DE10306616A1

DE10306616A1 - Kit for detection of microorganisms on skin, useful e.g. for diagnosis of infection, comprises specific oligonucleotides for in situ hybridization

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Publication number: DE10306616A1
Application number: DE2003106616
Authority: DE
Inventors: Andrea Dr. Sättler; Claudia Jassoy; Regine Scholtyssek; Silke Nieveler; Karl-Heinz Dr. Trebesius; Claudia Dr. Beimfohr; Ingrid Bergmaier
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2003-02-14
Publication date: 2004-08-26

Abstract

Kit for detecting microorganisms (A) contains at least one oligonucleotide (ON) specific for at least one species, or group of species, that is present on the skin. An independent claim is also included for a method for detecting microorganisms that are present on the skin by in situhybridization with the new kit.

Description

Die Erfindung betrifft ein Kit zum Nachweis von Mikroorganismen, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid für mindestens eine Spezies oder eine Gruppe von Spezies von Mikroorganismen, die auf der Haut vorkommen, sowie weiterhin ein Verfahrens, bei dem das erfindungsgemäße Kit eingesetzt wird.The invention relates to a kit for Detection of microorganisms containing at least one oligonucleotide for at least a species or a group of species of microorganisms that occur on the skin, as well as a procedure in which the kit according to the invention used becomes.

Die menschliche Haut beispielsweise ist mit ca. 2 m² Fläche eines der größten von Mikroorganismen bewohnten menschlichen Körperorgane. Im Laufe der Evolution hat sich eine enge Beziehung zwischen dem Wirt und seinen mikrobiellen Bewohnern entwickelt. Die von der Haut über verschiedene Körperdrüsen zur Verfügung gestellten Nährstoffe werden von Mikroorganismen verstoffwechselt. Die dadurch verursachte Ansäuerung der Hautoberfläche verhindert die Ansiedelung von pathogenen Mikroorganismen.The human skin, for example, with an area of approximately 2 m ^{2, is} one of the largest human body organs inhabited by microorganisms. In the course of evolution, a close relationship has developed between the host and its microbial inhabitants. The nutrients made available by the skin through various body glands are metabolized by microorganisms. The resulting acidification of the skin surface prevents the settlement of pathogenic microorganisms.

Die Stoffwechselaktivität von Mikroorganismen kann aber auch unerwünschte Folgen haben. So ist die Entstehung von Körpergeruch, Schuppenbildung und die Entwicklung verschiedener Hautkrankheiten auf die Aktivität von Mikroben zurückzuführen.The metabolic activity of microorganisms but can also be undesirable To have consequences. So is the development of body odor, dandruff and the development of various skin diseases on the activity of microbes due.

Prinzipiell sind alle Mikroorganismen zur Hautflora zu rechnen, die von der Haut isoliert werden können. Dabei können nach Price (Price P.B. The bacteriology of the normal skin: A new quantitative test applied to a study of the bacterial flora and the disinfectant action of mechanical cleansing. J Infect Dis. 63:301-318. 1938.) zwei unterschiedliche Gruppen unterschieden werden.In principle, all are microorganisms the skin flora, which can be isolated from the skin. there can according to Price (Price P.B. The bacteriology of the normal skin: A new quantitative test applied to a study of the bacterial flora and the disinfectant action of mechanical cleansing. J Infect Dis. 63: 301-318. 1938.) two different groups can be distinguished.

a) Resident flora: microorganisms that are can multiply on human skin or during examination of skin samples found in large numbers or with a high proportion regularly become. It is postulated that the above properties by firmly anchoring these resident microorganisms of the skin (attachment).
b) Transient flora: microorganisms that are on the human Skin can not multiply or in examinations only irregularly and in small numbers / proportions being found. These microorganisms are theoretically exposed, does not adhere to skin components, in front.

Ein genauerer Kenntnisstand vor allem der residenten Flora der Haut ist insbesondere im Hinblick auf die Suche nach neuen medizinischen oder kosmetischen Wirkstoffen wichtig. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Mikroorganismen können darüber hinaus ein breiteres Verständnis der Zusammenhänge zwischen gesunder Haut und ihren Erkrankungen eröffnen und die Entwicklung von besseren Wirkstoffen, Therapien oder Arzneimitteln ermöglichen. Auch die gezielte Beeinflussung relevanter Hautmikroorganismen durch Kosmetikprodukte, wie Deodorants, Cremes u.a., setzt die genaue Kenntnis von Struktur und Funktion des Mikro-Ökosystems Haut voraus.Above all, a more precise level of knowledge The resident flora of the skin is particular with regard to the Search for new medical or cosmetic active ingredients is important. Interactions between different microorganisms can also a broader understanding of the relationships open between healthy skin and its diseases and the development of enable better active ingredients, therapies or drugs. The targeted influencing of relevant skin microorganisms by cosmetic products, such as deodorants, creams etc., requires precise knowledge of structure and function of the micro-ecosystem Skin first.

Der Nachweis von Mikroorganismen wird bis heute in überwiegendem Maße serologisch oder mikroskopisch durchgeführt. Dabei sind die Methoden nicht empfindlich genug, um geringe Mengen an Mikroorganismen direkt nachzuweisen. Daher wurde dem Nachweis bisher ein Kultivierungsschritt vorgeschaltet, bei dem die Mikroorganismen vermehrt wurden. Ein Nachteil dieser Methode besteht darin, dass einige der Mikroorganismen gar nicht auf den zur Verfügung stehenden Nährböden anwachsen, und somit auch nicht nachgewiesen werden können. Untersuchungen an verschiedensten Umweltproben belegen, dass z. Z. nur zwischen 0,1 bis 14% aller Bakterien kultivierbar sind. Insbesondere zur Analyse der Zusammensetzung einer komplexen Biozönose haben sich kultivierungsabhängige Verfahren als ungeeignet erwiesen. Abhängig von den gewählten Kultivierungsbedingungen wird nämlich die Vermehrung derjenigen Mikroorganismen begünstigt, welche an diese Kultivierungsbedingungen besonders gut angepasst sind, wodurch es zu einer starken Verzerrung der in der Ausgangsprobe herrschenden Populationsverhältnisse kommt. Eine quantitative Analyse der Mikroorganismen ist aufgrund dieser Populationsverschiebungen gar nicht möglich. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahren besteht darin, dass die heute bekannten Kultivierungsverfahren teilweise sehr langwierig sind und nicht selten in ihrem Ergebnis nicht eindeutig sind. Auf diese Weise kommt es sowohl zu falsch positiven als auch zu falsch negativen Analyseergebnissen.Detection of microorganisms is still predominant to this day Dimensions serologically or performed microscopically. The methods are not sensitive enough to small amounts directly detectable on microorganisms. Hence the evidence So far, a cultivation step upstream in which the microorganisms were increased. A disadvantage of this method is that some of the microorganisms are not at all available Growing media, and therefore cannot be proven. Investigations on various Environmental samples show that e.g. Currently only between 0.1 to 14% of all Bacteria can be cultivated. Especially for analyzing the composition a complex biocenosis have become cultivation dependent Proven method unsuitable. Depending on the selected cultivation conditions namely favors the multiplication of those microorganisms that adhere to these cultivation conditions are particularly well adjusted, causing severe distortion the population relationships prevailing in the initial sample comes. A quantitative analysis of the microorganisms is due of these population shifts is not possible. Another disadvantage this method is that the cultivation methods known today are sometimes very lengthy and often the result are not clear. That way it both comes to wrong positive as well as false negative analysis results.

Aufgrund der beschriebenen Nachteile der Kultivierung haben moderne Methoden der Mikroorganismenbestimmung alle ein gemeinsames Ziel: Sie versuchen die Nachteile der Kultivierung zu umgehen, indem sie keine Kultivierung mehr benötigen.Because of the disadvantages described cultivation have modern methods of microorganism determination all have a common goal: they try the disadvantages of cultivation to circumvent by no longer needing cultivation.

Beispiele moderner Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen sind DNA-(Desoxyribonukleinsäure) bzw. RNA-(Ribonukleinsäure) basierte Hybridisierungs- oder Amplifikationsmethoden. Unter dem Begriff Hybridisierung ist insbesondere die Bildung einer Doppelhelix aus zwei einzelsträngigen, komplementären Oligo- oder Polynukleotiden zu verstehen. Eine Hybridisierung kann dabei insbesondere sowohl zwischen zwei DNA oder zwei RNA-Molekülen, aber auch zwischen DNA- und RNA-Molekülen entstehen. Die verschiedenen Moleküle hybridisieren nur dann, wenn die Zielsequenzen in einem ausreichenden Maße komplementär zueinander sind.Examples of modern processes for Detection of microorganisms are based on DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid) Hybridization or Amplification methods. The term hybridization is particularly the formation of a double helix from two single-stranded, complementary oligo- or polynucleotides to understand. Hybridization can in particular both between two DNA or two RNA molecules, but also between DNA and RNA molecules. The different molecules hybridize only if the target sequences are in a sufficient range Dimensions complementary to each other are.

Die komplementären Zielsequenzen für den Nachweis können auch immobilisiert sein, wie dies auf sogenannten DNA-Chips häufig getan wird. In der Gebrauchsmusterschrift DE 201 10 013 wird ein solcher Träger (DNA-Chip) zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen, insbesondere Parodontitis, beansprucht. Auf diesem Träger sind Oligonukleotide immobilisiert, die komplementär zu bekannten Referenzsequenzen bestimmter Bakterien oder Viren sind, welche in der Mundflora vorkommen. Aufgrund der Komplementarität können die auf diesem Genchip aufgebrachten Oligonukleotide mit den entsprechenden Referenzsequenzen unter bestimmten Bedingungen hybridisieren. Nachteilig bei diesem Träger ist, dass die Mikroorganismen entweder durch Kultivierung vermehrt werden müssen oder die genetische Information aus den vorhandenen Proben vor der Hybridisierung auf dem Chip amplifiziert werden muss. Eine Quantifizierung der ursprünglich in einer Probe vorhandenen Mikroorganismen ist daher ebenfalls nicht möglich.The complementary target sequences for the detection can also be immobilized, as is often done on so-called DNA chips. In the utility model DE 201 10 013 such a carrier (DNA chip) for diagnosis and therapy of oral diseases, in particular periodontitis, is claimed. On Oligonucleotides which are complementary to known reference sequences of certain bacteria or viruses which occur in the oral flora are immobilized on this support. Due to the complementarity, the oligonucleotides applied to this gene chip can hybridize with the corresponding reference sequences under certain conditions. A disadvantage of this carrier is that the microorganisms either have to be propagated by cultivation or the genetic information from the samples present has to be amplified on the chip before hybridization. It is therefore also not possible to quantify the microorganisms originally present in a sample.

Eine bekannte Amplifikationsmethode ist die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR). Bei der PCR wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Mikroorganismengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z.B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose-Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Auch können diverse in der untersuchten Probe vorhandene Stoffe eine Inhibierung des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies ist eine häufige Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Mikroorganismen und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und dadurch verursachte falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden und schließlich die Gefahr falsch negativer Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen.A well-known method of amplification is the polymerase chain reaction (PCR). The PCR uses specific Primers a characteristic piece of the respective microorganism genome amplified. If the primer finds its destination, it happens a million-fold increase in a piece of the genetic material. In the subsequent Analysis, e.g. by means of an agarose gel separating DNA fragments a qualitative assessment will take place. In the simplest case, this leads to the statement that the target sites for the primers used in of the sample examined were present. There are no further statements possible; this Can target both from a living bacterium and from a dead bacterium or come from naked DNA. There is no differentiation here possible. Can too various substances present in the examined sample inhibition of the DNA amplifying enzyme, the Taq polymerase. This is a common one Cause false negative results. A continuation of the PCR technique is the quantitative PCR that tries to a correlation between the amount of microorganisms present and the amount of amplified DNA. The advantages of PCR lie in their high specificity and in a short amount of time. The main disadvantages are their high susceptibility for contamination and this caused false positive results as well as those already mentioned lack of possibility to distinguish between living and dead cells or naked DNA and finally the risk of false negative results due to the presence of inhibitory Substances.

Zu Beginn der 90er Jahre wurde ein Verfahren zur in situ-Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden entwickelt, das in vielen Umweltproben erfolgreich zum Einsatz gekommen ist (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 762).At the beginning of the 90s, a Method for in situ hybridization with fluorescence-labeled oligonucleotides developed that have been successfully used in many environmental samples (Amann et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 762).

Das Verfahren wurde "FISH" (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) genannt und macht sich den Umstand zunutze, dass die in jeder Zelle vorkommenden ribosomalen Ribonukleinsäuren (RNAs) sowohl hochkonservierte als auch variable, d.h. gattungs- oder sogar artspezifische Sequenzen aufweisen. Gegen diese Sequenzbereiche können komplementäre Oligonukleotide hergestellt werden, die zusätzlich mit einem detektierbaren Marker versehen werden können. Mittels dieser sogenannten Nukleinsäuresonden können Mikroorganismenarten, – gattungen oder -gruppen hochspezifisch direkt in der Probe identifiziert und bei Bedarf auch visualisiert oder quantifiziert werden. Diese Methode ist das einzige Verfahren, das eine verzerrungsfreie Darstellung der tatsächlichen in situ-Verhältnisse der Biozönose darstellt. Sogar bisher nicht-kultivierte und demnach nicht beschriebene Mikroorganismen können identifiziert werden.The procedure became "FISH" (fluorescence in situ hybridization) called and takes advantage of the fact that in each cell occurring ribosomal ribonucleic acids (RNAs) both highly conserved as well as variable, i.e. generic or even species-specific sequences exhibit. Complementary oligonucleotides can be used against these sequence regions be made that additionally can be provided with a detectable marker. through these so-called nucleic acid probes can Microorganism species, - genera highly specific or identified directly in the sample and can also be visualized or quantified if necessary. This method is the only method that provides a distortion-free representation the actual in situ conditions the biocenosis represents. Even hitherto uncultivated and therefore not described Microorganisms can be identified.

