DE10331980A1

DE10331980A1 - Verwendung von Calpain zur Identifizierung von schmerzmodulierenden Verbindungen

Info

Publication number: DE10331980A1
Application number: DE10331980A
Authority: DE
Inventors: Martin Dr. Michaelis; Gerd Prof. Dr. Geisslinger; Ellen Dr. Niederberger
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2005-02-17
Also published as: WO2005004905A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Herstellung von schmerzmodulierenden pharmazeutischen Verbindungen sowie die Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Identifizierung solcher Verbindungen und ein Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln, die zur Schmerzmodulation und/oder -vorbeugung geeignet sind.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Herstellung von schmerzmodulierenden pharmazeutischen Verbindungen sowie die Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Identifizierung solcher Verbindungen und ein Verfahren zum Screenen von Arzneimitteln, die zur Schmerzmodulation und/oder -vorbeugung geeignet sind.
Die Auswirkungen der peripheren entzündlichen Stimulation auf das Proteinexpressionsmuster im Rückenmark der Ratte wurden untersucht. Mit dem Verfahren der zweidimensionalen (2D) Gelelektrophorese wurde ein zeitabhängiger Abbau des Neurofilament-leichte-Kette-(NF-L-)Proteins nach 24, 48 bzw. 96 h einer Behandlung mit Zymosan festgestellt, was durch immunhistochemische und Western Blot-Experimente bestätigt wurde.
Da es sich bei den Neurofilamenten um Substrate der Calcium-abhängigen Cysteinprotease Calpain handelt, wurde die Rolle von Calpain bei entzündlichen und schmerzhaften Prozessen weiter analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß die periphere entzündliche Stimulation mit Zymosan zu einer Hochregulierung der Calpainaktivität und der Proteinexpression im Rückenmark der Ratte führt. Durch Hemmung der Calpain-Protolyse mit dem spezifischen Calpain-Inhibitor III (MDL-28170; 12,5 mg/kg und 25 mg/kg i.p.) wurde der Zymosan-induzierte Abbau der Neurofilamente abgeschwächt. Die Calpain-Proteinexpression wurde durch MDL-28170 nicht beeinflußt. Die chemische Struktur des Calpain-Inhibitors III ist wie folgt:
Die Wirkungen von MDL-28170 auf Entzündung und Nozizeption wurden in zwei unterschiedlichen Tiermodellen getestet. Im Modell der Zymosan-induzierten Pfotenentzündung wurde im Vergleich mit Kontrolltieren das Pfotenödem durch den Calpain-Inhibitor III (25 mg/kg) deutlich reduziert. Im thermischen Hyperalgesiemodell führte die Anwendung von Calpain-Inhibitor III zu antinozizeptiven Reaktionen. Zusammengenommen lassen diese Daten vermuten, daß Calpain bei Entzündungs- und Schmerzprozessen eine wichtige Rolle spielt und deuten daher ein therapeutisches Potential für Calpain-Inhibitoren als alternative entzündungs- und schmerzhemmende Arzneistoffe an.
Darüber hinaus wurde der Calpain-Inhibitor MDL-102935 wie für den Calpain-Inhibitor III beschrieben getestet. MDL-102935 besitzt die folgende chemische Formel:
Die Wirkungen von MDL-102935 auf Entzündung und Nozizeption sind dieselben wie die von MDL-28170. Bei MDL-102935 handelt es sich um einen Calpain-Inhibitor.

Bei der spinalen nozizeptiven Verarbeitung werden verschiedene Schmerzreize von der Peripherie von den primären Zuleitungen auf das Zentralnervensystem im Hinterhorn des Lendenmarks umgeschaltet. Eine Dauerstimulation primärer Nozizeptoren und C-Fasern, wie sie bei entzündlichen Stimulationen auftritt, löst eine erhöhte Erregbarkeit nozizeptiver Neuronen im Rückenmark aus und führt dadurch zur Hyperalgesie und Allodynie (Yaksh et al., 1999). Langzeitveränderungen bei der synaptischen Kommunikation (sogenannte Langzeitpotenzierung (long term potentiation, LTP)) werden mit Lern- und Gedächtnisvorgängen in Verbindung (Bliss et al., 1993) gebracht und können für die synaptische Plastizität sowie chronische Schmerzen verantwortlich sein (Rygh et al., 1999; Vikman et al., 2001). Durch wiederholte oder ausgedehnte schädigende Stimulation wird eine Reihe intrazellulärer Second-Messenger-Systeme aktiviert, was auf die Phosphorylierung von Membranrezeptoren und -kanälen in Schlüsselpositionen durch Proteinkinasen, insbesondere Proteinkinase C (PKC), hinweist. Diese Kinaseaktivierung führt zu posttranslationalen Veränderungen, die zu einer Erhöhung der synaptischen Effektivität führen können. Intrazelluläre Signalkaskaden führen zu einer Induktion der „immediate early genes" (IEG) (c-fos, Zif 268, Cox-2) sowie der „later response genes", die Neuropeptide sowie Neuropeptid- und Neurotrophin-Rezeptoren codieren. Diese Proteinveränderungen werden als Beginn einer weitreichenden Veränderung der Proteinsynthese und darüber hinaus als allgemeine Grundlage für die Plastizität des Nervensystems angesehen (Dubner et al., 1992; Ji et al., 1994; McCarson et al., 1994) (Beiche et al., 1996; Ji et al., 1995; Mannion et al., 1999) (Woolf et al., 1999).

