolyethersulfate, Alkylarylpolyethersulfonate, Zitrate, Alkylnaphtalensulfonate, Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylsäure oder Petroliumsulfonate als anionische Substanzen, Dodecyltrimethylammoniumchlorid als kationisches Tensid sowie Nonylphenoxypolyglycidol, Polyvinylalkohol, Kerosin, Alkylaryloxypolyethoxyethanole, Nonylphenol oder Polyethylenglykole als nicht-ionische Substanzen. Die Teilchengrößen der mit Hilfe der vorgenannten Präparationsweisen dargestellten Magnetkolloide hängen, wie allgemein bekannt (s. zitierte Referenzen), von verschiedenen Versuchsparametern wie dem Eisensalzverhältnis, der Basenkonzentration, des pH-Wertes sowie der Temperatur ab.

Die für die erfindungsgemäßen Mittel geeigneten Magnetkolloide weisen durchweg eine Teilchengröße von 5–800 nm, vorzugsweise eine solche von 10–200 nm auf. Dadurch ist gewährleistet, daß die Magnetkolloide bei der anschließenden Einkapselung in die Polymermatrix in kolloiddisperser Form vorliegen. Durch gezielte Zudosierung der entsprechenden Mengen des betreffenden Kolloids lassen sich die magnetischen Eigenschaften und analog damit die Aufheizeigenschaften des Polymerträger gezielt steuern.

Die Konzentrationen der Magnetkolloide im Monomer- bzw. Polymeransatz betragen in der Regel 10 bis 40 Vol.%, wobei der Feststoffgehalt der Magnetsubstanz, bezogen auf die Polymerphase, im allgemeinen 5 bis 40 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 30% beträgt.

Neben den magnetischen Kolloiden können alternativ auch metallische Kolloide in die Polymermatrix eingekapselt werden. Grundsätzlich sind hierfür alle metallischen Werkstoffe in kolloidaler- bzw. fein dispersiver Form geeignet, die sich in einem hochfrequenten Wechselfeld induktiv aufheizen lassen. Da die physiologischen Applikationen bei den erfindungsgemäßen Mitteln einen wesentlichen Aspekt darstellen, werden bevorzugt solche induktiv aufheizbaren Metallkolloide eingesetzt, die physiologisch unbedenklich und/oder chemisch-physikalisch inert sind. Hierzu zählen die Metalle der Gruppe 8 bis 11 (IUPAC Bezeichnung 1986), wobei bevorzugt Gold-, Silber-, Palladium- und Platin-Kolloide oder entsprechende Pulver wegen ihrer Biokompatibilität zum Einsatz gelangen.

Die für die erfindungsgemäßen Mittel eingesetzten Metallkolloide weisen in der Regel eine Partikelgröße zwischen 5 und 200 nm auf. Die Herstellung solcher Kolloide, die seit langem wegen ihrer speziellen Absorptionseigenschaften im sichtbaren Bereich in der Bioanalytik zur Bestimmung von Proteinen und Nukleinsäuren eingesetzt werden, hier vor allem die Goldkolloide, sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt: Ackerman et al., J. Histochem. Cytochem., Vol. 31, 433, 1983, Geoghagen et al., J. Histochem. Cytochem., Vol. 24, 1187, 1977, Wang et al., Histochem., Vol. 83, 109, 1985, Birell et al., J. Histochem. Cytochem., Vol. 35, 843, 1987, Köhler et al., Sensors & Actuators B, Vol. 76, 166, 2001, Moeremans et al., Anal. Biochem., Vol. 145, 315, 1985, Englebienne, Analyst, Vol. 123, 1599, 1998, sowie US Patent 6,361,944. Sie werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet hinlänglich bekannt, durchweg durch Reduktion der entsprechenden Metallsalze oder durch Metallsprühverfahren gewonnen. Metallkolloide oder -Pulver werden darüber hinaus auch vielfältig kommerziell angeboten.

Für die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren können sowohl die Metallkolloide als auch die entsprechenden Pulver eingesetzt werden, die dem Polymeransatz in der gewünschten Konzentration zugemischt werden. Der Metallanteil in dem Polymeren bzw. in den Partikeln beträgt in der Regel zwischen 5 und 40Gew.%.

Nach der Zugabe der Kolloide ist es häufig von Vorteil, die Magnetkolloid-Polymermischung kurzzeitig mit Hilfe eines Ultraschallfingers oder in einem Ultraschallbad zu beschallen, um eine feine Dispersion des Kolloides zu erreichen. Durch die feindisperse Verteilung des Kolloids ist eine entsprechend homogene Wärmeverteilung in der Polymermatrix möglich, die ihrerseits eine kontinuierliche Freisetzung der eingekapselten Wirksubstanz gewährleistet.

Als thermosensitive Substanzen mit hoher Biokompatibilität kommen Polyethylenoxide, Polylactide, Polyglycolide, Polysaccharide, Polysaccharid-Derivate, Polyaminosäuren, Polyether, Chitosan, Polyvinylalkohol, Alginat, Gelatine oder Copolymere oder Blockcopolymere dieser Substanzen zum Einsatz.

Zur Herstellung der thermosensitiven Polymeren kommen je nach Polymerart folgende Verfahren zum Einsatz:

a) Ringöffnende Polymerisation
b) Suspensionspräzipitation
c) Suspensionsvernetzungsverfahren
d) Ionische Vernetzung in Suspension
e) Aussalz-Emulsionsverfahren
f) Solvent-Evaporationsverfahren

Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt: Li et al., J. Microencapsulation, Vol. 15, 163, 1998; Quellec et al., J. Biomed. Mat. Res. Vol. 42, 45, 1998; Hua et al., J. Mater. Sci. Vol. 36, 731, 2001; Kriwet et al., J. Contr. Release, Vol. 56, 149, 1998; Chu et al., Polym, Bull., Vol. 44, 337, 2000; Zweers et al., J. Biomed. Mater. Res., Appl. Biomater. Vol. 668, 559, 2003; „Methods in Enzymology", Vol. 112, Part A, Widder und Green Hrgs., Academic Press, Inc., Orlando, 1985.

Mikropartikuläre Pharmakaträger auf Poly(lactid)- und Poly(lactid-co-glycolid)-Basis können nach den bekannten Verfahren, wie sie von Suzuki und Price, J. Pharm. Sci. Vol. 74, 21 ,1985, Wakiyama et al., Chem. Pharm. Bull. Vol 29, 3363, 1981, Bodmeier et al., Microencapsulation Vol. 4, 279, 1987, Doelker et al. EP 0 363 549, 1990 sowie Sanders et al., J. Pharm. Sci., Vol 73, 1294, 1984, beschrieben sind, mit Hilfe des Solvent-Evaporations-, Phasenseparations- oder Sprühverfahrens oder Aussalztechnik hergestellt werden. Dabei kann bei letzterem Verfahren gänzlich auf die Verwendung von Lösungsmittel verzichtet werden. Das grundlegende Prinzip dieser Verfahrensweise ist die Verwendung wasserlöslicher organischer Lösungsmittel, Aceton z.B., die in einer mit einem Salz gesättigten wäßrigen Phase emulgiert werden. Beim Solvent-Evaporationsverfahren geht man vorzugsweise von einer wäßrigen Lösung des einzukapselnden Wirkstoffes aus, der anschließend in der Polymerphase dispergiert wird. Alternativ können die Wirkstoffe auch direkt in der Polymerphase dispergiert. Durch anschließende Zugabe von Nichtlösemitteln – vorzugsweise Pflanzen- oder Mineralöle – wird der Polymerträger an der Grenzphase ausgefällt. Als Lösungsmittel für die Polymeren werden vorzugsweise Aceton, Benzol und Methylenchlorid oder Chloroform für die Poly(lactid-co-glycolid)-Copolymeren verwendet. Zur besseren Stabilisierung der Kolloide können 0,1 bis 1Mol% (bezogen auf das Polymere) Proteine oder synthetische Polymere wie z.B. Serum Albumin, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon zugesetzt werden.

Für die Synthese der erfindungsgemäßen magnetischen Träger werden der Polymerphase in der Regel 5 bis 40Vol%, vorzugsweise 20–40%, eines Ferrofluides auf organischer Basis zugesetzt. Ein weiterer Vorzug der Polymeren auf Poly(lactid)-Basis ist ihre Bioabbaubarkeit über Monate hinweg, wobei das Polymere innerhalb von Monaten hydrolysiert und die Hydrolysate anschließend metabolisiert werden.

