DE10296800T5

DE10296800T5 - Inhibitoren von Isoformen der DNA Methyltransferase

Info

Publication number: DE10296800T5
Application number: DE10296800T
Authority: DE
Inventors: Alan Robert Montreal Macleod
Original assignee: Methylgene Inc
Current assignee: Methylgene Inc
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2004-04-22
Also published as: SE0302965D0; WO2002091926A3; CA2446606A1; AU2002342417A1; GB0328781D0; US20030083292A1; WO2002091926A2; GB2392911A

Abstract

Ein Mittel, das eine oder mehrere DNA Methyltransferase Isoformen, aber nicht alle DNA Methyltransferase Isoformen inhibiert, wobei das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, einem Anti-DNA Methyltransferase Oligonukleotid und einem Small Molecule Inhibitor der DNA Methyltransferase.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich den Bereich der Molekularbiologie, Zellbiologie, und Krebstherapie.
ZUSAMMENFASSUNG DES STANDES DER TECHNIK
In Säugetieren ist die Modifizierung der 5' Position des Cytosin durch Methylierung die einzige bekannte, natürlich vorkommende kovalente Modifizierung des Genoms. DNA Methylierungsmuster korrelieren invers mit der Genexpression (Yeivin, A., und Razin, A. (1993) EXS 64: 523). Deshalb ist vorgeschlagen worden, dass DNA Methylierung eine epigenetische Determinante der Genexpression ist. DNA Methylierung ist ebenfalls korreliert mit verschiedenen anderen zellulären Prozessen, einschließlich der Chromatinstruktur (Keshet, I. et al., (1986) Cell 44: 535–543; und Kass, S. U., et al., (1997) Curr. Biol., 7: 157–165), genomisches Imprinting (Barlow, D. P. (1993) Science, 260: 309–310; und Li. E., et al., (1993) Nature 366: 362–365), somatische X-Chromosom Inaktivierung in Frauen (6), und Timing der DNA Replikation (Shemer, R., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6371–6376).
Selig et al. beschreibt, dass die DNA 5-Cytosin Methyltransferase (DNA MeTase) Enzyme den Transfer einer Methylgruppe von S-Adenosyl-methionine zu der 5-Position des Cytosin-Restes in der Dinukleotid Sequenz CpG katalysieren (Selig, S., et al. (1988) EMBO J., 7: 419–426). Bisher sind drei DNA MeTasen in somatischen Geweben von Vertebraten identifiziert worden. Adams et al. lehrt das DNMT-1 die am meisten vorkommende DNA MeTase in Säugerzellen ist (Adams, R. L., et al., (1979) Biochem. Biophys. Acta 561: 345–357). Glickman et al. lehrt, dass DNMT-1 vorzugsweise halbmethylierte DNA als Substrat methyliert, und es wird daher angenommen, dass sie in erster Linie verantwortlich ist für die Aufrechterhaltung der Methylierungsmuster, die sich in der Entwicklung etabliert haben (Glickman, F. J., et al., (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 280–284). Okano et al. schlägt vor, dass die kürzlich identifierten DNA MeTase Enzyme DNMT3a und DNMT3b, die langgesuchte de novo Methylierungs-aktivität kodieren, die verantwortlich ist für die Methylierung zuvor unmethylierter DNA, um neue DNA Methylierungsmuster herzustellen (Okano, M., et al., (1998) Nat. Genet. 19: 219–20).
DNA-Methylierungsmuster sind sehr variabel während der Entwicklung und schließen sowohl die globale Demethylierung als auch de novo Methylierungs-ereignisse ein (zum Nachlesen, siehe Razin, A., und Cedar, H. (1993) EXS 64: 343–57). Genetische Experimente haben gezeigt, dass die richtige Regulierung der DNA Methylierung essential ist für die normale Säuger Entwicklung. Li et al. beschreibt das Mäuse, homozygot für die gezielte Ausschaltung der DNMT-1 (DNMT-1 -/- Maus), nicht in der Lage sind die etablierten DNA Methylierungsmuster aufrechterzuerhalten und sie überleben die Hälfte der Schwangerschaft nicht (Li, E., et al., (1992) Cell 69: 915–926). Gleichermaßen beschreibt Okano et al, dass der DNMT 3b -/- Genotyp letale Embryos in Maus verursacht, wohingegen DNMT3a -/- Mäuse sich bis zur Geburt entwickeln, allerdings unterentwickelt sind und nach ungefähr vier Wochen sterben (Okano, M., et al., (1999) Cell 99: 247–57).
Zusätzlich zu der Rolle, die die DNA-Methylierung in der Entwicklung spielt, hat sie ebenfalls eine Bedeutung in der Tumorgenese (zum Nachlesen, siehe Jones, P. A., und Laird, P. W. (1999) Nat. Genet. 21: 163–167). Baylin et al. beschreibt, dass abnormale Methylierungmuster in Krebszellen beobachtet werden. Diese Muster könnten zur Tumorgenese durch unpassendes Silencing der Tumor Suppressorgene oder Wachstumsreguliergungsgene beitragen (Baylin, S. B., et al., (1998) Adv. Cancer Res. 72: 141–196). Sayf et al., US. Patent No. 5,919,772 beschreibt, dass Tumorentwicklung durch Reduzierung der Expression von DNMT-1 rückgängig gemacht werden kann. Erhöhte Spiegel von DNMT3a und DNMT3b mRNA werden ebenfalls in menschlichen Tumoren gefunden, was die Frage aufwirft, ob sie eine Rolle in der Tumorgenese haben (Li, E., et al., (1992) Cell 69: 915–926; Robertson, K. D., et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 2291–2298, und Robertson, K. D., et al., (2000) Nucleic acid Res. 28: 2108–2113).
Deshalb besteht ein Bedarf Mittel zur Inhibierung spezifischer DNA MeTase Isoformen zu entwickeln. Es besteht ebenfalls ein Bedarf für die Entwicklung von Verfahren zur Verwendung dieser Mittel, um spezifische DNA MeTase Isoformen, die in der Tumorgenese involviert sind, zu identifizieren und zu inhibieren.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Inhibierung spezifischer DNA Methyltransferase (DNA MeTase) Isoformen durch Inhibierung der Expression auf dem Nukleinsäure Level oder durch Inhibierung der enzymatischen Aktivität auf den Protein Level bereit. Die Erfindung ermöglicht die Identifizierung und spezifische Inhibierung von spezifischen DNA MeTase Isoformen, die in der Tumorgenese involviert sind. Daher stellt die Erfindung eine Behandlung von Krebs bereit. Die Erfindung ermöglicht ferner die Identifizierung und spezifische Inhibierung von spezifischen DNA MeTase Isoformen involviert in Zellproliferation- und/oder Differenzierung und stellt somit ein Verfahren zur Behandlung von Zellproliferation- und/oder Differenzierungsstörungen bereit.
Die Erfinder haben neue Mittel entdeckt, die spezifische DNA MeTase Isoformen inhibieren. Entsprechend stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt Mittel bereit, die ein oder mehrere spezifische DNA MeTase Isoformen, aber nicht alle DNA MeTase Isoformen, inhibieren. Solche spezifischen DNA MeTase Isoformen schließen DNMT-1, DNMT3a, und DNMT3b ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Nicht einschränkende Beispiele dieser neuen Mittel schließen Antisense Oligonukleotide (Oligos) und Small Molecule Inhibitoren, spezifisch für ein oder mehrere, aber nicht alle, DNA MeTase Isoformen ein.
Die Erfinder haben überraschenderweise entdeckt, dass spezifische Inhibierung von DNMT3a und DNMT3b den tumorogenen Zustand einer transformierten Zelle umkehrt. Die Erfinder haben ebenfalls überraschenderweise entdeckt, dass die Inhibierung der DNMT3a und DNMT3b Isoformen dramatisch den Wachstumsstop und Apoptosis in Krebszellen induziert. Daher ist in verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung die inhibierte DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b. In verschiedenen bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel, dass die spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert ein Oligonukleotid, dass die Expression eines Nukleinsäuren-Moleküls, kodierend eine DNA MeTase Isoform, inhibiert. In einigen Ausführungsformen inhibiert das Oligonukleotid die Transkription der mRNA, die DNA MeTase Isoform kodieret. In anderen Ausführungsformen inhibiert das Oligonukleotid die Translation der DNA MeTase Isoform. In verschiedenen Ausführungsformen verursachen die Oligonukleotide einen Abbau der Nukleinsäure-Moleküle. Besonders bevorzugte Ausführungsformen schließen Antisense Oligonukleotide für DNMT-1, DNMT3a, oder DNMT3b ein. In einer Ausführungsform, dieses ersten Aspekts ist das Mittel, dass eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert ein Small Molecule Inhibitor, der die Aktivität einer oder mehrerer spezifischer DNA MeTase Isoformen, aber nicht aller DNA MeTase Isoformen, inhibiert.
In einem zweiten Aspekt, stellt die Erfindung ein Verfahren zu Inhibierung einer oder mehrerer, aber nicht aller, DNA MeTase Isoformen in einer Zelle bereit, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit einem Mittel des ersten Aspektes der Erfindung. In anderen, bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Oligonukleotid. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, ist das Mittel ein Small Molecule Inhibitor. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspektes der Erfindung ist die Zellproliferation in der kontaktierten Zelle inhibiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle, die in einem Tier, einschließlich eines Menschen, sein kann und die ein neoplastisches Wachstum zeigt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verfahren des zweiten Aspektes der Erfindung ferner das Kontaktieren der Zelle mit einem Small Molecule Inhibitor einer DNA MeTase, der mit einer oder mehreren spezifischen DNA MeTase Isoformen interagiert und die die enzymatische Aktivität reduziert. In anderen bevorzugten Ausführungsformen des zweiten Aspektes der Erfindung, umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung welches eine Kombination von einem oder mehreren Antisense Oligonukleotiden und/oder einem oder mehreren Small Molecule Inhibitors des ersten Aspektes der Erfindung ist.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a, oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3a. In einigen Ausführungsformen ist der Small Molecule Inhibitor der DNA MeTase funktional assoziiert mit dem Antisense Oligonukleotid.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der neoplastischen Zellproliferation in einem Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effizienten Menge eines Mittels des ersten Aspektes der Erfindung an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle im Körper. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid, dass mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert ist und für eine therapeutisch effiziente Zeit verabreicht wird. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Small Molecule Inhibitor der mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert ist und für eine therapeutische effiziente Zeit verabreicht wird. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Zellproliferation in der kontaktieren Zellen inhibiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle, die in einen Tier, einschließlich eines Menschen ist und die ein neoplastisches Wachstum zeigt. In anderen bestimmten Ausführungsformen ist das Mittel ein Small Molecule Inhibitor des ersten Aspektes der Erfindung, dass mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert ist und für eine therapeutisch effiziente Zeit verabreicht wird. In anderen bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des ersten Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination aus einem oder mehreren Antisense Oligonukleotiden und/oder einem oder mehreren Small Molecule Inhibitoren des ersten Aspektes der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1 , DNMT3a, oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen DNA MeTase Isoform bereit, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel des ersten Aspekts der Erfindung. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid, dass die Expression der DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei das Antisense Oligonukleotid spezifisch ist für eine bestimmte DNA MeTase Isoform und daher wird durch Inhibierung der Zellproliferation in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform identifiziert, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist. In bestimmten anderen Ausführungsformen ist das Mittel eine Small Molecule Inhibitor, der die Aktivität der DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei der Small Molecule Inhibitor spezifisch ist für eine bestimmte DNA MeTase Isoform und das Inhibieren der Zellproliferation in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform, die für die Zellproliferation erforderlich ist, identifiziert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle und die Induktion der Zellproliferation ist Tumorgenese. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des vierten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination von einen oder mehreren Antisense Oligonukleotiden und/oder einen oder mehreren Small Molecule Inhibitoren des erstes Aspektes der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, ist die DNA MeTase DNMT-1, DNMT3a, oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA MeTase Isoform bereit, die an der Induktion der Zelldifferenzierung beteiligt ist, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel, dass die Expression einer DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei die Induktion der Differenzierung in der kontaktierten Zelle, die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform identifiziert, die bei der Induktion der Zell Differenzierung beteiligt ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Small Molecule Inhibitor des ersten Aspekts der Erfindung. In anderen bestimmten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In andern bevorzugten Ausführungsformen des fünften Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination eines oder mehrerer Antisense Oligonukleotide und eines oder mehrerer Small Molecule Inhibitoren des ersten Aspektes der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahrung zur Inhibierung des neoplastischen Zellwachstums in einen Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effizienten Menge eines Mittels des ersten Aspektes der Erfindung an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid, dass mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert wird und für eine therapeutische effektive Zeit verabreicht wird.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA MeTase Isoform bereit, die an der Induktion der Zelldifferenzierung beteiligt ist, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Antisense Oligonukleotid, dass die Expression einer DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei die Induktion der Differenzierung in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform identifiziert, die bei der Induktion der Zell Differenzierung beteiligt ist. Vorzugsweise ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem achten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle bereit, umfassend dass Kontaktierten einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid des ersten Aspektes der Erfindung das die Expression der spezifischen DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor des erstes Aspektes der Erfindung, der eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Antisense Oligonukleotid, das eine DNA Methyltransferase inhibiert und einem Small Molecule, das eine DNA Methyltransferase inhibiert. In einer Ausführungsform, ist die Inhibierung des Zellwachstums der kontaktierten Zelle größer als die Inhibierung des Zellwachstums einer Zelle, die nur mit einem Mittel kontaktiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes Mittel ausgewählt aus der Gruppe im Wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In stärker bevorzugten Ausführungsformen sind die Mittel ausgewählt aus die Gruppe funktionell assoziiert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem neunten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulierung der Zellproliferation oder Differenzierung bereit, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, wobei eine oder mehrere, aber nicht alle, DNA MeTase Isoformen inhibiert werden, was zu einer Modulierung der Proliferation oder Differenzierung führt. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel eine Small Molecule Inhibitor des ersten Aspektes der Endung. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zellproliferation Neoplasia. In anderen bevorzugten Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination von einem oder mehreren Antisense Oligonukleotiden und/oder einem oder mehreren Small Molecule Inhibitoren des erstes Aspektes der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und oder DNMT3b.