In der folgenden Untersuchung wurden interzelluläre Veränderungen des Proteinexpressionsmusters, die die peripheren Entzündungszustände im Lendenmark der Ratte begleiten, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D PAGE) in Kombination mit MALDI-TOF MS untersucht. Mit diesem Verfahren wurden mehrere Proteinänderungen im Rattenmodell der Zymosan-induzierten Pfotenentzündung nachgewiesen. Diese Arbeit konzentrierte sich auf eines dieser Proteine, das als Neurofilament-leichte Kette (NF-L) identifiziert wurde. NF-L ist ein Cytoskelettprotein, das in neuronalen Zellen vorkommt, in denen es für den korrekten Zusammenbau von Neurofilamenten sowie die Aufrechterhaltung des Axon-Innendurchmessers verantwortlich ist (Sakaguchi et al., 1993). Die Desorganisation von Neurofilamenten wird mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen, wie etwa Parkinson und amyotrophe Lateralsklerose, in Zusammenhang gebracht (Julien, 1999). Zudem werden Neuronentod und neurologische Funktionsstörungen nach Rückenmarksverletzungen vom Verlust an Neurofilamentprotein begleitet (Ray et al., 2000a). Der Abbau der Neurofilamentproteine wird hauptsächlich durch die Wirkung der Protease Calpain vermittelt (Ray et al., 2000b; Schlaepfer et al., 1985; Stys et al., 2002). Bei den Calpainen handelt es sich um eine Familie ubiquitär exprimierter Calciumabhängiger Cysteinproteasen, die mit grundlegenden Zellvorgängen, einschließlich Vermehrung, Apoptose und Differenzierung, in Verbindung gebracht wurden. Viele Calpain-Substrate sind in den prä- und postsynaptischen Kompartimenten von Neuronen lokalisiert, was in zunehmendem Maße auf die Beteiligung von Calpainen an neurodegenerativen Erkrankungen und der Modulation der synaptischen Plastizität hindeutet (Chan of al., 1999). Das Calpain der Ratte wird von Thompson und Goll (Meth. Mol. Biol., Vol 144, 3–16, 2000) beschrieben. Zwei menschliche Calpain-Isoformen sind bekannt, nämlich Calpain I (embl locus HSCANPR, Zugangs-NR. X04366.1) und Calpain II (Morford et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (2), 540–546, 2002).

In der folgenden Arbeit wurde die Rolle von Calpain beim Zymosan-induzierten Abbau von Neurofilamenten ebenso wie die potentiellen entzündungshemmenden und antinozizeptiven Eigenschaften eines spezifischen Calpain-Inhibitors (MDL 28170) im allgemein eingeführten Modell der Zymosan-induzierten Pfotenentzündung untersucht.

Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß Calpain eine Rolle im Zusammenhang mit Schmerz spielt.

Eine erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in der Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Herstellung schmerzmodulierender pharmazeutischer Verbindungen.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in der Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Identifizierung schmerzmodulierender Verbindungen.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in der wie oben beschriebenen Verwendung, wobei es sich bei den pharmazeutischen Verbindungen um Verbindungen zur Schmerzvorbeugung oder -behandlung handelt und wobei insbesondere die Verbindungen Schmerzen lindern oder beseitigen.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in einem Verfahren zum Screenen von zur Schmerzmodulation und/oder -vorbeugung geeigneten Arzneimitteln, bei dem

a. zwei Proben bereitgestellt werden,
b. eine Probe, die Calpain oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon enthält, mit einer Verbindung in Kontakt gebracht,
c. die Calpainaktivität in Gegenwart der Verbindung bestimmt,
d. die Calpainaktivität in Abwesenheit der Verbindung bestimmt und
e. die Calpainaktivität gemäß (c) mit der gemäß (d) verglichen wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht in einer Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens, wobei es sich bei dem Calpain um menschliches Calpain I und/oder Calpain II handelt, insbesondere, wobei es sich bei dem Calpain um ein isoliertes Polypeptid oder Polynukleotid handelt.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einer wie oben beschriebenen Verwendung oder einem wie oben beschriebenen Verfahren, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polypeptid handelt, insbesondere, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polypeptid oder funktionelles Fragment davon handelt, das die Sequenz gemäß SEQ ID No 1 (Calpain I) oder ein Fragment davon, die Sequenz gemäß SEQ ID No 3 (Calpain II) oder ein Fragment davon enthält oder daraus besteht, oder wobei das Calpain von einem Polynukleotid, das die Sequenz gemäß SEQ ID No 2 (codiert Calpain II) oder ein Fragment davon oder die Sequenz gemäß Sequenz gemäß SEQ ID No 4 (codiert Calpain II) oder ein Fragment davon enthält oder daraus besteht, codiert wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einer wie oben beschriebenen Verwendung oder einem wie oben beschriebenen Verfahren, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polynukleotid handelt, insbesondere, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polynukleotid, das die Sequenz oder einen Teil der Sequenz, die für ein funktionelles Fragment von Calpain gemäß SEQ ID No 2 oder SEQ ID No 4 enthält oder daraus besteht, oder um ein Polynukleotid, das eine Sequenz, die mit den Polynukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, enthält oder daraus besteht, handelt, wobei vorzugsweise die funktionellen Fragmente die Aminosäuren 115 bis 272 der SEQ ID No 2 und/oder 105 bis 262 der SEQ ID No 4 enthalten oder daraus bestehen.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einem wie oben beschriebenen Verfahren, wobei eine Calpain exprimierende, vorzugsweise rekombinantes Calpain exprimierende Zelle verwendet wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einem wie oben beschriebenen Verfahren, wobei eine modifizierte Zelle, die im Vergleich mit ihrem nichtmodifizierten Zustand eine niedrigere Calpainaktivität aufweist, verwendet wird, wobei vorzugsweise eine Calpain-Knockout-Zelle verwendet wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einem wie oben beschriebenen Verfahren, wobei die Calpainaktivität direkt oder indirekt bestimmt wird.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus einem Verfahren zur Identifizierung einer schmerzmodulierenden Verbindung, bei dem

a. eine Verbindung, die die Aktivität von Calpain moduliert, als Testverbindung ausgewählt und
b. diese Testverbindung an eine Versuchsperson verabreicht wird, um zu bestimmen, ob die Schmerzen moduliert werden.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus der Verwendung von MDL-28170 (Calpain-Inhibitor III) beim Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus der Verwendung von MDL-28170 als Arzneimittel zur Schmerzbehandlung.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus der Verwendung von MDL-102935 beim Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform besteht aus der Verwendung von MDL-102935 als Arzneimittel zur Schmerzbehandlung.

