DE10321963A1 - Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen Download PDFInfo
- Publication number
- DE10321963A1 DE10321963A1 DE10321963A DE10321963A DE10321963A1 DE 10321963 A1 DE10321963 A1 DE 10321963A1 DE 10321963 A DE10321963 A DE 10321963A DE 10321963 A DE10321963 A DE 10321963A DE 10321963 A1 DE10321963 A1 DE 10321963A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- transit peptide
- plant
- predetermined
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 133
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 33
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 83
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 20
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 claims description 3
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 3
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 claims 2
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 claims 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 10
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 8
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 5
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 5
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 4
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 4
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 4
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 3
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- -1 ketohydrolase Proteins 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010017464 Fructose-Bisphosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102000027487 Fructose-Bisphosphatase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 2
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 2
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 description 2
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 108091054761 ethylene receptor family Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 108010006808 stromal processing peptidase Proteins 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 108010020589 trehalose-6-phosphate synthase Proteins 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 108091000130 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase Proteins 0.000 description 1
- 108010010888 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010041188 2,4-dichlorophenoxyacetic acid monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 2-oxopropanoic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC(=O)C(O)=O MWMOPIVLTLEUJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710168820 2S seed storage albumin protein Proteins 0.000 description 1
- 102100029103 3-ketoacyl-CoA thiolase Human genes 0.000 description 1
- GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 4'-Methylacetophenone Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C)C=C1 GNKZMNRKLCTJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150012623 AGL15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003902 Acetyl-CoA C-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001134629 Acidothermus Species 0.000 description 1
- 101710146995 Acyl carrier protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004539 Acyl-CoA Oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108020001558 Acyl-CoA oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000743339 Agrostis Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 1
- 235000003840 Amygdalus nana Nutrition 0.000 description 1
- 244000296825 Amygdalus nana Species 0.000 description 1
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000207875 Antirrhinum Species 0.000 description 1
- 241000208306 Apium Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 235000003911 Arachis Nutrition 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241001106067 Atropa Species 0.000 description 1
- 235000005781 Avena Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000209128 Bambusa Species 0.000 description 1
- 241000339490 Brachyachne Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209200 Bromus Species 0.000 description 1
- JSMRMEYFZHIPJV-UHFFFAOYSA-N C1C2CCC1C2 Chemical compound C1C2CCC1C2 JSMRMEYFZHIPJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 240000001548 Camellia japonica Species 0.000 description 1
- 241000218236 Cannabis Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 241000219312 Chenopodium Species 0.000 description 1
- 206010008583 Chloroma Diseases 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 235000010521 Cicer Nutrition 0.000 description 1
- 241000220455 Cicer Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 241000723377 Coffea Species 0.000 description 1
- 241000209205 Coix Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 244000024469 Cucumis prophetarum Species 0.000 description 1
- 235000010071 Cucumis prophetarum Nutrition 0.000 description 1
- 108010025880 Cyclomaltodextrin glucanotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 101150048270 DHPS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000209210 Dactylis Species 0.000 description 1
- 241000208296 Datura Species 0.000 description 1
- 241000208175 Daucus Species 0.000 description 1
- 102000001477 Deubiquitinating Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010093668 Deubiquitinating Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000001879 Digitalis lutea Species 0.000 description 1
- 235000005903 Dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 244000281702 Dioscorea villosa Species 0.000 description 1
- 235000000504 Dioscorea villosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 235000001942 Elaeis Nutrition 0.000 description 1
- 241000512897 Elaeis Species 0.000 description 1
- 235000007351 Eleusine Nutrition 0.000 description 1
- 241000209215 Eleusine Species 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- 241000220223 Fragaria Species 0.000 description 1
- 241000208152 Geranium Species 0.000 description 1
- 108700023224 Glucose-1-phosphate adenylyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001483 Glycogen Synthase Proteins 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000043261 Hevea brasiliensis Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001052477 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 1
- 241000208278 Hyoscyamus Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 description 1
- 235000021506 Ipomoea Nutrition 0.000 description 1
- 241000207783 Ipomoea Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000208822 Lactuca Species 0.000 description 1
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 241000208204 Linum Species 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 241000709757 Luteovirus Species 0.000 description 1
- UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N Lycopene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1C(=C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2C(=C)CCCC2(C)C UPYKUZBSLRQECL-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 1
- 235000002262 Lycopersicon Nutrition 0.000 description 1
- JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N Lycophyll Natural products OC/C(=C/CC/C(=C\C=C\C(=C/C=C/C(=C\C=C\C=C(/C=C/C=C(\C=C\C=C(/CC/C=C(/CO)\C)\C)/C)\C)/C)\C)/C)/C JEVVKJMRZMXFBT-XWDZUXABSA-N 0.000 description 1
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000121629 Majorana Species 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 241001093152 Mangifera Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 241000219823 Medicago Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000213996 Melilotus Species 0.000 description 1
- 235000000839 Melilotus officinalis subsp suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 102100024189 Mitogen-activated protein kinase 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 241001162910 Nemesia <spider> Species 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241001330001 Olyreae Species 0.000 description 1
- 241000219830 Onobrychis Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101710149663 Osmotin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000215747 Pachyrhizus erosus Species 0.000 description 1
- 235000001591 Pachyrhizus erosus Nutrition 0.000 description 1
- 235000018669 Pachyrhizus tuberosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000209117 Panicum Species 0.000 description 1
- 235000006443 Panicum miliaceum subsp. miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009037 Panicum miliaceum subsp. ruderale Nutrition 0.000 description 1
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 1
- 241000208181 Pelargonium Species 0.000 description 1
- 241000209046 Pennisetum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 240000007377 Petunia x hybrida Species 0.000 description 1
- 241001330025 Pharoideae Species 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000746981 Phleum Species 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 101710173432 Phytoene synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000219843 Pisum Species 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000209048 Poa Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 102000017033 Porins Human genes 0.000 description 1
- 108010013381 Porins Proteins 0.000 description 1
- 241000709769 Potato leafroll virus Species 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000011432 Prunus Nutrition 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000218206 Ranunculus Species 0.000 description 1
- 241000220259 Raphanus Species 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 235000011483 Ribes Nutrition 0.000 description 1
- 241000220483 Ribes Species 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- 241001092459 Rubus Species 0.000 description 1
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000209051 Saccharum Species 0.000 description 1
- 241001106018 Salpiglossis Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000780602 Senecio Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000005775 Setaria Nutrition 0.000 description 1
- 241000232088 Setaria <nematode> Species 0.000 description 1
- 241000220261 Sinapis Species 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000208292 Solanaceae Species 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000087212 Stenotaphrum Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020000005 Sucrose phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 108700006291 Sucrose-phosphate synthases Proteins 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000006474 Theobroma bicolor Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241001312519 Trigonella Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 102000018690 Trypsinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010027252 Trypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 108060008747 Ubiquitin-Conjugating Enzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000003431 Ubiquitin-Conjugating Enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000018390 Ubiquitin-Specific Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010066496 Ubiquitin-Specific Proteases Proteins 0.000 description 1
- 244000025271 Umbellularia californica Species 0.000 description 1
- 235000008674 Umbellularia californica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 241000219977 Vigna Species 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 1
- 241000219995 Wisteria Species 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 108091000039 acetoacetyl-CoA reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010050516 adenylate isopentenyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 244000193174 agave Species 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N cinnamic acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003211 cis-1,4-polyisoprene Polymers 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 235000018597 common camellia Nutrition 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 101150019926 glgA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150065899 glgA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150037310 glgM gene Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003898 horticulture Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N lycopene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CCC=C(C)C OAIJSZIZWZSQBC-GYZMGTAESA-N 0.000 description 1
- 229960004999 lycopene Drugs 0.000 description 1
- 235000012661 lycopene Nutrition 0.000 description 1
- 239000001751 lycopene Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 235000005739 manihot Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 1
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N o-dihydroxy-benzene Natural products OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000014774 prunus Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000000614 rib Anatomy 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 108010031092 starch-branching enzyme II Proteins 0.000 description 1
- 108010076424 stilbene synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000892 thaumatin Substances 0.000 description 1
- 235000010436 thaumatin Nutrition 0.000 description 1
- ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N trans-isorenieratene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/c1c(C)ccc(C)c1C)C=CC=C(/C)C=Cc2c(C)ccc(C)c2C ZCIHMQAPACOQHT-ZGMPDRQDSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8221—Transit peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/08—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a chloroplast localisation signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in Zellen einer vorbestimmten Pflanze, wobei das Verfahren umfasst: DOLLAR A Einführen eines Vektors in Zellen, der für ein Fusionsprotein kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus umfasst: DOLLAR A (i) ein Transitpeptid, um das Fusionsprotein in Plastiden zu dirigieren, und daran anschließend DOLLAR A (ii) das gewünschte Protein, DOLLAR A wobei die C-terminalen drei Aminosäuren X·-3·X·-2·X·-1· des Transitpeptids und die N-terminale Aminosäure Z des gewünschten Proteins eine Spaltstelle X·-3·X·-2·X·-1·-Z bilden, um das Fusionsprotein zwischen X·-1· und Z zu spalten und das gewünschte Protein in Plastiden freizusetzen.
Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten heterologen Proteins in genetisch veränderten Pflanzenzellen, insbesondere in deren Plastiden.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Pflanzen haben sich zu einem attraktiven, günstigen, unendlich skalierbaren Herstellungssystem für rekombinante Proteine für pharmazeutische und industrielle Anwendungen entwickelt (Stoger et al., 2000, Plant Mol. Biol., 42, 583–590; Larrick & Thomas, 2001, Curr. Opin. Biotechnol., 12, 411–418). Die meisten Proteine, insbesondere im pharmazeutischen Bereich, sind sekretorisch. Beispielsweise werden sie zuerst als Vorläufer-Proteine mit Signalpeptiden translatiert, die sie zum endoplasmatischen Retikulum (ER) für die weitere posttranslationale Prozessierung und Kompartmentalisierung dirigieren. Das Prozessieren umfasst das korrekte Falten und Zusammenfügen, die Bildung von Disulfidbindungen und komplexe enzymatische Modifizierungen. Posttranslationale Protein-Modifizierungen im ER von tierischen und pflanzlichen Zellen können sich jedoch beträchtlich unterscheiden, insbesondere was das Glykosylierungsmuster angeht, da Pflanzen andere Typen von Kohlenhydraten bilden, die an Glykosylierungsstellen angehängt werden (Wilson, IB., 2002, Curr. Opin. Struct. Biol., 12, 569–577; Schillberg, Fischer & Emans, 2003, Cell Mol. Life Sci., 60, 433–445). In vielen Fällen ist es vorteilhaft, pflanzenspezifische posttranslationale Modifizierungen, insbesondere die Glykosylierung von in Pflanzen produzierten pharmazeutischen Proteinen, zu verhindern, da diese in Patienten allergische Reaktionen auslösen können. Chloroplasten besitzen ihr eigenes Qualitätskontrollsystem für Proteine und können wie das ER für die korrekte Bildung von Disulfidbindungen und die Proteinfaltung sorgen (Dickson et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 11829–11835). Die Glykosylierung, die üblicherweise keine Rolle für die Proteinaktivität spielt, kann mittels zweier Verfahren vermieden werden: a) Durch Dirigieren (targeting) des gewünschten Proteins in verschiedene subzelluläre Kompartlmente für das Prozessieren, z.B. in Chloroplasten; b) Exprimieren des gewünschten Proteins in Plastiden von Pflanzen durch Herstellen von transplastomischen Pflanzen. Der zweite Ansatz ist nicht für die Expression von Proteinen geeignet, die eine andere N-terminale Aminosäure als Methionin (M) benötigen. Es wurde versucht, dieses Problem durch Expression des humanen Somatotropins in transplastomischen Tabak als Ubiquitin-Fusion zu lösen, um nach Abspaltung des Ubiquitins den gewünschten N-Terminus zu erhalten (Staub et al., 2000, Nature Biotechnol., 18, 333–338). Ubiquitin-Fusionsproteine werden durch die Ubiquitin-Protease unmittel stromab des C-terminalen Restes von Ubiquitin gespalten, was die Herstellung rekombinanter Proteine mit N-terminalen Resten nach Wahl außer Prolin erlaubt (Baker, R.T., 1996, Curr. Opin. Biotechnol., 7, 541–546). In Chloroplasten gibt es jedoch keine Ubiquitin-spezifische Protease, und die Prozessierung der Ubiquitin-Somatotropinfusion geschah ausschließlich während der Extraktion des Proteins, was zu einem hohen Maß (bis zu 70%) nicht-prozessiertem Somatotropin führte.
- Es gab Versuche, außerhalb von Plastiden exprimierte heterologe Proteine in die Plastiden von Pflanzenzellen zu dirigieren (
US 6 063 601 US 6 130 366 ). Dies setzt die Fusion des gewünschten Proteins mit einem N-terminalen Transitpeptid voraus. Das Transitpeptid hat die Funktion, die Translokation durch die Membranen der Plastiden zu erleichtern. In den Plastiden wird das Transitpeptid durch eine plastidäre Protease abgespalten. Einzelheiten der Spaltstellen von natürlichen plastidendirigierten (plastid targeted) Pflanzenproteinen wurden untersucht (Gavel & Von Heijne 1990, FEBS Lett., 261, 455–458). Diese Untersuchungen betreffen gut angepasste natürliche Proteine bestimmter Pflanzen. Heterologe Proteine sind jedoch nicht durch die Evolution an pflanzliche Plastide angepasst. Daher besteht das allgemeine Problem, Fusionsproteine aus einem Transitpeptid und einem gewünschten heterologen Protein sowie einer Sequenz um die erwartete Spaltstelle herum zu konstruieren, um die effiziente und definierte Spaltung des Fusionsproteins zur Herstellung des gewünschten Proteins in hoher Qualität, insbesondere mit hoher N-terminaler Sequenzgenauigkeit, sicherzustellen. - Es ist daher eine Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten heterologen Plastiden-dirigierten Proteins bereitzustellen, wobei die gewünschte N-terminale Sequenz des gewünschten Proteins mit hoher Verlässlichkeit leicht erhalten wird.
- Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in Zellen einer vorbestimmten Pflanze, wobei das Verfahren umfasst:
Einführen eines Vektors in Zellen, der für ein Fusionsprotein kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus umfasst: - (i) ein Transitpeptid, um das Fusionsprotein in Plastiden zu dirigieren, und daran anschließend
- (ii) das gewünschte
Protein,
wobei die C-terminalen drei Aminosäuren X–3X–2X–1 des
Transitpeptids und die N-terminale
Aminosäure
Z des gewünschten
Proteins eine Spaltstelle
- Hier wird allgemein der Ein-Buchstabe-Code für die 20 Standard-Aminosäuren verwendet. Ähnlich stehen die Symbole X–3, X–2, X–1 und Z jeweils für eine der Standard-Aminosäuren.
- Es ist allgemein akzeptiert, dass die Spaltgenauigkeit und -effizienz von der Sequenz des Transitpeptids und der Sequenz des plastidendirigierten natürlichen Proteins in der Nachbarschaft der Spaltposition abhängt. Es gibt jedoch keine allgemeine Lehre, die auf Kombinationen eines zufälligen Transitpeptids und eines ausgewählten gewünschten Proteins zur Anwendung auf heterologe Proteine anwendbar wäre.
- Die Länge der C-terminalen Sequenz des Transitpeptids und die Länge der N-terminalen Sequenz des gewünschten Proteins, die zusammen die Spaltposition bestimmen, sind nicht genau bekannt. Für natürliche Proteine kann angenommen werden, dass diese beiden Sequenzen während der Evolution aufeinander abgestimmt wurden. Für ein heterologes Protein, das in Plastide dirigiert werden soll, muss das geeignete Transitpeptid durch Versuch und Irrtum (trial and error) bestimmt werden. Der Erfolg des Trial and Error ist nicht vorhersagbar. Durch Glück kann eine geeignete Kombination der Sequenzen gefunden werden. Die Unsicherheit ist jedoch groß und nicht kalkulierbar.
