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Die Erfindung betrifft ein konfokales Rastermikroskop zum Abrastern einer Probe mit einem Beleuchtungsstrahlengang, der mindestens eine Punktlichtquelle und eine Strahlablenkeinrichtung umfasst, und mit einem Detektionsstrahlengang, der mindestens eine Detektionslochblende und die Strahlablenkeinrichtung umfasst
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In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
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Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt.
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Idealer Weise beschreibt die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt einen Mäander. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann bei konstanter y-Position diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Die Abtastbahn weicht bei zunehmend höherer Abtastgeschwindigkeit mehr und mehr von der Mäanderform ab. Dieses Phänomen ist im Wesentlichen auf die Massenträgheit der bewegten Elemente zurückzuführen. Bei schnellem Abtasten ähnelt die Abtastbahn eher einer Sinuskurve, wobei es jedoch oft vorkommt, dass sich die Teil-Bahnkurve für die Abtastung in positive x-Richtung von der Teil-Bahnkurve bei der Abtastung in negative x-Richtung unterscheidet.
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Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealer Weise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negative x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
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Bei vielen Rastermikroskopen beinhaltet die Strahlablenkeinrichtung sogenannte Galvanometerspiegel oder zur Erzielung höherer Tastraten resonante Galvanometerspiegel. Aus der Patentschrift
US 6,449,039 B1 ist ein Laserscanmikroskop bekannt, bei dem als Strahlablenkeinrichtung ein akustooptischer Deflektor (AOD) vorgesehen ist. Während mit Galvanometerspiegeln Zeilenabtastfrequenzen von einigen hundert bis zu einigen kHz erreichbar sind, werden mit akustooptischen Strahlablenkeinrichtungen Zeilenabtastfrequenzen von mehreren 10 kHz erzielt. Aus der Offenlegungsschrift
DE 100 38 622 A1 ist ein Scanmikroskop mit Mikrospiegeln bekannt. Aufgrund der kleinen zu bewegenden Masse von Mikrospiegeln wird mit diesem Scanmikroskop eine sehr hohe Abtastrate ermöglicht.
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Die
DE 100 38 622 A1 offenbart ein Scan-Mikroskop mit einer Scaneinheit, die zumindest einen Mikrospiegel aufweist. Zum Erreichen einer gleichmäßigen Beleuchtung kann die Beleuchtungslichtleistung an die Abtastgeschwindigkeit angepasst werden, so dass die aufgrund der resonanten Bewegung der Spiegel im Normalbetrieb nicht konstante Menge an pro Rastereinheit eingetragenen Beleuchtungslichts konstant ist. Dies kann durch Einsatz eines Abschwächers oder eines akusto-optischen Filters erreicht werden.
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Die
DE 101 15 578 A1 betrifft ein Verfahren zum Ausgleich von Abbildungsfehlern, die aus den verwendeten optischen Elementen inhärenten Eigenschaften resultieren. Dazu wird zunächst die Mikroskopoptik in einem separaten Experiment vermessen, um anschließend Korrekturwerte zu bestimmen, mit Hilfe derer dann die Abtastgeschwindigkeit und/oder die Abtastbahn so beeinflusst werden, dass die Abbildungsfehler der Optiken ausgeglichen werden.
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Die
US 5 084 612 A betrifft ein Durchlichtmikroskop mit Laserbeleuchtung. Vor einem Detektor ist eine Lochblende angeordnet um einen Haloeffekt zu korrigieren bzw. die Halo zu blockieren. Beim Durchdringen des Objekts kommt es zu Streueffekten, so dass der Lichtstrahl je nachdem, welcher Punkt des Objekts gerade untersucht wird, an unterschiedlichen Stellen auf dem Detektor auftrifft. Zur Verbesserung der Abbildung wird vorgeschlagen, die Lochblende in Abhängigkeit von den Koordinaten des gerade mittels des Laserstrahls untersuchten Punkts zu verschieben. Hierzu wird zuvor eine Kalibrationsmessung am zu untersuchenden Objekt durchgeführt.