Die Erfindung wird im folgenden durch die Beispiele beschrieben, durch die die Erfindung in keiner Weise auf die spezifischen Ausführungsformen der Beispiele beschränkt sein soll.

Beispiele

In den Beispielen verwendete Materialien und Methoden

Tiere

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River, Sulzbach) mit einem Gewicht von 260–300 g wurden in Gruppen von fünf Tieren in Standardkäfigen in Räumen mit Klima- und Lichtkontrolle (22 ± 0,5°C, 12/12 h Dunkel/Hell-Zyklus) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehalten. In allen Experimenten wurden die ethischen Richtlinien für Untersuchungen an Tieren bei Bewußtsein befolgt und die Vorgehensweisen durch den örtlichen Ethikausschuß genehmigt.

Zymosanbehandlung der Ratten

Eine Entzündung der Hinterpfote sowie ein Pfotenödem wurden jeweils einseitig mittels subkutaner Injektion von 1,25 mg Zymosan (Sigma, München), suspendiert in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (12,5 mg/ml), in den mittleren Bereich der Fußsohle der rechten Hinterpfote induziert. Nach 24, 48 oder 96 h wurden die Tiere betäubt und durch Herzpunktur getötet. Das Rückenmark wurde jeweils herausgeschnitten, in flüssigen Stickstoff schockgefroren und dann bis zur weiteren Analyse bei –80°C aufbewart.

Pfotenödem

Das Pfotenödem wurde durch Zymosaninjektion wie oben beschrieben induziert. Das Pfotenvolumen wurde vor sowie 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 24 h nach Zymosaninjektion mit einem Plethysmometer (Ugo Basile, Varese, Italy) gemessen. Dabei wurden sechs Ratten pro Gruppe eingesetzt. Bei jedem Zeitpunkt wurden fünf Messungen des Pfotenvolumens durchgeführt. Der Mittelwert dieser fünf Messungen wurde für die weitere Analyse verwendet.

Thermische Hyperalgesie

Die nozizeptive Latenz des Zurückziehens der Pfote gegenüber radikaler Wärme wurde nach Hargreaves (Hargreaves et al., 1988) bewertet, wobei ein spezielles, kommerziell erhältliches Gerät (Ugo Basile, Varese, Italy) verwendet wurde. Die Ratten wurden in durchsichtigen Plastikkammern (18 × 29 × 12,5 cm) auf ein Metallgitter (5 × 5 mm) gesetzt. Die aus einer starken Projektorglühbirne bestehende Wärmequelle wurde auf die Oberfläche der Fußsohlenmitte der Hinterpfote fokussiert. Bei Beginn des Tests wurden die Glühbirne und ein elektronischer Zeitmesser gleichzeitig aktiviert, und beide wurden automatisch inaktiviert, wenn ein Zurückziehen der Hinterpfote als Reaktion auf die Wärme von einer Photozelle nachgewiesen wurde. Die Latenzzeiten des Zurückziehens (paw withdrawal latencies, (PWL)) der rechten und linken Pfote (behandelte bzw. unbehandelte Pfote) wurden jeweils vor und dann alle 60 min bis zu 8 h und 24 h nach Zymosaninjektion aufgezeichnet.

Wirkstoffbehandlung

Calpain-Inhibitor III (MDL 28170) (Calbiochem, Schwalbach/Ts.) wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in PEG 400/DMSO (1:1) gelöst. Die Tiere erhielten Calpain-Inhibitor III in Form einer intraperitonealen (i.p.) Bolus-Injektion von entweder 12,5 mg/kg oder 25 mg/kg 20 min vor der intraplantaren Injektion mit Zymosan. Für jede Behandlungsgruppe wurden sechs Tiere eingesetzt (Kontrollen erhielten 1 ml Vehikel.). Den Tieren wurden die Behandlungen willkürlich zugewiesen, wobei den Beobachtern diese Zuweisung unbekannt war.

Datenanalyse und Statistik

Der relative prozentuale Unterschied in der Latenz des Zurückziehens der Pfote (ΔPWL) zwischen der mit Zymosan behandelten rechten und der unbehandelten linken Hinterpfote, berechnet als: ΔPWL = (rechts – links)/links × 100, wurde zur Bewertung der antinozizeptiven Wirkungen verwendet. Zur Beurteilung der entzündungshemmenden Wirkungen wurde der relative Unterschied zwischen dem Pfotenvolumen vor und nach Zymosaninjektion (ΔPV) verwendet. Die Flächen unterhalb der ΔPWL-Zeit-Kurven (AUC_ΔPWL) wurden ebenso wie die Flächen unterhalb der ΔPV-Zeit-Kurven (AUC_ΔPV) unter Anwendung der linearen Trapezoidregel berechnet. Die statistische Auslesewertung wurde mit SPSS 9,02 für Windows durchgeführt. Die Wirkungen der in der Arbeit durchgeführten Medikationen wurden bewertet, indem der AUC_ΔPV-Wert von 0–8 h einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) mit nachfolgenden T-Tests unter Verwendung einer Bonferroni ⎕-Korrektur für Mehrfachvergleiche unterzogen wurde. Die statistische Signifikanz von ΔPWL wurde mit dem ungepaarten Student-T-Test berechnet (Zymosan-behandelte Ratten gegen Kontrollratten). ⎕ wurde auf 0,05 festgelegt.