- Wir haben überraschend gefunden, dass das Problem, eine C-terminale Sequenz des Transitpeptids, die auf die N-terminale Sequenz des gewünschten Proteins abgestimmt ist, zu finden, mit höherer Erfolgsrate anhand einer Hierarchie von Kriterien gelöst werden kann. Es wurde gefunden, dass es in dieser Hierarchie in erster Näherung ausreicht, lediglich die N-terminale Aminosäure des heterologen gewünschten Proteins und die drei letzten Aminosäuren des Transitpeptids zu betrachten. Insbesondere wurde gefunden, dass jede N-terminale Aminosäure des gewünschten Proteins mit einer bestimmten Menge von geeigneten C-terminalen Aminosäure-Triaden des Transitpeptids korreliert ist.
- In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Vektor, der für das Fusionsprotein kodiert, in Pflanzenzellen eingeführt. Das gewünschte Protein kann dann in den Pflanzenzellen, z.B. in Zellkultur, exprimiert werden. Vorzugsweise wird das gewünschte Protein in vollständigen Pflanzen experimiert. Dies kann erreicht werden, indem Pflanzen aus Pflanzenzellen, die mit dem Vektor transformiert wurden, regeneriert werden. Alternativ wird der Vektor in Pflanzenzellen einer Pflanze eingeführt. Mehrere Transformations- oder Transfektionsmethoden sind für Pflanzen oder Pflanzenzellen bekannt. Dazu gehören die Agrobakterium-vermittelte Transformation, die Partikelbombardierung, die PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten, die virale Infektion usw. Für die bevorzugte Ausführungform der transienten Expression oder der Transfektion für transiente Expression wird vorzugsweise die virale Infektion oder die Agrobakterium-vermittelte Transformation eingesetzt. Die Pflanzen oder Pflanzenzellen werden mit einer Nucleotid-Sequenz (Vektor), die eine für das Fusionsprotein kodierende Kodierregion enthält, transformiert oder transfiziert. Die Transformation kann stabil transformierte Pflanzen oder Pflanzenzellen, z.B. transgene Pflanzen, erzeugen. Alternativ kann die Pflanze oder die Pflanzenzellen für die transiente Expression des Fusionsproteins transfiziert werden. Die transiente Transfektion von ausgewachsenen Pflanzen ist am bevorzugtesten.
- Der Vektor kann ein DNA-Vektor oder ein RNA-Vektor sein, je nach der Transformations- oder Transfektionsmethode. In den meisten Fällen wird er DNA sein. In einer wichtigen Ausführungsform wird die Transformation oder Transfektion jedoch mit Vektoren durchgeführt, die auf einem RNA-Virus beruhen, wobei in diesem Fall die Nucleotid-Sequenz RNA ist. Eine sehr bequeme Art besteht in der Verwendung eines DNA-Vektors, der auf einem Virus beruht. Vorzugsweise basiert der DNA-Vektor auf einem RNA-Virus, d.h., der DNA-Vektor enthält die cDNA von viralen RNA-Sequenzen zusätzlich zu der Nucleotid-Sequenz. Beispiele für Sequenzen von pflanzlichen DNA- oder RNA-Viren, die für die viralen Vektoren für diese Erfindung verwendet werden können, sind in WO 02/29068 und in WO 02/88369 beschrieben. Solche DNA-Vektoren enthalten ferner einen Transkriptionspromotor zur Erzeugung des RNA-viralen Transkripts. In diesen Ausführungsformen wird die Transformation oder Transfektion vorzugsweise über virale Transfektion, bevorzugter über die Agrobakterium-vermittelte Transformation durchgeführt.
- Für eine N-terminale Aminosäure Z eines gewünschten Proteins, das nach dem Verfahren dieser Erfindung hergestellt werden soll, wird eine Aminosäure-Triade X–3X–2X–1 aus der Gruppe von Aminosäure-Sequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt, die natürlicherweise auf der N-terminalen Seite von Z anschließend an Z in plastidendirigierten (plastid-targeted) Fusionsproteinen in Pflanzen vorkommen. Vorzugsweise wird das gewünschte Protein in Angiospermen hergestellt. In diesem Fall werden X–3X–2X–1-Triaden für ein vorbestimmtes Z ausgewählt, die natürlicherweise in Angiospermen vorkommen. Noch bevorzugter wird die Aminosäure-Sequenz (oder Triade) X–3X–2X–1 aus der Menge von Aminosäure-Sequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt, die natürlicherweise anschließend an Z in plastidendirigierten Fusionsproteinen der Familie, bevorzugter der Gattung, vorkommen, zu der die vorbestimmte Pflanze gehört. Am bevorzugtesten wird die Aminosäure-Sequenz X–3X–2X–1 aus der Menge von Aminosäure-Sequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt, die natürlicherweise anschließend an Z in plastidendirigierten Fusionsproteinen von Pflanzen vorkommen, die zu derselben Art gehören, wie die vorbestimmte Pflanze.
- Wenn Z M ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise FRV, NRE, VNC, VSC, VQC, VRC, VKC oder VPE.
- Wenn Z C ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise RGA, SIR, TIV oder VRA.
- Wenn Z I ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise AHS, GST oder VHC.
- Wenn Z A ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise ASN, ACR, AAA, FVA, HVR, ICC, IGA, IRA, IRC, ISA, ISC, IQC, QIR, KTK, KAK, PLQ, PIA, PIQ, RMG, RCM, RAQ, RVK, SAA, SCT, SLA, SIC, SIV, TCQ, TAM, TAQ, TCK, VCK, VAM, VVA, VKA, VRA, VTR, VGA, VVR, VVY, VVQ, VSC, WC oder VFA.
- Wenn Z N ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise GST, KAT oder KQS.
- Wenn Z H ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise GSD.
- Wenn Z Y ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise VAA.
- Wenn Z F ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise PSR oder RFN.
- Wenn Z P ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise IAE, RVA, RSA oder SVD.
- Wenn Z Q ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise DDN, IRA, SLG oder PGL.
- Wenn Z G ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise DSC, IIC, IVC, LRQ, SAT, VHC, VHA oder VKC.
- Wenn Z K ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise IVA, LLV, LPL, LAS, LRQ, MAA, NNN, RTD, TAE, TAQ, TEA, TSE, VAA, VEA oder VVC.
- Wenn Z R ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise AAA, IPA, MPT oder VPS.
- Wenn Z E ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise ALA, CRA, IVC, TPS oder VRA.
- Wenn Z L ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise VLA oder LSR.
- Wenn Z S ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise AGA, CLS, GKR, FPI, IAG, ITC, IVA, KAM, LCM, NMT, PAK, RLR, SVS, TTR, VCM, VVA, VAQ, VCC, VRC, VCA oder VRA.
- Wenn Z V ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise KMS, PRA, PKA, SLF, STS, TGV, TRM, VSF, VRA.
- Wenn Z D ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise ASA.
- Wenn Z T ist, ist die Triade X–3X–2X–1 vorzugsweise AVA, PAA, VAA, VAG, VSA, VNN oder WPR.
- Wenn die obigen Kombinationen von Triaden X–3X–2X–1 mit einem vorbestimmten N-terminalen Rest Z eines gewünschten Proteins verwendet wird, ist die Wahrscheinlichkeit, ein geeignetes Transitpeptid mit einem ausgewählten gewünschten Protein zu finden, so dass das erhaltene Fusionsprotein effizient in Plastiden dirigiert wird und mit hoher Spaltgenauigkeit bezüglich des N-terminalen Endes gespalten wird, um das gewünschte Protein freizusetzen, im Vergleich zu Verfahren des Standes der Technik, die auf Zufall beruhen, deutlich erhöht. Wenn mehr als ein X–3X–2X–1 für ein bestimmtes Z möglich ist, kann die Effizienz dieser X–3X–2X–1-Triaden unterschiedlich sein. Eine besonders geeignete X–3X–2X–1 Aminosäuretriade für ein bestimmtes gewünschtes Protein kann anhand eines Assays ausgewählt werden, der umfasst:
- (a) Konstruktion eines Vektors, der für ein Fusinsprotein kodiert, das in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus ein Transitpeptid mit den C-terminalen Aminosäuren X–3X–2X–1 wie in Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimmte Z definiert enthält und daran anschließend ein Reporterprotein wie das grün fluoreszierende Protein, das die vorbestimmte N-terminate Aminosäure Z enthält,
- (b) Einführen des Vektors in Pflanzenzellen, um das Fusionsprotein zu exprimieren,
- (c) Ermitteln der Spaltung des Fusionsproteins zwischen X–1 und Z in Plastiden,
- (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit einem oder mehreren weiteren X–3X–2X–1 gemäß Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimmte Z und
- (e) Auswahl eines X–3X–2X–1, das zu geeigneter Spaltung führt.