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Es hat sich gezeigt, dass die Detektionseffizienz der bekannten Scanmikroskope bei hohen und sehr hohen Abtastraten nachteiligerweise sinkt. Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Rastermikroskop anzugeben, bei dem die Detektionseffizienz weitgehend unabhängig von der Abtastrate ist.
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Diese Aufgabe wird durch ein Rastermikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Verlauf des Beleuchtungsstrahlengangs und/oder des Detektionsstrahlenganges an die Abrastergeschwindigkeit anpassbar ist.
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Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass die Veränderung des Ablenkwinkels der Strahlablenkeinrichtung während der Laufzeit eines Beleuchtungslichtphotons von der Strahlablenkeinrichtung zur Probe derzeit bis zum Aussenden eines Fluoreszenzphotons und der Laufzeit dieses Fluoreszenzphotons bis zur Strahlablenkeinrichtung bei hohen Abtastraten nicht vernachlässigt werden darf. In dieser Zeit verändert sich die Stellung der kontinuierlich schwingenden Strahlablenkeinrichtung so, dass nur noch ein Teil und im Extremfall gar kein Detektionslicht mehr, das für niedrige Abtastraten korrekt justierte Detektionspinhole trifft. Beispielsweise trifft ein Detektionslichtstrahl bei einer Abtastrate von 80 kHz bei einem maximalen Ablenkwinkel der Strahlablenkeinrichtung von 8 Grad und bei einem Lichtweg von 50 cm zwischen der Strahlablenkeinrichtung und der Probe und bei angenommenen 10 ns für den Zeitraum zwischen dem Anregen eines Fluoreszenzfarbstoffs und dem Abgeben eines Fluoreszenzphotons (mittlere Lebensdauer des angeregten Zustandes) um 8,9 µm versetzt auf die Ebene der Detektionslochblende. Der Zeitraum vom Ausgehen eines Beleuchtungslichtphotons von der Strahlablenkeinrichtung bis zum Eintreffen eines Fluoreszenzlichtphotons (Detektionslichtphotons) beträgt in diesem Beispiel 13,3 ns. In dieser Zeit ändert sich der Ablenkwinkel der Strahlablenkeinrichtung um 0,017 Grad. Eine Verschiebung von 8,9 µm entspricht bei gängigen Scanmikroskopen etwa der Hälfte des kleinsten einstellbaren Detektionslochblendendurchmessers, also etwa 10 % des Durchmessers einer Airyscheibe für derzeit verfügbare Objektive. Entsprechend dramatisch ist der Verlust an Detektionslicht.
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Das erfindungsgemäße konfokale Rastermikroskop hat den Vorteil, dass der Verlauf des Beleuchtungsstrahlengang und/oder des Detektionsstrahlenganges derart an die Abrastergeschwindigkeit anpassbar ist, dass weitgehend das gesamte von dem zu tastenden Rasterpunkten ausgehende Detektionslicht die Detektionslochblende trifft.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die Punktlichtquelle durch eine von hinten beleuchtete Beleuchtungslochblende definiert. In einer anderen vorteilhaften Variante dient ein Laser oder ein System von Lasern als Punktlichtquelle. In der Regel kann bei Verwendung von Lasern auf eine Beleuchtungslochblende verzichtet werden, da die Laser in der Regel einen resonatorinternen Fokus aufweisen und somit als Punktlichtquelle dienen können.