2D-PAGE

Die Lendenmarksgewebe wurden in Lysepuffer mit 9 M Harnstoff, 2% CHAPS, 1 DTT und 2 mM Pefabloc homogenisiert. Nach Entfernen der Zelltrümmer wurden die Extrakte 1 h bei 40'000 rpm ultrazentrifugiert (15°C), und der Überstand wurde bis zur weiteren Analyse bei –70°C aufbewahrt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Bradford-Proteinassay bestimmt.

Die 2D-PAGE wurde mit leichten Modifikationen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Gorg et al., 1995). In Kürze: für die erste Dimension (isoelektrische Fokussierung (IEF)) wurden 600 μg Protein mit 50% TCA bei –20°C ausgefällt. Das Pellet wurde in Rehydrationslösung (8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 2,8% DTT und 0,5% IPG-Puffer (Amersham Biosciences, Freiburg) gelöst und auf 13 cm lange Immobiline DryStrips, pH 3–10 linear (Amersham Biosciences, Freiburg) aufgetragen. Die IEF wurde unter Verwendung des isoelektrischen Fokussierungssystems IPGphor von Amersham durchgeführt, wobei der Lauf wie folgt durchgeführt wurde: Rehydration 2 h, 30 V für 6 h, 60 V für 3 h, 200 V für 1 h, 500 V für 1 h, 5000 V für 4 h und 8000 V für 1 h. Nach der IEF wurden die IPG-Streifen 10 min in Equilibrierungspufter (1,5 M Tris-Cl pH 8,8, 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS) unter Zugabe von 10% DTT und danach weitere 10 min in Equilibrierungspuffer mit 260 mM Iodacetamid equilibriert. Die IPG-Streifen wurden dann oben auf ein 13%iges Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel gelegt und mit 1 %iger Agaroselösung abgedichtet. Die Elektrophorese in der zweiten Dimension wurde 1 h bei 2,5 W/Gel und danach 4 h bei 5 W/Gel durchgeführt. Die Gele wurden mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Die gefärbten Gele wurden mit einem UMAX-PowerLookIII-Scanner abgebildet und mit der Software Image Master 2D analysiert (Amersham Biosciences, Freiburg). Die mit Coomassie gefärbten gewünschten Spots wurden aus den Gelen ausgeschnitten, die Proteine wurden verdaut und danach mittels Peptid-Massen-Fingerprinting unter Verwendung der matrixunterstützten Laserdesorption/Ionisation-Time Of Flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) identifiziert.

Immunoblot-Analyse

Die aus homogenisierten Rückenmarksgeweben extrahierten äquivalenten Mengen an Gesamtzellproteinen wurden mit 4 × Probenpuffer (1 × Probenpuffer besteht aus 2,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2,5% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin und einer Spur Bromphenolblau) verdünnt. Die Proben wurden 5 min gekocht und die Proteine (30 μg pro Spur) einer SDS-PAGE mit 10%igen Polyacrylamidgelen unterzogen. Die Proteine wurden dann auf Nitrocellulosemembranen übertragen (Pall Corporation). Die Blots wurden in PBS/5% Magermilch/0,3% Tween 20 über Nacht bei 4°C blockiert. Danach wurden sie mit primärem Antikörper gegen Neurofilament-L (1:500) (Sigma) für 90 min bei RT inkubiert und danach dreimal mit PBS/0,3% Tween 20 gewaschen und dann 60 min mit einem mit alkalischer Meerrettichperoxidase (HRP) markierten sekundären Antikörper (1:20000) (Santa Cruz Biotechnology) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/0,3% Tween 20 wurden spezifische Proteinbanden mit dem Enhanced Chemiluminescence (ECL)-System (Santa Cruz Biotechnology) nachgewiesen. Die ECL-Filme wurden mit einem Umax-PowerLookIII-Scanner unter Verwendung der Software Photoshop (Adobe Systems) abgebildet und die Bandenintensitäten densitrometrisch mit der Software Quantity One (PDI) bestimmt.

Immunhistochemische Färbung

Für die immunhistochemische Färbung wurden Lendenmarksegmente herausgeschnitten, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert. Frischgefrorene Gewebsschnitte (14 μm) wurden in einem Cryostat geschnitten, auf mit Gelatine beschichtete Objektträger aufgebracht und 10 min in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) fixiert. Die Objektträger wurden dreimal jeweils 10 min in PBS gewaschen und 15 min mit PBS mit 0,1 % Triton-X-100 behandelt. Die Schnitte wurden dann in 3% BSA in PBS 1 h blockiert, um die nichtspezifische Bindung zu verringern, und danach mit primärem monoklonalem Antikörper, Anti-NFL (1:100; Sigma) und Anti-M-Calpain (1:50; Affinity BioReagents) 1 h bei 37°C inkubiert. NF-L und M-Calpain wurden durch einstündige Inkubation bei 37°C mit Cy3-konjugiertem sekundärem Antikörper (1:600; Sigma) fluoreszenzmarkiert. Die Objektträger wurden nach jeder Inkubation dreimal für jeweils 10 min in PBS gewaschen. Die Inkubationen mit primärem und sekundärem Antikörper wurden in PBS mit 1 % BSA durchgeführt. Die Objektträger wurden mit SlowFade Light Antifade-Mounting-Medien nach Anleitung des Herstellers präpariert.