Bei der FISH dringen Sonden in die in der untersuchten Probe vorhandenen Zellen ein. Sofern ein Mikroorganismus der Art, Gattung oder Gruppe, für welche die Sonden entwickelt wurden, in der untersuchten Probe vorhanden ist, binden die Sonden in der Mikroorganismenzelle an ihre Zielsequenz, und die Zellen können aufgrund der Markierung der Sonden detektiert werden.At FISH, probes penetrate the cells present in the examined sample. Unless a microorganism of the species, genus or group for which the probes were developed are present in the sample under investigation the probes in the microorganism cell bind to their target sequence, and the cells can can be detected based on the labeling of the probes.

Die Vorteile der FISH-Technik gegenüber den weiter oben beschriebenen Methoden zur Mikroorganismenidentifizierung (Kultivierung, PCR) sind vielfältig.The advantages of FISH technology compared to Methods for microorganism identification described above (Cultivation, PCR) are diverse.

Erstens können mit Sonden zahlreiche Mikroorganismen detektiert werden, die mittels traditioneller Kultivierung gar nicht erfasst werden. Während durch die Kultivierung maximal nur 15 % der Bakterienpopulation einer Probe sichtbar gemacht werden können, erlaubt die FISH-Technik in vielen Proben eine Detektion bis zu 100 % der Bakteriengesamtpopulation. Zweitens ist die Detektion von Mikroorganismen mittels der FISH-Technik sehr viel schneller als mittels Kultivierung. Benötigt die Identifizierung von Mikroorganismen mittels Kultivierung oft mehrere Tage, so vergehen von der Probennahme bis zur Mikroorganismenidentifizierung sogar auf Artebene mittels der FISH-Technik nur wenige Stunden. Drittens können im Gegensatz zu einem Kultivierungsmedium Sonden in ihrer Spezifität fast beliebig frei gewählt werden. Einzelne Arten können genauso gut mit einer Sonde erfasst werden, wie ganze Gattungen oder Mikroorganismengruppen. Viertens können Mikroorganismenarten oder ganze Mikroorganismenpopulationen direkt in der Probe exakt quantifiziert werden. Fünftens können Assoziationen und Vergesellschaftungen verschiedener Mikroorganismen in einer Probe visualisiert werden.First, with probes, numerous Microorganisms are detected using traditional cultivation not be recorded at all. While through cultivation, only a maximum of 15% of the bacterial population FISH technology allows a sample to be made visible detection of up to 100% of the total bacterial population in many samples. Second is the detection of microorganisms using the FISH technique much faster than cultivation. Requires that Identification of microorganisms by cultivation often several Days pass from sampling to microorganism identification on art level using the FISH technique only a few hours. thirdly can in contrast to a culture medium, probes are almost arbitrary in their specificity freely selected become. Individual species can do just as well can be recorded with a probe, such as entire genera or groups of microorganisms. Fourth, can Microorganism species or whole microorganism populations directly can be exactly quantified in the sample. Fifth, associations and socializations different microorganisms can be visualized in a sample.

Im Gegensatz zur PCR weist die FISH zuverlässig nur lebende Mikroorganismen nach. Falsch positive Ergebnisse durch nackte DNA oder tote Mikroorganismen wie bei der PCR sind bei der FISH ausgeschlossen. Des weiteren sind falsch negative Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen ebenso ausgeschlossen wie falsch positive Ergebnisse infolge von Kontaminationen.In contrast to PCR, the FISH reliable only live microorganisms. False positive results naked DNA or dead microorganisms like in the PCR are in the FISH excluded. Furthermore, false negative results also excluded due to the presence of inhibitory substances like false positive results due to contamination.

Die FISH-Technik ist demnach ein überragendes Werkzeug, um Mikroorganismen schnell und äußerst spezifisch direkt in einer Probe nachzuweisen. Sie ist im Gegensatz zu Kultivierungsverfahren eine direkte Methode und erlaubt darüber hinaus auch eine Quantifizierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen.The FISH technique is therefore an outstanding one Tool to quickly and extremely specifically directly into microorganisms to prove a sample. It is in contrast to cultivation methods a direct method and also allows quantification of the microorganisms contained in the sample.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, den Nachweis von Mikroorganismen oder Gruppen von solchen Mikroorganismen, die insbesondere mit dem Menschen in Kontakt kommen, so zu ermöglichen, daß eine schnelle sowie ggf. quantitative Bestimmung dieser Mikroorganismen in einer Probe gewährleistet ist und darüber hinaus einzelne oder Gruppen von Spezies von Mikroorganismen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von anderen Mikroorganismen sicher detektiert werden können.Object of the present invention is therefore the detection of microorganisms or groups of those microorganisms that are particularly in contact with humans come so to allow a quick and possibly quantitative determination of these microorganisms in one Sample guaranteed is and about addition, individual or groups of species of microorganisms also safe in the presence of other microorganisms can be detected.

Dies wird gelöst durch ein Kit zum Nachweis von Mikroorganismen, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid für mindestens eine Spezies oder eine Gruppe von Spezies von Mikroorganismen, die auf der Haut vorkommen, sowie durch die Bereitstellung eines Verfahrens, bei dem das erfindungsgemäße Kit eingesetzt wird.This is solved with a kit for detection of microorganisms containing at least one oligonucleotide for at least a species or a group of species of microorganisms that occur on the skin, as well as by providing a procedure in which the kit according to the invention is used.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang ist unter „Haut" die menschliche und/oder tierische Haut oder Schleimhaut sowie die Anhangsgebilde der Haut (Haare, Haarfollikel, Nägel, Drüsen) zu verstehen.In the context of the invention, "skin" is human and / or animal skin or mucous membrane and the appendages the skin (hair, hair follicles, nails, glands) to understand.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang sind unter dem Begriff "Mikroorganismengruppe" mindestens zwei Arten von Mikroorganismen zu verstehen, die entweder der gleichen Gattung angehören oder eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Eine erfindungsgemäße Mikroorganismengruppe kann beispielsweise auch alle Spezies einer Gattung enthalten.In the context of the invention are under the term "microorganism group" at least two Understand types of microorganisms that are either the same Belong to the genus or a very similar one have rRNA. A microorganism group according to the invention can for example also contain all species of a genus.

Erfindungsgemäß gewünscht ist es auch, die Mikroorganismengruppen z. B. nach ihrem Vorkommen oder anderen Parametern auszusuchen. Als Beispiel dafür kann auch eine Anzahl oder alle Spezies einer Gattung, die auf der Haut vorkommen, als Gruppe von Spezies verstanden werden.According to the invention, it is also desirable to have the microorganism groups z. B. to search for their occurrence or other parameters. As an example of this can also include a number or all species of a genus that are on the Skin occur to be understood as a group of species.

Das erfindungsgemäße Kit oder Set kann sowohl ein Oligonukleotid für eine bestimmte Spezies, mehrere Oligonukleotide für eine Spezies, eine oder mehrere Oligonukleotide für eine Gruppe von Spezies von Mikroorganismen sowie mehrere Oligonukleotide für zwei oder mehrere Mikroorganismengruppen enthalten. So können z. B. mehrere Oligonukleotide für eine bestimmte Gruppe von beispielsweise Corynebacterium sowie mehrere Oligonukleotide z. B. für den Nachweis von Spezies von Peptostreptokokken in einem Kit enthalten sein.The kit or set according to the invention can both an oligonucleotide for a certain species, several oligonucleotides for one species, one or more oligonucleotides for a group of species of Microorganisms and several oligonucleotides for two or more groups of microorganisms contain. So can z. B. several oligonucleotides for a certain group of, for example, Corynebacterium and several Oligonucleotides e.g. B. for detection of peptostreptococcal species may be included in a kit.

Insbesondere ist es bevorzugt, ein oder mehrere Oligonukleotide oder eine Kombination dieser im erfindungsgemäßen Kit zum Nachweis aller Mikroorganismen einer Gattung einzusetzen. Dies hat den Vorteil, dass auch solche Spezies einer bestimmten Gattung, die bisher nicht oder nur schwer kultiviert werden konnten oder in solchen Proben bisher noch nicht nachgewiesen wurden, detektiert werden können. So können beispielsweise mit spezifischen Oligonukleotiden für die Gattung Anaerococcus alle Arten (Spezies) dieses Pilzes in einer Probe nachgewiesen werden.In particular, it is preferred to use a or more oligonucleotides or a combination of these in the kit according to the invention for the detection of all microorganisms of a genus. This has the advantage that such species of a certain genus, which so far could not be cultivated or only with difficulty or have not yet been detected in such samples can be. So can for example with specific oligonucleotides for the genus Anaerococcus all types of this fungus detected in one sample become.

Die erfindungsgemäß im Kit enthaltenen Oligonukleotide können auch spezifisch für nur eine einzige Spezies (Art) der genannten Mikroorganismen ausgewählt sein. So können vorteilhafterweise solche Mikroorganismenspezies nachgewiesen werden, die besondere Eigenschaften aufweisen, deren Auftreten auf der Haut beispielsweise im Zusammenhang mit Erkrankungen diskutiert wird. Sie können durch solche speziellen Sonden neben anderen Spezies der gleichen Gattung sowie sequenzähnlichen Mikroorganismen nachgewiesen werden.The oligonucleotides contained in the kit according to the invention can also specific to only a single species (species) of said microorganisms can be selected. So can such microorganism species are advantageously detected, which have special properties, their appearance on the skin is discussed in connection with diseases, for example. You can through such special probes alongside other species of the same Genus as well as sequence-like Microorganisms are detected.

Im erfindungsgemäßen Zusammenhang enthält das erfindungsgemäße Kit oder Set mindestens ein oder mehrere Oligonukleotide, beispielsweise in einer Lösung (z.B. einer Pufferlösung) oder Mischung (z.B. im lyophilisierten Zustand). Darüber hinaus können die Oligonukleotide auch von einander getrennt (z.B. in unterschiedlichen Gefäßen) nebeneinander vorliegen.In the context of the invention, the kit according to the invention contains or Set at least one or more oligonucleotides, for example in a solution (e.g. a buffer solution) or mixture (e.g. in the lyophilized state). Furthermore can the oligonucleotides are also separated from one another (e.g. in different ones Vessels) side by side available.

Das Oligonukleotid kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, ein Oligonukleotid zu wählen, das zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500 – 100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000 – 50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.The oligonucleotide can be complementary to one be chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is an advantage to choose an oligonucleotide complementary to an area is that in a copy number of more than 1 in the microorganism to be detected is present. The sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times. For this reason the rRNA is preferably used as the target site because the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis in thousands of times every active cell.

Bei dem Oligonukleotid im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA-Oligonukleotid handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 100, besonders bevorzugt zwischen 12 und 50, insbesondere zwischen 16 und 25 Nukleotide.With the oligonucleotide in the sense of Invention can be a DNA or RNA oligonucleotide which will usually be between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 100, particularly preferably between 12 and 50, especially between 16 and 25 nucleotides.

Die Auswahl der Oligonukleotide geschieht nach dem Gesichtspunkt, ob eine geeignete komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Geeignet ist eine Sequenz dann, wenn sie einerseits spezifisch für den nachzuweisenden Mikroorganismus ist und andererseits überhaupt zugänglich ist für das eindringende Oligonukleotid, also nicht etwa durch ribosomale Proteine oder rRNA-Sekundärstrukturen maskiert wird.The oligonucleotides are selected according to whether an appropriate complementary sequence is present in the microorganism to be detected. One is suitable Sequence when it is specific for the microorganism to be detected is and on the other hand at all accessible is for the penetrating oligonucleotide, i.e. not by ribosomal Protected proteins or rRNA secondary structures becomes.

Durch die Auswahl einer definierten Sequenz kann eine Mikroorganismenart, eine Mikroorganismengattung oder eine Mikroorganismengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einem Oligonukleotid von 15 Nukleotiden über 100 % der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.By choosing a defined one Sequence can be a type of microorganism, a type of microorganism or a group of microorganisms can be detected. Complementarity should given an oligonucleotide of 15 nucleotides over 100% of the sequence his. For oligonucleotides with more than 15 nucleotides, a until multiple mismatch points are allowed.

Insbesondere können im erfindungsgemäßen Kit Oligonukleotide für den Nachweis der residenten Mikroflora der Haut enthalten sein.In particular, oligonucleotides for the detection of the resident Mi kroflora of the skin may be included.

Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit zur Quantifizierung der nachgewiesenen Mikroorganismen. Erstmalig können somit Erkenntnisse bezüglich der absoluten und relativen quantitativen Verhältnisse der genannten Mikroorganismen der Hautmikroflora gewonnen werden. Dies ermöglicht vor, während und nach einer medizinischen oder kosmetischen Behandlung die Überprüfung des Erfolgs sowie aller Auswirkungen dieser Behandlung. In diesem Zusammenhang ist weiterhin von Vorteil, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausschließlich lebende Mikroorganismen erfasst.Another advantage is the possibility to quantify the detected microorganisms. first time can thus knowledge regarding the absolute and relative quantitative ratios of the microorganisms mentioned skin microflora. This allows before, during and after medical or cosmetic treatment, the review of the Success as well as all the effects of this treatment. In this context is also advantageous that the method according to the invention exclusively living microorganisms recorded.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Mikroorganismen ausgewählt aus den Gattungen Corynebacterium, Peptostreptococcus oder des Sporomusa-Taxons.According to a particularly preferred execution the microorganisms are selected from the genera Corynebacterium, Peptostreptococcus or the Sporomusa taxon.

