DE10328181A1 - Method for separating and detecting at least one analyte in biological matrices - Google Patents
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Abstract
Bei einem Verfahren zum Separieren von zumindest einem Analyten auf einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix wird eine erste schwingungsfähige Oberfläche verwendet, an der Trägerpartikel (16) immobilisiert werden, die zumindest eine Bindungsstelle für den Analyten (17) aufweisen. Die Matrix wird mit der ersten Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass das ggf. in der Matrix enthaltene Analyt (17) an die Trägerpartikel (16) bindet. Unspezifisch gebundene Bestandteile der Matrix werden von der ersten Oberfläche entfernt, vorzugsweise abgewaschen oder abgespült. Die erste Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Schwingungsamplitude erhöht, bis sich die Trägerpartikel (16) von der Oberfläche ablösen. Die Trägerpartikel (16) mit ggf. daran gebundenem Analyten (17) werden in einem Trägermedium (21) aufgenommen (Fig. 3b).In a method for separating at least one analyte on a complex, preferably biological matrix, a first vibratory surface is used, on which carrier particles (16) are immobilized, which have at least one binding site for the analyte (17). The matrix is brought into contact with the first surface, so that the analyte (17) possibly contained in the matrix binds to the carrier particles (16). Unspecifically bound components of the matrix are removed from the first surface, preferably washed off or rinsed off. The first surface is vibrated and its vibration amplitude increased until the carrier particles (16) detach from the surface. The carrier particles (16) with any analyte (17) bound to them are taken up in a carrier medium (21) (FIG. 3b).
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Separieren von zumindest einem Analyten aus einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix, ein Verfahren zum Nachweis von in einer biologischen Probe, vorzugsweise einer Blutprobe enthaltenen Antikörpern/Rezeptoren gegen Antigene/Liganden, ein Verfahren zum Nachweis von in einer ersten Blutprobe enthaltenen Antikörpern gegen Erythrozyten in einer zweiten Blutprobe, sowie eine Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix.The present invention relates to a method for separating at least one analyte from a complex, preferably biological matrix, a method for detection an analyte in a complex, preferably biological, matrix, a method for the detection of in a biological sample, preferably a blood sample containing antibodies / receptors against antigens / ligands, a method for the detection of contained in a first blood sample antibodies against erythrocytes in a second blood sample, as well as a device for the detection of an analyte in a complex, preferably biological Matrix.
Für den Nachweis von Analyten in komplexen Matrizes ist es häufig erforderlich, den Analyten, der ein Antikörper, ein Rezeptor oder ein beliebiges Biomolekül sein kann, von den anderen Komponenten der Matrix zu separieren, bevor der eigentliche Mess- oder Bestimmungsvorgang erfolgen kann.For the detection of analytes in complex matrices often requires the analyte, which is an antibody, one receptor or any biomolecule can be one of the others Separate components of the matrix before the actual measurement or determination process can take place.
Für die chemische Analyse in komplexen Matrizes kommen daher häufig analytische Systeme wie Test Kits, Membranen etc. oder analytische Apparaturen in Kombination mit Membranen zum Einsatz,, wobei die Membranen für die Separation des Analyten von den anderen Stoffen der Matrix notwendig sind. Beispiel für gängige chemische Analysemethoden finden sich in der WO 99120396.For chemical analysis in complex matrices therefore often come analytical Systems such as test kits, membranes etc. or analytical equipment in combination with membranes for use ,, the membranes for the separation of the analyte from the other substances of the matrix are necessary. example for common Chemical analysis methods can be found in WO 99120396.
Bei der Blutanalyse z.B. ist die Zentrifugation ein gängiges Verfahren zur Separierung von Blutbestandteilen für deren nachfolgende weitere Untersuchung.In blood analysis e.g. is the Centrifugation is a common Process for the separation of blood components for their subsequent further investigation.
Die WO 01102857 beschreibt ein Verfahren, bei dem verschiedene Komponenten aus einer Lösung auf einer schwingungsfähigen Oberfläche gebunden und anschließend durch schrittweise Erhöhung der Schwingungsamplitude wieder abgelöst werden.WO 01102857 describes a method in which binds various components from a solution to a vibrating surface and subsequently by gradually increasing the vibration amplitude can be replaced.