Eine weitere Gruppe thermosensitiver, biokompatibler Polymerträger leitet sich von Poly(ethylenglycol-lactid-ethylenglycol)-Blockcopolymeren ab. Deren besondere Eigenschaften bestehen darin, oberhalb von ca. 35°C von einem flüssigen Zustand in einen festen gelartigen Zustand überzugehen. Dieser Phasenübergang kann nun überraschenderweise dazu genutzt werden, thermosensitive, magnetische Nanopartikel herzustellen. Dazu werden magnetische Nanopartikel bzw. Magnetkolloide, vorzugsweise mit einer Teilchengröße zwischen 5 und 100 nm, in einer 10 bis 30%igen wäßrigen Lösung des Polymeren dispergiert und anschließend mit einem Ultraschallfinger 10 bis 120 Sekunden bei Temperaturen < 15°C behandelt. Dabei entstehen Magnetpartikel, die mit dem Poly(ethylenglycol-lactid-ethylenglycol)-Blockcopolymeren umhüllt sind und so stabile Kolloide bilden. Diese Kolloide können dann aufgrund ihrer besonderen Gelierungseigenschaften für die Behandlung von Tumoren und Metastasen genutzt werden, indem die bei Raumtemperatur niederviskosen Kolloide direkt in das Tumorgewebe eingespritzt werden. Durch die anschließende induktive Erwärmung des Kolloids auf oberhalb Körpertemperatur (> 37°C) tritt eine Verfestigung des Kolloids zu einem Gel ein. Infolge der wärmeinduzierten Gelierung können die blutzuführenden Gefäßsysteme blockiert und das weitere Tumorwachstum unterdrückt werden.

Mit Hilfe der Suspensionspräzipitation ergibt sich eine weitere Polymerart, die die erfindungsgemäßen Kriterien der Biokompatibilität und Thermosensitivität erfüllt. Zu dieser Gruppe zählen solche Polymere, die in einem bestimmten Lösungsmittel nur in der Hitze löslich sind, beim Abkühlen des Lösungsmittels jedoch ausfallen. Polymer-Lösungsmittelsysteme, die für diese Synthesetechnologie in Frage kommen, sind folgende, die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele: Polyvinylalkohol-Dimethylformamid, Polyvinylalkohol-Ethylenglykol, Gelatine-Wasser, Agarose-Wasser, Cellulosetributyrat- Ethanol, Celluloseacetatbutyrat-Methanol, Celluloseacetatbutyrat-Toluol, Stärke-Wasser, Cellulose-ZnCl₂-Lösung, Kollagen-Wasser.

Um zu sphärischen Partikeln zu gelangen, werden die bei höheren Temperaturen gelösten Polymeren in einem nicht mit der Polymerphase mischbaren organischen Phase dispergiert. Pflanzenöle oder Mineralöle, die in der Regel eine Viskosität zwischen 40 und 400 cp aufweisen, sind dafür bevorzugt geeignet. Beim anschließenden Abkühlungsprozess auf Raumtemperatur bzw. Temperaturen < 40°C fallen diese Polymeren als sphärische Partikel aus.

Durch Zumischen magnetischer Kolloide bzw. Ferrofluide, die mit der Polymerphase stabile Dispersionen bilden, sowie Pharmaka. z.B. in Form von Zytostatika, werden magnetische Pharmakaträger erhalten.

Durch die magnetfeldinduzierte Erwärmung dieser Polymerträger kommt es zu einem ausgeprägten Aufquellungsprozess, der eine konzentrierte Freisetzung der eingekapselten Pharmaka zur Folge hat. Die Freisetzungskinetik ist dabei sowohl abhängig von der Molmasse des Polymeren als auch von dem Magnetkolloid-Gehalt, der direkten Einfluß auf die Heizleistung ausübt. In der Regel nimmt die Quellfähigkeit mit fallender Molmasse zu und demzufolge steigen auch die Freisetzungsraten der inkorporierten Wirkstoffe.

Für die Synthese der Polymerträger mittels des Suspensionsfällungsverfahrens werden durchweg 1 bis 15%ige Polymerlösungen verwendet. Die Konzentrationen an zugesetztem Magnetkolloid beträgt in der Regel 10 bis 40Vol%, bezogen auf die Polymerphase. Als inkorporierbare Pharmaka kommen durchweg solche Substanzen in Frage, die mit den Polymerphasen stabile, homogene, d.h. nicht agglomerierende kolloidale Dispersionen ausbilden. Geeignet hierfür sind z.B. Plasmide, Peptide, Nukleinsäuren, Oligosaccharide oder Zytostatika wie z.B. Ifosfamid, Melphalan, Cyclophosphamid, Chlorambucil, Cisplatin oder Methotrexat.

In bezug auf die Qualität der Suspensionen und Teilchengeometrien (Kugelform) hat sich für alle erfindungsgemäßen Polymerträger als vorteilhaft herausgestellt, den Ölphasen ein bis drei bestimmte oberflächenaktive Substanzen zuzugeben. Beispiele für solche, die Erfindung nicht einschränkende Zusätze sind: Polyoxyethylenaddukte, Alkylsulfosuccinate, Polyoxyethylensorbitolester, Polyethylen-propylenoxid- Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, Fettalkoholglycolether-Phosphorsäureester, Sorbitan-Fettsäureester, Sucrosestearat-Palmitatester, Fettalkoholpolyethylenglykolether, Polyglycerinester, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylensorbitan-Fettsäurester und/oder Polyoxyethylensäuren. Substanzen dieser Art sind u.a. auch unter der Warenbezeichnung Hostaphat, Isofol, Synperonic, Span, Tween, Brij, Aerosol OT, Hypermer, Myrj, Triton, Arlacel, Dehymuls, Eumulgin, Renex, Lameform, Pluronic oder Tetronic im Handel erhältlich.

Um die beim Suspensionsprozess gebildeten Polymertröpfchengröße zu kleinen Werten hin zu verschieben (< 1 μm), werden der Ölphase üblicherweise 0,05–15 Gew.%, vorzugsweise 0,5 – 5 Gew.%, eines oder mehrerer Tenside zugegeben.

Diese Teilchengrößen sind vor allem für eine biomedizinische in vivo Applikation geeignet. Partikel mit einer Größe von 20–200 nm finden vorzugsweise Anwendung als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik sowie als Porogene zur Erzeugung einstellbarer Porenweiten in Membranen. Partikel mit einer Größe von 200–800 nm werden dagegen besonders als Medikamentendepot zur gezielten Applikation von Wirksubstanzen z.B. in Form therapeutischer, diagnostischer oder prophylaktischer Agenzien verwendet. Diese Partikelgrößen unterstützen die Gewebegängigkeit für in vivo Anwendungen nachhaltig.

Der Suspensionsvorgang wird üblicherweise mit Hilfe eines konventionellen KPG-Rührers oder eines Dispergierwerkzeuges bewerkstelligt. Für Teilchengrößen im Bereich von 10–500 μm genügen herkömmliche Propellerrührer mit Rührgeschwindigkeiten zwischen 600 und 1500 U/min. Teilchengrößen von < 10 μm sind in der Regel durch Rührgeschwindigkeiten von > 1500 U/min realisierbar. Dagegen kommen für Teilchengrößen < 1 μm nur Dispergierwerkzeuge mit Rührgeschwindigkeiten von > 5000 U/min. in Frage. Für diese Zwecke gelangen vor allem Rührwerkzeuge, die nach den Rotor-Stator-Prinzip funktionieren, zur Anwendung. Bei diesen hohen Rührgeschwindigkeiten sind die Experimente vorzugsweise unter Argon- oder Stickstoffatmosphäre oder im Vakuum durchzuführen, um das Einbringen von Luft, die die Suspensionsqualität negativ beeinflusst, weitestgehend auszuschalten.