- Anstatt das Reporterprotein auf die C-terminale Seite von X–3X–2X–1 zu setzen, kann das gewünschte Protein an X–3X–2X–1 anschließend gelegt werden, wobei ein Reporterprotein dem gewünschten Protein folgen kann. Wenn das gewünschte Protein in dem Assay verwendet wird, hat die X–3X–2X–1-Triade, die in dem Assay ausgewählt wird, eine höhere Wahrscheinlichkeit, ein effizientes Dirigieren (targeting) und Spalten in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu ergeben.
- Der Einfachheit halber wird der Assay vorzugsweise in Zellkultur der Pflanzenzelle durchgeführt, wobei die Zellen von der gleichen Pflanze herrühren können, die für die Herstellung des gewünschten Proteins verwendet wird. Alternativ können Blätter einer Pflanze transient mit dem Vektor des Assays transfiziert werden. Beide Ansätze erlauben ein einfaches Einschätzen des Dirigierens des Fusionsproteins in die Plastiden sowie der Spaltung des Fusionsproteins. Das Dirigieren des Fusionsproteins in Plastiden kann z.B. ermittelt werden, indem ein fluoreszierendes Reporter-Protein, wie das grün-fluoreszierende Protein (GPF), zusammen mit Fluoreszenz-Mikroskopie, eingesetzt wird, wie es für
4 geschehen ist. Das korrekte Spalten des Fusionsproteins kann überprüft werden, indem das Reporter-Protein oder das gewünschte Protein, das an ein Reporter-Protein, wie GFP, gekoppelt sein kann, isoliert wird, gefolgt von N-terminalem Sequenzieren. Insgesamt erlaubt der Assay eine weitere Steigerung der Erfolgsrate, ein Transitpeptid aufzufinden, das für ein in Plastiden zu dirigierendes gewünschtes Protein geeignet ist. - Bezüglich des für das Verfahren der Erfindung zu verwendenden Transitpeptids bestehen keine besonderen Beschränkungen. Es ist jedoch vorteilhaft, ein Plastid-Transitpeptid zu verwenden, das aus einer Pflanze bekannt ist, die mit der vorbestimmten Pflanze des erfindungsgemäßen Verfahrens verwandt ist. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren in Zellen von zweikeimblättrigen Pflanzen oder in zweikeimblättrigen Pflanzen durchgeführt wird, hat ein bevorzugtes Transitpeptid in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus die Sequenz MASSMLSSAA VVATRASAAQ ASMVAPFTGL KSAASFPVTR KQNNLDITSI ASNGGRX–3X–2X–1, wenn das Verfahren der Erfindung in Zellen von einkeimblättrigen Pflanzen oder in einkeimblätterigen Pflanzen durchgeführt wird, hat ein bevorzugtes Transitpeptid in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus die Sequenz MAPTVMASSA TTVAPFQGLK STAGRLPVAR RSSGSLGSVS NGGRX–3X–2X–1.
- Keine besonderen Beschränkungen bestehen hinsichtlich des gemäß der Erfindung herzustellenden gewünschten Proteins. Das gewünschte Protein kann bakteriellen, viralen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein, oder es kann künstlich entworfen sein. Das gewünschte Protein kann ein landwirtschaftliches Merkmal sein, ein menschliches oder tierisches Protein für die Gesundheit, ein Immun-Antwort-Protein, ein Polypeptid-Hormon usw.
- KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
-
1 . Peptid-Sequenzen von Transitpeptiden der kleinen Untereinheit von Rubisco aus neun verschiedenen Dicotyledonen und, unten, die daraus abgeleitete Konsensus-Sequenz. -
2 . Peptid-Sequenzen von Transitpeptiden der kleinen Untereinheit von Rubisco aus sechs verschiedenen Arten von Monocotyledonen und, unten, die daraus abgeleitete Konsensus-Sequenz. -
3 (A, B) zeigt schematisch die Vektoren pICH5300 (A) und pICH5320 (B). -
4 zeigt die transiente Expression von GFP in Tabak (A, C) und in Weizen (B, D) in epidermalen Zellen. A, B: GFP ohne Transitpeptid; C: GFP-Fusion mit einem synthetischen Transitpeptid für Dicotyledonen; D: GFP-Fusion mit einem synthetischen Transitpeptid für Monoctyledonen. -
5 zeigt Konstrukte zum Screening nach optimalen X–3X–2X–1-Triaden für ein gewünschtes Protein mit einer N-terminalen Aminosäure Z. TP: Für das Transitpeptid ohne die C-terminalen Aminosäuren X–3X–2X–1 kodierende Sequenz; GOI: gewünschtes Gen; GFP: für das grünfluoreszierende Protein kodierende Sequenz; pr1 und pr2: Überlappende Primer für das Design und das Klonieren der Region, die für die X–3X–2X–1-Z-Sequenz kodiert: RS1 und RS2: gebräuchliche Restriktionsstellen. -
6 zeigt die Aminosäure-Sequenzen aller vorhergesagter Typen von Fusionsproteinen, um ein gewünschtes Protein (Somatotropin oder Interferon-α-2b) in Plastiden mittels eines synthetischen Transitpeptids zu dirigieren. Die Fusionsproteine sind so entworfen, dass die benötigte N-terminale Aminosäure-Sequenz des gewünschten Proteins nach Abspalten des Transitpeptids erhalten wird. Unterstrichen: synthetisches Transitpeptid; eingerahmt: vorhergesagte Varianten von X–3X–2X–1-Triaden als C-terminale Aminosäuren des Transitpeptids; fettgedruckt: erste Aminosäure-Sequenz des gewünschten Proteins. -
7 zeigt die für die Fusionsproteine von5 kodierenden DNA-Sequenzen. -
8 zeigt schematisch die T-DNA-Regionen der Binärvektoren pICH14061 und pICH14071. - DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Das allgemeine Prinzip der Erfindung ist wie folgt: Ein Gen, das für das Fusionsprotein TP(XXX)-(Z)P (in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus) kodiert, umfassend:
- (i) ein Chloroplasten-Transitpeptid TP(X–3X–2X–1) mit den C-terminalen Aminsäure-Resten X–3X–2X–1 und daran anschließend
- (ii) ein gewünschtes Protein (Z)P, worin (Z) für die N-terminale Aminosäure des gewünschten Proteins P steht,
- Die in Tabelle 1 gezeigten Daten sind das Ergebnis einer Analyse der Spaltstellen von Transpeptiden von ungefähr 400 kernkodierten Proteinen, die in Chloroplasten dirigiert werden, aus öffentlich zugänglichen Datenbanken. Einige X–3X–2X–1-Triaden entsprechen dem Spaltmotif (I/V)-X-(A/C)-A, das von Gavel & Von Heijne, 1990, FEBS Lett., 261, 455–458, vorgeschlagen wurde. Bei der Zusammenstellung von Tabelle 1 wurde das mögliche Entfernen von 1 bis 2 Aminosäuren vom N-Terminus des gewünschten Proteins nach dem Abspalten des Transitpeptids berücksichtigt (Emanuelsson, Nielsen & Heijne, Protein Sci., 8, 987–984). Wir haben geeignete X–3X–2X–1-Triaden für beinahe alle möglichen N-terminalen Aminosäure-Reste Z, mit Ausnahme von Tryptophan (trp, W) gefunden. Gemäß der N-End-Regel destabilisiert ein Tryptophan am N-Terminus Proteine in eucaryotischen und prokaryotischen Zellen jedoch, was die Halbwertszeit eines Proteins auf 2 bis 3 Minuten vermindert (Varshavsky, A., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 12142–12149).