Bestimmung der Calpain-Aktivität

Die Calpainaktivität wurde mit einem kommerziell erhältlichen Calpainaktivitätsassay-Kit (Biocat, Heidelberg) gemäß Herstellerangaben analysiert. Der Assay beruht auf dem fluorometischen Nachweis der Spaltung des Calpainsubstrats Ac-LLY-AFC, das blaues Licht ausstrahlt (λ_max = 400 nm). Nach Spaltung des Substrats durch Calpain strahlt das freie AFC mit einer gelbgrünen Fluoreszenz (λ_max = 505 nm), die mit einem Fluorometer (Spectra Fluor Plus, Tecan) quantifiziert wurde.

Beispiel 1: Chronische Entzündung führt zu Veränderungen bei verschiedenen Proteinen
Zum Nachweis von auf Entzündung reagierenden Proteinen wurde das Zymosaninduzierte Entzündungsmodell in Ratten mit anschließender 2D-PAGE des Lendenmarks der Ratte verwendet. Die Proteinexpressionsmuster des Rückenmarklysats der Kontrolle wurden mit Rückenmarksproteinen von Ratten nach einer Zymosanbehandlung von 24, 48 bzw. 96 h verglichen. Mehr als 500 Proteinspots wurden auf jedem Gel getrennt, wobei die scheinbaren Molmassen in einem Bereich von 10 bis 100 kDa und die pl-Werte in einem Bereich von 3 bis 10 lagen, wie durch Coomassie Blue-Färbung nachgewiesen wurde. Die Zymosanbehandlung führte zur Modifikation von wenigstens 10 Proteinspots. Die Wirkungen waren am deutlichsten 96 h nach der Zymosaninjektion.
Beispiel 2: NF-L wird nach Zymosanbehandlung im Rückenmark der Ratte zeitabhängig runterreguliert.
Weitere Untersuchungen in dieser Arbeit konzentrierten sich auf Spot 1, der mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie als Neurofilament-leichte Kette (NF-L) mit einer Molmasse von 61,3 kDa und einem pl bei 4,63 identifiziert wurde (1A). Die 2D-PAGE ergab, daß die Proteinexpression von NF-L nach 24 und 48 h zeitabhängig runteneguliert war. Wie die Coomassie-Färbung zeigt (1A), war der Proteinspot vollständig verschwunden.
Um den Abbau der NF-L-Proteinexpression im Rückenmark nach einer entzündliche Stimulation zu beweisen, wurde ebenfalls eine Western-Blot-Analyse mit einem monoklonalen Anti-NF-L-Antikörper, der mit anderen intermediären Filamentproteinen nicht kreuzreagierte, durchgeführt. Wie in 1B durch Western-Blot-Analyse gezeigt, wurde das NF-L-Protein aufgrund der zunehmenden Dauer der peripheren Entzündung abgebaut.
Die densitrometrische Analysen der NF-L-Proteinbanden in der Western-Blot-Analyse sind in 1C gezeigt.
Beispiel 3: Entzündliche Stimulation führt zu einem Anstieg der Calpainaktivität.
Es ist allgemein bekannt, daß der Neurofilamentabbau hauptsächlich durch die Aktivität der Calcium-abhängigen Cysteinprotease Calpain stattfindet. Daher wurden die Wirkungen der peripheren Zymosanbehandlung auf die Calpainaktivität im die Wirkungen der peripheren Zymosanbehandlung auf die Calpainaktivität im Rückenmark untersucht. Die Calpainaktivität wurde durch fluorometrischen Nachweis der Spaltung eines synthetischen Calpainsubstrats bestimmt. Durch die periphere Entzündung wurde die Calpainaktivität im Rückenmark nach 24 und 48 h leicht und nach 96 h deutlich erhöht (p < 0,05) (2A). Als Enzyminhibitor wurde Calpain-Inhibitor III (Carbobenzoxy-valinyl-phenylalaninal, MDL 28170), der als ein potenter, selektiver und zellgängiger Inhibitor von Calpain I und II beschrieben wird (Chatterjee et al., 1998; Rami et al., 1997). Durch Behandlung der Ratten mit dem Calpain-Inhibitor III (i.p.) (25 mg/kg) wurde die Zymosan-induzierte Proteaseaktivierung im Rückenmark deutlich gehemmt (2B).
Beispiel 4: Immunhistochemie
Die Immunhistochemie wurde angewendet, um die Proteinniveaus von Neurofilament-L und Calpain in Rückenmarksschnitten der Ratte nach Zymosanbehandlung mit und ohne zusätzliche Verabreichung von Calpain-Inhibitor III zu bestimmen.
Die mit einem spezifischen NF-L-Antikörper behandelten Schnitte zeigten eine reduzierte Immunfluoreszenzintensität nach 96 h Zymosanbehandlung, was auf den Abbau von Neurofilament hindeutet. Diese Wirkung wurde durch Zugabe von Calpain-Inhibitor III rückgängig gemacht. Mit dem Proteaseinhibitor behandelte Schnitte zeigten Immunfluoreszenzniveaus, die mit denen von Kontrollschnitten unbehandelter Ratten vergleichbar waren (3A).