Für den Nachweis von Analyten, unter denen im Rahmen der vorliegenden Anmeldung allgemein Moleküle, Bakterien, Viren, Zel len, Antikörper, Rezeptoren, Liganden etc. verstanden werden, werden neuerdings Chemo- oder Biosensoren eingesetzt, auf deren Oberfläche der Analyt abgeschieden wird, um dann unterschiedlichste biologische, chemische oder physikalische Eigenschaften wie bspw. Temperatur, Masse, pH-Wert, Bindungskinetik, Absorption, Spannung etc. zu bestimmen. Wichtig ist dabei, dass die Anlagerung spezifisch für den Analyten ist und unspezifische Anlagerung – wenn überhaupt – nur unterhalb der Nachweisgrenze erfolgt. Hierzu wird im Allgemeinen die Oberfläche des Sensors mit einer Beschichtung versehen, die ein spezifisches Erkennen des Analyten ermöglicht.For the detection of analytes, among which within the scope of the present Registration in general molecules, Bacteria, viruses, cells, antibodies, Receptors, ligands etc. are understood, chemo- or biosensors are used, on the surface of which the analyte is deposited different biological, chemical or physical Properties such as temperature, mass, pH, binding kinetics, Determine absorption, tension etc. It is important that the Attachment specific to the analyte and nonspecific attachment - if at all - only below the detection limit he follows. For this purpose, the surface of the sensor is generally coated provided, which enables a specific recognition of the analyte.
Beim Nachweis von Analyten in komplexen, insbesondere biologischen Matrizes wie bspw. Körperflüssigkeiten ist die unspezifische Anlagerung jedoch oft so groß, dass ein Nachweis der spezifischen Anlagerung entweder überhaupt nicht oder nur schwer möglich ist.When detecting analytes in complex, in particular biological matrices such as body fluids is the non-specific one But often so large that proof of specific attachment either at all not possible or only with difficulty is.
Bei Sensoren auf der Basis von Schwingquarzen wird der Nachweis neben der unspezifischen Anlagerung auch noch durch die Masse des Analyten beeinflusst. Eine Änderung in der Schwingungsamplitude oder -frequenz lässt sich nur detektieren, wenn die Masseänderung durch die Belegung mit dem Analyten eine bestimmte Größe erreicht. Haben bspw. die Analyten nur eine geringe Masse, die sich unspezifisch ablagernden Komponenten der Matrix jedoch eine viel größere Masse, so führt schon eine geringe unspezifische Massebelegung zu nicht mehr aussagekräftigen Messsignalen.For sensors based on quartz crystals In addition to the unspecific attachment, the proof also becomes influenced by the mass of the analyte. A change in the vibration amplitude or frequency can only be detected if the mass change due to the assignment with the analyte reaches a certain size. For example, the analytes have only a small mass that is non-specific depositing components of the matrix, however, a much larger mass, so leads even a small non-specific mass assignment to measurement signals that are no longer meaningful.
Vor diesem Hintergrund besteht Bedarf an einem Verfahren, das es erlaubt, Moleküle, also Analyten, aus komplexen Matrizes nachzuweisen, die wegen störender unspezifischer Ablagerung von anderen Komponenten aus der Matrix und/oder wegen der nur geringen Massezunahme an dem Sensor bei Ablagerung des Analyten bisher nur mit Filterung der Matrix über bspw. Membranen oder andere aufwendige Verfahren nachzuweisen waren.With this in mind, there is a need on a process that allows molecules, i.e. analytes, to be made from complex Evidence of matrices due to disruptive non-specific deposition of other components from the matrix and / or because of the only minor So far, only mass increase on the sensor when the analyte is deposited with filtering the matrix over For example, membranes or other complex methods had to be demonstrated.