Die Mikroflora der Haut ist bisher nur durch die bekannten Kultivierungsmethoden untersucht worden. Dabei wurden durch den bereits erwähnten methodischen Mangel nur kultivierbare Bakterien oder Pilze nachgewiesen. Beispiele für solche Spezies sind: Corynebacterium minutissimum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. callunae, C. lipophiloflavum, C. pseudotuberculosis, C. glucuronolyticum, C. striatum, C. xerosis, C. jekeium, Anaerococcus hydrogenialis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii und A. vaginalis.The microflora of the skin is so far only examined by the known cultivation methods. there have been mentioned by the methodological deficiency only cultivable bacteria or fungi detected. examples for such species are: Corynebacterium minutissimum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. callunae, C. lipophiloflavum, C. pseudotuberculosis, C. glucuronolyticum, C. striatum, C. xerosis, C. jekeium, Anaerococcus hydrogenialis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii and A. vaginalis.

Einige dieser und weitere Spezies von Mikroorganismen können vorteilhafterweise mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden nicht nur qualitativ, sondern darüber hinaus auch noch quantitativ nachgewiesen werden. Diese quantitativen Informationen können vor allem für Tests von Wirkstoffen oder die Frühdiagnose von Hauterkrankungen von Nutzen sein.Some of these and other species of microorganisms can advantageously not with the oligonucleotides according to the invention only qualitatively, but above can also be demonstrated quantitatively. These quantitative Information can especially for Tests of active ingredients or the early diagnosis of skin diseases to be useful.

Darüber hinaus ist es nun mittels der erfindungsgemäßen Oligonukleotide möglich, bestimmte Spezies einer Gattung neben anderen Mikroorganismenspezies nachzuweisen, auch wenn diese der gleichen Gattung angehören.In addition, it is now using of the oligonucleotides according to the invention possible, certain species of a genus in addition to other microorganism species to be demonstrated, even if they belong to the same genus.

Wie bereits erwähnt ist ein genauerer Kenntnisstand der auf der Haut vorkommenden Mikroorganismenspezies insbesondere im Hinblick auf die Suche nach neuen Wirkstoffen wichtig.As already mentioned is a more precise level of knowledge the microorganism species occurring on the skin in particular important with regard to the search for new active ingredients.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis der Mikroorganismen mittels in-situ Hybridisierung, insbesondere mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode durchgeführt. Die Vorteile der Analyse von Mikroorganismen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, das Entfallen des Kultivierungsschrittes und die Möglichkeit zur Quantifizierung der Mikroorganismen sind bereits vorher eingehend beschrieben.According to a special embodiment The present invention uses the detection of microorganisms by means of in-situ hybridization, in particular with the aid of the fluorescence in-situ hybridization method carried out. The advantages of analyzing microorganisms using fluorescence in situ hybridization, the Eliminating the cultivation step and the possibility of quantification of the microorganisms have already been described in detail beforehand.

Eine mit der FISH-Technologie mögliche Quantifizierung von verschiedenen Mikroorganismenpopulationen ist ebenfalls von Vorteil. Aus den ermittelten Zellzahlen können dann u. a. Schlüsse bezüglich der Wechselwirkung von Populationen unterschiedlicher Mikroorganismen gezogen und z. B. für die Therapie bzw. andere Maßnahmen berücksichtigt werden. Es ist insbesondere möglich, verschiedene Marker an unterschiedliche Oligonukleotide anzuhängen und so mehrere verschiedene Mikroorganismenpopulationen oder -spezies parallel nachzuweisen. Hierbei kann z. B. ein Kit mit mehreren Oligonukleotiden für verschiedene Spezies oder Gruppen von Spezies vorteilhaft eingesetzt werden.A quantification possible with FISH technology from different microorganism populations is also from Advantage. Then u. a. Conclusions regarding the Interaction of populations of different microorganisms drawn and z. B. for the therapy or other measures considered become. It is particularly possible attach different markers to different oligonucleotides and so several different microorganism populations or species in parallel demonstrated. Here, for. B. a kit with several oligonucleotides for different Species or groups of species can be used advantageously.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform trägt das Oligonukleotid einen detektierbaren Marker (bevorzugt einen Fluoreszenzmarker), der insbesondere kovalent an das Oligonukleotid gebunden ist. Die Nachweisbarkeit der erfolgten Hybridisierung des Oligonukleotids mit der Zielsequenz ist eine Voraussetzung für die Identifizierung und ggf. Quantifizierung der Mikroorganismen. Insbesondere wird dies häufig durch eine kovalente Bindung eines detektierbaren Markers an das Oligonukleotid erreicht. Als detektierbare Marker werden häufig fluoreszierende Gruppen, z.B. Cy-2, Cy-3 oder Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), FITC (Fluoresceinisothiocyanat), CT (5,(6)-Carboxytetramethylrhodamin-N-hydroxysuccinimidester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (Tetramethylrhodamin-5,6-isothiocyanat (Molecular Probes Inc., s.o.) oder FLUOS (5,(6)-Carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland)). Alternativ werden chemolumineszierende Gruppen oder radioaktive Markierungen, z.B. 35S, 32P, 33P, 125J, verwendet. Nachweisbarkeit kann aber auch gegeben sein durch Kopplung des Oligonukleotids mit einem enzymatisch aktiven Molekül, beispielsweise alkalischer Phosphatase, saurer Phosphatase, Peroxidase, Meerettichperoxidase, β-D-Galaktosidase oder Glukoseoxidase. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrats umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.According to a special embodiment carries that Oligonucleotide a detectable marker (preferably a fluorescent marker), which is in particular covalently bound to the oligonucleotide. The Verifiability of the hybridization of the oligonucleotide with the target sequence is a prerequisite for identification and if necessary Quantification of microorganisms. In particular, this is often caused by covalent binding of a detectable marker to the oligonucleotide reached. Fluorescent groups are often used as detectable markers, e.g. Cy-2, Cy-3 or Cy-5 (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), FITC (fluorescein isothiocyanate), CT (5, (6) -carboxytetramethylrhodamine-N-hydroxysuccinimide ester (Molecular Probes Inc., Eugene, USA)), TRITC (tetramethylrhodamine-5,6-isothiocyanate (Molecular Probes Inc., see above) or FLUOS (5, (6) -carboxyfluorescein-N-hydroxysuccinimide ester (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)). Alternatively be chemiluminescent groups or radioactive labels, e.g. 35S, 32P, 33P, 125J. Verifiability can also be given by coupling the oligonucleotide with an enzymatically active one Molecule, for example alkaline phosphatase, acid phosphatase, peroxidase, Horseradish peroxidase, β-D-galactosidase or glucose oxidase. For each of these enzymes is known to be a series of chromogens that instead of the natural Substrate can be implemented and converted to either colored or fluorescent products can be. examples for such chromogens are given in Table 1 below.

Tabelle 1 Enzyme Chromogene Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase 4-Methylumbelliferylphosphat () Bis(4-Methylumbelliferylphosphat), () 3-O-Methylfluorescein, Flavon-3-Disphosphattriammoniumsalz (), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz Peroxidase Tyraminhydrochlorid (), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (), p-Hydroxyphenethylalkohol (), 2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-Sulfonsäure) (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (), 3,3'-Dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon; Tetramethylbenzidin Meerrettichperoxidase H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H2O2 + Tetramethylbenzidin β-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau Table 1 enzymes chromogenic Alkaline phosphatase and acid phosphatase 4-methylumbelliferyl phosphate ( ) Bis (4-methylumbelliferyl phosphate), ( ) 3-O-methylfluorescein, flavone-3-disphosphate triammonium salt ( ), p-nitrophenylphosphate disodium salt peroxidase Tyramine hydrochloride ( ), 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid ( ), p-hydroxyphenethyl alcohol ( ), 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline sulfonic acid) (ABTS), ortho-phenylenediamine dihydrochloride, o-dianisidine, 5-aminosalicylic acid, p-Ucresol ( ), 3,3'-dimethyloxybenzidine, 3-methyl-2-benzothiazolinehydrazone; tetramethylbenzidine horseradish peroxidase H ₂ O ₂ + diammonium benzidine H2O2 + tetramethylbenzidine β-D-galactosidase o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside glucose oxidase ABTS, glucose and thiazolyl blue

Schließlich ist es möglich, die Oligonukleotide so zu gestalten, dass an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15 bis 50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Oligonukleotid erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.Finally, it is possible that To design oligonucleotides so that their 5'- or 3'-end another a nucleic acid sequence suitable for hybridization is present. This nucleic acid sequence again comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15 to 50 nucleotides. This second nucleic acid region can in turn be recognized by an oligonucleotide which is characterized by one of the above Means is detectable.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Oligonukleotide mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.Another possibility is the coupling of the detectable oligonucleotides with a hapten, which then with an antibody recognizing the hapten can. As an example of such a hapten can be cited as digoxigenin. The specialist are aware of the given examples also well known.

Insbesondere wird der enzymatische Marker aus einer Gruppe, bestehend aus Peroxidase, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, und Phosphatase, vorzugsweise alkalischer Phosphatase, ausgewählt.In particular, the enzymatic Markers from a group consisting of peroxidase, preferably Horseradish peroxidase, and phosphatase, preferably alkaline Phosphatase.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kit mindestens ein Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

i) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen, und
ii) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter i) zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94 % der Nukleotide übereinstimmen, und
iii) Oligonukleotiden, welche sich von einem der unter i) und ii) genannten Oligonukleotide ableiten, wobei die Sequenz um ein oder mehrere Nukleotide deletiert oder verlängert ist, und
iv) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter i), ii) oder iii) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

According to a preferred embodiment, the kit contains at least one oligonucleotide selected from the group consisting of:

i) Oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 01 to 15 specified sequences, and
ii) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under i) at least in 77%, preferably in at least 83%, particularly preferably in at least 88%, very particularly preferably in 94% of the nucleotides, and
iii) oligonucleotides which are derived from one of the oligonucleotides mentioned under i) and ii), the sequence being deleted or extended by one or more nucleotides, and
iv) oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under i), ii) or iii) under stringent conditions.

Erfindungsgemäß sind neben den Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 01 bis 15 angegebenen Sequenzen sowie solchen Oligonukleotiden, die mit diesen zumindest in 77 %, bevorzugt in mindestens 83 %, besonders bevorzugt in mindestens 88 %, ganz besonders bevorzugt in 94 % der Nukleotide übereinstimmen, auch solche Oligonukleotide umfasst, die sich von den genannten Oligonukleotiden ableiten, wobei sie um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.According to the invention, in addition to the oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 01 to 15 specified sequences and such Oligonucleotides that are compatible with these at least in 77%, preferably in at least 83%, particularly preferably in at least 88%, very particularly preferably match in 94% of the nucleotides, including those Includes oligonucleotides that differ from the named oligonucleotides derive, being extended by one or more nucleotides or are deleted.

Es ist insbesondere auch möglich, dass am 3' und/oder am 5' Ende der genannten Oligonukleotide 1 bis 40, vorzugsweise 1 bis 25, insbesondere 1 bis 15 Nukleotide angehängt sind.In particular, it is also possible that on 3 'and / or on 5 'end of said Oligonucleotides 1 to 40, preferably 1 to 25, in particular 1 appended to 15 nucleotides are.

Ebenfalls ist es weiterhin erfindungsgemäß möglich, Oligonukleotide einzusetzen, die sich von den genannten Oligonukleotiden insbesondere dadurch ableiten lassen, dass die Sequenz um 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 5, insbesondere ein bis drei, beispielsweise ein oder zwei Nukleotide deletiert ist.It is also possible according to the invention to use oligonucleotides to use, which are different from the oligonucleotides mentioned in particular by deriving the sequence by 1 to 7, preferably 1 to 5, in particular one to three, for example one or two nucleotides is deleted.

Ein besonderer Vorteil ist die hohe Spezifität der entsprechend ausgewählten Oligonukleotide. Es können sowohl spezifisch bestimmte Gattungen oder Gruppen von Mikroorganismen nachgewiesen werden als auch hochspezifisch einzelne Spezies einer Gattung.The high advantage is a particular advantage specificity the selected one Oligonucleotides. It can both specific genera or groups of microorganisms be proven as well as highly specific individual species of a Genus.

Das erfindungsgemäße Kit oder Set kann zum schnellen und effizienten Nachweis von Mikroorganismen, die auf der Haut vorkommen, insbesondere mittels des FISH-Verfahrens eingesetzt werden. Dabei ist es ebenfalls möglich, die Oligonukleotidsequenzen auch als Sonden in anderen Verfahren, z.B. immobilisiert auf einem Genchip einzusetzen.The kit or set according to the invention can be used for quick and efficient detection of microorganisms that occur on the skin, can be used in particular by means of the FISH method. there it is also possible the oligonucleotide sequences also as probes in other processes, e.g. immobilized on a gene chip.

Das erfindungsgemäße Kit ermöglicht den spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Genera Corynebacterium, Peptostreptococcus sowie des Sporomusa-Taxons.The kit according to the invention enables specific detection of microorganisms of the Genera Corynebacterium, Peptostreptococcus and the Sporomusa taxon.

Folgende Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden ergeben sich erfindungsgemäß:
Beispielsweise ist die Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden jeweils aus einer der Gruppen i), ii) oder iii) darunter zu verstehen.The following combinations of one or more oligonucleotides each result according to the invention:
For example, the selection of one or more oligonucleotides is to be understood in each case from one of the groups i), ii) or iii).