Zur Bewertung der Calpain-Proteinexpression wurde ein Antikörper gegen M-Calpain verwendet. Nach Zymosanbehandlung (96 h) war die M-Calpain-Expression in Rückenmarksschnitten leicht erhöht. Diese Erhöhung der Immunreaktivität wurde durch Anwendung des Calpain-Inhibitors III nicht geändert (3B).
Beispiel 5: Wirkungen eines Calpain-Inhibitors im Zymosan-induzierten Entzündungsmodell in Ratten
Da die Calpain-Aktivität durch Zymosan-induzierte Entzündung hochreguliert wird und dadurch möglicherweise Neurofilamentabbau verursacht, wurde die Hypothese aufgestellt, daß der spezifische Calpain-Inhibitor entzündungshemmende Eigenschaften liefern könnte. Diese Hypothese wurde wiederum im Modell der Zymosan-induzierten Pfotenentzündung in Ratten getestet. In mit Vehikel behandelten Ratten führte die intraplantare Injektion von 1,25 mg Zymosan zu einem maximalen Anstieg des Pfotenvolumens von 129 ± 5,9 (Mittelwert ± sem [Standardabweichung])% nach 4 h. Wie in der Hypothese angenommen, wurde die Pfotenentzündung durch Calpain-Inhibitor III dosisabhängig in Dosen von 12,5 und 25 mg/kg gehemmt (4A). Ein statistischer Vergleich der Fläche unterhalb der Kurven „Pfotenvolumenanstieg" gegen „Zeit" (AUC_ΔPV von 0–8 h) zeigte statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Kontrollratten und den mit 25 mg/kg Calpain-Inhibitor behandelten Ratten (p < 0,001). Die Ergebnisse der post-hoc-Analyse sind in 4B gezeigt.
Beispiel 6: Wirkungen des Calpain-Inhibitors III bei der Zymosan-induzierten thermischen Hyperalgesie in Ratten
Um den Einfluß der Calpain-Hemmung auf die Hyperalgesie zu bewerten, wurde die Latenz des Zurückziehens der Pfote im thermischen Hyperalgesiemodell bestimmt. Die Ergebnisse in 5A lassen vermuten, daß die mit dem Calpain-Inhibitor III behandelten Ratten eine signifikant höhere Latenz des Zurückziehens der Pfote im Vergleich mit nur mit Zymosan behandelten Ratten zeigten, was darauf hindeutet, daß die mit dem Inhibitor behandelten Ratten weniger Schmerzen empfanden. Die Ergebnisse der post-hoc-Analyse sind in 5B gezeigt.
Diskussion der Ergebnisse der Beispiele:
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten mittels der 2D-Gelelektrophorese, daß die Neurofilament-Leichtkette nach peripherer entzündlicher Stimulation abgebaut wird. Die Neurofilamente stellen eine wichtige Gruppe von Cytoskelettproteinen dar, die an der Kontrolle des Axoninnendurchmessers sowie des Axonaufbaus und des axoplasmatischen Flusses beteiligt sind (Perrone Capano et al., 2001). Neurofilamentanomalien lösen den selektiven Abbau und Tod von Motoneuronen hervor und treten bei neurodegenerativen Erkrankungen auf (Julien, 1999). Der Neurofilamentabbau wurde bei Rückenmarksverletzungen ebenso wie unter anoxischen und ischämischen Bedingungen durch Aktivierung der Calcium abhängigen Cysteinprotease Calpain beobachtet (Banik et al., 1997; Leski et al., 2001; Stys et al., 2002).
Wie in 6 zusammengefaßt ist, löst eine noxische periphere Stimulation, z.B. Entzündungszustände, die Freisetzung von Neurotransmittern im Rückenmark aus, wobei insbesondere die exitatorische Aminosäure Glutamat und die Neuropeptidsubstanz P zur Aktivierung spannungsgesteuerter Calciumkanäle ebenso wie ionotroper und metabotroper Rezeptoren führen, wodurch ein Einströmen von Calcium aus spannungsempfindlichen Ionenkanälen und ebenso eine Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern hervorgerufen werden. Die dadurch entstandene Akkumulation von Calcium induziert die Aktivierung von Calpain ebenso wie eine Hochregulierung und Aktivierung mehrerer anderer Proteine im Rückenmark, z.B. nNOS, Ca²⁺-Calmodulin Kinase (Shields et al., 1998) und Adenylylcyclase. Der hier festgestellte Anstieg der Calpainaktivität und -expression kann auch mit der Produktion von Cytokinen und der Aktivierung der Arachidsäurekaskade, die während Entzündungsprozessen in Astrocyten und Entzündungsimmunzellen auftritt, in Verbindung gebracht werden. In-vitro-Untersuchungen zeigten ebenso eine erhöhte Synthese und Aktivität von Calpain in Gliazellen, neuronalen und lymphoiden Zellen als Reaktion auf Streß (Ray et al., 2003).