Das neue Verfahren soll bspw. den Nachweis von Antikörpern in Serum oder Blutplasma sowie eine komplette Blutgruppenbestimmung ermöglichen, also bspw. auch den sogenannten Antikörpersuchtest mit umfassen, aber auch den Nachweis von Viren, Bakterien und anderen Mikropartikeln nicht nur in Körperflüssigkeiten sondern auch in wässrigen Proben bspw, aus der Umweltanalytik ermöglichen.For example, the new method is intended to Detection of antibodies in serum or blood plasma as well as a complete blood group determination enable, also include the so-called antibody test, but also the detection of viruses, bacteria and other microparticles not just in body fluids but also in aqueous samples For example, enable from environmental analysis.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem schnell und ohne großen Aufwand Analyten aus komplexen Matrizes separiert und/oder nachgewiesen werden können.It is therefore the task of the present Invention to provide a method with which fast and without big Effort to analyze and / or detect analytes from complex matrices can.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Separieren von zumindest einem Analyten aus einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix unter Verwendung zumindest einer ersten schwingungsfähigen Oberfläche, mit den Schritten:
- a) an der ersten Oberfläche werden Trägerpartikel immobilisiert, die zumindest eine Bindungsstelle für den Analyten aufweisen;
- b) die Matrix wird mit der ersten Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass ggf. in der Matrix enthaltener Analyt an die Trägerpartikel bindet;
- c) unspezifisch gebundene Bestandteile der Matrix werden von der ersten Oberfläche entfernt, vorzugsweise abgewaschen oder abgespült;
- d) die erste Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Schwingungsamplitude erhöht, bis sich die Trägerpartikel von der Oberfläche ablösen; und
- e) die Trägerpartikel mit ggf. daran gebundenem Analyten werden in einem Trägermedium aufgenommen.
- a) carrier particles are immobilized on the first surface and have at least one binding site for the analyte;
- b) the matrix is brought into contact with the first surface, so that any analyte contained in the matrix binds to the carrier particles;
- c) unspecifically bound components of the matrix are removed from the first surface, preferably washed off or rinsed off;
- d) the first surface is vibrated and its vibration amplitude is increased until the carrier particles detach from the surface; and
- e) the carrier particles with any analyte bound to them are taken up in a carrier medium.
Die Erfindung wird ferner gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer komplexen, vorzugsweise biologischen Matrix, mit den Schritten:
- a) der Analyt wird in dem neuen Verfahren von der Matrix separiert, und
- b) es wird überprüft, ob an die von der ersten Oberfläche abgelösten Trägerpartikel ein Analyt gebunden hat.
- a) the analyte is separated from the matrix in the new method, and
- b) it is checked whether an analyte has bound to the carrier particles detached from the first surface.
Die Erfindung betrifft vor diesem Hintergrund auch ein Verfahren zum Nachweis von in einer biologischen Probe, vorzugsweise einer Blutprobe enthaltenen Antikörpern/Rezeptoren gegen Antigene/Liganden, unter Verwendung einer ersten schwingungsfähigen Oberfläche, an der Fängermoleküle für Trägerpartikel gebunden sind, auf denen sich die Antigene/Liganden befinden, mit den Schritten:
- a) die Trägerpartikel werden mit der ersten Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass sie an den Fängermolekülen der ersten Oberfläche immobilisiert werden;
- b) die Probe wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass die Antikörper/Rezeptoren an die Antigene/Liganden auf den Trägerpartikeln binden;
- c) unspezifisch gebundene Bestandteile der Probe werden von der Oberfläche entfernt, vorzugsweise abgewaschen oder abgespült;
- d) die Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Schwingungsamplitude erhöht, bis sich die Trägerpartikel von den Fängermolekülen ablösen;
- e) die Trägerpartikel werden mit einer zweiten schwingungsfähigen Oberfläche in Kontakt gebracht, an der Fängermoleküle für die Antikörper/Rezeptoren gebunden sind; und
- h) die zweite schwingungsfähige Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Massenbelegung ermittelt.