Die Kombinationen von ein oder mehreren Oligonukleotiden aus mindestens zwei der Gruppe, also z.B. aus Gruppe i) mit ein oder mehreren Oligonukleotiden aus der Gruppe ii), analog dazu auch solche aus der Gruppe i) mit iii) sowie ii) mit iii) sind erfindungsgemäß mit umfasst.The combinations of one or more oligonucleotides from at least two of the group, that is to say, for example, from group i) with one or more oligonucleotides from group ii), analogously to those from Group i) with iii) and ii) with iii) are also included according to the invention.

Ebenso sind die Kombinationen von jeweils ein oder mehreren Oligonukleotiden aus allen Gruppen erfindungsgemäß möglich.The combinations of one or more oligonucleotides from all groups possible according to the invention.

Das erfindungsgemäße Kit ist daher geeignet, eine Mikroorganismenspezies oder eine Mikroorganismengruppe nachzuweisen. Dazu werden beispielsweise zum Nachweis von bestimmten Spezies von Corynebacterium ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß i) ausgewählt.The kit according to the invention is therefore suitable to detect a microorganism species or a group of microorganisms. For this purpose, for example, for the detection of certain species of Corynebacterium selected one or more oligonucleotides according to i).

Darüber hinaus kann aber vorteilhafterweise durch die geeignete Zusammenstellung des Kits (gemäß den o.g. Kombinationsmöglichkeiten) der Nachweis von Spezies und/oder Gruppen von Mikroorganismen der verschiedenen genannten Gattungen gleichzeitig und/oder nebeneinander durchgeführt werden. Beispielsweise kann mit einer geeigneten Oligonukleotidauswahl der Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß i)) gleichzeitig und/oder nebeneinander zum Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Pepfostreptococcus (durch Auswahl von ein oder mehreren Oligonukleotiden gemäß iii)) stattfinden. Die möglichen Kombinationen können dadurch individuell an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden.In addition, however, can advantageously through the appropriate composition of the kit (according to the above Combinations) the detection of species and / or groups of microorganisms of the different mentioned genera are carried out simultaneously and / or side by side. For example, with a suitable oligonucleotide selection the Detection of microorganisms of the genus Corynebacterium (by Selection of one or more oligonucleotides according to i)) simultaneously and / or side by side for the detection of microorganisms of the genus Pepfostreptococcus (by selecting one or more oligonucleotides according to iii)) occur. The possible Combinations can thereby individually adapted to the respective requirements.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Kit

i) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Corynebacterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 1 bis 8 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder
ii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen aus dem Sporomusa-Taxon, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) einem Oligonukleotid mit der in SEQ ID NO. 09 angegebenen Sequenz, und b) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit dem Oligonukleotid unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren. und/oder
iii) mindestens ein Oligonukleotid zum spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Peptostreptococcus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Oligonukleotiden mit den in SEQ ID NO. 10 bis 15 angegebenen Sequenzen, und b) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 ii) übereinstimmen und c) Oligonukleotiden, welche mit den Oligonukleotiden unter a) entsprechend den Angaben des Anspruchs 8 iii) übereinstimmen und d) Oligonukleotiden, welche mit einer Sequenz, die zu einem der Oligonukleotide unter a), b) oder c) komplementär ist, unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

According to a particular embodiment, the kit according to the invention contains

i) at least one oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Corynebacterium selected from the group consisting of a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO. 1 to 8 specified sequence, and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 8 ii) and c) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 8 iii) and d ) Oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions. and or
ii) at least one oligonucleotide for the specific detection of microorganisms from the sporomusa taxon, selected from the group consisting of a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO. 09 specified sequence, and b) oligonucleotides which match the oligonucleotide under a) according to the details of claim 8 ii) and c) oligonucleotides which match the oligonucleotide under a) according to the details of claim 8 iii) and d) oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions. and or
iii) at least one oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Peptostreptococcus selected from the group consisting of a) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 10 to 15 sequences indicated, and b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 8 ii) and c) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under a) according to the details of claim 8 iii) and d ) Oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under a), b) or c) under stringent conditions.

Insbesondere werden erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 01 bis 08 angegebenen Sequenzen.In particular, according to the invention, oligonucleotides for the specific detection of microorganisms of the genus Corynebacterium provided, the oligonucleotides being complementary to rRNA and selected are from a group consisting of oligonucleotides with the SEQ ID NO. 01 to 08 specified sequences.

Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. coyleiae, C. afermentans, C. „genifalium", C. mucifaciens, C. amycolatum, C. „tuberculostearicum" und C. riegelii.Any of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genus Corynebacterium: C. coyleiae, C. afermentans, C. “genifalium”, C. mucifaciens, C. amycolatum, C. "tuberculostearicum" and C. riegelii.

Vorteilhafterweise werden folgende Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz von diesen Oligonukleotiden nicht erfasst: Clostridium acetobutylicum, Eubacterium yurii und Fusobacterium nucleatum. Ebenfalls nicht erfasst werden die folgenden Bakterien, welche zur Hautmikroflora gehören: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus und Streptococcus pyogenes. Dies ist ein besonderer Vorteil und zeigt die hohe Spezifität der Sonden.Advantageously, the following Microorganisms with similar rRNA sequence not recorded by these oligonucleotides: Clostridium acetobutylicum, Eubacterium yurii and Fusobacterium nucleatum. Likewise the following bacteria, which are responsible for the skin microflora, are not recorded belong: Micrococcus luteus, Micrococcus varians, Micrococcus lyae, Acinetobacter calcoaceticus and Streptococcus pyogenes. This is special Advantage and shows the high specificity of the probes.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 01 angegebenen Sequenz zum Nachwies von einer Gruppe von Mikroorgansimen aus der Gattung Corynebacterium eingesetzt, die von C. „tuberculostearicum" (insbesondere dem Stamm ATCC 35692) bzw. der Gruppe um den Stamm mit der Bezeichnung CDC G5840 und solchen Mikroorganismen gebildet wird, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen. Darunter sind solche Mikroorganismen zu verstehen, die sehr eng mit dem Mikroorganismus verwandt sind bzw. deren rRNA ein hohes Maß an Identität aufweist und/oder insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt mit der rRNA der genannten Mikroorganismen vollständig oder nahezu vollständig (d.h. mit einer Abweichung von ein oder mehreren, bevorzugt ein bis drei Nukleotiden) übereinstimmen.The oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 01 specified sequence for the detection of a group of microorganisms from the genus Corynebacterium used by C. "tuberculostearicum" (in particular the strain ATCC 35692) or the group around the strain with the Be Drawing CDC G5840 and those microorganisms that have a very similar rRNA is formed. These are understood to mean those microorganisms which are very closely related to the microorganism or whose rRNA has a high degree of identity and / or in particular in the section hybridizing with the oligonucleotide mentioned with the rRNA of the said microorganisms completely or almost completely (ie with a deviation of one or more, preferably one to three nucleotides) agree.

Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. „tuberculostearicum" und die Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. minutissimum, C. diphteriae, C. striatum, C. xerosis, C. „fastidiosum"; C. camporealensis, C. accolens und C. „pseudogenitalium" sowie C. afermentans, C. jeikeium, C. durum, C. mucifaciens, C. renale, C. riegelii, C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.This probe advantageously detects C. "tuberculostearicum" and the species of the genus Corynebacterium, which have a very similar rRNA, without following, more closely related species of the genus Corynebacterium Evidence: C. minutissimum, C. diphteriae, C. striatum, C. xerosis, C. "fastidiosum"; C. camporealensis, C. accolens and C. "pseudogenitalium" and C. afermentans, C. jeikeium, C. durum, C. mucifaciens, C. renale, C. riegelii, C. glutamicum, C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. amycolatum und mit dieser Art eng verwandte Spezies die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 02 angegebenen Sequenz eingesetzt. Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise C. amycolatum, und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine sehr ähnliche rRNA aufweisen, und die insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt der rRNA nur wenige, bevorzugt keine Fehlpaarungen aufweist. ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. „asperum"; C. jeikeium, C. bovis, C. freneyi, C. afermentans, C. durum, C. matruchotii, C. mucifaciens, C. renale, C. glutamicum, und C. xerosis sowie C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. minutissimum, C. ammoniagenes, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. riegelii, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.It is particularly preferred for the specific Detection of C. amycolatum and species closely related to this species the probe with the SEQ ID NO. 02 specified sequence used. This probe advantageously detects C. amycolatum, and others Species of the genus Corynebacterium, which is a very similar have rRNA, and in particular in that with said oligonucleotide hybridizing section of the rRNA only a few, preferably none Has mismatches. without the following, more distantly related species of the genus Corynebacterium: C. "asperum"; C. jeikeium, C. bovis, C. freneyi, C. afermentans, C. durum, C. matruchotii, C. mucifaciens, C. renale, C. glutamicum, and C. xerosis and C. lipophiloflavum, C. glucuronolyticum, C. minutissimum, C. ammoniagenes, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. riegelii, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 03 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Spezies von Mikroorganismen, insbesondere der Gattung Corynebaktenum eingesetzt, welche mit der unter Seq ID No 16 angegebenen Teilsequenz der 16 S rRNA zumindest in 60 %, bevorzugt in mindestens 70 %, besonders bevorzugt in mindestens 80 % und ganz besonders bevorzugt in mindestens 90 %, beispielsweise mindestens 95 der Nukleotide übereinstimmen. Besonders bevorzugt sind solche Mikroorganismen, deren 16 S rRNA insbesondere in dem mit dem genannten Oligonukleotid hybridisierenden Abschnitt mit der rRNA der genannten Mikroorganismen vollständig oder nahezu vollständig (d.h. mit einer Abweichung von ein oder mehreren, bevorzugt ein bis drei Nukleotiden) mit der in SEQ ID No. 16 angegebenen Sequenz übereinstimmen. Ebenso sind davon solche Mikroorganismenspezies umfasst, deren 16 S rRNA-Teilsequenz um ein oder mehrere Nukleotide verlängert oder deletiert sind.The oligonucleotide is particularly preferred with the SEQ ID NO. 03 specified sequence for the detection of certain species of microorganisms, especially the genus Corynebakteum used, which with the specified under Seq ID No 16 Partial sequence of the 16 S rRNA at least in 60%, preferably in at least 70%, particularly preferably in at least 80% and very particularly preferably match in at least 90%, for example at least 95, of the nucleotides. Microorganisms whose 16 S rRNA are particularly preferred especially in the hybridizing with said oligonucleotide Section with the rRNA of said microorganisms completely or almost completely (i.e. with a deviation of one or more, preferably one up to three nucleotides) with that in SEQ ID No. 16 specified sequence match. Also included are those microorganism species whose 16th S rRNA partial sequence extended by one or more nucleotides or are deleted.

Diese Sonde detektiert vorteilhafterweise die angegebenen Spezies der Gattung Corynebacterium, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: „C. genitalium"; C. mucifaciens, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. afermentans, C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.This probe advantageously detects the specified species of the genus Corynebacterium, without the following, detect more distant related species of the genus Corynebacterium: “C. genitalium "; C. mucifaciens, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. afermentans, C. pseudogenitalium and C. lipophiloflavum and C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 05 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans eingesetzt.The oligonucleotide is particularly preferred with the SEQ ID NO. 05 specified sequence for the detection of Corynebacteria of the species C. afermentans used.

Diese Sonden detektieren vorteilhafterweise C. afermentans und solche Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. „genitalium"; C. mucifaciens, C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. riegelii, C. thomssenii. C. pseudogenitalium und C. lipophiloflavum sowie C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae und C. urealyticum.These probes advantageously detect C. afermentans and those species of the genus Corynebacterium that one very similar to this species have rRNA without the following more distant related species of the genus Detect Corynebacterium: C. "genitalium"; C. mucifaciens, C. ammoniagenes, C. coyleiae, C. glucuronolyticum, C. riegelii, C. thomssenii. C. pseudogenitalium and C. lipophiloflavum as well C. amycolatum, C. jeikeium, C. durum, C. renale, C. striatum, C. glutamicum, C. accolens, C. xerosis, C. minutissimum, C. camporealensis, C. coyleiae, C. pseudotuberculosis, C. kutscheri, C. callunae and C. urealyticum.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 07 angegebenen Sequenz zum Nachweis von Corynebakterien der Spezies C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und/oder „C. genitalium" eingesetzt Diese Sonden detektieren vorteilhafterweise C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae und „C. genitalium" sowie solcher Spezies der Gattung Corynebacterium, die eine zu diesen Spezies sehr ähnliche rRNA aufweisen, ohne folgende, entfernter verwandte Spezies der Gattung Corynebacterium nachzuweisen: C. xerosis, C. jeikeium, C. urealyticum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. striatum, C. accolens, C. renale, C. ammoniagenes und C. kutscheri sowie C. glucuronolyticum, C. camporealensis, C. pseudotuberculosis, C. durum, C. minutissimum, C. lipophiloflavum, C. callunae und C. thomssenii.The oligonucleotide is particularly preferred with the SEQ ID NO. 07 specified sequence for the detection of Corynebacteria of the species C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae and / or “C. genitalium "used this Probes advantageously detect C. afermentans, C. mucifaciens, C. coyleiae and "C. genitalium "and such species of the genus Corynebacterium which are one of these Species very similar have rRNA without the following, more distantly related species of Detect genus Corynebacterium: C. xerosis, C. jeikeium, C. urealyticum, C. amycolatum, C. glutamicum, C. striatum, C. accolens, C. renale, C. ammoniagenes and C. kutscheri as well as C. glucuronolyticum, C. camporealensis, C. pseudotuberculosis, C. durum, C. minutissimum, C. lipophiloflavum, C. callunae and C. thomssenii.