- Ferner haben wir Sequenz-Alignments von Transitpeptiden der kleinen Untereinheit von RUBISCO aus verschiedenen Pflanzenarten dazu verwendet, künstliche Konsensus-Transitpeptide zu schaffen, die zum effizienten Dirigieren eines gewünschten Proteins in die Plastiden von Dicotyledonen (
1 ) und Monocotyledonen (2 ) geeignet sind. Die Einzelheiten des Designs solcher Sequenzen und Tests auf ihre Funktionsfähigkeit sind in Beispiel 1 beschrieben. Konstrukte, die Fusionen mit GFP aus künstlichen Transitpeptiden tragen, wurden entworfen (3A ,3B ) und mittels Mikroprojektilbombardierung von Tabak- und Weizenblättern getestet. Die in4 gezeigten Ergebnisse bestätigen, dass die in3A ,3B angegebenen künstlichen Transitpeptide das Reporter-Protein wirkungsvoll in Chloroplasten von Monocotyledonen und Dicotyledonen dirigieren. Die Transitpeptide wurden so entworfen, dass sie eine minimale Homologie mit den DNA-Sequenzen aufweisen, die für die Transitpeptide kodieren, die zum Auffinden der Konsensus-Sequenz verwendet wurden, jedoch ohne die Effizienz zum Dirigieren zu beeinträchtigen. Dies wurde als Vorsichtsmaßnahme getan, um ein mögliches Transgen-Silencing infolge einer Homologie eines wirtskodierten Transitpeptids zu dem Transgen zu vermeiden. - Die wie in Beispiel 1 beschrieben entworfenen Sequenzen können zum Testen aller möglichen Kombinationen eines spezifischen Z mit X–3X–2X–1-Triaden verwendet werden. Ein Schema des Experiments ist in Beispiel 2 beschrieben.
- In Beispiel 3 wird die Verwendung der künstlichen Transitpeptide zum Dirigieren des humanen Wachstumshormons Somatotropin und von humanem Interferon-α-2b in Chloroplasten von Nicotiana benthamiana-Pflanzen verwendet. Beide Proteine sind sekretorisch und haben in der prozessierten Form (nach Abspalten des Transitpeptids) Phenylalanin (F) für Somatotropin und ein Cystein (C) für Interferon-α-2b als N-Terminus.
6 zeigt in Kästchen die möglichen X–3X–2X–1-Triaden der betreffenden N-Termini der gewünschten Proteine. Die für die Fusionsproteine von6 kodierenden Konstrukte wurden in den 3'-Provektor (8 ) eines viralen Expressionssystems subkloniert und transient in Nicotiana benthamiana-Pflanzen exprimiert. Alternativ können Vektoren, die für die Fusionsproteine kodieren, stabil in die pflanzliche nukleäre DNA transformiert werden. - Verschiedene Methoden können dazu verwendet werden, einen DNA- oder RNA-Vektor in Pflanzenzellen einzuführen, darunter die direkte Einführung des Vektors in Pflanzenzellen mittels Mikroprojektil-Bombardierung, Elektroporation oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten (für eine Übersicht siehe: Gelvin, S.B., 1998, Curr. Opin. Biotechnol., 9, 227–232; Hansen & Wright, 1999, Trends Plant Sci., 4, 226–231). Pflanzliche RNA- oder DNA-Viren sind auch effiziente Verabreichungssysteme (Hayes et al., 1988, Nature, 334, 179–182; Palmer et al., 1999, Arch. Virol., 144, 1345–1360; Lindbo et al., 2001, Curr. Opin. Plant. Biol., 4, 181–185). Diese Vektoren können ein Transgen entweder stabil in das Genom der Pflanze integrieren (direkte oder Agrobakterium-vermittelte DNA-Integration) oder für die transiente Expression des Transgens ("Agroinfiltration").
- Bevorzugte Pflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. alle Pflanzenarten, vor allem jedoch Pflanzenarten, die in der Landwirtschaft oder im Gartenbau wichtig sind. Übliche Nutzpflanzen zur Verwendung in dieser Erfindung sind u.a. Alfalfa, Gerste, Bohnen, Raps, Futtererbsen, Baumwolle, Mais, Klee, Lotus, Linsen, Lupinen, Hirse, Hafer, Erbsen, Erdnüsse, Reis, Roggen, Süßklee, Sonnenblumen, süße Erbsen, Sojabohnen, Sorghum triticale, Yams-Bohnen, Seidenbohnen, Wicken, Weizen, Wisteria und Nusspflanzen. Pflanzenarten für diese Erfindung sind u.a. solche, die zu den Gramineae, Kompositeae, Solanaceae und Rosaceae gehören. Weitere Pflanzenarten für diese Erfindung sind solche der folgenden Gattungen: Arabidopsis, Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Bambusa, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium, Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Curcubita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon, Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Oryza, Panicum, Pelargonium, Pennisetum, Petunia, Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rubus, Saccharum, Salpiglossis, Secale, Senecio, Setaria, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Triticum, Vicia, Vigna, Vitis, Zea, und Olyreae, Pharoideae und viele andere.
- In dieser Erfindung sind Pflanzenarten, die nicht in die Nahrungskette eingehen, besonders bevorzugt für die Erzeugung pharmazeutischer oder technischer Proteine. Unter diesen sind Nicotiana-Arten besonders bevorzugt, da diese Arten leicht zu transformieren und zu kultivieren sind und es gut entwickelte Expressionsvektorsysteme (insbesondere virale Vektoren) gibt.
- Gewünschte Gene, deren funktionelle oder nichtfunktionelle Fragmente oder deren künstliche Derivate, die mit dieser Erfindung in Pflanzen oder Pflanzenzellen exprimiert werden können, sind unter anderem: Stärke-modifizierende Enzyme (Stärke-Synthase, Stärke-phosphorylierendes Enzym, debranching enzyme, Stärke- verzweigendes Enzym, Stärke-verzweigendes Enzym II, granule bound Stärke-Synthase), Sucrosephosphat-Synthase, Sucrose-Phosphorylase, Polygalacturonase, Polyfructan-Sucrose, ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, Cyclodextrin-Glycosyltransferase, Fructosyl-Transferase, Glycogen-Synthase, Pectin-Esterase, Aprotinin, Avidin, Bacterielle Levansucrase, E.coli glgA Protein, MAPK4 und Orthologe, Stickstoff-Assimilierungs/Methabolismus-Enzyme, Glutamin-Synthase, pflanzliches Osmotin, 2S Albumin, Thaumatin, ortspezifische Recombinasen/Integrasen (FLP, Cre, Recombinase, Int, SSVI Integrase R, Integrase phiC31, oder ein aktives Fragment oder Variante derselben), Isopentenyl-Transferase, Sca M5 (Sojabohnen-Calmodulin), Coleopteranartige Toxine oder ein insektizidaktives Fragment, Fusionsproteine des Ubiquitinkonjugierenden Enzyms (E2), Enzyme die Lipide, Aminosäuren, Zucker, Nukleinsäuren und Polysaccharide metabolisieren, Superoxide-Dismutase, inaktives Proenzym einer Protease, pflanzliche Proteintoxine, Merkmale die in faserproduzierenden Pflanzen Fasern verändern, gegen Coleoptera-aktives Toxin von Bacillus thuringiensis (Bt2 Toxin, Insektizides Kristallprotein (ICP), CryIC Toxin, Delta-Endotoxin, Polyopeptidtoxin, Protoxin etc.), insektenspezifisches Toxin AalT, Cellulose-abbauende Enzyme, E1 Cellulose von Acidothermus celluloticus, Lignin-modifizierende Enzyme, Cinnamoylalkohol-Dehydrogenase, Trehalose-6-phosphat-Synthase, Enzyme des Cytokinin metabolic pathway, HMG-CoA Reductase, E. coli anorganische Pyrophosphatase, Samenlagerungsprotein (seed storage protein), Erwinia herbicola Lycopen-Synthase, ACC Oxidase, pTOM36 kodiertes Protein, Phytase, Ketohydrolase, Acetoacetyl-CoA-Reductase, PHB (Polyhydroxybutanoate)-Synthase, Acyl-carrier-protein, Napin, EA9, Phytoen-Synthase aus nichthöheren Pflanzen, pTOM5-kodiertes Protein, ETR (Ethylen-Rezeptor), plastidäre Pyruvat-Phosphat-Dikinase, Nematoden-induzierbares Transmembranporenprotein, merkmalsfördernde photosynthetische oder plastidäre Funktion der Pflanzenzelle, Stilben-Synthase, Enzyme, die Phenole hydroxylieren können, Catechol-Dioxygenase, Catechol-2,3-Dioxygenase, Chloromuconat-Cycloisomerase, Anthranilat-Synthase, Brassica AGL15 Protein, Fructose-1,6-Biphosphatase (FBPase), AMV RNA3, PVY Replicase, PLRV Replikase, Potyvirus-Hüllprotein, CMV-Hüllprotein, TMV-Hüllprotein, Luteovirus Replicase, MDMV messenger RNA, mutierte geminivirale Replicase, Umbellularia californica C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, pflanzliche C10 or C12:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase, C14:0 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase (luxD), pflanzlicher Synthasefaktor A, pflanzlicher Synthasefaktor B, 6-Desaturase, ein Protein mit einer enzymatischen Aktivität in der peroxysomalen β-Oxidation von Fettsäuren in Pflanzenzellen, Acyl-CoA-Oxidase, 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, Lipase, Acetyl-CoA-Carboxylase aus Mais, 5-Enolpyruvylschikimat-3-Phosphat-Synthase (EPSP), Phosphinothricin-Acetyl-Transferase (BAR, PAT), CP4 Protein, ACC-Deaminase, Proteine mit posttranslationaen Spaltstellen, DHPS Gen, das Sulfonamid-Resistenz verleiht, bakterielle Nitrilase, 2,4-D Monooxygenase, Acetolactat-Synthase oder Acetohydroxysäure-Synthase (ALS, AHAS), Polygalacturonase, Taq Polymerase, bakterielle Nitrilase, viele andere Enzyme aus Bakterien oder Phagen, darunter Restriktionsendonucleasen, Methylasen, DNA- und RNA-Ligasen, DNA- und RNA-Polymerasen, Reverse Transcriptase, Nucleasen (Dnasen und Rnasen), Phosphatasen, Transferasen, usw.