- a) the carrier particles are brought into contact with the first surface so that they are immobilized on the capture molecules of the first surface;
- b) the sample is brought into contact with the surface so that the antibodies / receptors bind to the antigens / ligands on the carrier particles;
- c) non-specifically bound components of the sample are removed from the surface, preferably washed or rinsed off;
- d) the surface is vibrated and its vibration amplitude increased until the carrier particles detach from the catcher molecules;
- e) the carrier particles are brought into contact with a second vibratable surface, to which capture molecules for the antibodies / receptors are bound; and
- h) the second vibratable surface is vibrated and its mass assignment is determined.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von in einer ersten Blutprobe enthaltenen Antikörpern gegen Erythrozyten in einer zweiten Blutprobe, unter Verwendung einer ersten schwingungsfähigen Oberfläche, an der Fängermoleküle für die Erythrozyten der zweiten Blutprobe gebunden sind, mit den Schritten:
- a) die zweite Blutprobe wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass die Erythrozyten an der Oberfläche immobilisiert werden;
- b) unspezifisch gebundene Bestandteile der zweiten Blutprobe werden von der Oberfläche entfernt, vorzugsweise abgewaschen;
- c) die erste Blutprobe wird mit der Oberfläche in Kontakt gebracht, so dass die Antikörper an die Erythrozyten binden;
- d) unspezifisch gebundene Bestandteile der ersten Blutprobe werden von der Oberfläche entfernt, vorzugsweise abgewaschen oder abgespült;
- e) die Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Schwingungsamplitude erhöht, bis sich die Erythrozyten von den Fängermolekülen ablösen;
- f) die Erythrozyten mit ggf. daran gebundenen Antikörpern werden in einem Trägermedium aufgenommen;
- g) das Trägermedium wird mit einer zweiten schwingungsfähigen Oberfläche in Kontakt gebracht, an der Fängermoleküle für die Antikörper gebunden sind; und
- h) die zweite schwingungsfähige Oberfläche wird in Schwingung versetzt und ihre Massenbelegung ermittelt.
- a) the second blood sample is brought into contact with the surface so that the erythrocytes are immobilized on the surface;
- b) non-specifically bound components of the second blood sample are removed from the surface, preferably washed off;
- c) the first blood sample is brought into contact with the surface so that the antibodies bind to the erythrocytes;
- d) non-specifically bound components of the first blood sample are removed from the surface, preferably washed or rinsed off;
- e) the surface is vibrated and its vibration amplitude increased until the erythrocytes detach from the capture molecules;
- f) the erythrocytes with any antibodies bound to them are taken up in a carrier medium;
- g) the carrier medium is brought into contact with a second vibratable surface, to which capture molecules for the antibodies are bound; and
- h) the second vibratable surface is vibrated and its mass assignment is determined.
Schließlich betrifft die Erfindung
auch eine Vorrichtung zum Nachweis eines Analyten in einer komplexen,
vorzugsweise biologischen Matrix, mit
einer ersten Messzelle,
in der ein Analyt aus der Matrix spezifisch an auf einer schwingungsfähigen ersten
Oberfläche
immobilisierte Trägerpartikel
gebunden wird, und Trägerpartikel
mit ggf. daran gebundenem Analyten von der Matrix separiert werden;
einer
zweiten Messzelle, in der messtechnisch bestimmt wird, ob die Trägerpartikel
Analyt gebunden haben; und
einer Einrichtung, um die Trägerpartikel
aus der ersten in die zweite Messzelle zu überführen,
wobei die neue Vorrichtung
vorzugsweise dazu eingerichtet ist, das erfindungsgemäße Verfahren
in seinen verschiedenen Ausgestaltungen durchzuführen.Finally, the invention also relates to a device for detecting an analyte in a complex, preferably biological, matrix
a first measuring cell, in which an analyte from the matrix is specifically bound to carrier particles immobilized on a vibratable first surface, and carrier particles with analyte which may be bound to it are separated from the matrix;
a second measuring cell in which it is determined by measurement whether the carrier particles have bound analyte; and
a device for transferring the carrier particles from the first to the second measuring cell,
wherein the new device is preferably set up to carry out the method according to the invention in its various configurations.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird dadurch vollkommen gelöst.The basis of the invention This completely solves the task.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Blutprobe" nicht nur eine Probe aus Vollblut, sondern auch eine Plasma- oder Serumprobe verstanden.Within the scope of the present invention "Blood sample" is not just a sample from whole blood, but also understood a plasma or serum sample.