Diese Oligonukleotide detektieren darüber hinaus ebenfalls folgende Mikroorganismen nicht, die zwar nicht zur Gattung Corynebacterium gehören, aber eine ähnliche rRNA aufweisen: Nanomurea fastidiosa, Micromonospora echinospora, Abiotropha elegans und Arcanobacterium pyogenes.Detect these oligonucleotides about that In addition, the following microorganisms are not either belong to the genus Corynebacterium, but a similar one rRNA have: Nanomurea fastidiosa, Micromonospora echinospora, Abiotropha elegans and Arcanobacterium pyogenes.

Besonders bevorzugt wird für den spezifischen Nachweis von C. negelii und mit dieser Art eng verwandte Spezies die Sonde mit der unter SEQ ID NO. 08 angegebenen Sequenz eingesetzt.It is particularly preferred for the specific Detection of C. negelii and closely related species the probe with the SEQ ID NO. 08 specified sequence used.

Besonders bevorzugt wird das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 09 angegebenen Sequenz zum Nachweis von bestimmten Mikroorganismen des Sporomusa-Taxons, bevorzugt die eine Untergruppe des Sporomusa-Taxons bildenden Mikroorganismen der Gattungen Phascolarctobacterium und Acidaminococcus sowie solchen Mikroorganismen, die eine sehr ähnliche rRNA wie die genannten Mikroorganismen aufweisen, eingesetzt.The oligonucleotide with the one under SEQ ID NO. 09 specified sequence for the detection of certain microorganisms of the Sporomusa taxon, preferably the one subgroup of the microorganisms of the genera Phascolarctobacterium and Acidaminococcus which form sporomusa taxons, and those microorganisms which have a very similar rRNA to the microorganisms mentioned.

Das angegebene Oligonukleotid detektiert mindestens die Spezies Acidaminococcus fermentans, Phascolarctobacterium faecium sowie mit diesen eng verwandte Mikroorganismen mit sehr ähnlicher rRNA, aber nicht die folgenden Mikroorganismen: Veillonella spec. Halobacillus halophilus, Sporomusa paucivorans, Macrococcus caseolyticus, Anaeromusa acidaminophila, Halocella cellulosilytica, Peptostreptococcus anaerobius, Succiniclasticum ruminis und Succinispira mobilis.The specified oligonucleotide is detected at least the species Acidaminococcus fermentans, Phascolarctobacterium faecium as well as closely related microorganisms with very similar ones rRNA, but not the following microorganisms: Veillonella spec. Halobacillus halophilus, Sporomusa paucivorans, Macrococcus caseolyticus, Anaeromusa acidaminophila, Halocella cellulosilytica, Peptostreptococcus anaerobius, Succiniclasticum ruminis and Succinispira mobilis.

Insbesondere werden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis von Mikroorganismen der Gattung Peptostreptococcus bereitgestellt, wobei die Oligonukleotide komplementär sind zur rRNA und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden mit den unter SEQ ID NO. 10 bis 15 angegebenen Sequenzen.In particular, oligonucleotides continue to be used according to the invention for the specific detection of microorganisms of the genus Peptostreptococcus provided, the oligonucleotides being complementary to rRNA and selected are from a group consisting of oligonucleotides with the SEQ ID NO. 10 to 15 sequences indicated.

Die unter dem Gattungsnamen „Peptostreptococcus" bekannten Bakterien können nach neuesten Erkenntnissen verschiedenen Untergruppen, nämlich den Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia, zugeordnet werden.The bacteria known under the generic name "Peptostreptococcus" can according to the latest findings in various sub-groups, namely the Genera Anaerococcus, Peptoniphilus or Finegoldia, assigned become.

Jedes der angegebenen Oligonukleotide detektiert mindestens eine der folgenden Spezies der zu dem Oberbegriff „Peptostreptococcus" gehörenden Gattungen Anaerococcus, Peptoniphilus bzw. Finegoldia: P. assaccharolyticus, P. lacrimalis, P. hareii, P. indolicus, F. magnus, A. tetradius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, und A. vaginalis.Any of the specified oligonucleotides detects at least one of the following species of the genera belonging to the generic term "Peptostreptococcus" Anaerococcus, Peptoniphilus or Finegoldia: P. assaccharolyticus, P. lacrimalis, P. hareii, P. indolicus, F. magnus, A. tetradius, A. hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, and A. vaginalis.

Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zu den Peptostreptokokken gehören, nicht erfasst: Micromonas micros, Helcococcus kunzii, Helcococcus ovis.Advantageously, the following Species of the genus Peptostreptococcus and other microorganisms with similar rRNA sequence, which does not belong to the peptostreptococci, does not recorded: Micromonas micros, Helcococcus kunzii, Helcococcus ovis.

Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit den unter SEQ ID NO. 10 und 11 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren mindestens die folgenden Spezies der Gattung Peptoniphilus: Peptoniphilus assaccharolyticus, P. hareii, P. indolicus (insbesondere den Stamm ATCC 29427) sowie P. lacrimalis.The oligonucleotides are particularly preferred with the under SEQ ID NO. 10 and 11 specified sequences. This Oligonucleotides detect at least the following species of Genus Peptoniphilus: Peptoniphilus assaccharolyticus, P. hareii, P. indolicus (especially the ATCC 29427 strain) and P. lacrimalis.

Dabei werden folgende Spezies mit ähnlicher rRNA von diesen Oligonukleotiden nicht nachgewiesen: Pseudomonas saccharophila, Variovorax paradoxus, Finegoldia magna, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Gallicola baranese, Atopobium parvulum, Veilonella dispar, Pseudomonas putida sowie Spezies der Gattungen Anaerococcus und Corynebacterium.The following species become more similar rRNA not detected from these oligonucleotides: Pseudomonas saccharophila, Variovorax paradoxus, Finegoldia magna, Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Gallicola baranese, Atopobium parvulum, Veilonella dispar, Pseudomonas putida as well as species of the genera Anaerococcus and Corynebacterium.

Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 12 angegebenen Sequenz. Dieses Oligonukleotid detektiert mindestens die Spezies Finegoldia magna sowie solche Mikroorganismen, die in ihrer rRNA-Sequenz dazu sehr ähnlich sind, während folgende Mikroorganismen gleichzeitig nicht nachgewiesen werden können: Anaerococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus lacrimalis, Staphylococcus epidermdis, Halocella cellulosilytica, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Veilonella dispar, Pseudomonas putida sowie andere Spezies der Gattungen Anaerococcus, Corynebacterium sowie Peptoniphilus.The oligonucleotide is particularly preferred with the SEQ ID NO. 12 specified sequence. This oligonucleotide detects at least the species Finegoldia magna and others Microorganisms that are very similar in their rRNA sequence, while the following microorganisms are not detected at the same time can: Anaerococcus hydrogenalis, Peptostreptococcus anaerobius, Peptoniphilus lacrimalis, Staphylococcus epidermdis, Halocella cellulosilytica, Propionibacterium acnes, Micromonas micros, Veilonella dispar, Pseudomonas putida and other species of the genera Anaerococcus, Corynebacterium and peptoniphilus.

Besonders bevorzugt sind die Oligonukleotide mit der unter SEQ ID NO. 13-15 angegebenen Sequenzen. Diese Oligonukleotide detektieren jeweils mindestens die folgenden Spezies der Peptostreptokokken: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii, Anaerococcus tetradius und A. vaginalis.The oligonucleotides are particularly preferred with the SEQ ID NO. 13-15 sequences indicated. These oligonucleotides detect at least the following peptostreptococcal species: Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii, Anaerococcus tetradius and A. vaginalis.

Vorteilhafterweise werden die nachfolgend genannten Arten der Gattung Peptostreptococcus sowie andere Mikroorganismen mit ähnlicher rRNA-Sequenz, die aber nicht zur Gattung Peptostreptococcus gehören, nicht erfasst: Peptoniphilus lacrimalis, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magnus sowie Ruminococcus productus, Brevibacterium epidermidis, Abiotropha elegans und Clostridium hastiforme.Advantageously, the following Species of the genus Peptostreptococcus and other microorganisms with similar rRNA sequence, which does not belong to the genus Peptostreptococcus, does not recorded: Peptoniphilus lacrimalis, Peptostreptococcus anaerobius, Finegoldia magnus and Ruminococcus productus, Brevibacterium epidermidis, Abiotropha elegans and Clostridium hastiforme.

Besonders bevorzugt ist das Oligonukleotid mit der unter SEQ ID NO. 14 angegebenen Sequenz im erfindungsgemäßen Kit enthalten. Dieses Oligonukleotid detektiert mindestens die folgenden Spezies der unter den Gattungsbegriff „Peptostreptococcus" fallenden Mikroorganismen:, Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii und A. vaginalis.The oligonucleotide is particularly preferred with the SEQ ID NO. 14 specified sequence in the kit according to the invention contain. This oligonucleotide detects at least the following Species of the microorganisms falling under the generic term "Peptostreptococcus" :, Anaerococcus hydrogenalis, A. lactolyticus, A. octavius, A. prevotii and A. vaginalis.

In der folgenden Tabelle 2 sind die Sequenzen der Oligonukleotide mit der Bezugsnummer des Sequenzprotokolls zusammengefasst: Tabelle 2

The following table 2 summarizes the sequences of the oligonucleotides with the reference number of the sequence listing: Table 2

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Endung enthält das Kit zusätzlich mindestens ein Oligonukleotid zum Nachweis von anderen Mikroorganismenspezies, -gruppen oder -gattungen enthält.According to a particularly preferred embodiment the ending contains the kit additionally at least one oligonucleotide for the detection of other microorganism species, contains groups or genera.

Besonders geeignet ist ein Kit, das zusätzlich ein oder mehrere Oligonukleotide enthält, die eine größere Gruppe der nachzuweisenden Mikroorganismen detektieren können. Beispielsweise kann es sinnvoll, zuerst solche Proben mit einer oder mehreren Sonden vorab zu identifizieren, die Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium enthalten, und anschließend die positiven Proben spezifisch auf einzelne Mikroorganismenspezies oder -gruppen innerhalb der Gattung Corynebacterium zu untersuchen. Oligonukleotide, die insbesondere auch in Kombination für den Nachweis von vielen verschiedenen Spezies der Gattung Corynebacterium, bevorzugt für den Nachweis der hautrelevanten Spezies der Gattung Corynebacterium, eingesetzt werden können, sind in der deutschen Patentanmeldung DE 10232776.9 offenbart Ebenso ist es bevorzugt, dass das Kit zusätzlich ein oder mehrere, weitere Oligonukleotide zum Nachweis von Spezies der Gattungen Staphylococcus, Veillonella, Malassezia und/oder Propionibacterium enthält. Vorteilhafterweise können dann verschiedene hautrelevanten Mikroorganismen gleichzeitig bzw. parallel in einer Probe, insbesondere in einem einzigen Prozeß bzw. Verfahren, nachgewiesen werden. Geeignet sind wiederum insbesondere solche Oligonukleotide, wie sie in der deutschen Patentanmeldung DE 10232776.9 offenbart sind.A kit which additionally contains one or more oligonucleotides which can detect a larger group of the microorganisms to be detected is particularly suitable. For example, it can be useful to first identify those samples with one or more probes that contain microorganisms of the genus Corynebacterium, and then to examine the positive samples specifically for individual microorganism species or groups within the genus Corynebacterium. Oligonucleotides, which can also be used especially in combination for the detection of many different species of the genus Corynebacterium, preferably for the detection of skin-relevant species of the genus Corynebacterium, are in the German patent application DE 10232776.9 It is also preferred that the kit additionally contains one or more further oligonucleotides for the detection of species of the genera Staphylococcus, Veillonella, Malassezia and / or Propionibacterium. Different skin-relevant microorganisms can then advantageously be detected simultaneously or in parallel in a sample, in particular in a single process or method. Again, those oligonucleotides are particularly suitable, as described in the German patent application DE 10232776.9 are disclosed.

Dieses Kit kann (insbesondere bei der Anwendung in einem in-situ-Hybridierungs-Verfahren als wichtige Bestandteile die jeweiligen Hybridisierungslösungen mit den jeweils für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotiden enthalten. Weiterhin ist kann enthalten sein eine entsprechende Hybridisierungslösung ohne Oligonukleotide sowie die entsprechende Waschlösung oder ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung. Weiterhin können gegebenenfalls enthalten sein Enzymlösungen, Fixierungslösungen sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung. Gegebenenfalls sind Hybridisierungslösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle sowie einer Negativkontrolle (beispielsweise ohne oder mit nicht-hybridisierenden Oligonukleotiden) enthalten.This kit can (especially with the use in an in-situ hybridization process as important components the respective hybridization solutions with each for the microorganisms to be detected specific oligonucleotides contain. A corresponding may also be included hybridization solution without oligonucleotides and the corresponding washing solution or a concentrate of the corresponding washing solution. Furthermore, if necessary contain enzyme solutions, fixing solutions and, if necessary, a mounting solution. If necessary, hybridization solutions are available parallel implementation a positive control and a negative control (e.g. without or with non-hybridizing oligonucleotides).