Zur Zeit gibt es zwei Hauptisoformen von Calpain im zentralen Nervensystem, μ-Calpain (Calpain I) und m-Calpain (Calpain II), die durch mikromolare bzw. millimolare Calciummengen aktiviert werden. Sie sind mit einer Reihe physiologischer und pathologischer Zustände, einschließlich neuronaler Plastizität und neuronalen Zelltod, in Zusammenhang gebracht worden. Hinsichtlich dieses neuronalen Zelltods führt die Aktivierung von Calpain zur Protolyse mehrerer zellulärer Proteine, die größtenteils mit der Zellmembran assoziiert sind, einschließlich Cytoskelettproteine (z.B. Neurofilament, Spectrin, Fodrin und mit Mikrotubuli assoziierte Proteine), Membranproteine (z.B. Wachstumsfaktorrezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Ionentransporter), Enzyme (z.B. Kinasen, Phosphatasen und Phospholipasen) ebenso wie Cytokine und Transkriptionsfaktoren (Kampfl of al., 1997; Shields et al., 1998). Obwohl viele dieser Calpainwirkungen mit entzündungsbeitragenden Mechanismen in Zusammenhang gebracht werden können, bedarf die genaue Rolle der Calpainaktivierung in entzündetem Gewebe weiterhin der Aufklärung.
Es gibt Hinweise darauf, daß die Aktivierung von Calpain zum Abbau von IκB im Proteasom führt und daher einen wesentlichen Schritt bei der Translokation des nuklearen Faktors κB (NF-κB) aus dem Cytosol in den Zellkernen führt (Chen et al., 2000; Saido et al., 1994). Es konnte gezeigt werden, daß der Calpain-Inhibitor I diese NF-kB-Aktivierung sowie die nachfolgende Hochregulierung von iNOS und COX-2-Protein verhindert, wodurch die Entwicklung einer akuten und chronischen Entzündung vermindert wird (Cuzzocrea et al., 2000). Der entzündungshemmende Wirkstoff Indomethacin, der die Cyclooxygenase-Aktivität und die Hochregulierung von Prostaglandin hemmt, zeigte zusätzlich Calpain-hemmende Aktivität (Banik et al., 2000). Darüber hinaus wurde durch neue Ergebnisse über eine erhöhte Calpainaktivität bei der Ischämie, Morbus Alzheimer, Rückenmarksverletzungen sowie Hirntrauma, die durch Calpain vermittelte Protolyse mit der Zerstörung und dem Abbau von Gewebe bei CNS-Trauma und -Erkrankungen in Zusammenhang gebracht (Banik et al., 1997; Shields et al., 1998). Die unkontrollierte Calpainaktivierung führt zum Abbau von Cytoskelettproteinen, dem darauf folgenden Verlust der strukturellen Integrität und zu Störungen des axonalen Transports.
Die Ergebnisse über eine erhöhte Calpainaktivität in Erkrankungen lassen vermuten, daß sich Calpain-Inhibitoren als Therapeutika einsetzen lassen, da sie den Gewebeabbau durch Verhinderung des Abbaus von Substratproteinen minimieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Calpain-Inhibitor III (MDL 28170), ein potenter, spezifischer Calpain-Inhibitor, verwendet, der nach systemischer Verabreichung rasch die Blut-Hirn-Schranke durchdringt. Durch intraperitoneale Applikation dieses Inhibitors wurde der Abbau von Neurofilamentprotein im Rückenmark blockiert, was auf die Hemmung der Proteaseaktivität, jedoch nicht auf eine Runterregulierung des Calpain-Proteins zurückzuführen war. Zusätzliche Wirkungen der Calpain-Hemmung auf andere Calpain-Substrate sind ebenfalls möglich, wurden jedoch in der folgenden Arbeit nicht untersucht.
Es konnte erstmals gezeigt werden, daß die Vorbehandlung von Ratten mit Calpain-Inhibitor III die Entwicklung der Zymosan-induzierten Pfotenentzündung und thermischen Hyperalgesie in Ratten abschwächt. Als Abschluß wird von uns vorgeschlagen, daß es sich bei Calpain um eine wichtige Vermittlersubstanz bei nozizeptiven Reaktionen handelt und daß der Calpain-Inhibitor III möglicherweise zur Therapie von Entzündungserkrankungen geeignet ist.
Literatur