Unter „Trägerpartikel" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch ein „Trägermolekül" verstanden."Carrier particles" in the context of the present invention also understood a "carrier molecule".
Die Erfinder haben erkannt, dass es durch das erfindungsgemäße Verfahren möglich ist, aus einer komplexen Matrix Analyt, wie bspw. Antikörper/Rezeptoren, mit geringer Masse an Trägerpartikel größerer Masse zu binden und über eine schwingungsfähige Oberfläche von den anderen, sich ggf. unspezifisch ablagernden Komponenten der Matrix zu separieren, und anschließend zu prüfen, ob die Trägerpartikel Analyt gebunden haben. Dies kann mit verschiedenen Chemo- und Biosensoren erfolgen, es ist jedoch bevorzugt, wenn schwingungsfähige Oberflächen auch für diesen weiteren Schritt eingesetzt werden. Die Analyten erhalten nämlich während der Separierung bereits eine größere Masse, so dass sie bei Ablagerung auf einer schwingungsfähigen Oberfläche zu einer gut erfassbaren Masseveränderung führen.The inventors recognized that it by the inventive method possible is from a complex matrix analyte, such as antibodies / receptors, with low mass of carrier particles greater mass tie and over a vibratory surface of the other, possibly unspecific components separate the matrix, and then check to see if the carrier particles Have bound analyte. This can be done with different chemo and biosensors take place, but it is preferred if also vibratable surfaces For this another step. The analytes get namely during the Separation already a larger mass, so that when deposited on a vibrating surface it becomes a easily detectable change in mass to lead.
Durch das erfindungsgemäße Separierverfahren werden bekannte Chemo- und Biosensoren besser einsetzbar, denn die im Stand der Technik erforderlichen Laborarbeiten zur Separierung der Analyten werden durch die Erfindung erheblich verringert bzw. durch ein automatisierbares Verfahren ersetzt. Bei der kompletten Blutgruppenbestimmung, also bspw. einschließlich Antikörpersuchtest, sowie dem Nachweis von Viren, Bakterien und anderen Mikroorganismen aus Blut kann auf die bisher üblichen serologischen Methoden verzichtet werden. Gleiches gilt für bisher aufwendige Verfahren in der Umweltanalytik, bspw. dem Nachweis von Viren in Gewässern.By separating ver Known chemical and biosensors can be used more effectively because the laboratory work required in the prior art for separating the analytes is considerably reduced by the invention or replaced by an automatable method. In the complete blood group determination, for example including an antibody detection test, and the detection of viruses, bacteria and other microorganisms from blood, the previously usual serological methods can be dispensed with. The same applies to previously complex methods in environmental analysis, for example the detection of viruses in water.
Bei dem neuen Verfahren ist es folglich bevorzugt, wenn die schwingungsfähige erste und/oder zweite Oberfläche an einem Schwingquarz, einem Dickenscherschwinger, einer Quarzmikrowaage oder einem Balkenschwinger ausgebildet ist und vorzugsweise mit einer Elektrode, vorzugsweise einer Goldelektrode versehen ist.So it is with the new process preferred if the vibratory first and / or second surface on a quartz crystal, a Dickenscherschwinger, a quartz microbalance or a bar oscillator is formed and preferably with an electrode, preferably a gold electrode.
Die schwingungsfähige erste und/oder zweite Oberfläche bzw. die Elektrode ist dabei vorzugsweise funktionalisiert, weiter vorzugsweise mit einer Beschichtung aus organischem Material versehen ist, sie trägt insbesondere eine Protein A, Antikörper- oder Lektin-Schicht.The vibratory first and / or second surface or the electrode is preferably functionalized, further is preferably provided with a coating of organic material, she wears in particular a protein A, antibody or lectin layer.
Es ist dabei bevorzugt, wenn an der Beschichtung Fängermoleküle, insbesondere Antikörper, Lektine, Biotin oder Avidin gebunden sind, die eine Bindungsstelle für die Trägerpartikel aufweisen, wobei es weiter von Vorteil ist, wenn die Trägerpartikel über darauf befindliche Liganden oder Antigene an der ersten Oberfläche immobilisiert sind.It is preferred if at the Coating capture molecules, in particular Antibody, Lectins, biotin or avidin are bound, which is a binding site for the carrier particles have, it is further advantageous if the carrier particles over it located ligands or antigens immobilized on the first surface are.