In einem zehnten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle bereit, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung, dass die Expression einer spezifischen DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor, der eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Antisense Oligonukleotid, das eine Histon-Deactylase inhibiert, und einem Small Molecule, das eine Histon-Deactylase inhibiert. In einer Ausführungsform, ist die Inhibierung des Zellwachstums der kontaktierten Zelle größer als die Inhibierung des Zellwachstums einer kontaktierten Zelle mit nur einem der Mittel. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes der Mittel ausgewählt aus der Gruppe, im Wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen, ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, funktionell assoziiert.
In einem elften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle bereit, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung, dass die Expression einer spezifischen DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor, der eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Antisense Oligonukleotid, das eine Histon-Deacylase inhibiert und einem Small Molecule Inhibitor, der eine Histon-Deacylase inhibiert. In einer Ausführungsform ist die Inhibierung des Zellwachstums der kontaktierten Zelle größer als die Inhibierung des Zellwachstums eine Zelle kontaktiert mit nur einem der Mittel. In bestimmen Ausführungsformen ist jedes Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, im Wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In besonderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, funktionell assoziiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A ist ein schematisches Diagramm, das die Strukturen und die Genbank Hinterlegungsnummer der DNA Methyltransferase Gene, DNMT-1, DNMT3a, und DNMT3b zeigt.
1B ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT-1 cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer NM_001379 zeigt.
1C ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT3a cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer AF_067972 zeigt.
1D ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT3b cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer NM_006892 zeigt.
1E ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT3b3 cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer AF156487 zeigt.
1F ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT3b4 cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer AF_129268 zeigt.
1G ist ein schematisches Diagramm, das die Nukleotidsequenz der DNMT3b cDNA gemäß Genbank Hinterlegungsnummer AF_129269 zeigt.
2 ist ein schematisches Diagramm, das die Struktur der DNMT3a cDNA und die Position der in anfänglichen Screens getesteten Antisense Oligonukleotide zeigt. Die Zahlen in Klammern zeigen die Anfangsposition der Antisense Oligonukleotide auf der DNMT3a Sequenz. Die Sequenz und Position der aktivsten Antisense Inhibitoren, identifiziert im Screen, ist ebenfalls gezeigt.
3 ist ein schematisches Diagramm, das die Struktur der DNMT3b cDNA und die Position der in anfänglichen Screens getesteten Antisense Oligonukleotide zeigt. Die Zahlen in Klammern zeigen die Anfangsposition der Antisense Oligonukleotide auf der DNMT3b Sequenz. Die Sequenz und Position der aktivsten Antisense Inhibitoren, identifiziert im Screen, ist ebenfalls gezeigt.
4 ist eine Darstellung eines Northern Blots, der die Dosis abhängigen Effekte des DNMT3a Antisense Oligonukleotids (SEQ ID NO:33) auf die Expression der DNMT3a mRNA in menschlichen A549 „non small cell" Lungenkrebs Zellen zeigt. Ebenfalls gezeigt ist die Spezifität von SEQ ID NO:33 für DNMT3a. Als nicht Targets sind die mRNAs DNMT-1, DNMT3b, und Glyceraldehyd 3'-Phosphat-Dehydrogenase nicht betroffen.
5 ist eine Darstellung eines Northern Blots, der die Dosis abhängigen Effekte des DNMT3b Antisense Oligonukleotids (SEQ ID NO:18) auf die Expression der DNMT3b mRNA in menschlichen A549 „non small cell" Lungenkrebs Zellen zeigt. Ebenfalls gezeigt ist die Spezifität von SEQ ID NO:18 für DNMT3b. Als nicht Targets sind die mRNAs DNMT-1, DNMT3a, und Glyceraldehyd 3'-Phosphat-Dehydrogenase nicht betroffen.
6 ist eine Darstellung eines Western Blots, der die Dosis abhängigen Effekte der DNMT3b Antisense Inhibitoren SEQ ID NO:18 auf den DNMT3b Protein Spiegel in menschlichen T24 Blasenkrebszellen und menschlichen A549 „non small cell" Lungenkrebszellen zeigt. Die Zellen werden 48 Stunden mit ansteigenden Dosen von SEQ ID NO:18 behandelt. Danach werden die Zellen geerntet und die DNMT3b Spiegel werden durch Western Blot mit einem DNMT3b spezifischen Antikörper bestimmt.
7 ist eine graphische Darstellung, die den apoptopischen Effekt der DNMT3a und DNMT3b Inhibierung bei menschlichen „non small cell" Lungenkrebs Zellen zeigt.
8 ist eine graphische Darstellung, die den Dosis abhängigen apoptopischen Effekt der DNT3b Inhibierung bei menschlichen „non small cell" Lungenkrebs Zellen durch DNMT3b Antisense Inhibitoren zeigt.
9 ist eine graphische Darstellung, die den Dosis abhängigen apoptopischen Effekt der DNT3b Inhibierung bei menschlichen T24 „non small cell" Lungenkrebs Zellen durch DNMT3b Antisense Inhibitoren zeigt.
10 ist eine graphische Darstellung, die den Krebs spezifischen apoptotischen Effekt der DNMT3b Inhibierung zeigt. DNMT3b Inhibitor SEQ ID NO:18 induziert Apoptosis in A549 Zellen. Eine ähnliche Behandlung der beiden normalen Zelllinien HMEC und MRHF zeigt keine Apoptosis.
11A ist eine graphische Darstellung, die den Dosis abhängige Effekt der DNMT3b AS1 Antisense Oligonukleotide auf die Proliferation bei menschlichen A459 Krebszellen zeigt.
11B ist eine graphische Darstellung, welche die Krebsspezifität des antiproliferativen Effektes der DNMT3a und DNMT3b Inhibierung zeigt. Die Inhibierung von DNMT3a und DNMT3b verursacht antiproliferative Effekte auf Krebszellen, aber beeinflusst nicht die Proliferation der normalen menschlichen Hautfibroblasten Zelllinien MRHF.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Inhibierung spezifischer DNA MeTase Isoformen durch Inhibierung der Expression auf dem Nukleinsäuren Level oder Protein Aktivität auf dem enzymatischen Level bereit. Die Erfindung erlaubt die Identifizierung und spezifische Inhibierung von spezifischen DNA MeTase Isoformen, involviert in Tumorgenese, und stellt daher eine Behandlung für Krebs bereit. Die Erfindung erlaubt ferner die Identifizierung und spezifische Inhibierung von spezifischen DNA MeTase Isoformen, involviert in Zell-proliferation und/oder Differenzierung, und stellt daher eine Behandlung für Zell-proliferations und/oder Differenzierungsstörungen bereit.
Die Patente und wissenschaftliche Literatur auf die Bezug genommen wird, zeigt das Wissen auf, das für den Fachmann zur Verfügung steht. Die erteilten Patente, Anmeldungen und Referenzen, einschließlich der Genbank Database Sequenzen, die zitiert werden, sind in demselben Umfang eingeschlossen als wenn auf sie spezifisch und individuell Bezug genommen würde.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung Mittel bereit, die ein oder mehrere DNA MeTase Isoformen, aber nicht alle, spezifischen DNA MeTase Isoformen inhibieren. Wie hier austauschbar verwendet beziehen sich die Begriffe „DNA MeTase", „DNMT", „DNA MeTase Isoform", „DNMT Isoform", und ähnliche Begriffe auf jede Familie von Enzymen, die eine Methylgruppe an die C5-Position von Cytosin in DNA. Bevorzugte DNA MeTase Isoformen schließen Erhaltungs und de novo Methyltransferasen ein. Spezifische DNA MeTasen schließen ein DNMT-1, DNMT3a, und DNMT3b ohne auf diese beschränkt zu sein. Als nicht limitierendes Beispiel schließen nützliche Mittel, die ein oder mehrere DNA MeTase Isoformen, aber nicht alle spezifischen DNA MeTase Isoformen inhibieren, Antisense Oligonukleotide und Small Molecule Inhibitoren ein.
Die Erfinder haben überraschenderweise entdeckt, dass spezifische Inhibierung der DNMT-1 den tumorogenen Zustand einer transformierten Zelle umkehrt. Die Erfinder haben ebenfalls überraschenderweise entdeckt, dass die Inhibierung der DNMT3a und/oder DNMT3b Isoformen dramatisch den Wachstumsstop und die Apoptosis in Krebszellen induziert. Daher ist in verschiedenen Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung die inhibierte DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
Bevorzugte Mittel, die DNMT3a und/oder DNMT3b inhibieren dramatisch das Wachstum von menschlichen Krebszellen, unabhängig vom p53 Status. Diese Mittel induzieren signifikant Apoptosis in den Krebszellen und verursachen einen dramatischen Wachstumsstop. Inhibitorische Mittel, die ein oder mehrere dieser Ergebnisse erzielen, fallen in der Schutzbereich der Erfindung. Antisense Oligonukleotide und/oder Small Molecule Inhibitoren von DNMT3a und/oder DNMT3b sind nicht einschränkende Beispiele für die Erfindung.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel, dass die spezifische DNMT Isoform inhibiert, ein Oligonukleotid, dass die Expression einer Nukleinsäuren, kodierend eine spezifisches DNA MeTase Isoform, inhibiert. Das Nukleinsäuren-Molekülen kann eine genomische DNA (zum Beispiel, ein Gen), cDNA, oder RNA sein. In einer anderen Ausführungsform inhibiert das Oligonukleotid ultimativ die Translation der DNA MeTase. In bestimmten Ausführungsformen, verursacht das Oligonukleotid den Abbau der Nukleinsäuren-Moleküle. Bevorzugte Antisense Oligonukleotide haben wirksame und spezifische Antisense Aktivität in nanomolaren Konzentrationen. Die Antisense Oligonukleotide gemäß der Erfindung sind komplementär zu einer Region der RNA oder doppelsträngiger DNA, die einen Teil einer oder mehrerer DNA MeTase Isoformen kodiert (hierbei wird berücksichtigt, dass die Homologie zwischen verschiedenen Isoformen einem einzigen Antisense Oligonukleotid ermöglichen kann, komplementär zu einem Teil mehrerer Isoformen zu sein).