Auf die Verwendung von Ölen als Suspensionsmedium kann in einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensansatz gänzlich verzichtet werden, indem man von (Meth)acrylatsubstituierten Dextranen ausgeht, die anschließend in einer Polyethylenglykol-Phase suspendiert werden. Der interessante Aspekt hierbei ist, dass man, wie aus dem Stand der Technik bekannt (Stenekes et al. Pharm. Res., Vol. 15, 557, 1998) durch Variation des Verhältnisses Dextran zu Polyethylenglykol die Größe der sich bildenden Polymerteilchen variieren kann. In der Regel werden die Teilchengrößen bei Polyethylenglykol/Dextran-Volumenverhälnissen von < 40 zu größeren Partikeln (> 10 μm) verschoben. Durch weitere Variationen u.a. des Substitutionsgrades, der Acrylat-Susbtituenten (z.B. Hydroxyethylmethacrylat, Glycidylmethacrlylat) sowie der Molmassen der verwendeten Phasen (Polyethylenglykol, Dextran) kann eine breite Palette verschiedener Polymerträger gewonnen werden. Nach Einkapselung entsprechender Magnetkolloide, wie sie oben beschrieben sind, sowie nach Einkapselung bestimmter Pharmaka (Peptide, Plasmide z.B.) können die Träger mit Hilfe der magnetfeldinduzierten Erwärmung innerhalb von 5 Minuten zu einer gezielten und konzentrierten Wirkstofffreigabe stimuliert werden.

Eine weitere Gruppe biokompatibler und thermosensitiver Trägermedien im Sinne der Erfindung leitet sich von den Liposomen ab. Liposome sind synthetisch hergestellte kugelförmige Hohlkörper (Vesikel), die aus einer Lipidschicht oder Lipid-Doppelschicht bestehenden Membran umhüllt sind (G. Gregoriadis Hrsg. „Liposome Technology", CRC Press Inc., London). Der die Biokomaptibilität unterstützende Parameter ist, dass die die Membran konstituierenden Lipide überwiegend aus Bestandteilen natürlicher Zellmembranen bestehen.

Aufgrund der Vesikel-Struktur sind die Liposome daher besonders gut geeignet, durch Einkapselung von Pharmaka oder anderen bioaktiven Substanzen wie Peptide oder Nukleinsäuren als Pharmakaträger zu fungieren. Durch Einkapselung magnetischer Kolloide bzw. Ferrofluide in die Vesikel sowie durch Kombination bestimmter Lipide konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass thermosensitive magnetische Liposome gebildet werden, die mit Hilfe der oben erläuterten Magnetfeldinduktion auf Temperatur oberhalb 37°C erwärmt werden können. Als Lipide kommen grundsätzlich alle natürlichen Lipide wie z.B. Phosphatidylcholin, Phosphatidylsäure, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Monosialoganglioside, Phosphatidylinosit, Phosphatidylserin und Sphingomyelin in Frage. Wie allgemein bekannt (s. T.M. Allen et al., Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1066, 29, 1991 und A. Gabizon et al, Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 85, 69, 1988) lassen sich die Lipid-Zusammensetzungen sowohl in bezug auf das Verhältnis untereinander als auch hinsichtlich der Konzentration in bestimmten Grenzen variieren. Beispiele für derartige Zusammensetzungen sind: Phosphatidylcholin : Cholesterin : Monosialoganglioside: 2:1: 0,14; Sphingomyelin Monosialoganglioside 1:0,07; Sphingomyelin : Monosialoganglioside : Cholesterin 2:0,13:1; Sphingomyelin : Phosphatidylcholin : Cholesterin: 1:1:1; Phosphatidylcholin : Cholesterin Phosphatidylethanolamin: 1:1:0,2. Vor allem durch Substitution mit solchen Lipiden, die die Membrankonformation stabilisieren wie z.B. Sphingomyelin kann die Phagozytose um 90% verringert werden. Auch mit Polyethylengylkol(PEG)-substituierten (pegylierten) Lipiden, PEG-Phosphatidylethanolamin z.B., kann ein analoger Effekt erzielt werden. Die molaren Verhältnisse der biokompatibilitätssteigernden Substituenten zu den übrigen Lipiden liegen zwischen 0,1 und 0,4.

Zur Herstellung von Magnetliposomen wird ein aus dem Stand der Technik bekanntes Dialyse-Verfahren (M. De Cuyper et al. Prog. Coll. Polym. Sci. Vol. 82, 353, 1990) verwandt. Dazu wird der ein nach Reimers und Khalafalla (US Patent 3,843,540, 1974) gebildetes durch Laurinsäure stabilisiertes Ferrofluid in Gegenwart eines unilamellaren Lipid-Vesikels dialysiert. Es konnte nun überraschenderweise gezeigt werden, dass sich durch induktive Auflheizung der Magnetliposome auf < 45°C die lamellare Lipidkonformation in der Weise ändert, dass eingekapselte Wirkstoffe innerhalb von 1 bis 6 Minuten zu > 60% freigesetzt werden. Durch weiteres Aufheizen auf > 50°C bricht die Vesikelstruktur gänzlich zusammen, so dass die eingekapselten Wirkstoffe innerhalb einer Minute vollständig freigegeben werden.

Zu den erfindungsgemäßen thermosensitiven und biokompatiblen Mitteln gehört auch die Gruppe der Polyoxyethylene und Polyoxypropylene sowie Copolymere dieser Stoffe mit der allgemeinen Formel HO-(CH₂-CH₂O)_x-(CH(CH₃)-CH₂O)_y-(CH₂-CH₂O)_x-H. Diese auch unter der Bezeichnung Poloxamere oder Pluronic bekannten Polymere weisen einerseits eine hohe Biokompatibilität auf, andererseits weisen sie aufgrund ihrer starken Neigung Wasserstoffbrücken auszubilden eine ausgeprägte Thermosensitivität auf. Durch gezielte Copolymerisation oder Blockcopolymerisation aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen lassen sich die kritischen Phasenübergangstemperaturen im Bereich von 20 bis 70°C einstellen derart, dass mit steigendem hydrophilen Polyoxyethylen-Anteil (> 50Mol%) der Phasenübergang zu Temperaturen > 40°C hin verschoben werden kann. Eine Alternative, die Phasenübergangstemperatur zu variieren, besteht in der Zugabe von Polyhydroxyverbindungen wie beispielsweise Sorbit, Sucrose oder Glycerin. Diese Verbindungen verschieben den Gelierungspunkt zu tieferen Temperatur (< 40°C), wohingegen Säuren oder Salze wie z.B. NaCl, Na₂SO₃, Na₂SO₄, KCl den Phasenübergang zu höheren Temperaturen verschieben (> 45°C). Durch Kombination der Polyoxyethylene und Polyoxypropylene mit Di- oder Triaminen, wie z.B. Ethylendiamin, ergibt sich eine weitere Gruppe thermosensitiver, biokompatibler Polymere der allgemeinen Formel [(R1R2)(R1R2)]=X=[(R1R2)(R1R2)]. Diese Art Polymeren sind auch unter der Bezeichnung Poloxamine bekannt. Dabei bedeuten R1 und R2 ein Polyoxyethylen- oder Polyoxypropylen-Rest und X ein polyfunktionelles Amin. Die Synthesen solcher Copolymeren sind aus dem Stand der Technik allgemein bekannt: F. Garcia Sagrado et al. Pharm. Techn. Europe, 46, Mai 1994.

Die Herstellung magnetischer Mikro- oder Nanopartikel konnte nun überraschenderweise dadurch bewerkstelligt werden, dass den wäßrigen Lösungen dieser Polymeren bzw. Copolymeren bis zu 40Vol% eines Ferrofluides auf Wasserbasis zugemischt werden. Die Mischungen werden sodann in einer mit der Polymerphase nicht mischbaren organischen Phase – vorzugsweise Öle mit einer Viskosität von 40 bis 120 cp – unter Zugabe von 0,1 bis 2 Mol% eines bi- oder trifunktionellen Vernetzers suspendiert, der in der Lage ist, die endständigen Hydroxylgruppen zu vernetzen. Beispiele hierfür sind: Cyanurchlorid, Diisocyanate, Epichlorhydrin, Dihalogenide, Carbonyldiimidazol. Die Reaktionsweisen solcher Vernetzer sind allgemeiner Stand der Technik und u.a. in „Methods of Enzymology", Mosbach Hrsg, Vol. 135, 3–170, 1987, Academic Press, Inc., Orlando, detailliert beschrieben. Das mechanische Suspendieren dieser Mischungen kann wahlweise mit einem herkömmlichen KPG Rührer oder, zur Erzielung von Nanopartikeln, vorteilhaft mit einem Dispergierwerkzeug (z.B. T25 Ultraturrax, IKA, BRD) unter Anwendungen einer Rührgeschwindigkeit > 10.000 U/min bewerkstelligt werden. Das Volumenverhältnis Polymer- zu Suspensionsphase beträgt in der Regel 0,03 bis 0,1.