Vorzugsweise sind die Trägerpartikel ausgewählt aus der Gruppe: Latexpartikel, biologische Makromoleküle, biologische Zellen, Mikroorganismen, Bakterien, Blutzellen, insbesondere Erythrozyten, Partikel aus Zellulose, Polysaccharide, abgetötete Mikroorganismen und Zellen, magnetische Beads, wobei insbesondere jedes Trägerpartikel eine größere, vorzugsweise eine erheblich größere Masse hat als der Analyt.The carrier particles are preferably selected from the group: latex particles, biological macromolecules, biological Cells, microorganisms, bacteria, blood cells, especially erythrocytes, particles from cellulose, polysaccharides, killed microorganisms and cells, magnetic beads, in particular each carrier particle a larger, preferably a significantly larger mass has as the analyte.
Auf diese Weise erhalten die Analyten während des Separierens sozusagen eine größere Masse, so dass sie mit einem Masseschwinger leichter und vor allem genauer nachgewiesen werden können.In this way the analytes get while separating a larger mass, so to speak, so that it can be separated a mass oscillator more easily and, above all, more precisely can be.
Es ist weiter bevorzugt, wenn der Analyt ausgewählt ist aus der Gruppe: Biomoleküle, insbesondere Antigene oder Antikörper, vorzugsweise Antikörper gegen eine Blutgruppe, gegen Viren, gegen Mikroorganismen oder sonstige Mikropartikel, und wenn die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe: Körperflüssigkeiten, insbesondere Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Liquor cerebrospinalis, Lymphe, Sputum; Zellextrakte; Zellkulturüberstände; wässrige Proben.It is further preferred if the Analyte selected is from the group: Biomolecules, especially antigens or antibodies, preferably antibodies against a blood group, against viruses, against microorganisms or other Microparticles, and if the matrix is selected from the group: body fluids, in particular Whole blood, blood serum, blood plasma, urine, saliva, tear fluid, Cerebrospinal fluid, lymph, sputum; Cell extracts; Cell culture supernatants; aqueous samples.
Damit lassen sich "leichte" Analyten aus verschiedensten bereichen separieren und nachweisen.This allows "light" analytes to be obtained from a wide variety of different separate areas and prove.
Ferner ist es bevorzugt, wenn ein gebundener Analyt zu einer messtechnisch erfassbaren Veränderung der biologischen, chemischen oder physikalischen Eigenschaften der Trägerpartikel führt.It is further preferred if a bound analyte for a measurable change the biological, chemical or physical properties of the carrier particles leads.
Zusätzlich zu oder anstatt einer Erhöhung der Masse der Analyten kann die Separierung auch dazu führen, dass die Trägermoleküle durch den gebundene Analyten eine mit Chemo- oder Biosensoren messtechnisch erfassbare Veränderung erfahren. Dies kann bspw. die Bindungsmöglichkeit an Antikörper sein, die nicht unmittelbar an die Trägerpartikel, wohl aber an den Analyten binden, so dass nur solche Trägerpartikel an die Sensoren gebundene werden, die zuvor einen Analyten gebunden haben.In addition to or instead of one Increasing the Mass of the analytes can also cause separation through the carrier molecules the bound analyte is measured with chemo or biosensors detectable change Experienced. This can be, for example, the possibility of binding to antibodies, that are not directly attached to the carrier particles, but bind to the analyte, so that only such carrier particles are bound to the sensors that previously bound an analyte to have.
Allgemein ist es dabei bevorzugt, wenn die Trägerpartikel über daran gebundenen Analyten an einen Chemo- oder Biosensor gebunden werden, wobei der Chemo- oder Biosensor vorzugsweise als Schwingquarz, Dickenscherschwinger, Quarzmikrowaage oder Balkenschwinger mit der schwingungsfähigen zweiten Oberfläche ausgebildet ist.In general, it is preferred if the carrier particles over there bound analytes are bound to a chemo- or biosensor, whereby the chemical or biosensor preferably as quartz crystal, Dickenscherschwinger, Quartz microbalance or beam transducer with the vibratory second surface is trained.