- Die vorliegende Erfindung kann auch für Zwecke der molekularen Landwirtschaft (molecular farming) sowie für die Reinigung wertvoller und pharmazeutisch wichtiger Proteine verwendet werden, darunter industrielle Enzyme (Zellulasen, Lipasen, Proteasen, Phytasen usw.) und Faserproteine (Collagen, Seidenprotein von Spinnen usw.). Proteinwirkstoffe für Mensch und Tier können nach dieser Erfindung exprimiert und gereinigt werden. Beispiele für solche gewünschten Proteine sind unter anderem Proteine der Immun-Antwort (monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper, T-Zell-Rezeptoren usw.), Antigene, darunter solche aus pathogenen Mikroorganismen, Kolonie-stimulierende Faktoren, Relaxine, Polypeptid-Hormone, darunter Somatotropin (HGH) und Proinsulin, Cytokine und deren Rezeptoren, Interferone, Wachstumsfaktoren und Koagulationsfaktoren, enzymatisch aktives lysosomales Enzym, fibrinolytische Polypeptide, Blutgerinnungsfaktoren, Trypsinogen, a1-Antitrypsin (AAT), humanes Serumalbumin, Glucocerebrosidase, natives Cholera-Toxin B, sowie funktionskonservative Proteine wie Fusionen, Mutantenversionen und synthetische Derivate der oben genannten Proteine.
- BEISPIEL 1
- Erzeugung von Sequenzen von synthetischen Transitpeptiden für Monocotyledonen und Dicotyledonen
- a) Transitpeptid für das Dirigieren in Plastiden in Dicotyledonen
- Die Aminosäure-Konsensus-Sequenz von neun Chloroplasten-Transitpeptiden der Vorläuferproteine der kleinen Untereinheit von Rubisco (rbcs) aus verschiedenen Dicotyledonen wurde mittels Analyse mit dem DNASTAR-Software-Paket erzeugt (
1 ). Die für das Konsensus-Transitpeptid kodierende Nucleotid-Sequenz wurde unter Berücksichtigung des Kodongebrauchs in Dicotyledonen entworfen: Jedes Triplett wurde nach seinem häufigsten Gebrauch ausgewählt, was einen durchschnittlichen GC-Gehalt von 43,6% ergab. Ferner wurde versucht, auf der Ebene der cDNA den Unterschied zwischen der cDNA-Konsensus-Sequenz und den cDNAs, die für die Transitpeptide der Dicotyledonen kodieren, die zum Auffinden der Konsensus-Sequenz verwendet wurden, zu maximieren. Die erhaltene und von geeigneten Restriktionsstellen flankierte Nucleotid-Sequenz wurde de novo synthetisiert und als ClaI/NcoI-Fragment (ClaI 5'-cATCGATaac atggcttctt ctatgctttc ttctgctgct gttgttgcta ctcgtgctag tgctgctcaa gctagtatgg ttgctccttt tactggactt aagtctgctg cttcttttcc tgttactaga aagcaaaaca accttgatat tacttctatt gctagtaacg gaggaagagt tcaatgcgCC ATGG-3' NcoI) in das gewünschte Konstrukt subkloniert, um die N-terminale Translationsfusion mit dem Reporter-Gen (GFP) (siehe3A , Plasmid pICH5300) zu schaffen. - b) Transitpeptid für Monocotyledonen
- Die gleiche Strategie wie oben beschrieben wurde dazu verwendet, ein künstliches Chloroplasten-Transitpeptid für die Expression und das Plastid-Targeting in Monocotyledonen zu schaffen. Die Konsensus-Aminosäure-Sequenz aus sechs Chloroplasten-Transitpeptiden aus rbcs-Proteinen verschiedener Monocotyledonen wurde durch Sequenzanalyse mit dem DNASTAR-Software-Paket erzeugt (
2 ). Die für das Konsensus-Transitpeptid kodierende Nucleotid-Sequenz wurde unter Berücksichtigung des Kodon-Gebrauchs in Monocotyledonen entworfen: Jedes Triplett wurde nach seinem häufigsten Gebrauch ausgewählt, was einen durchschnittlichen GC-Gehalt von 71,0% in der schlussendlich erhaltenen Nucleotid-Sequenz ergab. Die Nucleotid-Sequenz, die für das Konsensus-Transitpeptid für Monocotyledonen kodiert, wurde de novo synthetisiert und als Cla1/Nco1- oder BamH1/Nco1-Fragment (ClaI/BamHI 5'-cATCGATAGG ATCCacgatg gccccaaccg tgatggcctc ctccgccacc accgtggccc cattccaggg cctcaagtcc accgccggcc tcccagtggc caggaggtcc tccggcagcc tcggcagcgt gagcaacggc ggcaggatca ggtgcgCCAT GG-3'NcoI) in den gewünschten Vektor subkloniert (siehe3B , Plasmid pICH5320). - Um die Effizienz des Targeting (Dirigieren) in Chloroplasten mit Hilfe der künstlichen Transitpeptide zu testen, wurden die Plasmide, die für die Fusion aus Transitpeptid und Reportergen kodierten, in Blattzellen von Tabak und Weizen mit Hilfe der Mikroprojektil-Bombardierung verabreicht. Die Ergebnisse ergaben ein effizientes Dirigieren von GFP in Chloroplasten sowohl in Dicotyledonen und Monocotyledonen mit Hilfe der künstlichen Transitpeptide (
4 ). - BEISPIEL 2
- Design und Test der Spaltstelle von Transitpeptiden, um einen gewünschten N-Terminus (nicht jedoch Alanin) des gewünschten Proteins zu erhalten
- Um einen benötigten N-Terminus eines gewünschten Proteins, das in Chloroplasten dirigiert wird, zu erzeugen, wurden ungefähr 400 vorhergesagte oder experimentell identifizierte Spaltstellen von Transitpeptiden von kernkodierten in Chloroplasten dirigierten Proteinen aus öffentlich zugänglichen Datenbanken analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Spaltstellen können auf ihre Eignung, einen gewünschten N-Terminus des gewünschten Proteins zu ergeben, getestet werden, indem die Konstrukte von
5 verwendet werden. Die einfachste Version (Konstrukt A) besteht aus einer Klonierstelle, die von einem Transitpeptid (TP) und einem Reporter-Gen (GFP) flankiert ist. Das erste Methionin (M) von GFP kann durch irgendeine andere Aminosäure Z ersetzt werden, um eine damit kompatible X–3X–2X–1-Triade zu finden, um eine Spaltstelle zu erzeugen. Geeignete Restriktionsstellen RS1 und RS2 können innerhalb der kodierenden Regionen von TP und GFP lokalisiert werden, die nicht weit voneinander entfernt liegen (vorzugsweise im Bereich von 30 bis 50 bp), was eine einfache Synthese von zwei überlappenden gewünschten Primern für das Einführen einer gewünschten Kombination von X–3X–2X–1 und Z in das Konstrukt erlaubt. Die erhaltenen Konstrukte können transient in Pflanzenzellen exprimiert werden, und die Komparfmentalisierung von GFP kann leicht mit Hilfe der UV-Mikroskopie verfolgt werden. Das Vorliegen des benötigten N-Terminus kann mittels Protein-Mikrosequenzieren bestätigt werden. Um die Isolierung von GFP zu erleichtern, kann das Reporter-Protein an seinem C- terminalen Ende mit einer Markierung versehen werden (z.B. mit einem 6 × HIS-tag). Ein fortschrittlichere Version des Testkonstrukts enthält eine Fusion des gewünschten Gens mit GFP (Konstrukt B,5 ), da diese genauere Daten der erwarteten Ergebnisse und des Prozessierens des gewünschten Gens in Chloroplasten erlaubt. - BEISPIEL 3
- Dirigieren (Targeting) in Chloroplasten von Somatotropin (hGH) und Interferon-α-2b unter Verwendung künstlicher Transitpeptide mit erfindungsgemäßen Spaltstellen
- Die Kodiersequenzen von Fusionsproteinen nach