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Beschreibung der Abbildungen
1: Die Behandlung mit Zymosan verursacht eine zeitabhängige Abnahme von Neurofilament-L.
(A) Vergrößerte Bereiche der 2D-Gele von Ratten-Rückenmarksgewebe der Kontrolle sowie nach 24 h, 48 h und 96 h Zymosanbehandlung. Die Pfeile markieren das Protein 1, das als Neurofilament-leichte Kette identifiziert wurde.
(B) Repräsentative Western-Blot-Analyse der Expression der Neurofilament-leichte Kette (NF-L) nach 24, 48 und 96 h Zymosanbehandlung.
(C) Densitometrische Analyse von 3 unabhängigen Western-Blot-Experimenten (**statistisch signifikanter mittlerer Unterschied, p < 0,01).
2: Die Calpain-Aktivität ist nach Zymosanbehandlung erhöht und wird durch Calpain-Inhibitor III reduziert.
(A): Calpain-Aktivität von Ratten-Rückenmarksextrakten der Kontrolle und nach 24, 48 und 96 h Zymosanbehandlung.
(B): Calpain-Aktivität der Rückenmarksextrakte Zymosan-behandelter Kontrollratten und von Tieren, die 12,5 mg/kg oder 25 mg/kg Calpain-Inhibitor III erhielten.
Die Aktivität wird durch den fluorometrischen Nachweis der Spaltung des Calpain-Substrats Ac-LLY-AFC bestimmt.
(*, **statistisch signifikanter mittlerer Unterschied p < 0,01 bzw. p < 0,05)
3: Immunhistochemische Markierung von Lendenmarkschnitten mit Cy-3. Die Querschnitte wurden Kontrolltieren ebenso wie Tieren 96 h nach Injektion mit Zymosan mit und ohne Vorbehandlung mit Calpain-Inhibitor III entnommen. Die Abbildungen stellen das Hinterhorn des Rückenmarks dar.
(A): Mit monoklonalem Anti-NF-L-Antikörper immunhistochemisch angefärbte Schnitte. Der Calpain-Inhibitor III verringert den Verlust an NF-L nach Zymosanbehandlung.
(B): Mit monoklonalem Anti-m-Calpain-Antikörper immunhistochemisch angefärbte Schnitte. Die Zymosanbehandlung führte zu einer Erhöhung der m-Calpain-Immunpositivität, die durch den Calpain-Inhibitor III nicht geändert wurde.
4: Calpain-Inhibitor III in einer Konzentration von 25 mg/kg verkleinert in signifikanter Weise das Pfotenödem
(A): Veränderung des Pfotenvolumens in Abhängigkeit von der Zeit nach intraplantarer Injektion von 1,25 mg Zymosan in Kontrolltieren (♦) und in mit 12,5 (∎) bzw. 25 mg/kg
Calpain-Inhibitor III behandelten Ratten.
(B): Für den statistischen Vergleich der Wirkstoffwirkungen wurden die Flächen unterhalb der Kurven "Pfotenvolumenanstieg" gegen "Zeit" (AUC_ΔPW von 0–8 h, Mittelwert ± s.e.m.) unter Verwendung der linearen Trapezregel berechnet und einer univariaten Varianzanalyse mit anschließendem Bonferroni-post-hoc-Tests unterzogen (* statistisch signifikanter mittlerer Unterschied mit p < 0.05)
5: Calpain-Inhibitor III in einer Konzentration von 25 mg/kg reduziert in signifikanter Weise die thermische Hyperalgesie
Zeitlicher Verlauf der Latenz des Zurückziehens der Pfote als Antwort auf die thermische Stimulation der Fußsohlenoberfläche nach intraplantarer Injektion von 1,25 mg Zymosan allein (♦) oder von Zymosan und Calpain-Inhibitor III
Die Daten werden als relativer Unterschied zwischen der mit Zymosan behandelten rechten und der unbehandelten linken Hinterpfote, berechnet als: ΔPWL = (rechts – links)/links × 100, ausgedrückt.
(A): Latenz des Zurückziehens der Pfote nach intraperitonealer Verabreichung von 25 mg/kg Calpain-Inhibitor 111 im Vergleich mit Vehikel-behandelten Ratten. (B): Fläche unterhalb der Wirkung (relative Abnahme der Latenz des Zurückziehens der Pfote, ΔPWL) gegen Zeit-Kurven nach intraplantarer Injektion mit Zymosan und Behandlung mit 25 mg/kg Calpain-Inhibitor III. (***, statistisch signifikanter mittlerer Unterschied, p < 0,001)
6: Schema des möglichen Signalweiterleitungswegs im Hinterhorn des Rückenmarks
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Herstellung schmerzmodulierender pharmazeutischer Verbindungen.
Verwendung von Calpain oder funktionellen Fragmenten oder Derivaten davon zur Identifizierung schmerzmodulierender pharmazeutischer Verbindungen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei den pharmazeutischen Verbindungen um Verbindungen zur Schmerzvorbeugung oder -behandlung handelt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verbindungen Schmerzen lindern oder beseitigen.
Verfahren zum Screenen von zur Schmerzmodulation und/oder -vorbeugung geeigneten Arzneimitteln, bei dem a. zwei Proben bereitgestellt werden, b. eine Probe, die Calpain oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon enthält, mit einer Verbindung in Kontakt gebracht, c. die Calpainaktivität in Gegenwart der Verbindung bestimmt, d. die Calpainaktivität in Abwesenheit der Verbindung bestimmt und e. die Calpainaktivität gemäß (c) mit der gemäß (d) verglichen wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei es sich bei dem Calpain um menschliches Calpain 1 und/oder Calpain II handelt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Calpain um ein isoliertes Polypeptid oder Polynukleotid handelt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polypeptid handelt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polypeptid oder funktionelles Fragment davon handelt, das die Sequenz gemäß SEQ ID No 1 (Calpain I) oder ein Fragment davon, die Sequenz gemäß SEQ ID No 3 (Calpain II) oder ein Fragment davon enthält oder daraus besteht, oder wobei das Calpain von einem Polynukleotid, das die Sequenz gemäß SEQ ID No 2 (codiert Calpain II) oder ein Fragment davon oder die Sequenz gemäß Sequenz gemäß SEQ ID No 4 (codiert Calpain II) oder ein Fragment davon enthält oder daraus besteht, codiert wird.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polynukleotid handelt.
Verwendung oder Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Calpain um ein Polynukleotid, das die Sequenz oder einen Teil der Sequenz, die für ein funktionelles Fragment von Calpain gemäß SEQ ID No 2 oder SEQ ID No 4 enthält oder daraus besteht, oder um ein Polynukleotid, das eine Sequenz, die mit den Polynukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann, enthält oder daraus besteht, handelt.
Verwendung oder Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, wobei die funktionellen Fragmente die Aminosäuren 115 bis 272 der SEQ ID No 2 und/oder 105 bis 262 der SEQ ID No 4 enthalten oder daraus bestehen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei eine Calpain exprimierende, vorzugsweise rekombinantes Calpain exprimierende Zelle verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei eine modifizierte Zelle mit einer geringeren Calpainaktivität im Vergleich zu ihrem unmodifizierten Zustand verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei eine Calpain-Knockout-Zelle verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 13 und 14, wobei die Calpainaktivität direkt bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 13 und 14, wobei die Calpainaktivität indirekt bestimmt wird.
Verfahren zur Identifizierung einer schmerzmodulierenden Verbindung bei dem a. eine Verbindung, die die Aktivität von Calpain moduliert, als Testverbindung ausgewählt und b. diese Testverbindung an eine Versuchsperson verabreicht wird, um zu bestimmen, ob die Schmerzen moduliert werden.
Verwendung von MDL-28170 (Calpain-Inhibitor III) beim Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung.
Verwendung von MDL-28170 als Medikament zur Schmerzbehandlung.
Verwendung von MDL-102935 beim Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Schmerzbehandlung.
Verwendung von MDL-102935 als Medikament zur Schmerzbehandlung.