Für die Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff „Komplementär" die Fähigkeit zu einer genomischen Region, einem Gen, oder einem RNA Transkript hiervon unter physiologischen Bedingungen zu hybridisieren. Diese Hybridisierung ist das Ergebnisse von Basen spezifischen Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Strängen, vorzugsweise auf Grund von Watson Crick oder Hoogsteen Basenpaarungen, obgleich andere Arten der Wasserstoffbrücken genauso wie Basenstappelung ebenfalls zu Hybridisierung führen können. Praktisch gesehen, kann Hybridisierung beobachtet werden durch die spezifische Inhibierung der Gen Expression, auf der Stufe der Transkription oder Translation (oder auf beiden).
Für die Zwecke der Erfindung schließt der Begriff „Oligonukleotid" ein, Polymere von zwei oder mehr Deoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, oder 2'-O-substituierten Ribonukleotide-Resten, oder jede Kombination hiervon. Vorzugsweise haben diese Oligonukleotide von etwa 8 bis etwa 50 Nukleosid-Reste und besonderes bevorzugt von etwa 12 bis etwa 30 Nukleosid-Reste. Die Nukleosid-Reste können durch jede der bekannten Internukleosid-Bindungen miteinander verbunden sein. Diese Internukleosid-Bindungen schließen ohne Einschränkung die folgenden ein, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carbolxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, Phosphoramidat-Brücken, Methylen-Phosphonat-Brücken, Phosphorothioat-Brücken, und Sulfon-Internukleosid-bindungen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese Internukleosid-Bindungen Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorothioat, oder Phosphoramidat Bindungen, oder Kombination hiervon sein. Der Begriff Oligonukleotid schließt ebenfalls Polymere mit chemischen modifizierten Basen oder Zucker-Resten und/oder mit zusätzlichen Substituenten, einschließlich lipophilen Gruppen, interkalierender Agenzien, Diamine, und Adamantane ein, ohne auf diese beschränkt zu sein. Der Begriff Oligonukleotid schließt ebenfalls Polymere wie PNA und LNA ein. Für die Zwecke der Erfindung bedeutet der Begriff " 2'-0-substituiert", Substitution an der 2'-Position des Pentose-Restes mit einer O-Niederalkylgruppe mit 1–6 gesättigten oder ungesättigen Kohlenstoffatomen, oder mit einer O-Aryl oder Alkyl Gruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkyl-, Aryl-, oder Allyl- Gruppe unsubstituiert oder substituiert sein kann, zum Beispiel mit einer Halogen-, Hydroxy-, Trifluromethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl-, oder Amino-Gruppe, oder die 2'-Substitution kann eine Hydroxy-Gruppe haben (um ein Ribonukleosid herzustellen), eine Amino- oder eine Halogen- Gruppe, aber nicht mit einer 2'-H-Gruppe.
Besonders bevorzugte Antisense Oligonukleotide die gemäß diesem Aspekt der Erfindung benutzt werden, schließen Chimärische Oligonukleotide und Hybridoligonukleotide ein.
Für die Zwecke der Erfindung bezieht sich ein „chimärisches Oligonukleotid" auf ein Oligonukleotid mit mehr als einem Typ von Internukleosid-Bindung. Eine bevorzugte Ausführungsformen eines Chimären Oligonukleotids ist ein chimäres Oligonukleotide, umfassend eine Phosphorothioat-, Phosphodiester- oder Phosphorodithioat-Region, vorzugsweise umfassend von etwa 2 bis etwa 12 Nukleotide, und eine Alkylphosphonat- oder Alkylphosphonothioat- Region (siehe z.B. Pederson et al. U. S. Patents 5,635,377 und 5,366,878).
Vorzugsweise enthalten die Chimären Oligonukleotide mindestens drei aufeinander folgende Internukleosid-Bindungen ausgewählt von Phosphodiester- und Phosphorothioat-Bindungen oder Kombination hiervon.
Für die Zwecke der Erfindung bezieht sich ein „Hybrid Oligonukleotid" auf eine Oligonukleotid mit mehr als einem Nukleosidtyp. Eine bevorzugte Ausführungsform eines Hybrid Oligonukleotids umfasst eine Ribonukleotid Region, vorzugsweise umfassend etwa 2 bis etwa 12 2'-0-substituierte Nukleotide und eine Deoxyribonukleotid-Region. Vorzugsweise enthält ein Hybrid Oligonukleotid mindestens 3 aufeinander folgende Deoxyribonukleoside und enthält ebenfalls Ribonukleosid, 2'-O-substituierte Ribonukleoside, oder Kombination hiervon (siehe, z.B. Metelev und Agrawal, U. S. Patents 5,652,355 und 5,652,356).
Die exakte Nukleotidsequenz und chemische Struktur eines Antisense Oligonukleotids zur Anwendung in der Erfindung kann variiert werden, so lange wie das Oligonukleotid die Fähigkeit behält die Expression einer spezifischen DNA MeTase Isoform zu inhibieren, eine oder mehrere DNA MeTase Isoformen, aber nicht alle, spezifischen DNA MeTase Isoformen zu inhibieren. Dies kann einfach festgestellt werden durch den Test, ob ein bestimmtes Antisense Oligonukleotid aktiv ist z.B. durch Quantifizierung der Menge von mRNA, kodiert durch eine spezifisches DNA MeTase Isoform, Quantifizierung der Menge von Protein einer DNA MeTase Isoform, Quantifizierung der enzymatischen Aktivität der DNA MeTase Isoform oder Quantifizierung der Fähigkeit der DNA MeTase Isoform Zellwachstum in einem in vitro oder in vivo Zellwachstumsassay zu inhibieren. Details sind in dieser Patentanmeldung beschrieben. Der Begriff „Expressions Inhibierung" und ähnliche hier verwendete Begriffe umfassen eine oder mehrere dieser Parameter.
Antisense Oligonukleotide zur Verwendung in dieser Erfindung können auf einen geeigneten festen Träger synthesiziert werden unter Verwendung bekannter chemische Verfahren, einschließlich H-Phosphonat Chemie, Phosphoramidit Chemie, oder einer Kombination von H-Phosphonat Chemie und Phosphoramidit Chemie (d.h. H-Phosphonate Chemie für einige Zyklen und Phosphoramidit Chemie für andere Zyklen). Geeignete feste Träger schließen alle Standard festen Träger ein, die für Festphasen-oligo-synthese wie Controlled Pure Glass (CPG) (siehe, z.B. Pon, R. T., Methods in Molec. Biol. 495–496, 1993) verwendet werden.
Antisense Oligonukleotide gemäß der Erfindung sind nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Zum Beispiel, können sie als „Proben" der physiologischen Funktion der spezifischen DNA MeTase Isoformen verwendet werden durch Verwendung der Inhibierung der Aktivität der spezifischen DNA MeTase Isoform in einen experimentellen Zell-Kultur – oder Tier-System und Evaluierung der Effekte der Inhibierung dieser spezifischen DNA MeTase Isoform Aktivität. Dies wird erreicht durch Verabreichung eines Antisense Oligonukleotid, dass die Expression einer oder mehrerer DNA MeTase Isoformen gemäß der Erfindung inhibiert an eine Zelle oder ein Tier und beobachten der phenotypischen Effekte. Bei diese Verwendung wird ein Antisense Oligonukleotid gemäß der Erfindung einem traditionellen „Gene Knockout" Ansatz vorgezogen, da die Verwendung einfacher ist, um die Aktivität einer spezifischen DNA MeTase Isoform an ausgewählten Stadien der Entwicklung oder Differenzierung zu inhibieren.
Bevorzugte Antisense Oligonukleotide der Erfindung inhibieren entweder die Transkription eines Nukleinsäure-Moleküle, kodierend die DNA MeTase Isoform und/oder die Translation eines Nukleinsäure-Moleküle, kodierend die DNA MeTase Isoform und/oder führen zum Abbau von dieser Nukleinsäure. DNA MeTase kodierende Nukleinsäure-Moleküle können RNA oder doppelsträngige DNA Regionen sein und schließen ohne auf diese beschränkt zu sein intronische Sequenzen, nicht translatierte 5' und 3' Regionen, Intron-Exon Grenzen genauso wie kodierende Sequenzen eines Gens für ein Familien Mitglied einer DNA MeTase ein (Siehe, z.B., Yoder, J. A., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 31092–31097; Xie, S., et al. (1999) Gene 236: 87–95; und Robertson, K. D., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27: 2291–2298).
Besonders bevorzugte nicht beschränkende Beispiele von Antisense Oligonukleotiden der Erfindung sind komplementär zu Bereichen der RNA oder doppelsträngiger DNA, kodierend eine DNA MeTase Isoform (z.B., DNMT-1, DNMT3a, DNMT3b (auch genannt DNMT3b1), DNMT3b2, DNMT3b3, DNMT3b3, DNMT3b4, DNMT, 3b5) (siehe, z.B., GenBank Accession No. NM001379 für humane DNMT-1 (1B); GenBank Accession No. AF-067972 für humane NMT3, (1C); GenBank Accession Nos. NM006892, AF_156 188, AF_176228, und XM-009449 für humane DNMT3b (1D); Nukleotide Positionen 115–1181 und 1240–2676 of GenBank No. NM006892 für humane DNMT3b2, GenBank Accession No. AF 156487 für human DNMT3b3 (1E), GenBank Accession No. AF 129268 für humane DNMT3b4 (1F), und GenBank Accession No. AF 129269 für humane DNMT3b5 (1G).
Wie hier verwendet, schließt die Referenz zu einer spezifischen DNA MeTase Isoform die Referenz zu allen RNA Splice Varianten dieser bestimmten Isoform ein. Als nicht einschränken des Beispiel bedeutet die Referenz zu DNMT3b, dass auch dies Splice Varianten DNMTb2, DNMTb3, DNMTb4, und DNMTb5 eingeschlossen sind.
Die Sequenzen kodierend DNA MeTasen von nicht menschlichen Tier Spezies sind ebenfalls bekannt, siehe, z.B., GenBank Accession Nummer AF_175432 (murine DNMT-1) ; NM_010068 (murine DNMT3a) ; und NM_007872 (murine DNMT3b).
Entsprechend können die Antisense Oligonukleotide der Erfindung ebenfalls komplementär sein zu Bereichen von RNA oder doppelsträngiger DNA, die DNA MeTase von nicht menschlichen Tieren kodieren. Antisense Oligonukleotide gemäß dieser Ausführungsform sind nützlich als Werkzeuge in Tier-Modellen zum Studium der Rolle von spezifischen DNA MeTase Isoformen.
Besonders bevorzugte Oligonukleotide haben Nukleotidsequenzen von etwa 13 bis 35 Nukleotiden, die etwa 13 bis alle Nukleotidsequenzen von Tabelle 1 und 2 einschließen. Besondere bevorzugte Oligonukleotide haben Nukleotidsequenzen von etwa 15 bis etwa 26 Nukleotiden. Insbesondere bevorzugt sind nachstehend gezeigte Oligonukleotide mit Phosphorothioate Rückrat und 20–26 Nukleotiden länge und Modifizierungen, so dass die 4 Nukleotide am 5' Ende des Oligonukleotids und die 4 Nukleotide am 3' Ende des Oligonukleotids je 2'-O-Methyl Gruppen an dem Zucker-Resten aufweisen.