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In einer Ausgestaltungsvariante ist der Verlauf des Beleuchtungsstrahlenganges und/oder des Detektionsstrahlenganges fest auf eine bestimmte Abtastgeschwindigkeit einstellbar. In dieser Variante arbeitet das Rastermikroskop nur bei der bestimmten Abtastgeschwindigkeit mit optimaler Detektionseffizienz. Dies ist jedoch für viele Anwendungen durchaus ausreichend. Die Punktlichtquelle bzw. die Beleuchtungslochblende und die Detektionslochblende sind bei dieser Variante auf die bestimmte Abtastgeschwindigkeit angestimmten Positionen ortsfest angeordnet.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante sind die Punktlichtquelle (Beleuchtungslochblende) und/oder die Detektionslochblende verschiebbar angeordnet. Hierzu ist vorzugsweise eine Verschiebevorrichtung vorgesehen, die die Punktlichtquelle und/oder die Detektionslochblende in Abhängigkeit von der Abtastgeschwindigkeit verschiebt. Ganz besonders vorteilhaft ist eine Variante, bei der die Verschiebung automatisch erfolgt. Hierzu weist die Verschiebevorrichtung vorteilhafterweise einen motorischen Antrieb auf. Dieser Antrieb kann beispielsweise als Galvanometerantrieb oder vorzugsweise als schneller Piezoantrieb ausgeführt sein.
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In einer ganz besonders bevorzugten Variante verschiebt die Verschiebevorrichtung die Punktlichtquelle und/oder die Detektionslochblende synchron zum Abrastervorgang, durch die Tatsache Rechnung getragen werden kann, das die Rasterbahn entlang der der Beleuchtungslichtstrahl über bzw. durch die Probe geführt wird, mit unterschiedlichen Abtastgeschwindigkeiten durchlaufen wird. In der Regel gleicht die Abtastbahn einer Sinuskurve, wobei die Umkehrpunkte mit einer niedrigeren Abtastgeschwindigkeit durchlaufen werden, als die weitgehend linearen Teilstücke der Abtastbahn. Diese Variante ist ganz besonders vorteilhaft, da die Verläufe des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlenganges immer optimal an die aktuelle Abtastgeschwindigkeit angepasst sind. Für viele Anwendungen wird es jedoch ausreichend sein, wenn die Anpassung an eine mittlere Abtastgeschwindigkeit erfolgt.
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In einer anderen Ausführungsvariante ist zur Anpassung des Verlaufs des Beleuchtungsstrahlengangs oder des Detektionsstrahlengangs an die Abrastergeschwindigkeit ein Strahlführungselement vorgesehen. Das Strahlführungselement kann beispielsweise einen Spiegel, eine Linse, ein akustooptisches Bauteil, ein elektrooptisches Bauteil, eine Glasplatte oder ein Gitter beinhalten. Vorzugsweise ist die Anordnung und/oder die Stellung des Strahlführungselements in Abhängigkeit von der Abrastergeschwindigkeit veränderbar. Ganz besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der die Anordnung und/oder Stellung des Strahlführungselements in Abhängigkeit von der Abrastergeschwindigkeit automatisch veränderbar ist.
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Es kann auch vorgesehen sein, dass die Anordnung und/oder Stellung des Strahlführungselements synchron zum Abrastvorgang erfolgt, um, wie bereits beschrieben, eine Anpassung des Verlaufs des Beleuchtungsstrahlengangs und des Detektionsstrahlengangs an die beim Abfahren der Abtastbahn veränderliche Abrastergeschwindigkeit zu erreichen.
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Vorzugsweise ist eine Einstellvorrichtung vorgesehen, die die Veränderung der Anordnung und/oder Stellung des Strahlführungselements bewirkt. Vorteilhafterweise verfügt die Einstellvorrichtung über einen motorischen Antrieb.