Thermosensitive und biokompatible Polymerträger können überraschenderweise auch dadurch hergestellt werden, dass in wäßrigen Phasen gelöste positiv oder negativ geladener Polymere in organischer Phase suspendiert und durch anschließende Zugabe entgegengesetzt geladener Substanzen zu diskreten sphärischen Polymerteilchen verfestigt werden. Die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele hierfür sind Alginate, Chitosan, Nukleinsäuren, Proteine Polyaminosäuren. Dazu werden die Polymeren zunächst in eine 1 bis 10Gew%ige wäßrige Lösung überführt. Während der anschließenden Suspension in einer mit Wasser nicht mischbaren Phase (z.B. Pflanzen- oder Siliconöle oder chlorierte Kohlenwasserstoffe, Verhältnis Polymerphase/kontinuierliche Phase: 0,025–0,15) werden durch Zugabe entgegengesetzt geladener Substanzen die gelösten Polymeren zu sphärischen Partikeln vernetzt. Beispiele für solche vernetzend wirkenden Substanzen sind zweiwertige Salze wie z.B. Kalziumchlorid für Alginate, Nukleinsäure, Polyaminosäuren oder Polyphosphate für Chitosan.

Für die Synthese magnetischer Träger werden den Polymerlösungen Ferrofluide auf Wasserbasis zugesetzt, die mit der Polymerphase stabile, kolloiddisperse Lösungen zu bilden in der Lage sind.

Überraschenderweise können darüber hinaus auch positiv geladene Amine wie z.B. Spermin, Spermidin und Protamin, die in den Zellen vorkommenden und die DNA umhüllen, zur Herstellung sphärischer Magnetpartikel herangezogen werden. Ein bevorzugter Syntheseweg dieser Partikel geht dabei von einer 0,5 bis 10%igen Nukleinsäure-Pufferlösung (pH > 8,4) aus. Der Lösung werden 10 bis 40Vol% eines Ferrofluids auf Wasserbasis sowie wahlweise ein wasserlösliches Pharmakon oder bioaktive Substanz zugesetzt. Dieser Ansatz wird in einer mit Wasser nicht-mischbaren Phase, vorzugsweise bestehend aus Ölen mit einer Viskosität von 60 bis 100 cp, unter mechanischem Rühren suspendiert. Während des Suspensionsvorganges werden unter Zugabe von 0,1 bis 3 Mol%, bezogen auf den Nukleinsäuregehalt, die entsprechenden Amine zugesetzt, die die Nukleinsäure-Suspension zu sphärischen Partikeln verfestigen. Es fallen je nach Rührbedingungen und Nukleinsäure-Konzentrationen Partikel mit einer Größe zwischen 0,3 und 20 μm an, wobei in der Regel die Teilchengrößen mit steigender Rührgeschwindigkeit (> 3000 U/min) und fallender Nukleinsäure-Konzentration (< 5%) in den Nanometer-Bereich hin verschoben werden. Durch Zugabe von 0,1–5Gew% (bezogen auf den Nukleinsäure-Anteil) einer bioaktiven, vorzugsweise neutralen Wirksubstanz zu den Nukleinsäure-Lösungen lassen sich Pharmakaträger herstellen, die in einer Induktionsspule (15 kA/m, 0,3 MHz, 4,4 kW) innerhalb von 1 bis 5 Minuten so aufgeheizt werden, dass die eingekapselte Wirksubstanz aufgrund des partiellen Aufquelleffektes des Nukleinsäure-Trägers innerhalb der Aufheizperiode bis zu 70% freigesetzt wird.

Neben der magnetfeldinduzierten Freigabe eingekapselter Pharmaka oder bioaktiver Substanzen bieten die erfindungsgemäßen Mittel die Möglichkeit, bioaffine Liganden wie Antikörper, Zellrezeptoren, Anti-Zellrezeptor-Antikörper, Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Lektine und Antigene an die Polymerträger zu koppeln, mit denen sich die thermosensitiven Träger an bestimmte Zielsubstanzen wie Zellen, Biomoleküle, Viren, Bakterien oder Gewebekompartimente dirigieren lassen bzw. sich an diese Zielorgane gemäß dem bekannten Affinitätsprinzip selektiv anlagern. So lassen sich die Polymerträger durch Ankopplung solcher Antikörpern, die gegen die Zelloberflächenstrukturen wie z.B. CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD14, CD15, CD34 und CD45 („cluster of differentiation") gerichtet sind, spezifisch an T-Zellen, B-Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Stammzellen und Leukozyten anlagern. Für die zielgerichtete Applikation mittels ligandengekoppelter Polymerträger kommen vor allem die erfindungsgemäßen Mittel in Frage, die über funktionelle Gruppen in Form von Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen verfügen. Beispiele hier für sind die Polysaccharide, Polyvinylalkohol, Gelatine, Alginate und Polylactide.

Durch Kopplung solcher Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente, die gegen ein Tumorzellantigen gerichtet sind, ist zunächst die Voraussetzung geschaffen, die Polymerträger zielgerichtet im Tumorgewebe zu konzentrieren bzw. an die Tumorzellen anzulagern. Beispiele für solche, die Erfindung jedoch nicht einschränkende Tumormarker bzw. -Antigene sind: tumorassoziiertes Transplantationsantigen (TATA), Onkofetales Antigen, tumorspezifisches Transplantationsantigen (TSTA), p53-Protein, carzinoembryonales Antigen (CEA), Melanom-Antigene (MAGE-1, MAGE-B2, DAM-6, DAM-10), Mucin (MUC1), humaner Epidermis Rezeptor (HER-2), alpha-Fetoprotein (AFP), Helicose-Antigen (HAGE), humanes Papilloma Virus (HPV-E7), Caspase-8 (CASP-8), CD3, CD10, CD20, CD28, CD30, CD25, CD64, Interleukin-2, Interleukin-9, Mamma-CA-Antigen, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), GD2-Antigen, Melanocortin-Rezeptor (MCIR), 138H11-Antigen. Die entsprechenden Antikörper können dabei wahlweise als monoklonale oder polyklonale Antikörper, als Antikörper-Fragmente (Fab, F(ab')₂), als Einzelkettenmoleküle (scFv), als „Diabodies", „Triabodies", „Minibodies" oder bispezifische Antikörper eingesetzt werden.

Zur parallelen Behandlung der Tumore werden die aus der Krebstherapie bekannten Antitumormittel bzw. Zytostatika in die Polymerpartikel eingekapselt. Beispiele hierfür sind: Methotrexat, Cis-Platin, Cyclophosphamid, Chlorambucil, Busulfan, Fluorouracil, Doxorubicin, Ftorafur oder Konjugate dieser Substanzen mit Proteinen, Peptiden, Antikörpern oder Antikörperfragmenten. Konjugate dieser Art sind aus dem Stand der Technik bekannt: „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Reisfeld und Sell, Hrsg., Alan R. Riss, Inc., New York, 1985.

Für die kovalenten Anbindung der Bio- bzw. Affinitätsliganden oder Rezeptoren an die Polymerträger werden die bekannten Methoden zur Kopplung bioaktiver Substanzen wie Proteine, Peptide, Oligosaccharide oder Nukleinsäuren an feste Träger genutzt (vgl. „Methods in Enzymology", Mosbach Hrsg, Vol 135, Part B, Academic Press, 1987). Kopplungsagenzien, die hier zum Einsatz gelangen, sind z.B.: Tresylchlorid, Tosylchlorid, Bromcyan, Carbodiimide, Epichlorhydrin, Diisocyanat, Diisothiocyanate, 2-Fluor-1-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat, 1,4-Butandiol-diglycidyläther, N-Hydroxysuccinimid, Chlorcarbonat, Isonitril, Hydrazid, Glutaraldehyd, 1,1',-Carbonyl-diimidazol. Darüber hinaus lassen sich die Bioliganden auch über reaktive heterobifunktionelle Verbindungen, die sowohl mit den funktionellen Gruppen der Matrix (Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioliganden eine chemische Bindung eingehen können, koppeln. Beispiele im Sinne der Erfindung sind: Succinimidyl-4-(N-maleiimido-methyl)-cyclohexan-1-carboxylat, 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-(2-pyridyldithio)toluol, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, N-γ-Maleimidobutyryloxysuccinimidester, 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiopropionat. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann diese Kopplungsagenzien jeder Zeit entsprechend den Angaben in „Ullmanns Enzyclopädie der Technischen Chemie", 4. Aufl., Bd. 10, oder G.T. Hermanson, „Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996 nutzen.