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann das Kit sowohl markierte Oligonukleotiden als auch unmarkierte Oligonukleotide enthalten. Bevorzugt dient die Inkubation von Proben mit unmarkierten neben markierten Oligonukleotiden der Erhöhung der Spezifität der Sonden. Es ist beispielsweise möglich, nah verwandte Spezies von Mikroorganismen dadurch zu unterscheiden, dass für eine nicht nachzuweisende, mit einer nachzuweisenden Spezies nahe verwandte Mikroorganismenart ein Oligonukleotid eingesetzt wird, die unter den gewählten Bedingungen besser mit der Zielsequenz der rRNA hybridisiert als die markierte Sonde. Eine Kompetition von zwei oder mehr Oligonukleotiden um die Hybridisierung an die Zielsequenz führt dazu, dass die unmarkierte Sonde vorwiegend mit der rRNA des nicht nachzuweisenden Mikroorganismus hybridisiert. Eine Bindung der markierten Sonde und somit ein falsch-positives Ergebnis werden dadurch verhindert. Der spezifische Nachweis von bestimmten Mikroorganismenspezies oder Mikroorganismengruppen wird dadurch vor allem auch in Gegenwart eng verwandter Spezies mit einer sehr ähnlichen rRNA-Sequenz ermöglicht.According to a particularly preferred embodiment, the kit can contain both labeled oligonucleotides and unlabeled oligonucleotides. The incubation of samples with unlabelled and labeled oligonucleotides preferably serves to increase the specificity of the probes. For example, it is possible to distinguish closely related species of microorganisms by using a an oligonucleotide of a species which is closely related to the species to be detected is used, which under the chosen conditions hybridizes better with the target sequence of the rRNA than the labeled probe. A competition of two or more oligonucleotides for hybridization to the target sequence leads to the fact that the unlabeled probe hybridizes predominantly with the rRNA of the undetectable microorganism. This prevents binding of the labeled probe and thus a false positive result. The specific detection of certain microorganism species or groups of microorganisms is thereby made possible, especially in the presence of closely related species with a very similar rRNA sequence.

Beispielsweise ist es erfindungsgemäß geeignet, zusammen mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 3 das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 einzusetzen. Dabei wird bevorzugterweise das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 3 markiert und das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 unmarkiert eingesetzt. Somit kann die Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 16 angegebene Sequenz beinhaltet, problemlos nachgewiesen werden, ohne, dass C. afermentans gleichzeitig detektiert wird (vergleiche Analyseergebnis im Beispiel).For example, according to the invention it is suitable together with the oligonucleotide according to SEQ ID No. 3 the oligonucleotide according to SEQ ID No. 4 use. The oligonucleotide according to SEQ ID is preferably used No. 3 marked and the oligonucleotide according to SEQ ID No. 4 unmarked. Thus, the microorganism species whose 16 S rRNA sequence is the under SEQ ID No. 16 specified sequence includes, easily detected without detecting C. afermentans at the same time (compare analysis result for example).

Ebenfalls kann es erfindungsgemäß geeignet sein, Oligonukleotide der SEQ ID No. 5 und 6 gemeinsam einzusetzen. Während das Oligonukleotid mit der SEQ ID No. 5 markiert als Sonde eingesetzt wird, um C. afermentans, C. ammoniagenes und/oder C. thomssenii zu detektieren, maskiert das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 6 die sehr ähnliche Zielsequenz der Mikroorganismenspezies, deren 16 S rRNA Sequenz die unter SEQ ID No. 16 angegebene Sequenz beinhaltet.It can also be suitable according to the invention be oligonucleotides of SEQ ID No. Use 5 and 6 together. While the oligonucleotide with SEQ ID No. 5 marked used as a probe to C. afermentans, C. ammoniagenes and / or C. thomssenii to detect, the oligonucleotide according to SEQ ID No. 6 the very similar Target sequence of the microorganism species, their 16 S rRNA sequence those under SEQ ID No. 16 specified sequence includes.

Weiterhin kann das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 8 als unmarkierter Kompetitor gemeinsam mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 7 eingesetzt werden. Damit gelingt der Nachweis der folgenden, sich im phylogenetischen Stammbaum nahestehenden Spezies der Gattung Corynebacterium: C. afermentans, C. genitalium, C. mucifaciens, C. coyleiae, ohne, dass gleichzeitig die Corynebacterium-Spezies C. riegelii, die eine sehr ähnliche rRNA aufweist, nachgewiesen wird.Furthermore, the oligonucleotide according to SEQ ID No. 8 as an unlabeled competitor together with the oligonucleotide according to SEQ ID No. 7 are used. The following, species related to the genus in the phylogenetic family tree Corynebacterium: C. afermentans, C. genitalium, C. mucifaciens, C. coyleiae without the Corynebacterium species C. riegelii, which is a very similar one rRNA has been detected.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die folgenden Schritte:

a) Entnahme einer Probe von der Haut
b) Fixierung der in der genommenen Probe enthaltenen Mikroorganismen
c) Inkubieren der fixierten Mikroorganismen mit mindestens einem Oligonukleotid, um eine Hybridisierung herbeizuführen
d) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide und
e) Detektieren und ggf. Quantifizieren der mit den Oligonukleotiden hybridisierten Mikroorganismen.

The implementation of the method according to the invention comprises the following steps:

a) Taking a sample from the skin
b) fixation of the microorganisms contained in the sample taken
c) incubating the fixed microorganisms with at least one oligonucleotide in order to bring about hybridization
d) removing non-hybridized oligonucleotides and
e) Detecting and possibly quantifying the microorganisms hybridized with the oligonucleotides.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Fixieren" der Mikroorganismen eine Behandlung verstanden, mit der die Mikroorganismenhülle für Oligonukleotide durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Oligonukleotiden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung oder ähnliches.Within the scope of the present invention is under "fixing" the microorganisms understood a treatment with which the microorganism shell for oligonucleotides permeable is made. Ethanol is usually used for fixation. Can the cell wall with these measures are not penetrated by the oligonucleotides, so the expert sufficient further measures known that lead to the same result. These include, for example Methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a diluted one formaldehyde solution or similar.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die „Hybridisierung" die fixierten Zellen mit insbesondere fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden inkubiert. Diese können ggf. nach Penetration der Zellhülle sich an die dem Oligonukleotid entsprechende Zielsequenz binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.Within the scope of the present invention be for the "hybridization" the fixed cells incubated with in particular fluorescence-labeled oligonucleotides. these can if necessary after penetration of the cell envelope bind to the target sequence corresponding to the oligonucleotide. The Binding is to form hydrogen bonds between complementary pieces of nucleic acid understand.

Die Oligonukleotide des erfindungsgemäßen. Kits werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer geeigneten Hybridisierungslösung eingesetzt. Geeignete Zusammensetzungen dieser Lösung sind dem Fachmann wohlbekannt. Eine solche Hybridisierungslösung enthält beispielsweise Formamid in einer Konzentration zwischen 0 % und 80 %, bevorzugt von 0 – 45 %, besonders bevorzugt von 20 bis 40 % und hat z.B. eine Salzkonzentration (bei dem Salz handelt es sich bevorzugt um NaCl) zwischen 0,1 Mol/l und 1,5 Mol/l, bevorzugt zwischen 0,5 und 1,0 Mol/l, besonders bevorzugt 0,9 Mol/l. Weiterhin ist enthalten i.a. ein Detergens (i.d.R. SDS) in einer Konzentration zwischen 0,001 % und 0,2 %, bevorzugt 0,005 % bis 0,1 %, besonders bevorzugt von 0,01 %. Zum Puffern der Lösung ist eine geeignete Puffersubstanz (z.B. Tris-HCl, Na-Citrat, HEPES, PIPES o.a.) enthalten, üblicherweise in einer Konzentration zwischen 0,01 Mol/l und 0,1 Mol/l, bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 Mol/l bis 0,05 Mol/l, besonders bevorzugt von 0,02 Mol/l. Der pH-Wert der Hybridisierungslösung liegt in der Regel zwischen 6,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 7,0 und 8,0, besonders bevorzugt um 8,0.The oligonucleotides of the invention. Kits are in the context of the inventive method with a suitable hybridization solution used. Suitable compositions of this solution are well known to those skilled in the art. Such a hybridization solution contains for example formamide in a concentration between 0% and 80%, preferably from 0-45 %, particularly preferably from 20 to 40% and has e.g. a salt concentration (The salt is preferably NaCl) between 0.1 mol / l and 1.5 mol / l, preferably between 0.5 and 1.0 mol / l, particularly preferred 0.9 mol / l. It also includes a detergent (usually SDS) in a concentration between 0.001% and 0.2%, preferably 0.005 % to 0.1%, particularly preferably from 0.01%. To buffer the solution is a suitable buffer substance (e.g. Tris-HCl, Na citrate, HEPES, PIPES or the like), usually in a concentration between 0.01 mol / l and 0.1 mol / l, preferred in a concentration of 0.01 mol / l to 0.05 mol / l, especially preferably 0.02 mol / l. The pH of the hybridization solution is usually between 6.0 and 9.0, preferably between 7.0 and 8.0, particularly preferably around 8.0.

Weitere Zusatzstoffe können zum Einsatz kommen, z.B. fragmentierte Lachsspermien-DNA oder Blocking-Reagenzien zur Verhinderung von Hintergrundrauschen der Hybridisierungsreaktion oder auch Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon oder Dextransulfat zur Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion. Des weiteren können auch Substanzen zugegeben werden, welche die DNA aller in der Probe enthaltenen lebenden und/oder Organismen anfärben (z.B. DAPI, 4',6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid). Solche Zusätze sind dem Fachmann sämtlich wohlbekannt und können in den bekannten und üblichen Konzentrationen zugegeben werden.Other additives can be used, for example fragmented salmon sperm DNA or blocking reagents to prevent background noise from the hybridization reaction, or polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone or dextran sulfate to accelerate the hybridization reaction. Furthermore, substances can also be added which stain the DNA of all living and / or organisms contained in the sample (for example DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride). Such additives are all well known to the person skilled in the art and can be added in the known and customary concentrations become.

Die Konzentration des Oligonukleotids in der Hybridisierungslösung ist abhängig von der Art seiner Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Oligonukleotide die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist zu bedenken, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Oligonukleotide sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 – 500 ng/μl liegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1 – 10 ng jedes verwendeten Oligonukleotids pro μl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 μl und 100 ml liegen, bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt es zwischen 10 μl und 1000 μl, besonders bevorzugt beträgt es zwischen 20 μl und 40 μl.The concentration of the oligonucleotide in the hybridization solution depends on the type of its marking and the number of target structures. To enable fast and efficient hybridization, should the number of oligonucleotides the number of target structures exceed several orders of magnitude. However, it should be borne in mind that an excessive amount of fluorescence-labeled Oligonucleotides too elevated Background fluorescence leads. The concentration of the oligonucleotides should therefore be in a range between 0.5 - 500 ng / μl. The in the context of the inventive method preferred concentration is 1 - 10 ng of each oligonucleotide used per μl hybridization solution. The volume of hybridization solution used should be between 8 μl and 100 ml are in a preferred embodiment of the method according to the invention it is between 10 μl and 1000 μl, is particularly preferred between 20 μl and 40 ul.

Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44 °C und 48 °C, besonders bevorzugt 46 °C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Oligonukleotiden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut.The duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferred for about 1.5 hours. The hybridization temperature is preferably between 44 ° C and 48 ° C, especially preferably 46 ° C, where the parameter of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and detergents in the hybridization solution in dependence on the oligonucleotides, in particular their lengths and the degree of complementarity to the target sequence can be optimized in the cell to be detected. The expert is relevant with here Calculations familiar.

Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Oligonukleotide entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1 % eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01 % bevorzugt wird, sowie Tris-HCl oder eine andere geeignete Puffersubstanz in einer Konzentration von 0,001-0,1 Mol/l, bevorzugt 0,02 Mol/l, enthalten, wobei der pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise um 8,0 liegt. Das Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 Mol/l bis 0,9 Mol/l, bevorzugt von 0,01 Mol/l bis 0,9 Mol/l, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl-Konzentration von 0,07 Mol/l. Des weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 Mol/l beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.After hybridization the non-hybridized and excess oligonucleotides are removed or washed off, which is usually done using a usual wash solution he follows. This washing solution can, if desired, 0.001-0.1% of a detergent such as SDS, with a concentration of 0.01 % is preferred, as well as Tris-HCl or another suitable buffer substance in a concentration of 0.001-0.1 mol / l, preferably 0.02 mol / l, contain, the pH in the range of 6.0 to 9.0, preferably around 8.0 lies. The detergent can be included, but is not mandatory required. Further contains the washing solution usually NaCl, the concentration depending on the stringency required of 0.003 Mol / l to 0.9 mol / l, preferably from 0.01 mol / l to 0.9 mol / l. Especially a NaCl concentration of 0.07 mol / l is preferred. Furthermore can the washing solution Contain EDTA, the concentration is preferably 0.005 mol / l. Further can the washing solution also familiar to the expert Preservatives contained in suitable amounts.

Das „Abwaschen" der nicht gebundenen Oligonukleotide erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44 °C bis 52 °C, bevorzugt von 44 °C bis 50 °C und besonders bevorzugt bei 44 °C bis 48 °C für eine Dauer von 10 – 40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.The "washing off" of the unbound oligonucleotides usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C to 52 ° C, preferably from 44 ° C to 50 ° C and especially preferably at 44 ° C up to 48 ° C for one Duration from 10 - 40 Minutes, preferably for 15 minutes.

Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung des verwendeten Oligonukleotids möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u.a.The final evaluation depends on the type of labeling of the oligonucleotide used possible with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, Fluorometer and others

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vielfältig.The advantages of the method according to the invention are diverse.