Bei der neuen Vorrichtung ist es bevorzugt, wenn die Einrichtung Ventile und Schläuche umfasst, über die die einzelnen Flüssigkeiten zu und von den Messzellen geleitet werden.It is with the new device preferred if the device comprises valves and hoses via which the individual liquids to and from the measuring cells.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den Figuren.There are further advantages the examples below and the figures.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above not only mentioned and the features to be explained below in the specified combination, but also in others Combinations or alone can be used without the frame to leave the present invention.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden in der nachstehenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:Embodiments of the invention are shown in the figures and are shown in the following Description closer explained. Show it:
Anhand des nachstehend beschriebenen Beispiels wird die Anwendung des Verfahrens gezeigt.Using the example described below the application of the method is shown.
Auf eine Goldelektrode eines Schwingquarzes (Fa. Vectron International, AT-Schnitt, Durchmesser 8,5 mm, 10 MHz) wird 50 ul Protein-A Lösung (2 mg/ml; Sigma-Aldrich) aufpipettiert. Auf dieser Protein-A Schicht werden anti-A Antikörper BS-66 (Biotest AG) immobilisiert, wobei eine funktionalisierte, gerichtete Oberfläche entsteht, da Protein-A an das Fc-Fragment des BS-66 bindet. Werden bspw. Erythrozyten über den Quarz geführt, so gehen bei Übereinstimmung die Antigene auf der Erythrozytenoberfläche mit den BS-66 eine Bindung ein und werden an die schwingungsfähige Oberfläche gebunden, dort also immobilisiert.50 μl Protein-A solution (2 mg / ml; Sigma-Aldrich) is pipetted onto a gold electrode of a quartz crystal (Vectron International, AT cut, diameter 8.5 mm, 10 MHz). Anti-A antibodies BS-66 (Biotest AG) are immobilized on this protein-A layer, whereby a functionalized, directed surface is created since protein-A binds to the Fc fragment of the BS-66. If, for example, erythrocytes are passed over the quartz, then at Über the antigens on the erythrocyte surface bind with the BS-66 and are bound to the vibratable surface, ie immobilized there.
Die Ankopplung der Erythrozyten an die schwingungsfähige Oberfläche kann auch über brückenbildende Moleküle wie z.B. Lektine oder sonstige Makromoleküle, insbesondere auch über Antikörper mit breiter Spezifität außerhalb der gängigen Blutgruppensysteme erfolgen.The coupling of the erythrocytes to the vibratory surface can also about bridging molecules such as. Lectins or other macromolecules, especially with antibodies broad specificity outside of common blood group systems respectively.
Statt der Erythrozyten könne auch andere Trägerpartikel wie z.B. Mikrospheren an die Goldelektrode gebunden werden.Instead of erythrocytes, too other carrier particles such as. Microspheres are bound to the gold electrode.
Statt eines Schwingquarzes kann auch ein Balkenschwinger, also ein Cantilever verwendet werden, wie er bspw. beschrieben ist bei Lange et al., Anal. Chem. (2002), 74(13) 3084.Instead of a quartz crystal can also a beam transducer, so a cantilever can be used like him For example, it is described in Lange et al., Anal. Chem. (2002), 74 (13) 3084th
In Ventilstellung 1 wird bei einem Antikörpersuchtest zunächst die erste Blutprobe in die Zelle 1 geleitet, so dass Erythrozyten an die Oberfläche binden können. Nach einem Waschschritt wird die zweite Blutprobe in die Zelle 1 geleitet, so dass an die immobilisierten Erythrozyten Antikörper, also Analyten aus der zweiten Probe binden können.In valve position 1, a Antibody screening first the first blood sample is passed into cell 1 so that erythrocytes to the surface can bind. After a washing step, the second blood sample is placed in cell 1 directed so that antibodies to the immobilized erythrocytes, ie Can bind analytes from the second sample.