Antisense Oligonukleotide verwendet in der vorliegenden Studie sind in Tabellen 1 und 2 gezeigt. TABELLE 1 Sequenzen humaner DNA MeTase DNMT-1 Antisense (AS) Oligonukleotide und ihre Mismatch (MM) Oligonukleotide
Tabelle 2 Sequenzen humaner DNA MeTase DNMT3a und DNMT3b Antisense (AS) Oligonukleotide und ihre Mismatch (MM) Oligonukleotide
PTE bezieht sich auf ein Phosphorothioat-Rückrat anstelle eines Phosphodiester- Rückrats.
PTE-OME bezieht sich auf ein Phosphorothioat- Rückrat mit 2'-Methyl Modifizierung in den ersten vier und letzten vier Basen dieser Oligonukleotide. Wo Thymin vorkommt in der Oligonukleotidsequenz, ist es ersetzt durch Uracil.
Die Antisense Oligonukleotide gemäß der Erfindung können mit jedem bekannten pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel formuliert werden (siehe die Herstellung von pharmazeutisch verträglichen Formulierungen in beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Aus., ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) mit der Maßgabe, dass solche Träger oder Verdünnungsmittel die Fähigkeit der Modulierung der DNA MeTase Aktivität nicht beeinflussen.
Als nicht einschränkendes Beispiel können die Mittel des ersten Aspektes der Erfindung auch Small Molecule Inhibitoren sein. Der Begriff „Small Molecule" wie er bezogen auf die Inhibierung der DNA MeTase verwendet wird, meint eine Verbindung mit einem Molekulargewicht, von vorzugsweise weniger als 100 Da, und stärker bevorzugt von weniger als 600 Da, die zur Interaktion mit einer DNA MeTase in der Lage ist und die Expression eines Nukleinsäuremoleküls, kodierend eine DNMT Isoform, oder die Aktivität eines DNMT Proteins zu inhibieren. Die Inhibierung einer enzymatischen Aktivität der DNA MeTase bedeutet, die Reduzierung der Fähigkeit einer DNA MeTase eine Methylgruppe an die C5-Position von Cytosin anzufügen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist die Reduzierung der DNA MeTase Aktivität mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 75 % und mehr bevorzugt mindestens 90%. In anderen bevorzugten Ausführungsform die DNA MeTase Aktivität um mindestens 95% und mehr bevorzugt um mindestens 99% reduziert. In einer bestimmten Ausführungsform ist der Small Molecule Inhibitor ein Inhibitor von einer oder mehreren, aber nicht allen DNMT Isoformen. Mit „allen DNMT Isoformen" sind alle Proteine gemeint, die spezifisch eine Methylgruppe zu der C5-Position von Cytosin hinzufügen; eingeschlossen sind DNMT-1, DNMT3a, oder DNMT3b, die alle als „verwandte Proteine" angesehen werden. Besonders bevorzugt ist, dass ein DNA MeTase Small Molecule Inhibitor mit einer oder mehreren DNA MeTase Isoformen interagiert und deren Aktivität reduziert (z.B. DNMT3a und/oder DNMT3b), aber nicht mit allen interagiert und die Aktivität von allen DNA MeTase Isoformen reduziert (z.B. DNMT-1, DNMT3a und DNMT3b). Wie nachstehend dargestellt ist ein bevorzugter DNA MeTase Small Molecule Inhibitor einer, der mit einer DNA MeTase Isoform, die in Tumorgenese involviert ist, interagiert und deren Aktivität reduziert.
Die hier beschriebene Erfindung umfasst die Verwendung von verschiedenen Bibliotheken zur Identifizierung von Small Molecule von einer oder mehreren, aber nicht allen MeTasen. Bibliotheken nützlich für die Zwecke der Erfindung sind (1) Chemische Bibliotheken, (2) Naturprodukt- Bibliotheken, (3) Kombinatorische Bibliotheken, umfassend Peptide, Oligonukleotide und/oder organische Moleküle nach dem Zufallsprinzip.
Chemische Bibliotheken bestehen aus Strukturanaloga von bekannten Verbindungen oder Verbindungen, die als „Hits" oder „Leads" durch Naturprodukt-Screening identifiziert wurden. Naturprodukt-Bibliotheken sind abgeleitet von Sammlungen von Mikroorganismen, Tieren, Pflanzen oder Meeresorganismen, die verwendet werden, um Gemische für die folgenden Screeningverfahren zu erzeugen: (1) Fermentation und Extraktion von Brühe von Erde, Pflanzen oder Meeresorganismen oder (2) Extraktion von Pflanzen oder Meeresorganismen. Naturprodukt-Bibliotheken schließen Polyketide, nicht-ribosomale Peptide und nicht-natürlich vorkommend Varianten hiervon ein. Siehe Übersichtsartikel Cane, D. E., et al., (1998) Science 282: 63–68. Kombinatorische Bibliotheken sind zusammengesetzt aus einer großen Anzahl von Peptiden, Oligonukleotiden oder organischen Verbindungen als ein Gemisch. Sie sind relativ leicht durch traditionelle automatische Syntheseverfahren, PCR, Klonierungsverfahren oder Syntheseverfahren bestimmter Hersteller herzustellen. Von besonderem Interesse sind Peptide und Oligonukleotide aus kombinatorischen Bibliotheken.
Genauer ist eine kombinatorische Bibliothek eine Sammlung von verschieden chemischen Verbindungen hergestellt durch chemische Synthese oder biologische Synthese, durch Kombinieren einer Anzahl von chemischen „Bausteinen", wie Reagenzien. Zum Beispiel wird eine lineare kombinatorische Bibliothek wie ein Polypeptid Bibliothek gebildet durch das Kombinieren eines Satzes von chemischen Bausteinen (Aminosäuren) in jeder möglichen Weise für eine gegebene Verbindungslänge (d.h. die Anzahl der Aminosäuren in einem Polypeptid). Millionen von chemischen Verbindungen können durch kombinatorisches Mixen von chemischen Bausteinen synthetisiert werden.
Für Übersichtsartikel betreffend kombinatorische Chemie und dadurch erzeugte Bibliotheken siehe Huc, I. und Nguyen, R. (2001) Comb. Chem. High Throughput Screen 4: 53–74; Lepre, C. A. (2001) Drug Discov. Today 6: 133–140; Peng, S. X. (2000) Biomed. Chromatogr. 14: 430 441; Bohm, H. J. und Stahl, M. (2000) Curr.
Opin. Chem. Biol. 4: 283–286; Barnes, C. und Balasubramanian, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 346–350; Lepre, Enjalbal, C., et al., (2000) Mass Septrom Rev. 19: 139–161, Hall, D. G., (2000) Nat. Biotechnol. 18: 262–262; Lazo, J. S., und Wipf P. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 293: 705–709; Houghten, R. A., (2000) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40: 273–282; Kobayashi, S. (2000) Curr. Opin. Chem. Bid. (2000) 4: 338–345; Kopylov, A. M. und Spiridonova, V. A. (2000) Mol. Biol. (Mosk) 34: 1097–1113; Weber, L. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4: 295–302; Dolle, R. E. (2000) J. Comb. Chem. 2: 383–433; Floyd, C. D., et al., (1999) Prog. Med. Chem. 36: 91–168; Kundu, B., et al., (1999) Prog. Drug Res. 53: 89–156; Cabilly, S. (1999) Mol. Biotechnol. 12: 143–148; Lowe, G. (1999) Nat. Prod. Rep. 16: 641–651; Dolle, R. E. und Nelson, K. H. (1999) J. Comb. Chem. 1: 235–282; Czarnick, A. W und Keene, J. D. (1998) Curr. Biol. 8: R705–R707; Dolle, R. E. (1998) Mol. Divers. 4: 233–256; Myers, P. L., (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701–707; und Pluckthun, A. und Cortese, R. (1997) Biol. Chem. 378: 443.
Geräte zur Herstellung von Kombinatorischen Bibliotheken sind erhältlich (siehe z.B. 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Mass). Darüber hinaus sind eine Vielzahl von Kombinatorische Bibliotheken selbst erhältlich (siehe z.B. ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd., Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, Pa., Martek Biosciences, Columbia, Md., usw.).
Andere Bibliotheken von Interesse schließen Peptid-, Protein-, Peptidomimetische Bibliotheken, multiparallele synthetische Sammlungen und rekombinatorische und Polypeptid Bibliotheken ein. Small Molecule Inhibitoren von einer oder mehreren, aber nicht allen MeTasen werden identifiziert und isoliert aus den hier beschriebenen Bibliotheken durch bekannte Methoden. Solche Screeningverfahren schließen funktionelles Screening und Affiniätsbindungsmethoden ein. Zusätzlich werden auch Highthroughput Assays als Screeningverfahren zur Identifizierung von Small Molecule Inhibitoren von einer oder mehreren, aber nicht allen MeTasen eingesetzt. Beispielsweise beschreibt Meldal M. die Verwendung von kombinatorischen Festphasenassays für Enzymaktivitäts- und Inhibierungsexperimente (Meldal M. (1998) Methods Mol. Biol. 87: 51–57), und Dolle R.E. beschreibt im Allgemeinen die Verwendung von Kombinatorischen Bibliotheken zum Auffinden von Inhibitoren von Enzymen (Dolle, R. E (1997) Mol. Divers. 2: 223–236).
Als nicht einschränkendes Beispiel beschreibt nachstehendes Beispiel s ein erfindungsgemäßes Screening für Small Molecule Inhibitoren.
Die erfindungsgemäßen Mittel sind nützlich als analytische Werkzeuge und als therapeutische Werkzeuge, einschließlich als Werkzeug für die Gentherapie. Die Erfindung stellt ebenfalls Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die manipuliert werden können oder durch Feinabstimmung verändert werden können, um weniger Nebenwirkungen zu verursachen bei der bestimmungsgemäßen Verwendung.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung einem Verfahren zur Inhibierung einer oder mehrerer, aber nicht aller DNA MeTase Isoformen in einer Zelle bereit, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel des ersten Aspektes der Erfindung. Als nicht einschränkendes Beispiel können die Mittel ein Antisense Oligonukleotid oder ein Small Molecule Inhibitor sein, die die Expression einer oder mehrerer, aber nicht aller DNA MeTase Isoformen in einer Zelle inhibieren.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Antisense Oligonukleotid, dass eine oder mehrere, aber nicht alle DNA MeTase Isoformen in einer Zelle inhibiert. Vorzugsweise ist die Zellproliferation in der kontaktierten Zelle inhibiert. Daher ist das erfindungsgemäße Antisense Oligonukleotid nützlich für therapeutische Behandlungen von menschlichen Krankheiten, einschließlich gutartiger und bösartiger Neoplasmen durch Inhibierung der Zellproliferation in der kontaktierten Zelle mit dem Antisense Oligonukleotid. Der Begriff „Inhibierung der Zellproliferation" bedeutet die Fähigkeit eines DNA MeTase Antisense Oligonukleotids oder eines Small Molecule DNA MeTase Inhibitors (oder Kombinationen hiervon) das Wachstum der Zellen, kontaktiert mit dem Oligonukleotid oder Small Molecule Inhibitor, zu verzögernd verglichen mit einer nicht kontaktierten Zelle. Diese Untersuchung der Zellproliferation kann gemacht werden durch Zählen der kontaktierten und nicht-kontaktierten Zellen unter Verwendung eines Coulter Cell Counters (Coulter, Miami, FL) oder eines Hemacytometers. Wenn die Zellen sich in einem gebundenen Zustand befinden (z.B. in einem Tumor oder einem Organ) kann die Untersuchung der Zellproliferation durch das Messen des Wachstums mit Zirkel durchgeführt werden und die Größe des Wachstums der kontaktierten Zellen wird mit dem der nicht-kontaktierten verglichen. Vorzugsweise umfasst der Begriff eine Verzögerung des Wachstums der Zellproliferation die mindestens 50% höher ist als in nicht-kontaktierten Zellen. Stärker bevorzugt ist, dass der Begriff eine Verzögerung von 100% verglichen mit nicht kontaktierten Zellen umfasst (d.h. die kontaktierten Zellen nehmen in Anzahl und Größe nicht zu). Besonders bevorzugt umfasst der Begriff eine Reduktion der Anzahl oder der Größe der kontaktierten Zellen verglichen mit nicht-kontaktierten Zellen. Daher kann ein DNA MeTase Antisense Oligonukleotid oder DNA MeTase Small Molecule Inhibitor, der die Zellproliferation in einer kontaktierten Zelle inhibiert, eine Wachstumsverzögerung, einen Wachstumsstillstand, den programmierten Zelltod (d.h. Apoptose) oder den nekrotischen Zelltod in der kontaktierten Zelle induzieren.