6 wurden nach Standardmethoden der Molekularbiologie hergestellt und in Binärvektoren (8 ) kloniert (Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Aufl. 2, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). DNA-Konstrukte, die den in6 gezeigten Fusionsproteinen entsprechen, sind in8 gezeigt. Zwei Fusionen mit Transitpeptiden für Somatotropin und vier verschiedene Fusionen für Interferon-α-2b wurden mit X–3X–2X–1-Triaden nach Tabelle 1 für die. N-terminale Aminosäure Phenylalanin (F) oder Cystein (C) für Somatotropin bzw. Interferon-α-2b hergestellt. Die Binärvektoren von8 sind die 3'-Komponenten (Provektoren) eines Expressionssystems auf der Basis des Tabak-Mosaik-Virus (TMV), das im Detail in WO 02088369 beschrieben ist. Nicotiana benthamiana-Pflanzen wurden für die Expression beider Proteine mit Hilfe der Provektor-Technologie verwendet. Alternativ kann jedes geeignete Pflanzenexpressionssystem verwendet werden, um das Ziel dieses Experiments zu erreichen. Um die Effizienz des Targeting in Chloroplasten und des Abspaltens des Transitplastids von dem dirigierten Protein zu überprüfen, wurde das gesamte lösliche Protein aus Blattmaterial extrahiert und auf Western-Blots unter Verwendung von kommerziell erhältlichen monoklonalen Antikörpern gegen Somatotropin (Anti-hGH aus Maus, Kat.Nr.: RDI-TRK2G2-Gh29, RDI Research Diagnostic, Flanders, NJ, USA) und Interferon-α-2b (Kat.Nr. 95360-0128, Biotrend, Köln, Deutschland) analysiert. Tabelle 1. Kombinationen verschiedener Aminosäuresequenzen für eine Transitpeptid-Spaltstelle.Tabelle 2. C-terminale Enden (XXX) des Transitpeptids, welche mit mehr als einem N-terminalen Aminosäurerest (Z) des prozessierten Proteins kompatibel sind.SEQUENCE LISTING
Claims (14)
- Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Proteins in Zellen einer vorbestimmten Pflanze, wobei das Verfahren umfasst: Einführen eines Vektors in Zellen, der für ein Fusionsprotein kodiert, das vom N-Terminus zum C-Terminus umfasst: (i) ein Transitpeptid, um das Fusionsprotein in Plastiden zu dirigieren, und daran anschließend (ii) das gewünschte Protein, wobei die C-terminalen drei Aminosäuren X–3X–2X–1 des Transitpeptids und die N-terminale Aminosäure Z des gewünschten Proteins eine Spaltstelle
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz X–3X–2X–1 aus der Menge der anschließend an Z in plastidendirigierten Fusionsproteinen in natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt wird, die in der Pflanzenfamilie vorkommen, zu der die vorbestimmte Pflanze gehört.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz X–3X–2X–1 aus der Gruppe der anschließend an Z in plastidendirigierten Fusionsproteinen in natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt wird, die in der Pflanzengattung vorkommen, zu der die vorbestimmte Pflanze gehört.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz X–3X–2X–1 aus der Menge der anschließend an Z in plastidendirigierten Fusionsproteinen in natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzen X–3X–2X–1 ausgewählt wird, die in der Pflanzenart vorkommen, zu der die vorbestimmte Pflanze gehört.
- Das Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Sequenz X–3X–2X–1 je nach der Aminosäure Z des gewünschten Proteins gemäß der folgenden Korrelationstabelle ausgewählt wird:wobei alle Aminosäuretriaden in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus angegeben sind.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei für Z = A, X–3X–2X–1 gleich ASN, ACR, AAA, FVA, HVR, ICC, IGA, IRA, IRC, ISA, ISC, IQC, QIR, KTK, KAK, PLQ, PIA, PIQ, RMG, RCM, RAQ, RVK, SAA, SCT, SLA, SIC, SIV, TCQ, TAM, TAQ, TCK, VCK, VAM, VVA, VKA, VRA, VTR, VGA, VVR, VVY, VVQ, VSC, WC oder VFA ist.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei für ein vorbestimmtes Z und ein gegebenes Transitpeptid eine geeignete Triade von C-terminalen Aminosäuren X–3X–2X–1 des Transitpeptids anhand eines Assays ausgewählt wird, der umfasst: (a) Konstruktion eines Vektors, der für ein Fusinsprotein kodiert, das in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus ein Transitpeptid mit den C-terminalen Aminosäuren X–3X–2X–1 wie in Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimmte Z definiert enthält und daran anschließend ein Reporterprotein wie das grün fluoreszierende Protein, das die vorbestimmte N-terminale Aminosäure Z enthält, (b) Einführen des Vektors in Pflanzenzellen, um das Fusionsprotein zu exprimieren, (c) Ermitteln der Spaltung des Fusionsproteins zwischen X–1 und Z in Plastiden, (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit einem oder mehreren weiteren X–3X–2X–1 gemäß Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimtme Z und (e) Auswahl eines X–3X–2X–1, das zu geeigneter Spaltung führt.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei für ein vorbestimmtes Z und ein gegebenes Transitpeptid eine geeignete Triade von C-terminalen Aminosäure X–3X–2X–1 des Transitpeptids anhand eines Assays ausgewählt wird, der umfasst: (a) Konstruktion eines Vektors, der für ein Fusinsprotein kodiert, das in Richtung vom N-Terminus zum C-Terminus ein Transitpeptid mit den C-terminalen Aminosäuren X–3X–2X–1 wie in Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimmte Z definiert enthält und daran anschließend das gewünschte Protein, das die vorbestimmte N-terminale Aminosäure Z enthält, gefolgt von einem Reporterprotein wie dem grün fluoreszierenden Protein, (b) Einführen des Vektors in Pflanzenzellen, um das Fusionsprotein zu exprimieren, (c) Ermitteln der Spaltung des Fusionsproteins zwischen X–1 und Z in Plastiden, (d) Wiederholen der Schritte (a) bis (c) mit einem oder mehreren weiteren X–3X–2X–1 gemäß Anspruch 5 oder 6 für das vorbestimtme Z und (e) Auswahl eines X–3X–2X–1, das zu geeigneter Spaltung führt.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Transitpeptid die Sequenz MASSMLSSAA VVATRASAAQ ASMVAPFTGL KSAASFPVTR KQNNLDITSI ASNGGR stromaufwärts der Spaltstelle aufweist.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Transitpeptid die Sequenz MAPTVMASSA TTVAPFQGLK STAGRLPVAR RSSGSLGSVS NGGR stromaufwärts der Spaltstelle aufweist.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das gewünschte Protein bakteriellen, viralen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs ist oder wobei das gewünschte Protein künstlich entworfen wurde.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das gewünschte Protein ein landwirtschaftliches Merkmal, ein humanes oder tierisches Gesundheitsprotein, ein Immunantwortprotein, ein Polypeptidhormon ist.