Nach einem weiteren Waschschritt
werden die Ventile in Stellung 2 gebracht und durch Erhöhung der
Schwingungsamplitude der Oberfläche
in Zelle 1 die Erythrozyten mit ggf. daran gebundenen Analyten von
den BS-66 abgelöst.
Dann wird ein Trägermedium
durch Zelle 1 geleitet, das die Trägerpartikel, in diesem Fall
also die Erythrozyten in die zweite Zelle transportiert, wo mit
Hilfe eines Chemo- oder Biosensors überprüft wird, ob an den Erythrozyten Antikörper gebunden
sind. Auch in Zelle 2 kann ein Schwingquarz verwendet werden, der
jetzt jedoch bspw. Anti-Humanserum
trägt,
wie es nachstehend unter Bezug auf die
In
In der unten in
Die Zelle 1 wird über eine bei
In der Ventilstellung 1 gelangt eine
bei
In Ventilstellung 2 wird Puffer
Schwingquarze sind dafür bekannt,
dass sie bei externer Anregung nahe ihrer Resonanzfrequenz nur in
einem sehr schmalen Frequenzband eine Amplitudenerhöhung aufweisen.
Sie sind daher vorzüglich
dafür geeignet,
ein schwingendes System, wie z.B. Uhren, exakt auf die Resonanzfrequenz
des Quarzes zu justieren. Die Resonanzfrequenz ist nun abhängig von
der Geometrie des Quarzes und den Materialeigenschaften (mechanische,
piezoelektrische etc.). Zum Beispiel wird bei den sogenannten Dickenscherschwingern,
die aufgrund ihrer transversalen Schwingbewe gung auch in Flüssigkeitsphase eingesetzt
werden können,
bei konstanten Materialeigenschaften die Resonanzfrequenz durch
die Dicke des Quarzes bestimmt. Insbesondere ist die Resonanzfrequenz
auch von der Massenbelegung auf einer der planaren Oberflächen abhängig. Diese
Situation ist in
Wird nun ein Dickenscherschwinger mit einer biologischen Schicht versehen, die spezifisch den Analyten binden kann, so wird bei einer Bindung eine Massenänderung an der Quarzoberfläche generiert. Diese Massenänderung führt zu einer Resonanzfrequenzverschiebung, die elektrisch detektiert werden kann.Now becomes a Dickenscherschwinger provided with a biological layer that specifically the analyte can bind, so a binding becomes a change in mass on the quartz surface generated. This mass change leads to a resonance frequency shift that are electrically detected can.
Zur Bestimmung der Blutgruppe einer
Blutprobe wird genau dieser Effekt ausgenützt. Wie in
Nach diesem Prinzip konnten bisher ohne Filterung der Blutprobe die Blutgruppen AB0 und der Rhesusfaktor nachgewiesen werden.According to this principle, without Filtering the blood sample, the blood groups AB0 and the rhesus factor can be detected.
Für eine komplette Blutgruppenbestimmung wird jedoch auch die Gegenprobe und der Antikörper-Suchtest (AKS) verlangt. Bei beiden Verfahren ist es erforderlich, anstatt der schweren Erythrozyten die viel leichteren Antikörper nachzuweisen. Das bringt einige Probleme mit sich, wie es weiter unten noch beschrieben wird.For a complete blood group determination will also be the cross-check and the antibody search test (AKS) demands. Both procedures require it instead to detect the much lighter antibodies of the heavy erythrocytes. This creates some problems, as described below becomes.
Um nun Antikörper gegen die Antigene, die auf
den Erythrozyten
Wird Humanserum
Es ist daher vorteilhaft, die spezifischen
Antikörper
Zuerst werden die Erythrozyten
Nun wird die Amplitude des Quarzes
durch Erhöhen
der angelegten Spannung so gesteigert, dass die Energie ausreicht,
um die Bindung zwischen den Erythrozyten
Die „abgerissenen" Erythrozyten
Man hat somit erreicht, dass „keine" unspezifischen Wechselwirkungen
Einfluss auf die Massenbelegung haben und das Signal nicht durch
die leichteren Antikörper
Anstatt der Erythrozyten
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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