Mit der zielgerichteten Applikation der erfindungsgemäßen Polymerträger in Verbindung mit einer von außen steuerbaren Strukturveränderung wird überraschenderweise auch die Möglichkeit eröffnet, neue integrale Wirkkombinationen zu nutzen. Sie bestehen darin, die Polymerpartikel als neuartige kontrastverstärkende Mittel im Rahmen der NMR-Diagnostik und parallel als Basis für eine steuerbare Wirkstoffapplikation zu verwenden. Aus dem Stand der Technik ist bekannt (DE-OS 3508000, US Patente 5,492,814 und 4,647,447), dass superparamagnetische, ferromagnetische oder paramagnetische Substanzen bei der Bildgebung im Rahmen der NMR-Diagnostik (z.B. Magnetresonanztomographie, MRT) zu einer substantiellen Kontrastvertärkung führen. Aufgrund der rezeptorspezifischen Bioligandenkopplung an die erfindungsgemäßen Mitteln können genauere Diagnosen durch bessere Lokalisation und Zuordnung pathologischer Prozesse, z.B. Erkennung von Tumoren im Frühstadium und Mikrometastasen, ermöglicht werden.

Um die vorgenannten magnetischen und metallischen Substanzen bzw. Verbindungen auf die für die analytischen, therapeutischen und diagnostischen Anwendungen relevanten Temperaturen aufheizen zu können, bedarf es einer speziellen Auslegung des Magnetfeldes im Hinblick auf die Magnetfeldstärke sowie die Frequenz. Es werden in der Regel stromdurchflossene Spulen benutzt, die von einem Hochfrequenzgenerator gespeist werden. Solche Spulensysteme und Hochfrequenzgeneratoren sind allgemeiner Stand der Technik und werden kommerziell angeboten. Die Abmessungen der Spulen richten sich nach den jeweiligen Probengrößen; sie weisen allgemein einen Durchmesser von 5 bis 30 cm und eine Länge von 5–30 cm auf. Die erforderliche Ausgangsleistung der HF-Generatoren liegt normalerweise zwischen 1,5 und 4,5 kW. Zum Aufheizen der Magnetproben können grundsätzlich zwei Generatoreinstellungen gewählt werden: a) hohe Frequenz im Bereich von 5–20 MHz bei niedriger Magnetfeldstärke von 100–500 A/m oder b) niedrige Frequenz von 0,2–0,8 MHz in Verbindung mit einer hohen Feldstärke von 1 bis 45 kA/m. Beide Feldparameterkombinationen gewährleisten eine ausreichende Heizleistung innerhalb eines kurzen Applikationszeitraumes (< 1 Min.). Auch für die Bestrahlung größer volumiger Areale, so wie es z.B. bei der Applikation medizinischer Wirkstoffe in bestimmte Körperareale der Fall ist, kann mit größeren Spulengeometrien (30–40 cm Durchmesser) durch entsprechende Erhöhung der Feldstärke auf > 15kA/m ausreichend Energie zur Aufheizung der Träger zur Verfügung gestellt werden.

Aufgrund der besonderen Produkt- und Verfahrenskombination können die erfindungsgemäßen Polymerträger im besonderen als Matrix zur Einkapselung von Wirksubstanzen sowie als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen herangezogen werden.

Unter Ausnutzung der induktiven Aufheizung werden Dosiersysteme für die Verabreichung bzw. Applikation von Wirksubstanzen für den medizinischen Bereich oder die Analytik geschaffen, die sich im besonderen durch ihre kontaktfreie Steuerbarkeit auszeichnen. Unter einer Wirksubstanz wird ein Stoff verstanden, der in irgendeiner Weise eine chemische, biochemische oder physiologische Reaktion auslöst und dabei eine therapeutische, diagnostische und/oder prophylaktische Wirkung erzeugen oder eine analytische Funktion erfüllen kann. Beispiele hierfür sind biologisch aktive Proteine oder Peptide, Enzyme, Antikörper, Antigene, Nukleinsäuren, Glykoproteine, Lektine, Oligosaccharide, Hormone, Lipide, Wachstumsfaktoren, Interleukine, Cytokine, Steroide, Vakzine, Antikoagulantien, zytostatische Agenzien, immunmodulatorische Agenzien oder Antibiotika. Dazu werden die Wirksubstanzen in die Polymerpartikel eingekapselt. Dies geschieht in der Regel durch direktes Zumischen der betreffenden Wirksubstanz zu der löslichen Polymerphase.

Die so gewonnenen, mit den betreffenden Wirksubstanzen beladenen Träger können anschließend mit Hilfe der bekannten Verabreichungsmethoden wie Injektion, Implantation, Infiltration, Diffusion, Strömung oder Punktion an die gewünschten physiologischen oder bioanalytischen Wirkorte appliziert werden. Die ortspezifische Applikation der Magnetpartikel kann noch dadurch verstärkt werden, indem die Teilchen mit Hilfe von Elektro- oder starken Permanentmagneten, die von außen an den Ziel- bzw. Wirkort angelegt werden, punktuell an die gewünschten Stellen plaziert werden können. Nachdem die Polymerteilchen ihren Wirkort erreicht haben, können sie durch Anlegen eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes auf oberhalb Körpertemperatur erwärmt werden, woraus eine Konfigurationsänderung der Polymermatrix resultiert. Dadurch wird je nach Polymer ein Quellungs- oder Entquellungsvorgang in Gang gesetzt, der eine konzentrierte und rasche Freisetzung der eingekapselten Wirkstoffe aus der Matrix auslöst.

Die Zeiten, die die Wirksubstanz benötigt, um aus dem Gel herauszudiffundieren, hängen grundsätzlich von der Größe des Polymerträgers (mikro- oder nanoskalig), dessen Molmasse, der Molmasse des Wirkstoffes sowie der erzeugten Temperatur in der Polymerkapsel ab. In der Regel benötigen nanoskalige Polymerpartikel unter sonst analogen Bedingungen (gleiche Wirksubstanz, Temperatur, Polymer) eine um den Faktor 0,1 bis 0,5 geringere Freisetzungszeit auf als entsprechende Mikragele (> 20 μm).