Im Gegensatz dazu bedeutet der Ausdruck „Induzieren der Zellproliferation" und ähnliche Begriffe, dass Erfordernis des Vorhandenseins oder die enzymatische Aktivität einer spezifischen DNA MeTase Isoform für die Zellproliferation in einer normalen (d.h. nicht neoplastischen) Zelle. Daher kann oder kann nicht die Überexpression einer spezifischen DNA MeTase Isoform, die die Zellproliferation induziert, zur erhöhten Zellproliferation führen. Jedoch führt die Inhibierung einer spezifischen DNA MeTase Isoform, die die Zellproliferation induziert, zur Inhibierung der Zellproliferation.
Die Zellproliferationsinhibierungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Antisense Oligonukleotide erlaubt die Synchronisation einer Population von synchron wachsenden Zellen. Zum Beispiel kann ein erfindungsgemäßes Antisense Oligonukleotid verwendet werden, um eine Population von nicht neoplastischen Zellen, vermehrt in vitro, in der G1 oder G2 Phase des Zellzyklus zu stoppen. Diese Synchronisation erlaubt zum Beispiel die Identifizierung eines Gens oder Genproduktes, exprimiert während der G1 oder G2 Phase des Zellzyklus. Solch eine Synchronisation von Zellkulturen kann nützlich sein, um die Effizienz eines neuen Transfektionsprotokolls zu testen, wobei die Transfektionseffizienz variiert und abhängt von der Phase des Zellzykluses der zu transfizierenden Zelle. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Antisense Oligonukleotide erlaubt die Synchronisation einer Population von Zellen, und ermöglicht daher den Nachweis von erhöhter Transfektionseffizienz.
Die anti-neoplastischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Antisense Oligonukleotide sind an anderer Stelle beschrieben.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird die Zelle, die mit einem DNA MeTase Antisense Oligonukleotide kontaktiert wird, ebenfalls mit einem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor kontaktiert.
In einigen Ausführungsformen ist der DNA MeTase Small Molecule Inhibitor funktionell mit einem Antisense Oligonukleotide assoziiert. Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Antisense Oligonukleotid mit bekannten pharmazeutisch-verträglichen Trägern oder Verdünnungsmitteln formuliert werden. Diese Formulierungen können zusätzlich ein oder mehrere weitere DNA MeTase Antisense Oligonukleotide und/oder ein oder mehre DNA MeTase Small Molecule Inhibitoren enthalten oder können jedes andere pharmakologisch aktive Mittel enthalten.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsformen ist ein Antisense Oligonukleotid funktionell mit einem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor assoziiert. Der Begriff „funktionell assoziiert" bedeutet jede Assoziation zwischen Antisense Oligonukleotid und Small Molecule Inhibitor, die dem Antisense Oligonukleotide ermöglicht, die Expression einer oder mehrerer spezifischer DNA MeTase Isoform-kodierender Nukleinsäuren zu inhibieren und dem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor ermöglicht, die enzymatische Aktivität spezifischer DNA MeTase Isoformen zu inhibieren. Ein oder mehrere erfindungsgemäße Antisense Oligonukleotide können funktionell mit einem oder mehreren DNA MeTase Small Molecule Inhibitoren assoziiert sein. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist ein erfindungsgemäßes Antisense Oligonukleotid, dass gegen eine spezifische DNA MeTase Isoform gerichtet ist (z.B. DNMT-1, DNMT 3a oder DNMT3b) funktionell mit einem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor assoziiert, der gegen eine DNA MeTase Isoform gerichtet ist. Eine bevorzugte funktionelle Assoziation ist hydrolysierbar. Vorzugsweise ist eine hydrolysierbare Assoziation eine kovalente Bindung zwischen dem Antisense Oligonukleotide und dem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor. Bevorzugte kovalente Bindungen sind durch Esterasen und/oder Amidasen spaltbar. Beispiele derartiger hydrolysierbarer Assoziationen sind bekannt. Phosphatester sind besonders bevorzugt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die kovalente Bindung direkt zwischen Antisense Oligonukleotid und DNA MeTase Small Molecule Inhibitor sein, um den Small Molecule Inhibitor in das Rückrat zu integrieren. Alternativ kann die kovalente Bindung über eine verlängerte Struktur erfolgen und kann gebildet sein durch kovalente Bindung des Antisense Oligonukleotids zu dem DNA MeTase Small Molecule über eine Kopplung von beiden an ein Trägermolekül wie einen Zucker, ein Peptid oder ein Lipid oder ein Glycolipid. Andere bevorzugte funktionelle Assoziationen umfassen lipophile Assoziationen, wie die Bildung eines Liposoms enthaltend ein Antisense Oligonukleotid und ein DNA MeTase Small Molecule Inhibitor, kovalent gebunden zu einem lipophilen Molekül und daher assoziiert mit dem Liposom. Solche lipophilen Moleküle umfassen Phosphatidylcholin, Cholesterol, Phosphatidylethanolamin und synthetische Neoglycolipide wie syalyllacNAc-HDPE. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die funktionelle Assoziation eine nicht physikalische Assoziation sein, sondern einfach aus dem simultanen Vorkommen im Körper bestehen, z.B. wenn das Antisense Oligonukleotid mit einem Liposom assoziiert ist und der Small Molecule Inhibitor ist assoziiert mit einem anderen Liposom.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der neoplastischen Zellproliferation in einem Tier bereit, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch effizienten Menge eines Mittels des ersten Aspekts der Erfindung an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle im Körper. In einer Ausführungsform, ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid und das Verfahren umfasst ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Das Antisense Oligonukleotid und der pharmazeutisch verträgliche Träger werden über eine pharmazeutisch effiziente Zeit verabreicht. Vorzugsweise ist das Tier ein Säuger, besonders bevorzugt ein domestizierter Säuger. Insbesondere bevorzugt ist das der Säuger ein Mensch ist.
Der Begriff „neoplastische Zelle" bedeutet eine Zelle, die abweichendes Wachstum zeigt. Vorzugsweise ist das abweichende Wachstum einer neoplastischen Zelle erhöhtes Zellwachstum. Eine neoplastische Zelle kann eine hyperplastische Zelle sein, eine Zelle, die ein Fehlen der Kontaktinhibierung des Wachstums in vitro zeigt, eine gutartige Tumorzelle, die in vivo keine Metastasen bildet oder eine Krebszelle, die in vivo Metastasen bildet und die nach der versuchten Entfernung wiederkommen kann. Der Begriff „Tumorgenese" bedeutet die Induktion der Zellproliferation, die zu neoplastischem Wachstum führt.
Die Begriffe „therapeutische effiziente Menge" und „therapeutische effiziente Zeit" bedeutet Behandlung mit einer Dosis und für eine Zeit effektiv, um neoplastisches Zellwachstum zu reduzieren. Bevorzugt erfolgt Verabreichung parenteral, oral, sublingual, transdermal, topical, intranasal, oder intrarectal. Für lokale Verabreichung können sehr viel niedrigere Konzentrationen effektiv sein und viel höhere Konzentrationen toleriert werden. Der Fachmann weis, dass dieser therapeutische Effekt, der zu einen niedrigeren effektiven Konzentration des DNA MeTase Inhibitors, führt vom zu behandelndem Gewebe, Organ, oder dem Tier oder Patienten abhängig.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung in einer ausreichend Dosis verabreicht, um den Blutspiegel des Antisense Oligonukleotids von etwa 0,01 μM bis etwa 20 μM zu erhalten. In eine besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die therapeutische Zusammensetzung in einer ausreichend Dosis verabreicht, um den Blutspiegel des Antisense Oligonukleotids von etwa 0,05 μM bis etwa 15 μM zu erhalten. In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsformen wird die therapeutische Zusammensetzung in einer ausreichend Dosis verabreicht, um den Blutspiegel des Antisense Oligonukleotids von etwa 0,1 μM bis etwa 10 μM zu erhalten.
Für lokale Verabreichung können sehr viel niedrigere Konzentrationen therapeutisch effektiv sein. Vorzugsweise beträgt die totale Dosis des Antisense Oligonukleotids von 0,1 mg bis etwa 200 mg Oligonukleotid per kg Körpergewicht pro Tag. Besonders bevorzugt Ausführungsformen beträgt die totale Dosis des Antisense Oligonukleotids von 1 mg bis etwa 20 mg Oligonukleotid per kg Körpergewicht pro Tag. Noch mehr bevorzugt Ausführungsformen beträgt die totale Dosis des Antisense Oligonukleotids von 1 mg bis etwa 10 mg Oligonukleotid per kg Körpergewicht pro Tag. In besonderen bevorzugt Ausführungsformen beträgt die totale Dosis des Antisense Oligonukleotids etwa 5 mg Oligonukleotid per kg Körpergewicht pro Tag.
In bestimmten bevorzugt Ausführungsformen des dritten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren die Verabreichung einer therapeutisch Effektiven Menge eines DNA MeTase Small Molecule Inhibitors mit einem pharmazeutischen verträglichen Träger für eine therapeutische effizient Zeit. In einigen bevorzugt Ausführungsformen ist der DNA MeTase Small Molecule Inhibitor funktionell assoziiert mit dem vorstehend beschriebenem Oligonukleotid.
Die therapeutische Zusammensetzung enthaltend den DNA MeTase Small Molecule Inhibitor wird systematisch in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,01 μM bis etwa 10 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. In bestimmten bevorzugt Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung systematisch in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,05 μM bis etwa 10 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. In besonders bevorzugt Ausführungsformen wird die therapeutische Zusammensetzung in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,1 μM bis etwa 5 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. Für lokale Verabreichung können niedrigere Konzentrationen therapeutisch effektiv sein. Vorzugsweise beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer stärker bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,1 mg bis etwa 50 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die therapeutische effiziente synergistische Menge von DNA MeTase Small Molecule Inhibitor (wenn verabreicht mit einem Antisense Oligonukleotide) etwa 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen dieses Aspektes der Erfindung resultieren in einen gesteigerten inhibitorischen Effekt, wodurch die therapeutisch effizienten Konzentrationen von einem oder beiden, dem Nukleinsäure Spiegel Inhibitor (d.h. Antisense Oligonukleotid) und dem Protein Spiegel Inhibitor (d.h. DNA MeTase Small Molecule Inhibitor) reduziert werden, die erforderlich sind, um einen bestimmten inhibitorischen Effekt zu erreichen, im verglich zur einzelnen Verabreichung.
