DE10259677B4

DE10259677B4 - Sonden zum Nachweis von Nukleinsäuren, insbesondere zum Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln

Info

Publication number: DE10259677B4
Application number: DE2002159677
Authority: DE
Original assignee: Jaszczuk Wieslaw Dipl-Phys; Klauth Peter Dr Dipl-Biol
Current assignee: Jaszczuk Wieslaw Dipl-Phys; Klauth Peter Dr Dipl-Biol
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: DE10259677A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Probe oder einer Lebensmittelprobe, aufweisend folgende Verfahrensschritte:
– Isolierung der Mikroorganismen aus der Probe,
– Überführung der isolierten Mikroorganismen in ein PCR-Gefäß,
– Amplifikation der Zielnukleinsäure durch eine real-time PCR als Marker für die Mikroorganismen,
– Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure mittels einer Sonde mit mindestens zwei Fluorophoren, die ein FRET-Paar bilden, wobei die Fluorophoren so gewählt sind, daß erst nach der Hybridisierung der Sonde mit dem Zielnukleotid ein erkennbares Signal von dem Fluorophor emittiert wird, dass eine gegenüber der Fluoreszenzemission der Probenumgebung verlängerte Lebensdauer aufweist, so dass das Meßsignal durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung von der Autofluoreszenz der Probenumgebung differenzierbar ist,
– Erfassen der Fluoreszenzemission mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung,
– Quantifizierung der Pathogen-Konzentration in der Ausgangsprobe über eine Standardkurve mit Kalibrierfaktoren.