Neben der Nutzung der Temperaturerhöhung zum Auslösen eines Quellungs- oder Entquellungsprozesses können die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren auch in umgekehrter Weise derart genutzt werden, dass die Polymerträger bei höheren Temperaturen oberhalb Körpertemperatur in einem entquollenen (geschrumpften) Zustand appliziert werden und nach Abkühlen auf Körpertemperatur wieder in einen gequollenen Zustand übergehen. Dieses Phänomen läßt sich im Rahmen therapeutischer Antitumor-Maßnahmen anwenden. Eine der fatalen pathologischen Entwicklungen bei der Tumorentwicklung ist die Angiogenese. Hierunter versteht man allgemein eine sich stark ausbreitende Ausbildung von Blutgefäßen im Tumorgewebe. Dieser pathologische Prozess, der bisher vornehmlich medikamentös (oder operativ) behandelt wurde, kann nun überraschenderweise mit Hilfe der erfindungsgemäßen Mittel unterdrückt bzw. stark verzögert werden. Dazu werden Partikel, vorzugsweise mit einer Teilchengröße von 0,3 μm bis 5 μm, die zuvor auf Temperaturen > 45°C aufgeheizt worden sind und damit ihren maximalen Schrumpfgrad erreicht haben, in das Tumorgewebe appliziert. Infolge der anschließenden Adaptation an die Körpertemperatur beginnen die Teilchen wieder zu quellen, um schließlich ihren Gleichgewichtsquellzustand nach einigen Minuten zu erreichen. In diesem gequollenen Zustand üben die Polymerträger eine Embolisationsfunktion aus, d.h., sie sind befähigt, die Blutgefäße zu blockieren und dadurch einer Tumorbildung entgegenzuwirken. Diese spezielle Funktion auszuüben sind vor allem Polymere wie z.B. Hydroxyalkylcellulose, Isopropylcellulose, Polyoxyethylene sowie Poly(ethylenglycol-lactid-glycolid)-Copolymere befähigt. Für die Bekämpfung der Angiogenese sind in der Praxis Teilchen mit einer breiten Größenverteilung (0,3 bis 10 μm) geeignet, da hierdurch sämtliche Blutgefäßweiten integral erfasst werden können.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1
2,8 g Polyvinylalkohol, Molmasse 204 kDa, werden in 18 ml Ethylenglykol bei 120°C gelöst. Nachdem die Lösung auf 80°C heruntergekühlt ist, werden der Lösung 5 ml einer nach Reimers und Khalafalla (US Patent 3,843,540, 1974) hergestellten und mit Laurinsäure stabilisierten Ferrofluides zugesetzt. Es folgt eine fünfminütige Behandlung im Ultraschallbad. Danach läßt man die Dispersion auf 65°C herunter kühlen. Nachdem 50 mg Melphalan in der Polymerphase gelöst wurden, wird die Mischung in 100 ml auf 70°C vorgeheiztem Pflanzenöl (Viskosität 84 cp), in dem 1,5 Vol% Pluronic 6200, 0,8 Vol% Dehymuls HRE und 2Vol% Tween 85 gelöst sind, unter Rühren (2000 U/min) suspendiert. Während des Suspensionsvorganges wird das Rührgefäß mit Eis heruntergekühlt. Nach ca. 3 Minuten fallen die Polymere als perlförmige Teilchen aus. Es wird 15 Minuten weitergerührt. Danach werden 100 ml Petrolether zugefügt und die magnetische Teilchenfraktion mit Hilfe eines Handmagneten abgetrennt. Es wird 10mal abwechselnd mit Petrolether und Methanol nachgewaschen. Nach Trocknung im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 12 μm an.
Die Pharmakaträger können u.a. zur Behandlung von Mammakarzinomen eingesetzt werden.
Beispiel 2
500 mg eines analog der Vorschrift von B. Jeong et al., Colloid Surfaces B Biointerfaces Vol. 16, 185, 1999, hergestellten Triblockcopolymeren, bestehend aus Poly(ethylenglycol-lactidethylenglycol) (Mw: 11.8 KDa), werden in 4 ml 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, gelöst und anschließend 5 Min. bei 15°C in einem Ultraschallbad beschallt. Zu dieser Lösung werden 100 mg Kobalt-Ferrit-Pulver (CoFe₂O₄, mittlere Teilchengröße 259 nm), das nach einer Vorschrift von Sato et al., J. Magn. Magn. Mat., Vol. 65, 252, 1987, aus CoCl₂ und FeCl₃ hergestellt wurde, zugegeben. Die Dispersion wird sodann unter Eiskühlung mit Hilfe eines Hochleistungsultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher, 80% Amplitude) dreimal für 50 Sek. unter Eiskühlung und Stickstoffatmosphäre beschallt. Es entsteht ein stabiles Kolloid mit einer mittleren Teilchengröße von 645 nm (Messmethodik: Streulicht/Laserbeugung, Malvern MasterSizer 2000, Malvern Instruments, BRD).
Beispiel 3
Magnetische Chitosan Nanopartikel werden durch ionische Gelierung von Chitosan mit Na-Tripolyphosphat hergestellt.
Dazu werden 3,5 ml einer 0,6%igen Chitosan-Glutamat-Lösung (MW: 205 kDa) in doppelt destilliertem und entgastem Wasser, dessen pH auf 5,5 eingestellt wurde, mit 1,5 ml einer nach Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, hergestellten wäßrigen Magnet-Kolloides (mittlere Teilchengröße 26 nm) versetzt. Zu dieser Dispersion werden 2,8 ml einer 0,084 %igen Na-Tripolyphosphat Lösung, in der 3 mg/ml Gonadotropin gelöst sind, unter starkem Rühren (4500 U/min) tropfenweise zupipettiert. Nach zweiminütigem Rühren werden die Magnetteilchen auf eine mit Stahlwolle dichtgepackte Glassäule (Füllvolumen: ca. 4 ml; Innendurchmesser: 0,5 cm), die von einem 3 cm langen ringförmigen Neodym-Bor-Eisen-Magneten umgeben ist, aufgegeben. Man läßt die Mischung langsam (0,5 ml/Min.) durchtropfen. Nach dem Durchlauf wird zehnmal mit ca. 20 ml 30%igem Ethanol nachgewaschen. Dem schließt sich funfmaliges Waschen mit 0,1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.2, an, gefolgt von zehnmaligem Waschen mit bidest. Wasser. Die magnetische Polymerfraktion auf der Säule wird sodann nach Wegnahme des Magneten mit 10 ml bidest. Wasser eluiert. Das gewonnene Eluat wird anschließend gefriergetrocknet.
Es fallen Teilchen mit einer mittleren Größe von 672 nm an (Messmethodik s. Beispiel 2). Die Pharmakaträger können nach entsprechender Dispersion in physiologischer Kochsalzlösung zur Hormonbehandlung eingesetzt werden.
Beispiel 4
Eine 2,8Gew%ige Gelatine-Lösung wird durch Erwärmen auf 90°C in 1,5 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, hergestellt. Danach wird die Lösung auf 40°C gebracht. Zu dieser Lösung werden zunächst 0,5 ml Ferrofluid EMG 507 (Fa. Ferro Tec, USA) zugegeben. Die Dispersion wird danach 2 Minuten bei 40°C im Ultraschallbad beschallt. 1 ml auf 40°C erwärmte 0,05 M Na-Phosphat-Puffer-Lösung, pH 7,4, in der 0,25% Human Insulin (Fa. Sigma) sowie 0,5% Polyvinylalkohol (Mw: 22 kDa) gelöst sind, wird sodann zu der Gelatine-Ferrofluid-Dispersion zugegeben. Die resultierende Mischung wird in 80 ml, auf 40°C vorgewärmtes Pflanzenöl (Viskosität 84 cp), in dem 0.8Vol% Pluronic L61, 0.8Vol% Tetronic 1101 und 2.5Vol% Dehymuls FCE gelöst sind, gegeben und bei 12.000 U/min mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (T25 Ultraturrax, IKA, BRD) unter Stickstoffatmosphäre 2 Minuten homogenisiert. Danach wird die Dispersion mittels Eiskühlung auf < 10°C heruntergekühlt. Dabei fallen die Gelatinepartikel aus. Nach Zugabe von 50 ml Petrolether wird die magnetische Fraktion mittels eines Neodym-Bor-Eisen Handmagneten abgetrennt und zehnmal abwechselnd mit Petrolether und Ethanol nachgewaschen. Danach erfolgt fünfmaliges Waschen mit Eiswasser. Es werden Polymerteilchen mit einer mittleren Größe von 1,4 μm gewonnen (Messmethodik s. Beispiel 2).
Beispiel 5