Der Fachmann weis, dass die therapeutisch effiziente synergistische Menge von beiden, durch „fine tuning" erhöht oder erniedrigt werden kann und entsprechender Änderung der Menge der anderen Verbindung. Die Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit zum Anpassen der Verabreichung/Behandlung an ein bestimmtes Exemplar einer gegebenen Tierspezie oder einen bestimmten Patienten. Therapeutisch effiziente Bereiche können leicht bestimmt werden, zum Beispiele empirisch durch beginnen mit einer relativ niedrigen Menge und schrittweisen Erhöhen bei evaluieren der Inhibierung.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen DNA MeTase Isoform bereit, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel des ersten Aspekts der Erfindung. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid, dass die Expression der DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei das Antisense Oligonukleotid spezifisch ist für eine bestimmte DNA MeTase Isoform und durch Inhibierung die Zellproliferation in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, identifiziert. In bestimmten anderen Ausführungsformen ist das Mittel eine Small Molecule Inhibitor, der die Aktivität der DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei der Small Molecule Inhibitor spezifisch ist für eine bestimmte DNA MeTase Isoform und das Inhibieren der Zellproliferation in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform, die für die Zellproliferation erforderlich ist, identifiziert. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle und die Induktion der Zellproliferation ist Tumorgenese. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen des vierten Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination von einen oder mehreren Antisense Oligonukleotiden und/oder einen oder mehreren Small Molecule Inhibitoren des erste Aspekt der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, ist die DNA MeTase DNMT-1, DNMT3a, oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA MeTase Isoform bereit, die an der Induktion der Zelldifferenzierung beteiligt ist, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel, dass die Expression einer DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei die Induktion der Differenzierung in der kontaktierten Zelle, die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform identifiziert, die bei der Induktion der Zell Differenzierung beteiligt ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Small Molecule Inhibitor des ersten Aspekts der Erfindung. In anderen bestimmten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In andern bevorzugten Ausführungsformen des fünften Aspektes der Erfindung umfasst das Verfahren ein Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, dass eine Kombination eines oder mehrerer Antisense Oligonukleotide und eines oder mehrerer Small Molecule Inhibitoren des erstes Aspektes der Erfindung ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahrung zur Inhibierung des neoplastischen Zellwachstums in einen Tier bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch effizienten Menge eines Mittels des ersten Aspektes der Erfindung an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Mittel ein Antisense Oligonukleotid, dass mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert wird und für eine therapeutisch effektiv Zeit verabreicht wird.
In bestimmten Ausführungsformen, in denen das Mittel des ersten Aspektes der Erfindung ein DNA MeTase Small Molecule Inhibitor ist, werden die therapeutischen Zusammensetzungen enthaltend den DNA MeTase Small Molecule Inhibitor systematisch in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,01 μM bis etwa 10 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. In bestimmten bevorzugt Ausführungsform wird die therapeutische Zusammensetzung systematisch in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,05 μM bis etwa 10 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die therapeutische Zusammensetzung in ausreichender Dosis verabreicht, um einen Blutspiegel von etwa 0,1 μM bis etwa 5 μM DNA MeTase Small Molecule Inhibitor zu erhalten. Für lokale Verabreichung können niedrigere Konzentrationen therapeutisch effektiv sein. Vorzugsweise beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,01 mg bis etwa 100 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer stärker bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,1 mg bis etwa 50 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Gesamtmenge des DNA MeTase Small Molecule Inhibitors von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg Protein Effektor pro kg Körpergewicht pro Tag. In einer bestimmten bevorzugten Ausführungsformen beträgt die therapeutische effiziente synergistische Menge von DNA MeTase Small Molecule Inhibitor (wenn Verabreicht mit einem Antisense Oligonukleotide) etwa 5 mg pro kg Körpergewicht pro Tag.
In einem siebten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung der Rolle einer bestimmten DNA MeTase Isoform in der Zellproliferation bereit, einschließlich der Proliferation von neoplastischen Zellen. In diesem Verfahren wird die interessierende Zelle mit einer Menge eines Antisense Oligonukleotids kontaktiert, die die Expression von einer oder mehreren spezifischen DNA MeTase Isoformen inhibiert, wie beschrieben für den ersten Aspekt die Erfindung, resultierend in der Inhibierung der Expression der DNA MeTase Isoform(en) in der Zelle. Wenn die kontaktierte Zelle mit inhibierter Expression der DNA MeTase Isoform ebenfalls eine Inhibierung der Zellproliferation zeigt, dann ist die DNA MeTase Isoform(en) erforderlich für die Induktion die Zellproliferation. Falls in diesem Szenario die kontaktierte Zelle eine neoplastische ist und die kontaktierte neoplastische Zelle eine Inhibierung der Zellproliferation zeigt, dann ist die DNA MeTase Isoform deren Expression inhibiert wurde, eine DNA MeTase Isoform, die für die Tumorgenese erforderlich ist. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
Durch Identifizierung einer bestimmten DNA MeTase Isoform, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, muss nur diese bestimmte DNA MeTase Isoform mit einem Antisense Oligonukleotid angegriffen werden, um die Zellproliferation zu inhibieren oder die Differenzierung zu induzieren. Entsprechend kann eine niedrigere therapeutisch effektiv Dosis eines Antisense Oligonukleotids in der Lage sein, die Zellproliferation effektiv zu inhibieren. Darüber hinaus können unerwünschte Nebeneffekte der Inhibierung alle DNA MeTase Isoformen durch die spezifische Inhibierung der einen (oder mehrerer) DNA MeTase Isoform(en) erforderlich für die Induktion der Zellproliferation vermieden werden. Wie zuvor beschrieben, schließen die Mittel des ersten Aspektes der Erfindung Oligonukleotide und Small Molecule Inhibitoren ein, die die Aktivität einer oder mehrerer, aber nicht aller, DNA MeTase Isoformen inhibieren. Das Messen der enzymatischen Aktivität der DNA MeTase Isoform kann durch bekannte Verfahren erfolgen. Siehe z.B. Szyf, M. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 10027–10030.
Vorzugsweise ist der DNA MeTase Small Molecule Inhibitor der Erfindung, der eine DNA MeTase Isoform inhibiert, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, ein DNA MeTase Small Molecule Inhibitor, der mit weniger als allen DNA MeTase Isoformen interagiert und die enzymatische Aktivität reduziert.
In einem achten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA MeTase Isoform bereit, die an der Induktion der Zelldifferenzierung beteiligt ist, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Antisense Oligonukleotid, dass die Expression einer DNA MeTase Isoform inhibiert, wobei die Induktion der Differenzierung in der kontaktierten Zelle die DNA MeTase Isoform als eine DNA MeTase Isoform identifiziert, die bei der Induktion der Zell Differenzierung beteiligt ist. Vorzugsweise ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und/oder DNMT3b.
Der Ausdruck „Induzieren der Zelldifferenzierung" und ähnliche Begriffe bedeutet die Fähigkeit eines DNA MeTase Antisense Oligonukleotides oder eines DNA MeTase Small Molecule Inhibitors (oder Kombinationen hiervon) die Differenzierung in einer kontaktierten Zelle zu induzieren verglichen mit einer nicht kontaktierten Zelle. Daher kann eine neoplastische Zelle induziert werden zu differenzieren, wenn sie mit einem DNA MeTase Antisense Oligonukleotid oder einem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor (oder beiden) kontaktiert wird. Die resultierende Tochterzelle ist phylogenetisch weiter fortgeschritten als die kontaktierte Zelle.
In einem neunten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle bereit, umfassend dass Kontaktierten einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid des ersten Aspektes der Erfindung, dass eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor, einem Antisense Oligonukleotid, das eine DNA Methyltransferase inhibiert und einem DNA MeTase Small Molecule Inhibitor. In einer Ausführungsform, ist die Inhibierung des Zellwachstums der kontaktierten Zelle größer als die Inhibierung des Zellwachstums einer Zelle, die nur mit einem Mittel kontaktiert wird. In bevorzugten Ausführungsformen ist jedes Mittel ausgewählt aus der Gruppe im Wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In stärker bevorzugten Ausführungsformen sind die Mittel ausgewählt aus die Gruppe funktionell assoziiert.
In einem zehnten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulierung der Zellproliferation oder Differenzierung bereit, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel des erstes Aspektes der Erfindung, wobei eine oder mehrere, aber nicht alle, DNA MeTase Isoformen inhibiert werden, was zu einer Modulierung der Proliferation oder Differenzierung führt. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zellproliferation Neoplasia. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT-1, DNMT3a oder DNMT3b. In anderen bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA MeTase Isoform DNMT3a und oder DNMT3b.
Für Zwecke dieses Aspektes ist es nicht bedeutend wie die spezifische DNMT Isoform inhibiert wird. Die vorliegende Erfindung stellt die Lehre bereit, dass spezifische individuelle DNMTs an der Zellproliferation oder Differenzierung beteiligt sind, wohingegen andere nicht beteiligt sind. Wie hier dargestellt, trifft dies zu unabhängig wie (eine) bestimmte DNMT Isoform(en) inhibiert wird (werden).
Der Ausdruck „Modulieren" der Proliferation oder Differenzierung bedeutet Änderung der relativen Betrages der Proliferation oder Differenzierung durch Anstieg oder Abnahme verglichen mit einer Kontrollzelle, die nicht mit einem Mittel des ersten Aspektes der Erfindung kontaktiert wird. Vorzugsweise handelt es sich um einen Anstieg oder eine Abnahme von etwa 10% bis 100%. Stärker bevorzugt ist ein Anstieg oder eine Abnahme von etwa 25% bis 100%. Insbesondere bevorzugt ist ein Anstieg oder eine Abnahme von etwa 50% bis 100%. Der Begriff „etwa" beschreibt eine Abweichung von bis zu 20% von den genannten Zahlenwerten.
Die folgenden Beispiele beschreiben bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und sind nicht als einschränkend zu betrachten. Ebenfalls umfasst sind verschiedene Äquivalente der spezifischen Substanzen und Verfahren, die der Fachmann durch Routineexperimente auffinden kann.
In einem elften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle bereit, umfassend Kontaktieren einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid des erstes Aspektes der Erfindung, dass die Expression einer spezifischen DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor, der eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Antisense Oligonukleotid, das eine Histon-Deactylase inhibiert, und einem Small Molecule, das eine Histon-Deactylase inhibiert. In einer Ausführungsform, ist die Inhibierung des Zellwachstums der Kontaktierten Zelle größer als die Inhibierung des Zellwachstums einer kontaktierten Zelle mit nur einem der Mittel. In bestimmten Ausführungsformen ist jedes der Mittel ausgewählt aus der Gruppe, im Wesentlichen rein. In bevorzugten Ausführungsformen, ist die Zelle eine neoplastische Zelle. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, funktionell assoziiert.
BEISPIELE
Beispiel 1
Synthese und Identifizierung von aktiven DNMT3a und DNMT3b Antisense Oligonukleotiden
Antisense (AS) Moleküle wurden entworfen, um gegen die 5'- oder 3'-untranslatierte Region (UTR) der Zielgene DNMT3a und DNMT3b gerichtet zu sein. Oligos wurden mit einem Phosphorothioat-Rückrat mit einem automatischen Synthesizer synthetisiert und durch und eine Präparativ Revers-Phasen HPLC gereinigt. Alle verwendeten Oligos waren 20 Basenpaare lang.
Um Antisense Oligodeoxynukleotide (ODN), fähig zur Inhibierung der DNMT3a oder DNMT3b Expression in humanen Krebszellen zu identifizieren, wurden Antisense Oligonukleotide anfänglich in T24 (human Blase) A549 (Humane „non small cell" Lungenkrebszellen bei 100 nM gescreent. Zellen wurden nach 24 h Behandlung geerntet und die DNMT3a oder DNMT3b RNA Expression wurde durch Northern Blot Analyse analysiert.