Ein besonderer Vorteil ist die Geschwindigkeit dieses Nachweisverfahrens. Während die traditionelle Kultivierung bis zu sieben Tage für den Nachweis benötigt, liegt das Ergebnis nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb von drei Stunden vor. Dies ermöglicht erstmals eine begleitende diagnostische Kontrolle der Wirkungen und unerwünschten Wirkungen einer angewandten Behandlung. Hier ist weiterhin vorteilhaft, dass das erfinderisch bereitgestellte Verfahren es ermöglicht, alle genannten Mikroorganismen gleichzeitig nachzuweisen, was einen weiteren Zeitvorteil bedeutet, da alle Schritte von der Probenahme bis zur Auswertung nur einmal durchgeführt werden müssen.The speed is a particular advantage this verification procedure. While traditional cultivation up to seven days for detection needed the result is after application of the method according to the invention within three hours before. This enables accompanying for the first time diagnostic control of the effects and adverse effects of an applied Treatment. It is also advantageous here that this is inventive provided method allows to demonstrate all of the above-mentioned microorganisms at the same time, Another time advantage means having all the steps from sampling only have to be carried out once before evaluation.

Ein wesentlicher Vorteil besteht weiterhin darin, dass nun erstmals der gleichzeitige Nachweis dieser medizinisch und kosmetisch relevanten Mikroorganismen der Hautmikroflora möglich ist. So können durch Verwendung unterschiedlicher Marker für die Oligonukleotide ganz nach Bedarf alle, mehrere oder einzelne Mikroorganismengruppen oder -spezies parallel nachgewiesen und dabei klar voneinander unterschieden werden. Auch können so erstmals die Populationsverhältnisse dieser Mikroorganismengruppen oder -spezies und die zwischen ihnen bestehenden Wechselwirkungen analysiert werden. Dies eröffnet erstmals die Möglichkeit zur eindeutigen Diagnose und gezielten Behandlung von medizinisch und/oder kosmetisch relevanten Hautproblemen. Es ist nun erstmals möglich, die Auswirkungen einer medizinischen Therapie oder kosmetischen Behandlung auf die Gesamtmikroflora der Haut zu erfassen. Mögliche Wirkungen ebenso wie unerwünschte Wirkungen einer Behandlung können so früh erkannt und in der weiteren Behandlung verstärkt bzw. unterbunden werden.There is a significant advantage continue in that now for the first time the simultaneous detection of this medically and cosmetically relevant microorganisms of the skin microflora is possible. So can by using different markers for the oligonucleotides entirely if necessary, all, several or individual groups of microorganisms or - Species detected in parallel and clearly differentiated from one another become. Can too the population ratios for the first time these groups or species of microorganisms and those between them existing interactions are analyzed. This opens for the first time the possibility of clear diagnosis and targeted treatment of medical and / or cosmetically relevant skin problems. It is now possible for the first time Effects of medical therapy or cosmetic treatment to capture the total microflora of the skin. Possible effects as well unwanted effects treatment so early recognized and reinforced or prevented in further treatment.

Darüber hinaus können mit dem erfindungsgemäßen Kit in diesem Verfahren nunmehr erstmals auch solche Mikroorganismen der Hautmikroflora nachgewiesen werden, die von den traditionellen Nachweisverfahren bislang nicht erfasst wurden.In addition, with the kit according to the invention Such microorganisms are now also used for the first time in this process the skin microflora can be detected by the traditional Detection methods have not yet been recorded.

Dabei können je nach Spezifität des Oligonukleotids bzw. der verwendeten Oligonukleotide unterschiedlichste Gruppen von Mikroorganismen detektiert werden. Es ist einerseits möglich große Gruppen von Mikroorganismen, aber auch kleinere Untergruppen, die eine enge Verwandtschaft aufweisen, und sogar einzelne Spezies spezifisch, neben anderen, auch nahe verwandten Mikroorganismenspezies nachzuweisen.Depending on the specificity of the oligonucleotide or the different groups of oligonucleotides used can be detected by microorganisms. On the one hand, large groups are possible of microorganisms, but also smaller subgroups that have a narrow Have kinship, and even specific species, among other, also closely related species of microorganisms.

Weiterhin ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, im Falle des positiven Signals, über die Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde, eine Einordnung von unbekannten Mikroorganismenspezies in den phylogenetischen Stammbaum vorzunehmen oder solche Zuordnungen, die aufgrund von biochemischen Nachweisen vorgenommen wurde, zu bestätigen.Furthermore, with the aid of the method according to the invention, in the case of the positive signal, about the hybridization with a specific probe, to assign unknown microorganism species to the phylogenetic family tree or to confirm such assignments based on biochemical evidence.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Probe in Schritt a) des Verfahrens von der Hautoberfläche gewonnen.According to a preferred embodiment the inventive method the sample is obtained from the skin surface in step a) of the method.

Bei der Probennahme von der Haut des Probanden wird die Haut in Kontakt mit einer Detergenslösung gebracht, die die Ablösung der Mikroorganismen von der Hautoberfläche erleichtern soll. Bevorzugt werden physiologisch unbedenkliche Detergenzien, wie z. B. Tween oder Triton, in Konzentrationen von etwa 0,01-1 Gew.-% eingesetzt. Ein pH-Wert zwischen 5 und 10, insbesondere zwischen 7 und 9, z. B. 8, hat sich als günstig erwiesen.When sampling from the skin the subject's skin is brought into contact with a detergent solution, the detachment to facilitate the removal of microorganisms from the surface of the skin. Prefers are physiologically safe detergents, such as. B. Tween or Triton, used in concentrations of about 0.01-1 wt .-%. A pH between 5 and 10, especially between 7 and 9, e.g. B. 8, has proven to be cheap proved.

Um eine bessere Ablösung der Mikroorganismen zu erreichen, wird die Hautoberfläche mit Hilfe eines Schabeinstrumentes abgerieben. Es eignen sich dabei Stäbe unterschiedlicher Dicke, z. B. mit einem Durchmesser von 0,05 bis 1,5 cm, aus unterschiedlichen Materialien wie beispielsweise Glas, Metall oder Plastik. Ebenso sind Spatel aus den genannten Materialien mit einer abgerundeten Fläche geeignet. Bevorzugt finden Glasstäbe zwischen 0,4 und 0,8 cm Durchmesser oder Plastikspatel Verwendung. Ebenfalls günstig eingesetzt werden können beispielsweise Mundstücke von Glaspipetten, z. B. einer 5 ml Glaspipette. Als besonders geeignet hat es sich erwiesen, rauere Oberflächen über die Haut zu reiben, um die Ablösung zu erhöhen.To better replace the Reaching microorganisms is using the skin surface Rubbed off with the help of a scraping instrument. It is suitable Rods different Thickness, e.g. B. with a diameter of 0.05 to 1.5 cm, from different Materials such as glass, metal or plastic. As well are spatulas made of the materials mentioned with a rounded area suitable. Glass rods between 0.4 and 0.8 cm are preferred Diameter or plastic spatula use. Can also be used cheaply can for example mouthpieces of glass pipettes, e.g. B. a 5 ml glass pipette. As particularly suitable it has been shown to rub rougher surfaces over the skin to the detachment to increase.

Insbesondere geeignet sind Plastikspatel mit rauer Oberfläche, beispielsweise ein Probenahmespatel aus Polyamid glasfaserverstärkt der Fa. Merck (Art. Nr. 231J2412, Doppelspatel, Länge 180 mm). Ebenfalls erfindungsgemäß geeignet sind Abreibungen mit Tupfern sowie die Probengewinnung durch Abklatschen mit viskoseren Medien oder auch Hautabrisse mit Klebefilmen (beispielsweise handelsübliche Haushaltsklebestreifen). Die Mikroorganismen können bei diesen Methoden beispielsweise durch Abwaschen mit einer entsprechenden Pufferlösung von diesen Gegenständen gewonnen werden. Das weitere Verfahren kann auch direkt auf dem Klebestreifen durchgeführt werden.Plastic spatulas are particularly suitable with a rough surface, for example a sampling spatula made of glass fiber reinforced polyamide Merck (Art. No. 231J2412, double spatula, length 180 mm). Also suitable according to the invention are rubbing with swabs as well as sampling by clapping with more viscous media or skin tears with adhesive films (for example commercial Household adhesive tape). The microorganisms can, for example, with these methods obtained from these objects by washing with an appropriate buffer solution become. The further procedure can also be done directly on the adhesive strip carried out become.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Fixierung durch

i) denaturierende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Ethanol, Aceton und Ethanol-Essigsäuremischungen,
ii) quervernetzende Reagenzien, vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Formaldehyd, Paraformaldehyd und Glutaraldehyd, oder
iii) als Hitzefixierung

According to a further preferred embodiment, the fixation takes place by

i) denaturing reagents, preferably selected from a group consisting of ethanol, acetone and ethanol-acetic acid mixtures,
ii) crosslinking reagents, preferably selected from a group consisting of formaldehyde, paraformaldehyde and glutaraldehyde, or
iii) as heat fixation

Insbesondere können die Mikroorganismen nach dem Fixieren auf einem Träger immobilisiert werden.In particular, the microorganisms can fixing on a support be immobilized.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die fixierten Zellen der Mikroorganismen vor Schritt c) des erfindungsgemäßen Verfahrens permeabilisiert.According to a particularly preferred embodiment the fixed cells of the microorganisms before step c) of inventive method permeabilized.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter „Permeabilisierung" eine enzymatische Behandlung der Zellen verstanden. Durch diese Behandlung wird die Zellwand von Pilzen und gram-positiven Bakterien für die Oligonukleotide durchlässig gemacht. Hierfür geeignete Enzyme, deren geeignete Konzentrationen und für diese geeignete Lösungsmittel sind dem Fachmann bekannt. Es versteht sich von selbst, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Analyse gram-negativer Bakterien geeignet ist; die enzymatische Behandlung zur Permeabilisierung wird dann entsprechend adaptiert, es kann auf diese dann auch ganz verzichtet werden.Within the scope of the present invention becomes an enzymatic under "permeabilization" Treatment of the cells understood. Through this treatment the Cell wall of fungi and gram-positive bacteria for the oligonucleotides permeable made. Therefor suitable enzymes, their suitable concentrations and for these suitable solvents are known to the person skilled in the art. It goes without saying that that inventive method is also suitable for the analysis of gram-negative bacteria; the enzymatic Treatment for permeabilization is then adapted accordingly, this can then be dispensed with entirely.

Die Permeabilisierung der Zellen vor der Hybridisierung hat den Vorteil, dass die Oligonukleotide zwar in die Zellen eindringen können, die Ribosomen und somit die rRNA aber nicht aus den Zellen entweichen kann. Der große Vorteil dieser Technik der Ganzzellhybridisierung ist, dass die Morphologie der Bakterien intakt bleibt und man diese intakten Bakterien in situ, also in ihrem natürlichen Umfeld detektieren kann. Folglich können die Bakterien nicht nur quantifiziert werden, sondern auch eventuelle Assoziationen zwischen verschiedenen bakteriellen Gruppen nachgewiesen werden.The permeabilization of the cells before hybridization has the advantage that the oligonucleotides can penetrate the cells the ribosomes and therefore the rRNA cannot escape from the cells. The great The advantage of this whole cell hybridization technique is that Morphology of the bacteria remains intact and you get these intact bacteria in situ, that is, in its natural state Environment can detect. Consequently, the bacteria can not only be quantified, but also any associations between different bacterial groups can be detected.

Ganz besonders bevorzugt kann die Permeabilisierung durch partiellen Abbau mittels zellwandlytischer Enzyme, bevorzugt ausgewählt aus einer Gruppe, bestehend aus Lysozym, Lysostaphin, Proteinase K, Pronase und Mutanolysin erfolgen.The can very particularly preferably Permeabilization through partial degradation using cell wall lytic Enzymes, preferably selected from a group consisting of lysozyme, lysostaphin, proteinase K, pronase and mutanolysin occur.

Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird außerdem ein als Positivkontrolle geeignetes Oligonukleotid bereit gestellt. Ein solches Oligonukleotid ist dadurch gekennzeichnet, dass es möglichst viele, optimalerweise alle in der analysierten Probe enthaltenen Bakterien bzw. Eurkaryonten erfasst. Hierzu ist beispielsweise das von Amann et al., (1990) beschriebene Oligonukleotid EUB338 (Bakterien) bzw. das Oligonukleotid EUK (Eukaryonten) geeignet. Eine solche Positivkontrolle kann zur Überprüfung der ordnungsgemäßen Durchführung des angewendeten Verfahrens eingesetzt werden. Vor allem aber erlaubt sie die Bestimmung eines prozentualen Anteils der spezifisch nachgewiesenen Mikroorganismen gegenüber der Bakteriengesamtpopulation.According to a particularly preferred embodiment The present invention also becomes a positive control suitable oligonucleotide provided. Such an oligonucleotide is characterized in that there are as many, optimally all bacteria or eurkaryotes contained in the analyzed sample detected. For example, that of Amann et al., (1990) described oligonucleotide EUB338 (bacteria) or the oligonucleotide EUK (eukaryotes) suitable. Such a positive control can be used to check the proper implementation of the applied method can be used. Above all, allowed they determine a percentage of the specifically proven Against microorganisms the total bacterial population.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Kits zum Nachweis und/oder der Quantifizierung von Mikroorganismen auf der Haut.Another object of the invention is the use of the kit for detection and / or quantification of microorganisms on the skin.

So ist die Verwendung des Kits, insbesondere im erfindungsgemäßen Verfahren, bei der Wirkstoffsuche, bei der Analyse der Mikroflora der Haut sowie bei der Testung der Wirkung von wirkstoffhaltigen Kosmetika vorteilhaft. Die Untersuchung sowohl von menschlicher als auch von tierischer Haut direkt oder in von ihnen genommenen Proben kann mit den erfindungsgemäßen Kits effizient und auch gegen einen hohen Hintergrund von anderen Mikroorganismen erfolgen.The use of the kit, in particular in the process according to the invention, is the case with active ingredient su che, advantageous in the analysis of the microflora of the skin and in testing the effect of cosmetics containing active ingredients. The investigation of both human and animal skin directly or in samples taken from them can be carried out efficiently with the kits according to the invention and also against a high background of other microorganisms.