80 mg eines nach einer Vorschrift von Zweers et al. (J. Biomed. Mater. Res. Part B, Vol. 66B, 559, 2002) hergestellten und im Vakuum getrockneten Poly(lactid-co-glycolid)s (Mw 110 kDa), werden in 4 ml Aceton gelöst. Der Lösung werden 1,5 ml des Ferrofluids DKS1S21 (Fa. Liquids Research Ltd., Wales) sowie 8 mg Cyclophosphamid zugefügt. Die Mischung wird anschließend mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (T25 Ultraturrax, IKA, BRD) bei 20.000 U/min. in 8 ml Wasser, in dem 60Gew% MgCl₂ und 2Gew% Polyvinylalkohol (Mw 22 kDa) als Stabilisator gelöst sind, eine Minute bei Raumtemperatur suspendiert. Während des Emulgiervorganges werden 7,5 ml Wasser zugesetzt und der Rührvorgang wird für 20 Sekunden fortgesetzt. Danach erfolgt die Hochgradientenmagnetfeld-Separation analog Beispiel 3. Nach dem Durchlauf (0,5 ml/Min.) wird zehnmal mit ca. 20 ml bidest. Wasser nachgewaschen. Der auf der Säule retendierte magnetische Polymerträger wird sodann nach Wegnahme des Magneten dreimal mit jeweils 1,5 ml physiologischer Kochsalzlösung eluiert. Es werden Nanopartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 483 nm gewonnen (Messmethodik s. Beispiel 2). Die eingekapselten für die Tumortherapie einsetzbaren Pharmaka können mit Hilfe eines hochfrequenten Magnetfeldes (10 kA/m, 0,8 MHz, 4,8 kW) innerhalb von 5 Minuten zu > 50% freigesetzt werden.
Beispiel 6
1,5 ml Magnetkolloid (2,2 mM Fe/ml, mittlere Teilchengröße 26 nm), das nach einer Vorschrift von Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, hergestellt wurde, werden mit 5 ml einer 0,05 M Na-Carbonat-Pufferlösung, pH 9,5, in der 10% des Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Copolymeren (Pluronic^®F68) gelöst sind, vermischt und 5 Min. in einem Ultraschallbad (500 W) unter Eiskühlung beschallt. In die Mischung wird sodann für 15 Minuten bei 20°C Stickstoff eingeleitet. Der Dispersion werden sodann 0,5 ml 0,05 M Na-Carbonat-Puffer-Lösung, pH 9,5, in der 1Gew% Somatotropin, 0,5Gew% Inosit und 0,05Gew% Human Serum Albumin gelöst sind, zugefügt. Die Mischung wird noch zwei Minuten weiter beschallt. Die Mischung wird sodann in 50 ml Sesamöl (Viskosität 153 cp) in dem 2,5 Vol% Span 60 und 1,5 Vol% Dehymuls HRE7 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/min) und Stickstoffeinleitung bei 20°C dispergiert. Während des Dispergiervorganges werden 100 μl Divinylsulfon zupipettiert. Die Mischung wird über einen Zeitraum von 2 Stunden weiter gerührt. Dem schließen sich Separation mit Hilfe des Hochgradientenmagnetfeldes sowie Waschprozesse analog Beispiel 3 an. Nach Gefriertrocknung und Dispersion in physiologischer Kochsalzlösung fallen Polymerträger mit einer mittleren Teilchengröße von 0,767 μm an.
Bei der Behandlung der Teilchen in einem magnetischen Wechselfeld (Magnetfeld: 10 kA/m; 0,6 MHz, Spulendurchmesser: 5,5 cm, 8 Windungen) wird ein Entquellungsprozess ausgelöst, der innerhalb von 5 Minuten > 45% des inkorporierten Hormons freisetzt.
Beispiel 7
Magnetliposome werden analog der von M. De Cuyper und M. Joniau beschriebenen Methode hergestellt (Eur. Biophys. J. Vol. 15, 311, 1988). Dazu werden zunächst Magnetit-Magnetkolloide (Durchmesser ca. 15 nm) nach dem Verfahren von Reimer und Khalfalla (s. Beispiel 1) hergestellt und mit Laurinsäure bei 90°C stabilisiert. 0,18 ml dieses Kolloides (61 mg Fe₃O₄/ml) werden mit 9 ml einer Vesikel Dispersion, die durch Ultraschallbehandlung mittels eines Ultraschallfingers (150 W) einer Phospholipid-Lidocain-Mischung Dimyristoylphosphatidylglycerin Na-Salz/Phosphatidylethanolamin-Polyethylengycolbiotin/Lidocain (Phospholipid-Konzentration: 8,4μM/mlmolares; Verhältnis 9/1/0,5) gewonnen wurde, für 72 h bei 37°C dialysiert (Spectra/Por Dialyse Röhrchen, Spectrum medical Industries, Los Angeles, CA, Molmassen-Ausschlußgrenze 12,000–14,000). Der Dialsyse-Puffer (5 mM N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonsäure, TES, pH 7.0) wird alle 5 Stunden ausgewechselt. Überschüssige Vesikel werden mittels der Stahlwolle gefüllten Kolonne (s. Beispiel 3) abgetrennt. Nach der Separation wird die Magnetfraktion mehrfach mit 4 ml TES-Puffer nachgewaschen. Danach werden die Magnetliposome nach Entfernen des Magneten durch dreimalige Elution mit je 2 ml Puffer-Lösung gewonnen. Das molare Verhältnis Phospholipid/Fe₃O₄ beträgt 0.69. Bei der anschließenden Behandlung der Teilchen in einem magnetischen Wechselfeld (Magnetfeld: 10 kA/m; 0,6 MHz, Spulendurchmesser: 5,5 cm, 8 Windungen) wird die vesikuläre Struktur der Liposome innerhalb von 5 Minuten aufgelöst und das eingekapselte Lidocain vollständig feigesetzt. Der Pharmakaträger kann als Lokalanästhetikum verwendet werden.
Beispiel 8
Ein Kobalt-Ferrit-Magnetkolloid (CoFe₂O₄) wird nach einer Vorschrift von Sato et al., J. Magn. Magn. Mat., Vol. 65, 252, 1987, aus CoCl₂ und FeCl₃ hergestellt und in Wasser mit Hilfe eines Hochleistungsultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher, 80% Amplitude) in Gegenwart von 0,75% Polyacrylsäure (M_w: 5,500) 30 Sek. dispergiert. 2 ml des 1,9 mM Fe/ml enthaltenden Kolloides (Teilchengröße 21 nm) werden mit 5 ml zweimal destilliertem und entgastem Wasser, in dem 5Gew% Isopropylcellulose gelöst ist, vermischt. Die Mischung wird für 10 Minuten im Ultraschallbad bei 20°C beschallt. Danach wird die Mischung in 70 ml auf 70°C vorgeheiztes Pflanzenöl (Viskosität 134 cp), in dem 1,5% Tween 80, 2,5% Pluronic PE 3100 und 2,5% Span 85 gelöst sind, mit Hilfe eines KPG Rührers (1200 U/min.) dispergiert. Es wird 10 Minuten bei dieser Temperatur weitergerührt. Während dieses Vorganges werden feste Polymerpartikel gebildet. Nach Zugabe von 100 ml Butanol wird die Magnetfraktion mittels eines Handmagneten abgetrennt und mehrfach abwechselnd mit Petrolether und Methanol nachgewaschen. Es werden Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 16 μm gewonnen.
200 mg der so hergestellten Polymerpartikel werden mit 3 ml 3.5 M NaOH und 5 ml Epichlorhydrin versetzt und 2 h bei 55°C unter intensivem Rühren umgesetzt. Danach werden die Magnetpartikel mittels eines Neodym-Eisen-Bor-Magneten abgetrennt. Das Produkt wird in ca.10 ml Wasser suspendiert und nochmals magnetisch abgetrennt. Dieser Wasch/Abtrennvorgang wird 10mal wiederholt, gefolgt von einmaligem Waschen mit Aceton. Die aktivierte Magnetpartikelfraktion wird sodann mit 2 ml 0.1 M Borat-Puffer, pH 11.4, der 10% Hexamethylendiamin enthält, bei 50°C 2 h umgesetzt. Nach magnetischer Abtrennung wird zehnmal mit Wasser nachgewaschen. Das gewonnene Produkt wird anschließend mit 2 ml 0.1 M K-Phosphat-Puffer, pH 7.0, in dem 12.5% Glutaraldehyd gelöst ist, für 2 h bei 30°C zur Reaktion gebracht. Anschließend wird über einen Zeitraum von 30 Minuten zunächst 20mal mit Wasser und dann fünfmal mit 0.1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.5, nachgewaschen. Durch dreistündige Inkubation von 1,5 ml 0.1 M Na-Phosphat-Puffer, pH 7.5, in dem 0.2 mg CD4 gelöst sind, werden Polymerpartikel gewonnen, die zur Bindung des HIV (human immunodeficiency virus) herangezogen werden können. Durch induktive Erwärmung des Virus- Magnetpartikel-Komplexes (4,8 kW, 0,5 MHz) werden innerhalb von 10 Minuten Temperaturen (> 60°C) erreicht, die die Viren abtöten können.