Insgesamt wurden 27 Phosphorothioat ODNs, enthaltend Sequenzen, komplementär zu dem 5' oder 3 UTR des humanen DNMT3 Gens (GenBank Accession No. AF067972) gescreent, siehe oben (2). Die erste Generation von DNMT3a AS-ODNs mit größter Antisense Aktivität gegen humane DNMT3a wurde ausgewählt für die Herstellung der zweiten Generation. Diese Oligos wurden dann als zweite Generation synthetisiert (Phosphorothioat-Rückrat und 2'-0-methyl Modifizierung) und geeignete Mismatch-Kontrollen wurden hergestellt.
Insgesamt wurden 34 Phosphorothioat ODNs, enthaltend Sequenzen, komplementär zu dem 5' oder 3' UTR des humanen DNMT3b Gens (GenBank Accession No. NM_006892) gescreent, siehe oben (3). Die erste Generation von DNMT3b AS-ODNs mit größter Antisense Aktivität gegen humane DNMT3b wurde ausgewählt für die Herstellung der zweiten Generation. Diese Oligos wurden dann als zweite Generation synthetisiert (Phosphorothioat-Rückrat und 2'-0-methyl Modifizierung) und geeignete Mismatch-Kontrollen wurden hergestellt.
Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen eine Zusammenfassung der Oligonukleotidesequenzen, Nukleotide-Position und chemische Modifizierung der Antisense Oligonukleotide gegen DNMT-1, DNMT3a und DNMT3b Gene. Sequenzen der Mismatch-Kontrololigonukleotide sind ebenfalls dargestellt.
Beispiel 2
Dosis Abhängige Inhibierung der DNMT3a und DNMT3b mRNA Expression, durch Antisense Oligonukleotide
Aktive Oligonukleotide, identifiziert in anfänglichen Screens, werden synthetisiert mit Phosphorothiate-Rückrat und 2'-0-Methyl Modifikation des Zuckers an den vier 5' und 3' Nukleotiden. Um zu bestimmen, ob AS ODN Behandlung die DNMT3a und DNMT3b Expression auf dem mRNA Level reduziert, wurden „Dose-Response" Experimente durchgeführt. Humane A549 oder 724 Zellen wurden mit ansteigenden Dosen von Antisense (AS) Oligonukleotiden von 0–75 nM für 24 Stunden behandelt.
Humane A549 oder T24 humane Blasenkrebszellen wurden in 10 cm Kulturschalen einen Tag vor der Oligonukleotid Behandlung ausgesät. Die Zellleinen wurden erhalten von der American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) und angezogen unter den empfohlenen Kultur-Bedingungen. Vor der Zugabe der Oligonukleotide, wurden die Zellen mit PBS (Phosphat gepufferter Salzlösung) gewaschen. Danach wurde „Lipofectin Transfektions Reagenz" (GIBCO BRL Mississauga, Ontario, CA) bei einer Konzentration von 6,25 μg/ml zu Serum-freien OPTIMEM Medium (GIBCO BRL, Rockville, MD) hinzubegeben, welches dann zu den Zellen gegeben wurde. Die zutestenden Oligonukleotide wurden direkt zu den Zellen gegeben (d.h. ein Oligonukleotid pro Zellplatte).
Die Zellen wurden geerntet und Gesamt-RNAs wurden durch Northern Blot Analyse bestimmt. Gesamt-RNA wurde extrahiert unter Verwendung von RNeasy Miniprep Saulen (QIAGEN). Zehn bis zwanzig Mikrogram Gesamt-RNA wurden auf ein Formaldehyd-enthaltendes 1% Agarose Gel aufgetragen, mit 0,5 M Natrium Phosphat (pH 7.0) als Puffer. RNAs wurden dann auf Nitrocellulose Membranen transferiert und mit Radioaktiv-markierten DNA-Proben, spezifisch für DNMT3a oder DNMT3b Messenger RNA hybridisiert.
Autoradiographie wurde nach bekanntem Verfahren durchgeführt. 4 zeigt die Ergebnisse der Experimente mit Antisense Inhibitoren von DNMT3a der ersten Generation. 5 ist ein repräsentativen Northern Blot, der die Dosis abhängige Inhibierung der DNMT3b Expression durch AS-ODN (SEQ ID NO:18) in A549 humanen „non small cell" Lungenkrebszellen zeigt (bestimmter IC₅₀ Wert bei 25 nM). Gezeigt ist also die Spezifität von SEQ ID NO:18 für DNMT3b. Die mRNAs für DNMT1, DNMT3a und Glyceraldehyd 3'-Phosphate Dehydrogenase waren nicht betroffen. MM zeigt Kontrol-Mismatch Oligonukleotide.
Die Behandlung von Zellen mit dem angegebenen AS-ODN inhibiert signifikant die Expression der Ziel mRNA DNMT3a oder DNMT3b in einer Dosis abhängigen Weise in menschlichen A549 und T24 Zellen.
Beispiel 3
DNMT3b Antisense ODNs inhibieren DNMT3b Protein-Expression
Um zu bestimmen, ob die Behandlung mit DNMT3a oder DNMT3b AS-ODNs die Expression auf dem Protein Level inhibiert, wurden Antikörper, spezifisch für DNMT3a oder DNMT3b, hergestellt zur Verwendung in Western Blots. DNMT3b wird in ausreichend hohen Mengen in menschlichen Krebszellen exprimiert, um durch unseren DNMT3b Antikörper nachgewiesen zu werden. Jedoch wird DNMT3a nicht in nachweisbaren Mengen exprimiert. Daher werden humane A549 "non small cell" Lungenkrebszellen und T24 humane Blasekrebszellen mit Dosen des DNMT3b Antisense Inhibitors (SEQ ID NO:18) von 0–75 nM für 48 Stunden behandelt und die DNMT3b Protein Menge wird durch Western Blot bestimmt.
Zellen wurden in Puffer, enthaltend 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdeoxycholat, 5 mM EDTA, 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, und Protease Inhibitoren lysiert. Gesamt-Protein wurde durch das Protein Assay Reagenz von Bio-Rad bestimmt (Hercules, CA). 100 μg von Gesamt-Protein durch SDS PAGE analysiert. Gesamt-Protein wurde auf eine PVDF Membrane transferiert und mit dem DNMT3b spezifischen Antikörper getestet. Anti-DNMT3b Antikörper wurden gewonnen durch immunisieren von Kaninchen mit einem GST Fusionsprotein, enthaltend ein Fragment des DNMT3b Proteins (Aminosäuren 4-101 der GenBank Accession No. NM006892).
Kaninchen Antiserum wurde getestet und reagierte spezifisch mit der humanen DNMT3b Isoform. DNMT3b Antiserum wurde in einer 1:500 Verdünnung im Western Blots verwendet, um DNA MeTase-6 in Gesamt-Zell Lysaten nachzuweisen. Meerrettich Peroxidase konjugiert mit einem zweiten Antikörper wurde bei einer Verdünnung von 1:5000 verwendet, um Bindung des ersten Antikörpers nachzuweisen. Die Bindung die zweiten Antikörpers wurde durch den Enhanced Chemiluminescence (ECL) Nachweis Kit (Amersham-Phannacia Biotech., Inc., Piscataway, NJ) sichtbar gemacht.
Wie in 6 gezeigt, inhibiert die Behandlung von T24 oder A549 Zellen mit DNMT3b AS-ODN MG3741 die Expression des DNMT3b Proteins.
Beispiel 4
Effekt der DNMT3a und DNMT3b Inhibition auf Krebszell-Apoptose und Wachstum
Um die Effekte der DNMT3a und DNMT3b Inhibition auf die Apoptose von Krebszellen zu bestimmen, wurden verschiedene Krebszelllinien (A549 oder T24 Zellen, MDAmb231) DNMT3a und DNMT3b AS-ODN für verschiedene Zeiten ausgesetzt und die Effekte auf die Apoptose wurden bestimmt. Für die Untersuchung der Apoptose (aktiver Zelltod) wurden die Zellen gemäß Herstellerangaben mit dem „Cell Death Detection ELISA Plus" Kit (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Deutschland) analysiert. Typischerweise werden 10.000 Zellen auf 96-Well Zellkulturplatten 2 Stunden vor der Ernte und Lyse platiert.
Jede Probe wurde zweifach analysiert. ELISA Auswertung erfolgte mit einem „MR700 Plate Reader" (DYNEX Technology, Ashford, Middlesex, England) bei 410 nm. Die Referenz wurde auf 490 nm gesetzt. Die Ergebnisse dieser Studien der DNMT3a und DNMT3b Inhibierung in humanen Krebszellen sind in den 7–9 gezeigt.
Die Effekte der DNMT3b Inhibierung auf die Induktion der Apoptose in normalen Zellen wurden ebenfalls bestimmt. Die Ergebnisse sind in 10 dargestellt. HMEC (humane epitheliale Brustzellen, ATCC, Manassas, VA) und MRHF (männliche Vorhaut-Fibroblasten, ATCC, Manassas, VA) wurden mit 75 nM DNMT3b AS (SEQ ID NO:18) oder deren Mismatch-Kontrolle SEQ ID NO:19 für 48 Stunden behandelt, wie vorstehend für humane Krebszellen beschrieben. 10 zeigt, dass der DNMT3b AS Inhibitor in normalen Zellen keine Apoptose induziert, anders als in Krebszellen in denen Apoptose induziert wird.
Um die Effekte der DNMT3a und DNMT3b Inhibierung auf die Proliferation von Krebszellen zu bestimmen, wurden verschiedene Krebszell-Linien (A549 oder T24t Zellen, MDAmb231) den DNMT3a und DNMT3b AS-ODN unterschiedlichen Zeiten ausgesetzt und die Effekte auf die Zellproliferation wurden bestimmt. Die Ergebnisse dieser Studien sind in den 11A und 11B gezeigt und zeigen, dass die Inhibierung der DNMT3a oder DNMT3b Expression die Krebszell-Proliferation drastisch beeinflusst.
Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass die Inhibierung von der DNMT3a oder DNMT3b zur Wachstums-Inhibierung führt und Apoptose in humanen Krebszellen, aber nicht in normalen Zellen induziert. Da T24 Zellen keine p53 Aktivität haben, wohingegen A549 Zellen ein funktionsfähiges p53 Protein haben, ist die Induktion der Apoptose unabhängig von der p53 Aktivität.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Inhibierung DNMT3a oder DNMT3b eine spezifische und effektive Antikrebstherapie sein könnte.
Beispiel 5
Identifizierung von Small Molecule Inhibitoren von DNA Methyltransferase Isoformen
Die enzymatischen Aktivitätsassays und die Bestimmungen zur Substratspezifität der verschiedenen Isoformen der DNA Methyltransferase werden wie vorstehend beschrieben durchgeführt (Szyf M. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 10027–10030). Kernextrakte wurden hergestellt von 1 × 10⁸ humanen H446 Zellen oder Maus-Y1 (ATCC, Manassas, VA) Zellen in der mittleren Log-Phase, die unter Standardbedingungen angezogen wurden.
Die Zellen wurden behandelt mit Medium supplementiert mit der Testverbindung mit einer Konzentration von etwa 0,001 μM bis etwa 10 mM, oder einer Konzentration von etwa 0,01 μM bis etwa 1 mM oder einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 1 mM. Die Zellen wurden geerntet und zweimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann in 0,5 ml Puffer A (10 mM Tris pH 8,0; 1,5 mM MgCl₂, 5 mM KCl₂, 0,5 mM DTT, 0,5 mM PMSF und 0,5% Nonidet P40) resuspendiert, um die Zellkerne von den anderen Zellkomponenten zu trennen. Die Zellkerne werden durch Zentrifugation in einer Eppendorf Mikrofuge bei 2,000 RPM für 15 min bei 4°C pellitiert.
Die Zellkerne werden einmal in Puffer A gewaschen und re-pelletiert und danach in 0,5 ml Puffer B (20 mM Tris pH 8,0, 0,25% Glycerol, 1,5 mM MgCl₂, 0,5 mM PMSF, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM DTT und 0,4 mM NaCl) resuspendiert.