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In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
- 1 ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,
- 2 eine Detailansicht eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
- 3 eine Detailansicht eines anderen erfindungsgemäßen Rastermikroskops,
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1 zeigt ein erfindungsgemäßes konfokales Rastermikroskop mit einer Punktlichtquelle 1, die aus einem Laser 3, der eine Beleuchtungslochblende 5 beleuchtet, besteht. Der durch die Beleuchtungslochblende 5 tretende Beleuchtungslichtstrahl 7 wird von einem Hauptstrahlteiler 9 zu einer Strahlablenkeinrichtung 11, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13 beinhaltet, gelenkt. Die Strahlablenkeinrichtung 11 führt den Beleuchtungslichtstrahl 7 durch die Scanoptik 15, die Tubusoptik 17 und das Objektiv 19 über bzw. durch die Probe 21. Durch die Punktlichtquelle 1, den Hauptstrahlteiler 9, die Strahlablenkeinrichtung 11 und die genannten nachfolgenden Optiken ist ein Beleuchtungsstrahlengang definiert. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht 23 gelangt durch das Objektiv 19, die Tubusoptik 17, die Scanoptik 15 und über die Strahlablenkeinrichtung 11 zurück zum Hauptstrahlteiler 9, passiert diesen und trifft anschließend auf die Detektionslochblende 25. Das durch die Detektionslochblende 25 tretende Detektionslicht wird von einem Detektor 27 detektiert. Der Detektor erzeugt zur Leistung des Detektionslichts proportionale elektrische Signale, die an eine nicht gezeigte Verarbeitungseinheit weitergegeben werden. Die Detektionslochblende 25, die Strahlablenkeinrichtung 11 sowie die zwischen der Strahlablenkeinrichtung 11 und der Probe 21 angeordneten Optiken definieren einen Detektionsstrahlengang, dessen Verlauf durch Verschieben der Detektionslochblende 25 an die Abrastergeschwindigkeit anpassbar ist. Zum Verschieben der Detektionslochblende 25 ist eine Verschiebevorrichtung 27, die einen motorischen Piezoantrieb 29 beinhaltet, vorgesehen. Die Verschiebevorrichtung 39 wird von einer Steuereinrichtung 31, die von der Strahlablenkeinrichtung Signale bezüglich der Stellung des Scanspiegels 13 empfängt, gesteuert. Es ist hierdurch ermöglicht, die Position der Detektionslochblende 25 der jeweils aktuellen Abrastergeschwindigkeit beim Durchlaufen der Scanbahn anzupassen. Die Detektionslochblende 25 führt entlang der Verschieberichtung 39 hierbei eine Oszillationsbewegung aus. Für bestimmte Anwendungen kann es ausreichend sein, die Position der Detektionslochblende 25, der mittleren Abtastgeschwindigkeit anzupassen, so dass während des Abscannens die Position der Detektionslochblende 25 konstant bleibt.
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2 zeigt eine Detailansicht eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops. Die Figur illustriert anschaulich, dass sich aufgrund der Laufzeiteffekte zwischen Scanspiegel und Probe und ggfs. auch aufgrund der verzögerten Ausstrahlung von Fluoreszenzphotonen bei Fluoreszenzfarbstoffen, das Detektionslicht 23 nach dem Passieren des Scanspiegels 13 nicht auf der selben optischen Achse 33 wie der Beleuchtungsstrahl 7 befindet. Zur Anpassung des Detektionsstrahlenganges ist die Detektionslochblende 25 seitlich versetzt zur optischen Achse 33 angeordnet, so dass der beschriebene Effekt vorteilhaft kompensiert ist.
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3 illustriert eine Detailansicht eines anderen erfindungsgemäßen Rastermikroskops. Bei diesem Rastermikroskop ist zur Anpassung des Verlaufs des Detektionsstrahlenganges an die Abrastergeschwindigkeit ein Strahlführungselement 35 vorgesehen, das eine Linse 37 beinhaltet, die das aufgrund des beschriebenen Effektes abseits der optischen Achse 33 verlaufende Detektionslicht 23 zu der Detektionslochblende 25, die auf der optischen Achse 33 angeordnet ist, lenkt.
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Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Punktlichtquelle
- 3
- Laser
- 5
- Beleuchtungslochblende
- 7
- Beleuchtungslichtstrahl
- 9
- Hauptstrahlteiler
- 11
- Strahlablenkeinrichtung
- 13
- Scanspiegel
- 15
- Scanoptik
- 17
- Tubusoptik
- 19
- Objektiv
- 21
- Probe
- 23
- Detektionslicht
- 25
- Detektionslochblende
- 27
- Detektor
- 29
- Piezoantrieb
- 31
- Steuereinrichtung
- 33
- Achse
- 35
- Strahlführungselement
- 37
- Linse
- 39
- Verschiebevorrichtung