- Das Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das gewünschte Protein ein Interferon ist.
- Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, das in Pflanzen durchgeführt wird und wobei der Vektor in Zellen der Pflanze eingeführt wird.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10321963A DE10321963A1 (de) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen |
| AU2004238991A AU2004238991B2 (en) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Process of producing a plastid-targeted protein in plant cells |
| AT04732589T ATE533851T1 (de) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Prozess zur herstellung eines plastidgerichteten proteins in pflanzenzellen |
| CA002526911A CA2526911A1 (en) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Process of producing a plastid-targeted protein in plant cells |
| US10/556,542 US20080131933A1 (en) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Process of Producing a Plastid-Targeted Protein in Plant Cells |
| MXPA05012336A MXPA05012336A (es) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Procedimiento para producir una proteina dirigida a un plastidio en celulas vegetales. |
| PCT/EP2004/005151 WO2004101797A1 (en) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Process of producing a plastid-targeted protein in plant cells |
| JP2006529809A JP2007500010A (ja) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | 植物細胞における色素体標的タンパク質の生成方法 |
| EP04732589A EP1623033B1 (de) | 2003-05-15 | 2004-05-13 | Prozess zur herstellung eines plastidgerichteten proteins in pflanzenzellen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10321963A DE10321963A1 (de) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10321963A1 true DE10321963A1 (de) | 2004-12-02 |
Family
ID=33394635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE10321963A Withdrawn DE10321963A1 (de) | 2003-05-15 | 2003-05-15 | Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080131933A1 (de) |
| EP (1) | EP1623033B1 (de) |
| JP (1) | JP2007500010A (de) |
| AT (1) | ATE533851T1 (de) |
| AU (1) | AU2004238991B2 (de) |
| CA (1) | CA2526911A1 (de) |
| DE (1) | DE10321963A1 (de) |
| MX (1) | MXPA05012336A (de) |
| WO (1) | WO2004101797A1 (de) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7704955B2 (en) | 2004-11-24 | 2010-04-27 | Neopro Pain, Inc. | Methods and compositions for modulating conditions in both mammals and plants |
| WO2007112453A2 (en) | 2006-03-28 | 2007-10-04 | Neopro Labs, Llc | Methods amd compositions for treating conditions |
| FI20060533A7 (fi) * | 2006-06-01 | 2007-12-02 | Timo Kalevi Korpela | Parannettu tuberkuloosirokoteproteiinien ilmentäminen kasveissa |
| CN101460626B (zh) | 2006-06-06 | 2013-10-09 | 孟山都技术有限公司 | 选择转化细胞的方法 |
| US7855326B2 (en) | 2006-06-06 | 2010-12-21 | Monsanto Technology Llc | Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity |
| AR061248A1 (es) * | 2007-02-26 | 2008-08-13 | Monsanto Technology Llc | Peptidos transito cloroplasticos para el direccionamiento eficiente de dmo y sus usos |
| US7838729B2 (en) | 2007-02-26 | 2010-11-23 | Monsanto Technology Llc | Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof |
| CA2683288A1 (en) | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Neopro Labs, Llc | Crystalline and amorphous forms of peptide |
| EP2100961A1 (de) | 2008-03-04 | 2009-09-16 | Icon Genetics GmbH | Verfahren zur Proteaseerzeugung in Pflanzen |
| EP2584042A1 (de) | 2011-10-17 | 2013-04-24 | Nomad Bioscience GmbH | Herstellung, Lagerung und Verwendung von zellwandabbauenden Enzymen |
| AU2013205557B2 (en) * | 2012-04-17 | 2016-04-21 | Corteva Agriscience Llc | Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides |
| WO2018164019A1 (en) * | 2017-03-04 | 2018-09-13 | Kyoto University | Therapeutic peptides |
| CN110218777B (zh) * | 2019-06-14 | 2023-05-16 | 苏州天合优才生物科技有限公司 | Pcr预混液 |
| KR20240094145A (ko) * | 2022-12-09 | 2024-06-25 | (주)케어젠 | 연골 재생용 펩타이드 및 이의 용도 |
| JP2025035113A (ja) * | 2023-09-01 | 2025-03-13 | 学校法人北里研究所 | 抗真菌薬に対する活性増強作用を有する新規化合物及びその製造方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE93542T1 (de) * | 1984-12-28 | 1993-09-15 | Plant Genetic Systems Nv | Rekombinante dna, die in pflanzliche zellen eingebracht werden kann. |
| US6429359B1 (en) * | 1999-09-02 | 2002-08-06 | Arch Development Corporation | Production of cellulase in plastids of transgenic plants |
| SE9903336D0 (sv) * | 1999-09-17 | 1999-09-17 | Astacarotene Ab | DNA construct and its use |
| US6683231B2 (en) * | 2000-06-02 | 2004-01-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High level production of p-hydroxybenzoic acid in green plants |
| JP2002017186A (ja) * | 2000-06-30 | 2002-01-22 | Hayashibara Biochem Lab Inc | トランスジェニック植物 |
-
2003
- 2003-05-15 DE DE10321963A patent/DE10321963A1/de not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-05-13 AU AU2004238991A patent/AU2004238991B2/en not_active Ceased
- 2004-05-13 AT AT04732589T patent/ATE533851T1/de active
- 2004-05-13 US US10/556,542 patent/US20080131933A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-13 JP JP2006529809A patent/JP2007500010A/ja active Pending
- 2004-05-13 MX MXPA05012336A patent/MXPA05012336A/es active IP Right Grant
- 2004-05-13 CA CA002526911A patent/CA2526911A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-13 WO PCT/EP2004/005151 patent/WO2004101797A1/en not_active Ceased
- 2004-05-13 EP EP04732589A patent/EP1623033B1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2526911A1 (en) | 2004-11-25 |
| US20080131933A1 (en) | 2008-06-05 |
| EP1623033A1 (de) | 2006-02-08 |
| JP2007500010A (ja) | 2007-01-11 |
| WO2004101797A1 (en) | 2004-11-25 |
| EP1623033B1 (de) | 2011-11-16 |
| ATE533851T1 (de) | 2011-12-15 |
| AU2004238991B2 (en) | 2010-04-22 |
| MXPA05012336A (es) | 2006-01-30 |
| AU2004238991A1 (en) | 2004-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2347325T3 (es) | Metodo de produccion de proteinas. | |
| DE10321963A1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Plastid-dirigierten Proteins in Pflanzenzellen | |
| US9006414B2 (en) | Recombinant DNA for gene suppression | |
| JP4795619B2 (ja) | ウキクサにおける生物学的に活性なポリペプチド類の発現 | |
| DE69735580T2 (de) | An aminosaeure angereicherte speicherproteine, insbesondere an lysin angereicherte mais-gamma-zeine, und diese exprimierende pflanzen | |
| US8871468B2 (en) | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins | |
| DE60214400T2 (de) | Verfahren zur proteinproduktion in pflanzen | |
| US7888561B2 (en) | Ubiquitin regulatory nucleic acids, vectors, and methods of using same | |
| US20230340476A1 (en) | Regulation of translation of expressed genes | |
| BG98042A (bg) | Ген,кодиращ семенен протеин с високо съдържание на сяра и метод за повишаване на серни амино киселини в растенията | |
| EP1713908B1 (de) | Rekombinante dna zur gensuppression | |
| JPH04502861A (ja) | 植物および植物細胞中での非相同タンパク類の生産 | |
| Schinkel et al. | Production of an active recombinant thrombomodulin derivative in transgenic tobacco plants and suspension cells | |
| US20060252120A1 (en) | Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins | |
| WO2003041493A1 (de) | Produktion von rekombinanten antikörpern mittels fusion mit elastin-ähnlichen peptiden | |
| EP1398383A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinen | |
| Class et al. | Patent application title: Regulation of translation of expressed genes Inventors: Raymond Michael Dimphena Verhaert (Breda, NL) Pieter Victor Schut (Leiden, NL) Sharief Barends (Voorschoten, NL) Maurice Wilhelmus Van Der Heijden (Gouda, NL) Assignees: R1 B3 Holdings BV | |
| Raven et al. | FKZ: 0313639 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8141 | Disposal/no request for examination |