Die resuspendierten Zellkerne werden für 15 Minuten auf Eis inkubiert und dann für 15 Minuten bei 15.000 RPM zentrifugiert, um die nuklearen Tümmer zu pelletieren. Der nukleare Extrakt im Überstand wird vom Pellet getrennt und für die DNA MeTase Aktivitätsassays verwendet.
Jeder Assay wurde dreifach durchgeführt. 3 μg des nuklearen Extraktes werden in einem Reaktionsgemisch verwendet, umfassend 0,1 μg eines synthetischen 33-Basenpaar langen-halbmethylierten DNA Moleküls-Substrats mit 0,5 μCi S-[methyl-³H] Adenosyl-L-methionin (78,9 Ci/mmol) als Methyldonor in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 25% Glycerol, 0,2 mM PMSF, und 20 mM 2-Mercaptoethanol. Das Reaktionsgemisch wird für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um die anfängliche Rate der DNA MeTase Aktivität zu bestimmen. Die Reaktion wird gestoppt durch Zugabe von 10% TQA, um die DNA zufällen. Die Proben werden dann bei 4°C für 1 Stunde inkubiert und die TCA Präzipitate werden dann durch GFC Filter (Fischer, Hampton, N. H.) gewaschen. Kontrollen sind DNA inkubiert in dem Reaktionsgemisch in Abwesenheit des nuklearen Extraktes und der nukleare Extrakt inkubiert in dem Reaktionsgemisch in Abwesenheit der DNA.
Die Filter werden in ein Scintillationsröhrchen gelegt, enthaltend 5 ml eines Scintillationscocktails und H³-enthaltende Methyl-Gruppen eingebaut in die DNA werden im Scintillationszähler gemäß Standardverfahren gezählt. Um die Inhibierung der DNA MeTase Expression zu messen, wird die spezifische Aktivität des nuklearen Extraktes von den mit den Testverbindungen behandelten Zellen mit der spezifischen Aktivität unbehandelter Zellen verglichen. Die Behandlung der Zellen mit den Testverbindungen, die Small Molecule Inhibitor-Kandidaten der DNA MeTase sind, führt zu einer Reduzierung der DNA MeTase Aktivität in den nuklearen Extrakten.
Der vorstehende Assay kann einfach angepasst werden, um die Effekte der Testverbindungen auf die Aktivität von individuellen, rekombinant-hergestellten DNA MeTase Isoformen zu testen. Um rekombinante Proteine für jede DNA MeTase Isoform herzustellen, wird ein Expressionskonstrukt für jeden Isotyp (DNMTI, DNMT3a und DNMT3b (DNMT3b2 und DNMT3b3 Splice-Varianten)) durch Insertion der gesamten kodierenden Sequenz des jeweiligen Isotyps in den pBlueBac4.5 Baculovirus-Expressionvektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) hergestellt. Jedes Konstrukt wurde dann verwendet, um "High Five" Insektenzellen gemäß den Herstellerangaben zu infizieren.
Die Reinigung der Baculovirus exprimierten humanen Proteine DNMTI, DNMT3a und DNMT3b wurde folgendermaßen durchgeführt: Nukleare Extrakte wurden aus "High Five" Insektenzellen isoliert, die Salzkonzentration wurde mit Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 1 mM Na EDTA, 10% Sucrose) auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaCl eingestellt. Die Lysate wurden bei 9500 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde nacheinander auf eine Q-Sepharose-, Heparin- und Source-Q15 Säule gegeben. Alle Reinigungen wurden mit einem Gradientensystem mit einer P1-Pumpe bei 4°C durchgeführt.
Die DNA MeTase Isotyp spezifischen Aktivitätsassays wurden folgendermaßen durchgeführt:
Etwa 100 pg bis etwa 25 μg, oder bevorzugt etwa 10 ng bis etwa 10 μg, oder mehr bevorzugt etwa 100 ng bis etwa 2,5 μg rekombinantes Protein des DNA MeTase Isotyps wurde in einem Reaktionsgemisch inkubiert, enthaltend 0,1 μg eines synthetischen 33-Basenpaar langen- halbmethylierten DNA Molekülssubstrats mit 0,5 μCi S-[Methyl-³H] Adenosyl-L-methionin (78,9 Ci/mmol) als Methyldonor in einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM EDTA, 25% Glycerol, 0,2 mM PMSF, und 20 mM 2- Mercaptoethanol in einem Gesamtvolumen von 30 μl. Die Testproben schließen auch Small Molecule Inhibitor-Testverbindungen mit einer Konzentration von etwa 0,001 μM bis etwa 10 mM, oder einer Konzentration von etwa 0,01 μM bis etwa 1 mM, oder mit einer Konzentration von etwa 0,1 μM bis etwa 1 mM ein. Die Reaktionen werden gestoppt und die Proben aufgearbeitet, wie vorstehend beschrieben.
Es wird erwartet, dass bestimmte Kandidaten der Small Molecule Inhibitoren der DNA MeTase Aktivität signifikant die Menge an eingebautem radioaktivem Methyl in die Substrat DNA reduzieren.
Äquivalente
Ebenfalls umfasst sind Äquivalente der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die der Fachmann durch Routineexperimente auffinden kann. SEQUENCE LISTING
Zusammenfassung
Die Erfindung bezieht sich auf die Inhibierung der DNA MeTase Expression und der enzymatischen Aktivität.
Die Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Inhibierung spezifischer DNA MeTase Isoformen durch die Inhibierung der Expression auf dem Nukleinsäurelevel oder der enzymatischen Aktivität auf dem Proteinlevel bereit.

Claims

Ein Mittel, das eine oder mehrere DNA Methyltransferase Isoformen, aber nicht alle DNA Methyltransferase Isoformen inhibiert, wobei das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus, einem Anti-DNA Methyltransferase Oligonukleotid und einem Small Molecule Inhibitor der DNA Methyltransferase.
Das Mittel gemäß Anspruch 1, das ein Oligonukleotid ist.
Das Mittel gemäß Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid ein chimäres Oligonukleotid ist.
Das Mittel gemäß Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid ein hybrides Oligonukleotid ist.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einer Region einer RNA oder doppelsträngigen DNA ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a. einem Nukleinsäuremolekül kodierend mindestens 13 aufeinanderfolgende Oligonukleotide von DNMT-1 (SEQ ID NO:1), b. einem Nukleinsäuremolekül kodierend mindestens 13 aufeinanderfolgende Oligonukleotide von DNMT-3a (SEQ ID NO:2), c. einem Nukleinsäuremolekül kodierend mindestens 13 aufeinanderfolgende Oligonukleotide von DNMT-3b (SEQ ID NO:3).
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5 mit einer Nukleotidsequenz von etwa 13 bis etwa 15 Nukleotiden.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5 mit einer Nukleotidsequenz von etwa 15 bis etwa 26 Nukleotiden.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5 mit einer oder mehreren Phophorothioatinternukleosid-Bindungen, 20–26 Nukleotide Länge und modifiziert, so dass die vier terminalen Nukleotide am 5' Ende des Oligonukleotids und die vier terminalen Nukleotide am 3' Ende des Oligonukleotids jeweils 2'-O-Methylgruppen an ihren Zuckerresten haben.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einer Region der RNA oder doppelsträngiger DNA, kodierend einen Teil von DNMT1 (SEQ ID NO:1).
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:4, SEQ II) NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einer Region der RNA oder doppelsträngiger DNA, kodierend einen Teil von DNMT3a (SEQ ID NO:2).
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 und SEQ ID NO:36.
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 5, wobei das Oligonukleotid komplementär ist zu einer Region der RNA oder doppelsträngiger DNA, kodierend einen Teil von DNMT3b (SEQ ID NO:3).
Das Oligonukleotid gemäß Anspruch 13, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 und SEQ ID NO:27.
Ein Verfahren zur Inhibierung einer oder mehrerer DNA Methyltransferase Isoformen in einer Zelle, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit einem Mittel gemäß Anspruch 1.
Ein Verfahren zur Inhibierung einer oder mehrerer DNA Methyltransferase Isoformen in einer Zelle, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit dem Oligonukleotid gemäß Anspruch 2.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Zellproliferation in der kontaktierten Zelle inhibiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Oligonukleotid, das die Zellproliferation in einer kontaktierten Zelle inhibiert, die Wachstumsverlangsamung in der kontaktierten Zelle induziert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Oligonukleotid, das die Zellproliferation in einer kontaktierten Zelle inhibiert, den Wachstumsstop in der kontaktierten Zelle induziert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Oligonukleotid, das die Zellproliferation in einer kontaktierten Zelle inhibiert, den programmierten Zelltod in der kontaktierten Zelle induziert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das Oligonukleotid, das die Zellproliferation in einer kontaktierten Zelle inhibiert, den neokrotischen Zelltod in der kontaktierten Zelle induziert.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, ferner umfassend, das Kontaktieren der Zelle mit einem Small Molecule Inhibitor der DNA Methyltransferase.
Ein Verfahren zur Inhibierung der neoplastischen Zellproliferation in einem Tier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch effizienten Menge eines Mittel gemäß Anspruch 1 an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle im Körper.
Ein Verfahren zur Inhibierung der neoplastischen Zellproliferation in einem Tier, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch effizienten Menge eines Oligonukleotids gemäß Anspruch 2 an ein Tier mit mindestens einer neoplastischen Zelle im Körper.
Das Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das Tier ein Mensch ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 24, ferner umfassend die Verabreichung einer therapeutisch effizienten Menge eines Small Molecule Inhibitors der DNA Methyltransferase mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger für eine pharmazeutisch ausreichende Zeit.
Das Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das Tier ein Mensch ist.
Ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA Methyltransferase Isoform, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, umfassend das Kontaktieren der DNA Methyltransferase Isoform mit einem inhibitorischem Mittel, wobei eine Abnahme der Induktion der Zellproliferation zeigt, das die DNA Methyltransferase Isoform für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das inhibitorische Mittel ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 2 ist.
Ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA Methyltransferase Isoform, die für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist, umfassend das Kontaktieren der DNA Methyltransferase Isoform mit einem inhibitorischem Mittel, wobei eine Abnahme der Zellproliferation zeigt, das die DNA Methyltransferase Isoform für die Induktion der Zellproliferation erforderlich ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei das inhibitorische Mittel ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 2 ist. 32: Ein Verfahren zur Identifizierung einer DNA Methyltransferase Isoform, die für die Induktion der Zelldifferenzierung erforderlich ist, umfassend das Kontaktieren der DNA Methyltransferase Isoform mit einem inhibitorischem Mittel, wobei eine Induktion der Zelldifferenzierung zeigt, das die DNA Methyltransferase Isoform für die Induktion der Zelldifferenzierung erforderlich ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei das inhibitorische Mittel ein Oligonukleotid gemäß Anspruch 2 ist.
Ein Verfahren zur Inhibierung der Zellproliferation in einer Zelle, umfassend das Kontaktieren einer Zelle mit mindestens zwei Mitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antisense Oligonukleotid, dass eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Small Molecule Inhibitor, der eine spezifische DNA MeTase Isoform inhibiert, einem Antisense Oligonukleotid, das eine spezifische DNA MeTase inhibiert und einem Small Molecule Inhibitor der DNA MeTase.
Ein Verfahren zur Modulierung der Zellproliferation oder Differenzierung einer Zelle, umfassend die Inhibierung einer spezifische DNA MeTase Isoform, die in der Zellproliferation oder Differenzierung involviert ist durch kontaktieren der Zelle mit einem Mittel des Anspruchs 1.
Das Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei die Zellproliferation Neoplasie ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei die DNA Methyltransferase Isoform ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNMT1, DNMT3a und DNMT3b.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die DNA Methyltransferase Isoform ausgewählt ist von DNMT3a und DNMT3b.
Das Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die DNA Methyltransferase Isoform DNMT3b ist.