Das folgende Beispiel soll die Endung beschreiben, ohne sie einzuschränken:The following example is the extension describe without restricting them:

Beispiel:Example:

Nachweis von Mikroorganismen der HautmikrofloraDetection of microorganisms the skin microflora

Probenahme:Sampling:

Die Probenahme erfolgt mittels der Detergens-Waschmethode ((P. Williamson, A.M. Kligman. (1965) J. Invest. Derm., Vol. 45, No. 6).Sampling is carried out using the Detergent washing method ((P. Williamson, A.M. Kligman. (1965) J. Invest. Derm., Vol. 45, No. 6).

Durchführung:Execution:

1. The plastic cylinder, which is open on both sides, is pressed with the undamaged side onto the skin surface to be examined and with 1.5 ml of the detergent solution (a physiological Tween buffer solution, pH 8.0 with 0.523 KH 2 PO 4 g / liter, 16.73 KH 2 PO 4 g / liter, 8.50 NaCl g / liter, 10.00 tween 80 g / liter and 1.00 trypton g / liter).
2. With one of the above Scraper tools will be the one to be treated area Rubbed 6x horizontally and 6x vertically under light pressure.
3. The procedure is repeated after aspirating the liquid.

Die beiden Flüssigkeiten werden vereinigt. Ein Teil der Probe aus den beiden vereinigten Flüssigkeiten wird für den anschließenden Nachweis unter Verwendung von Oligonukleotiden verwendet, ein anderer Teil wird für den als Kontrolle dienenden, parallel durchgeführten Nachweis durch Kultivierung der in der Probe enthaltenen Mikroorganismen verwendet.The two liquids are combined. Part of the sample from the two combined liquids is used for subsequent detection using oligonucleotides, another part is for the as a control, performed in parallel by cultivation of the microorganisms contained in the sample.

Zum Ansetzen der Detergenslösung soll keimfreies Wasser (z. B. Millipore-Wasser) eingesetzt werden.To prepare the detergent solution germ-free water (e.g. Millipore water) can be used.

Fixierung:fixation:

Die entnommene Probe wird sodann mit einem Volumen absolutem Ethanol versetzt und zentrifugiert (Raumtemperatur, 8.000 U/min, 5 Minuten). Der Überstand wird verworfen und das Pellet in einem Volumen 1 × PBS-Lösung gewaschen. Abschließend wird das Pellet in 1/10 Volumen Fixierungslösung (50 % Ethanol) resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.The sample taken is then with a volume of absolute ethanol and centrifuged (room temperature, 8,000 rpm, 5 minutes). The supernatant is discarded and the pellet washed in a volume of 1 × PBS solution. Finally the pellet is resuspended in 1/10 volume of fixative solution (50% ethanol) and stored at -20 ° C until further use.

Ein Aliquot der Zellsuspension wird auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen vollständig dehydratisiert durch Aufbringen einer weiteren Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46 °C, 3 min oder bis vollständig trocken).An aliquot of the cell suspension is made on a slide applied and dried (46 ° C, 30 min or until complete dry). Subsequently the cells become complete dehydrated by applying another fixation solution (ethanol absolutely) and dried again (46 ° C, 3 min or until completely dry).

Permeabilisierung:permeabilization:

Anschließend wird ein geeignetes Volumen einer geeigneten Enzymlösung aufgebracht und die Probe inkubiert (Raumtemperatur, 15 min). Dieser Schritt wird ggf. mit einer weiteren geeigneten Enzymlösung wiederholt.Then a suitable volume a suitable enzyme solution applied and the sample incubated (room temperature, 15 min). This If necessary, the step is repeated with a further suitable enzyme solution.

Die Permeabilisierungslösung wird mit destilliertem Wasser entfernt und die Probe erneut vollständig getrocknet (Inkubation bei 46 °C bis vollständig trocken). Anschließend werden die Zellen erneut vollständig dehydratisiert durch Aufbringen der Fixierungslösung (Ethanol absolut) und erneut getrocknet (46 °C, 3 min oder bis vollständig trocken).The permeabilization solution will removed with distilled water and the sample completely dried again (Incubation at 46 ° C until complete dry). Subsequently the cells are completely dehydrated again by applying the fixation solution (Absolute ethanol) and dried again (46 ° C, 3 min or until completely dry).

Hybridisierung:hybridization:

Anschließend wird auf die fixierten, vollständig aufgeschlossenen und dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Oligonukleotide aufgebracht. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungslösung (ohne Oligonukleotide) befeuchteten Kammer (46 °C, 90 min).Then the fixed, Completely digested and dehydrated cells with the hybridization solution the one described above for the respective microorganism-specific oligonucleotides applied. The slide will then in a hybridization solution (without oligonucleotides) humidified chamber (46 ° C, 90 min).

Waschen:To wash:

Anschließend wird der Objektträger in eine mit Waschlösung befüllte Kammer eingetaucht und inkubiert (46 °C, 15 min).Then slide the slide into one with washing solution filled Chamber immersed and incubated (46 ° C, 15 min).

Anschließend wird der Objektträger in eine mit destilliertem Wasser befüllte Kammer kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46 °C, 30 min oder bis vollständig trocken).Then slide the slide into one filled with distilled water Chamber immersed briefly and then in a lateral position air dried (46 ° C, 30 min or until complete dry).

Detektion:detection:

Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Einbettmedium eingebettet. Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.Then the slide is in one suitable embedding medium. Finally, the sample is made with the help analyzed by a fluorescence microscope.

Analysenergebnis:Analysis Result:

Von einer weiblichen Probandin wurde eine Mikroorganismen-Probe von der Haut mittels der oben beschriebenen Methode zur Probennahme genommen.From a female subject a microorganism sample from the skin using the method described above Sampling method taken.

Aus einem Teil der Probe wurde ein Teil der 16 S rRNA-Sequenz eines Mikroorganismus isoliert, deren Sequenz noch nicht bekannt war, die sich aber der Gattung Corynebacterium zuordnen läßt. Diese Sequenz, anhand derer eine entsprechende Sonde (gemäß SEQ ID No. 03) entwickelt wurde, die diesen Mikroorganismus nachweisen kann, ist unter SEQ ID No. 16 im Sequenzprotokoll angegeben.Part of the sample became one Part of the 16 S rRNA sequence of a microorganism isolated, its sequence was not yet known, but which belongs to the genus Corynebacterium assigns. This Sequence based on which a corresponding probe (according to SEQ ID No. 03) was developed to detect this microorganism can be found under SEQ ID No. 16 specified in the sequence listing.

Ein weiterer Teil der Probe wurde mit der früher beschriebenen bakterienspezifischen Sonde EUB und mit den in der DE 102 32 776.9 beschriebenen Sonde für Corynebakterien (Sondengemisch zum Nachweis der hautrelevanten Corynebakterien, SEQ ID No. 07 bis 11, DE 102 32 776.9 ) hybridisiert.Another part of the sample was with the previously described bacteria-specific probe EUB and with the in the DE 102 32 776.9 described probe for corynebacteria (probe mixture for the detection of skin-relevant corynebacteria, SEQ ID No. 07 to 11, DE 102 32 776.9 ) hybridizes.

Es wurde ein hoher Anteil an Corynebakterien durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der Gesamtzellzahl, die von der bakterienspezifischen Sonde erfasst worden war, festgestellt (ca. 73%).There was a high percentage of corynebacteria by counting of the fluorescence signals and comparison with the total cell number that was detected by the bacteria-specific probe (approx. 73%).

Von den Corynebakterien dieser Probe hybridisierte ein kleiner Anteil von etwa 5% mit dem markierten Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 03, was durch Auszählung der Fluoreszenzsignale und Vergleich mit der zuvor detektierten Corynebakterienzahl ermittelt werden konnte, wobei das Oligonukleotid gemäß SEQ ID No. 4 gleichzeitg unmarkiert als Kompetitor mitzugesetzt wurde.From the corynebacteria of this sample a small fraction of about 5% hybridized with the labeled oligonucleotide according to SEQ ID No. 03 what by counting the Fluorescence signals and comparison with the previously detected number of corynebacteria could be determined, the oligonucleotide according to SEQ ID No. 4 was simultaneously added unmarked as competitor.

SEQUENCE LISTINGSEQUENCE LISTING

Claims

Kit for the detection of microorganisms containing at least one oligonucleotide for at least one species or a group of species of microorganisms, that occur on the skin.

Kit according to claim 1, characterized in that the microorganisms selected are from the genera Corynebacterium, Peptostreptococcus and the Sporomusa-taxon.

Kit according to one of claims 1 or 2, characterized in that that the detection of the microorganisms by means of in-situ hybridization, especially fluorescence in situ hybridization.

Kit according to one of the preceding claims, characterized characterized that it is additional at least one oligonucleotide for at least one species or group of species from Veillonella, Mallassezia, Propionibacterium, Staphyloccocus and / or Corynebacterium contains.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the oligonucleotide carries a detectable marker which in particular is covalently bound to the oligonucleotide.

The kit of claim 5, wherein the detectable marker selected is made up of a group of a) fluorescent markers, b) chemiluminescent, c) radioactive marker, d) enzymatic active group, e) hapten, f) detectable by hybridization Nucleic acid.

The kit of claim 6, wherein the enzymatic marker from a group consisting of peroxidase, preferably horseradish peroxidase, and phosphatase, preferably alkaline phosphatase.

Kit according to one of the preceding claims, characterized in that it contains at least one oligonucleotide selected from the group consisting of i) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 01 to 15 specified sequences, and ii) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides under i) in 77%, preferably in at least 83%, particularly preferably in at least 88%, very particularly preferably in 94% of the nucleotides, and iii) oligonucleotides, which are derived from one of the oligonucleotides mentioned under i) and ii), the sequence being deleted or extended by one or more nucleotides, and iv) oligonucleotides which hybridize with a sequence which is complementary to one of the oligonucleotides under i), ii) or iii) under stringent conditions.

Kit according to claim 8, characterized in that it contains at least one oligonucleotide selected from the group consisting of out i) at least one oligonucleotide for specific detection of bacteria of the genus Corynebacterium selected from the group out a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO. 1 to 8 specified Sequence, and b) oligonucleotides, which with the oligonucleotides under a) in accordance with the details of claim 8 ii) and c) oligonucleotides, which with the oligonucleotides under a) match according to the information in claim 8 iii) and d) oligonucleotides which have a sequence which leads to a the oligonucleotides under a), b) or c) are complementary under hybridize stringent conditions. and or ii) at least an oligonucleotide for the specific detection of microorganisms selected from the Sporomusa taxon from the group consisting of a) an oligonucleotide with the in SEQ ID NO. 09 specified sequence, and b) oligonucleotides, which with the oligonucleotide under a) according to the information of claim 8 ii) agree and c) oligonucleotides, which with the oligonucleotide under a) match according to the information in claim 8 iii) and d) oligonucleotides which have a sequence which leads to a the oligonucleotides under a), b) or c) are complementary under hybridize stringent conditions. and or iii) at least an oligonucleotide for the specific detection of bacteria of the genus Peptostreptococcus selected from the group consisting of a) oligonucleotides with the in SEQ ID NO. 10 to 15 sequences indicated, and b) oligonucleotides, which with the oligonucleotides under a) according to the information of claim 8 ii) agree and c) oligonucleotides, which with the oligonucleotides under a) match according to the information in claim 8 iii) and d) oligonucleotides which have a sequence which leads to a the oligonucleotides under a), b) or c) are complementary under hybridize stringent conditions.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally to one or more labeled oligonucleotides at least one, preferably contains one or more unlabeled oligonucleotides.

Kit according to one of the preceding claims, wherein , the kit additionally at least one hybridization solution contains no oligonucleotides.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally at least one suitable washing solution or a concentrate of the washing solution contains.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally contains at least one suitable permeabilization solution.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally contains at least one suitable fixation solution.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally contains at least one suitable positive control solution.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally contains at least one suitable negative control solution.

Kit according to one of the preceding claims, wherein the kit additionally an embedding solution contains.

Method for the detection of microorganisms which occur on the skin, in particular the genera Corynebacterium, Peptostreptococcus or microorganisms of the Sporomusa taxon by in-si tu hybridization, wherein a kit according to one of claims 1 to 17 is used, comprising the following steps: a) taking a sample from the skin b) fixing the microorganisms contained in the sample taken c) incubating the fixed microorganisms with at least one oligonucleotide or oligonucleotide combination to bring about hybridization d) removing non-hybridized oligonucleotides e) detecting and, if necessary, quantifying the microorganisms hybridized with the oligonucleotides.

The method of claim 18, wherein the sample in a) from the skin surface is won.

Method according to one of claims 18 or 19, wherein the fixation by i) denaturing reagents, preferably selected from a group consisting of ethanol, acetone and ethanol-acetic acid mixtures he follows, ii) cross-linking reagents, preferably selected from a group consisting of formaldehyde, paraformaldehyde and glutaraldehyde he follows, iii) where the fixation takes place as heat fixation

A method according to any one of claims 18 to 20, wherein the microorganisms after being fixed on a support be immobilized.

Method according to one of claims 18 to 21, wherein the microorganisms be permeabilized before hybridization.

The method of claim 22, wherein the permeabilization takes place through partial degradation by means of cell wall lytic enzymes, preferably selected from a group consisting of lysozyme, lysostaphin, proteinase K, pronase and mutanolysin.

Use of a kit according to one of claims 1 to 17 for the detection and / or quantification of microorganisms on the skin.