Claims

Thermosensitive und biokompatible, magnetische und/oder metallische Kolloide enthaltende Polymerteilchen, die mit Hilfe eines hochfrequenten magnetischen Wechselfeldes aufheizbar sind und dadurch eine Änderung ihrer physikalischen Polymerstruktur erfahren.
Thermosensitive und biokompatible, magnetische und/oder metallische Kolloide enthaltende Polymere gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erwärmung mit Hilfe einer Induktionsspule geschieht.
Thermosensitive und biokompatible, magnetische und/oder metallische Kolloide enthaltende Polymerpartikel, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der physikalischen Struktur in einem Quellungs-, Entquellungs-, Lösungs- oder Gelierungsprozess besteht.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere Polyorthoester, Polyalkylcyanacrylate, Polyglycolsäure, Polyetherester, Polycarbonate, Polyhydroxyalkanoate, Polyhydroxysäuren, Poly(ε-caprolacton), Polyaminsosäuren, Polysaccharide, Polysaccharid-(Meth)acrylatderivate, Liposome, Isopropylcellulose, Celluloseacetatbutyrat, Stärke, Stärkealkylether, Collagen, Alginat, Chitosan, Polyvinylalkohol, Gelatine, ionisch vernetzte multifunktionelle Amine oder lineare Copolymere, Pfropfcopolymere oder Blockcopolymere dieser Polymere oder aus den Polymeren gebildete Dendrimere sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere aus einem oder mehreren Copolymer(en) oder Blockcopolymer(en) bestehen.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere sphärische nano- oder mikropartikuläre Teilchen oder Fasern, Röhren oder Fäden sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der physikalischen Struktur in einer Änderung der geometrischen Form der Polymeren besteht.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der geometrischen Form in einer Rückkehr zu einer Ursprungsform besteht, die das Polymere vor einer wärmebedingten Formänderung innehatte („shape-memory-polymer").
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung der physikalischen Struktur in einer Vergrößerung oder Verkleinerung der Polymerteilchen besteht.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Kolloide ferromagnetische, superparamagnetische oder ferrimagnetische Teilchen oder Ferrite oder ein Ferrofluid mit einer Teilchengröße < 1 μm sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Kolloide eine Curie-Temperatur im Bereich von 30°C bis 100°C aufweisen.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallischen Kolloide aus Elementen der Gruppe 8, 9, 10 oder 11 (Gruppeneinteilung: neuer Vorschlag IUPAC 1986) bestehen.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Ansprüchen 1, 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen und/oder metallischen Kolloide mit (einer) oberflächenaktiven Substanz(en) stabilisiert sind, die ein Agglomerieren der Kolloide verhindern.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die oberflächenaktive(n) Substanz(en) Alkyl- und/oder Arylgruppen-tragende Sulfonsäure-, Sulfonat- oder Carboxylat-Derivate oder Polyethylenglycolderivate sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mit einem multifunktionellen Vernetzer vernetzt sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer aus der Gruppe der Dihalogenide, Diisocyanate, Diisothiocyanate, Dioxirane, Dialdehyde, Divinyl-Derivate ausgewählt ist.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Vernetzer eine Konzentration von 0,05 bis 10Mol%, bezogen auf das Polymere, aufweist.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mit Biomolekülen koppelnde, reaktive Gruppen aufweisen.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die koppelnden Gruppen mit Peptiden, Proteinen, Antikörpern, Antigenen, Enzymen, Zellrezeptor-Antikörpern, Antikörpern gegen Tumormarker, Antikörperfragmenten, künstlich hergestellten Antikörpern, abgewandelten Antikörpern, Antikörperkonjugaten, Oligosacchariden, Glykoproteinen, Lektinen, Nukleinsäuren, Streptavidin oder Biotin umgesetzt sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in den Polymeren Wirksubstanzen oder Pharmaka eingekapselt sind.
Thermosensitive und biokompatible Polymere gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die eingekapselten Wirksubstanzen oder Pharmaka aus der Gruppe Hormone, Zytostatika, Antikörper, Antikörperderivate, Antikörperfragmente, Cytokine, Immunmodulatoren, Antigene, Proteine, Peptide, Lektine, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Antisens-Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Antibiotika oder Generika ausgewählt sind.
Verfahren zur Herstellung thermosensitiver und biokompatibler, mittels magnetischer Induktion aufheizbarer Polymeren gemäß einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Polymere Polyorthoester, Polyalkylcyanacrylate, Polyglycolsäure, Polyetherester, Polycarbonate, Polyhydroxyalkanoate, Polyhydroxysäuren, Poly(ε-caprolacton), Polyaminsosäuren, Polysaccharide, Polysaccharid-(Meth)acrylatderivate, Liposome, Isopropylcellulose, Celluloseacetatbutyrat, Stärke, Stärkealkylether, Stärkederivate, Collagen, Alginat, Chitosan, Polyvinylalkohol, Gelatine, ionisch vernetzte Nukleinsäuren oder Copolymere, Pfropfcopolymere oder Blockcopolymere dieser Polymeren oder aus diesen Polymeren gebildete Dendrimere verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeren mittels ringöffnender Polymerisation, Polykondensation, radikalischer Polymerisation oder ionischer Vernetzung hergestellt werden.
Verfahren gemäß Ansprüchen 22 und 23, dadurch gekennzeichnet, dass die lösliche Polymerphase in einer nicht mit der Polymerphase mischbaren organischen Phase unter mechanischem Rühren dispergiert und mittels der Suspensionspräzipitation, des Suspensions -Vernetzungs-, des Aussalz-Emulsions- oder des Solvent-Evaporationsverfahrens zu mikro- oder nanopartikulären Teilchen verfestigt wird.
Verfahren gemäß Ansprüchen 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass magnetische und/oder metallische Kolloide der löslichen Polymerphase zugegeben werden und diese nach der Verfestigung des Polymeren in kolloiddisperser Form in der Polymermatrix vorliegen.
Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass als magnetische Kolloide ferromagnetische-, superparamagnetische- oder ferrimagnetische Substanzen oder Ferrite oder Ferrofluide mit einer Teilchengröße < 1 μm verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des zugesetzten magnetischen und/oder metallischen Kolloids 5 bis 40Gew%, bezogen auf die Polymerphase, beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass als organische Phase Mineralöle oder Pflanzenöle mit einer Viskosität von 40 bis 400 cp organische, nicht mit Wasser mischbare Lösungsmittel oder Polyethylenglykole verwendet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass in der organischen Phase 0,1 bis 10Vol% einer oder mehrerer oberflächenaktive(n) Substanz(en) gelöst wird/werden.
Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass als oberflächenaktive Substanz Alkylsulfosuccinate, Polyoxyethylenarylether, Polyoxyethylene, Polyoxyethylensorbitanester, Polyoxyethylenaddukte, Polyethylenpropylenoxid-Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyethoxyethanole, Fettalkoholpolyethylenglykolether, Polyglycerinester, Polyoxyethylenalkohole, Polyoxyethylensorbitan-Fettsäurester, Polyoxyethylensäuren oder Mischungen derselben zugesetzt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass an die Polymeren Peptide, Proteine, Antikörper, Antigene, Enzyme, Zellrezeptor-Antikörper, Antikörper gegen Tumormarker, Antikörper gegen Tumorantigene, Antikörperfragmente, künstlich hergestellte Antikörper, abgewandelte Antikörper, Antikörperkonjugate, Oligosaccharide, Glykoproteine, Lektine, Nukleinsäuren, Streptavidin oder Biotin gekoppelt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass in die Polymeren Wirksubstanzen oder Pharmaka eingekapselt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Wirksubstanz Hormone, Zytostatika, Antikörper, Cytokine, Immunmodulatoren, Antigene, Proteine, Peptide, Lektine, Glykoproteine, Nukleinsäuren, Antisense-Nukleinsäuren, Oligosaccharide, Antibiotika oder Generika verwendet werden.
Verwendung der thermosensitiven und biokompatiblen Polymere gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 als kontrastverstärkende Mittel in der NMR-Diagnostik, als Träger für Wirksubstanzen in der medizinischen Therapie und Diagnostik, als steuerbare Träger für Reaktanden, als Mittel zur Steuerung von mikrofluiden Prozessen, als Separationsmedium in der Säulenchromatographie, als Mittel zur Einstellung und Regulierung von Porengrößen in Membranen, als Mittel zur Blockierung von Blutgefäßen in der Tumorbehandlung, als künstliche Zellträger, als Separationsmedium für Nukleinsäuren, Zellen, Proteinen, Steroiden, Viren oder Bakterien.