Description

Die Erfindung betrifft eine Sonde zum Nachweis eines molekularen Ereignisses, insbesondere zum Nachweis der Hybridisierung der Oligonukleotidsonden mit einem Zieloligonukleotid, vorzugsweise mit Hilfe von molecular beacons. Das erfindungsgemäße System dient vorzugsweise dem Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln.
Molecular beacons (MB) sind Einzelstrang-DNA-Moleküle mit einer Haarnadelstruktur (hair pin). Sie besitzen demnach eine "stem and loop structure". Die Schleife (loop) weist eine Nukleotidsequenz auf – die sog. Probensequenz, die zu einer vorbestimmten Zielnukleotidsequenz komplementär ist. Der Stamm (stem) wird durch die Hybridisierung zweier komplementärer Armsequenzen gebildet, die die Probensequenz flankieren. Ein Fluoreszenzfarbstoff befindet sich am Ende eines Armes, während ein Quencher am Ende des anderen Arms gebunden ist. Durch den Stamm werden diese beiden Einheiten in einer definierten räumlichen Nähe zueinander gehalten, die zu einem möglichst vollständigen Quenchen (Löschen) der Fluoreszenz-Strahlung des Fluorophors durch den sog. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) führt. Dazu ist es erforderlich, das FRET-Paar "Fluorophor-Quencher" aufeinander abzustimmen.
Trifft der molecular beacon auf eine Zielsequenz, hybridisieren die Probensequenz und die Zielsequenz über einen Bereich, der stabiler und länger ist als der Stamm aus den beiden Armsequenzen. Der Stamm wird daher in seine Arme getrennt und der Fluorophor und der Quencher nehmen eine definierte räumliche Distanz zueinander ein. Damit wird der FREI unterbrochen, da der FREI mit der 6. Potenz Radius abnimmt. Fluoreszenz-Emission des Fluorophors wird detektierbar.
Die Struktur und das Funktionsprinzip der molecular beacon sind ausführlich beschrieben von Tyagi und Kramer (1996): "Molecular beacons: grobes that fluoresce upon hybridization" in Nature Biotechnology 14, 303–308. Ebenso sind sie Gegenstand der US Patentschrift 5,925,517 , die hiermit zu Offenbarungszwecken hinsichtlich der Struktur und Funktion der MBs sowie der Wahl geeigneter FRET-Paare vollumfänglich in Bezug genommen wird.
Als bekanntes ideales Fluorophor-Quencher Paar, das in der Stammformation des MB zu einem fast vollständigen Löschen der Fluoreszenz-Emisson führt, ist die 5'-(2-Aminoethyl)Aminonaphtalin-1-Sulfonsäure (EDANS) am 5'-Ende und als Quencher die 4-(4'-Dimethylaminophenylazobenzolsäure (DABCYL) am 3'-Ende bekannt. Ebenso ist auch die Verwendung des DABCYL in Kombination mit Fluorescein am 5'-Ende geeignet (G. Leone, von Schijndel H., van Gemen B., Kramer R. F. und Schön D. (1998) "Molecular Beacon Probes combined with Amplification by NASBA enable homogeneous real-time Detection of RNA" in: Nucleic Acids Research 26, 9, 2150–2155).
Da MBs aufgrund des durch FREI verursachten Quenchings im Ergebnis solange keine oder kaum eine Fluoreszenzstrahlung emittieren, oder spektrale Verschiebung bei Verwendung von zwei Fluorophoren verursachen und damit das Signal aus dem Meßbereich entfernen, wie die Probensequenz nicht mit der Zielsequenz hybridisiert vorliegt, haben sich MBs in jüngerer Vergangenheit besonders als Sonden in Nachweissystemen bewährt, in denen das Auswaschen überschüssiger Sonden nicht gewünscht oder möglich ist. Dies gilt insbesondere bei der real-time PCR oder bei der Detektion von Nukleinsäuren in lebenden Zellen (Liu X., Farmerie W., Schuster S., Tan W. (2000): "Molecular beacons for DNA Biosensors with a Micrometer to Submicrometer Dimension" in: Analytical Biochemistry 283, 56–63).
Gerade in komplexen biologischen Systemen wie lebenden Zellen hat sich jedoch die unspezifische Fluoreszenz beispielsweise zellulärer Bestandteile als wesentliche systematische Fehlerquelle erwiesen, die die Aussagekraft und Spezifität der Nachweismethoden selbst mit den bekannten MB deutlich vermindert. So zeigen beispielsweise Hämoglobine oder aromatische Kohlenwasserstoffe bei Anregung mit UV-Licht ungewollt eine unspezifische Fluoreszenz, die sich als Hintergrundstrahlung bemerkbar macht. Das eigentliche Meßsignal wird somit überlagert. Diese Hintergrundstrahlung wird nachfolgend auch als Autofluoreszenz der Probenumgebung oder des Probenmilieus bezeichnet.
EP 0 973 036 B1 betrifft ein Testverfahren auf der Basis eines an den distalen Enden eines Peptidmoleküls angeordneten FRET-Systems, in dem aufgrund ihrer langen Emissionszeiten Seltene-Erde-Fluorophoren als Donatoren verwendet werden (Absatz 36). Die Signaldetektion erfolgt über eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung, die als besonders vorteilhaft für die Reduktion der Hintergrundstrahlung beschrieben wird.
US 5,998,146 A geht auf denselben Anmelder zurück und entspricht in ihrem Offenbarungsgehalt im wesentlichen EP 0 973 036 B1 .
LEONE et al. ("Molecular beacon grobes combined with amplification by NASBA enable homogeneous, real-time detection of RNA", Oxford University Press Vol.. 26 1998, Seiten 2150–2155), beschreibt allgemein den Einsatz von Molecular Beacons in einem NASBA-System.
TAN et al. („Molecular Beacons: A novel DNA probe for nucleic acid and Protein studies", Journal of Chemistry, No. 6, 2000, Seiten 1107–1111), beschreibt den allgemeinen technologischen Hintergrund zu Molecular Beacons u.a. in ihrer Anwendung in der Real-time PCR oder der RNA-Detektion in lebenden Zellen.
FLUIT et al. („Molecular detection of antimicrobial resistance", Clinical Microbiology Reviews, October 2001, Seiten 836–871), betrifft die Detektion bakterieller Resistenzen und offenbart dazu u.a. auch die Verwendung von Molecular Beacons. Diese Druckschrift offenbart daher die Verwendung von Molecular Beacons für den Nachweis von Bakterien.
Ferner war ein Europium-Chelat bekannt, das als Fluoreszenzmarker eingesetzt wird.
US 5,720,923 betrifft eine PCR-Maschine für die Real-time-Amplifikation, die einen UV-Detektor aufweist (30). Dieser weist zur Fluoreszenzmessung eine UV-Lichtquelle und Photodioden auf.
EP 1 049 806 offenbart Methoden zur zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung (Absätze 42 bis 45). Ferner wurden Molecular Beacons mit einem FRET-System bestehend aus FAM als Fluorophor und Methylrot als Quencher offenbart (Absätze 89 und 139). Beispiele für Molecular Beacons mit einem Seltene-Erde-Farbstoff werden hingegen nicht offenbart.
Der vorliegenden Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes System zum Nachweis von Ereignissen in einer Probenumgebung zur Verfügung zu stellen, wobei der Nachweis des Ereignisses insbesondere dem Nachweis der Gegenwart eines Zielmoleküls dient. Das Zielmolekül kann beispielsweise ein Oligonukleotid oder auch ein Peptid oder Protein (Enzym) sein. Damit soll insbesondere eine Sonde zum Nachweis von Nukleinsäuren, sowie ein entsprechendes Auswertesystem unter Verwendung dieses Systems bereitgestellt werden, mit dem vor allem das Problem der ungewollten Hintergrundstrahlung bei UV-Anregung reduziert wird. Des weiteren soll eine Vorrichtung zur Durchführung einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe beruht im Kern darin, eine Sonde mit zwei ein FRET-Paar bildenden Fluorophoren einzusetzen, wobei das Paar so gewählt ist, daß der Donor des FRET-Paares bei Anregung im Falle des Eintritts des Ereignisses ein Meßsignal emittiert, das eine gegenüber der Floureszenz-Emission der Probenumgebung verlängerte Lebensdauer aufweist. Durch die zeitliche Differenz der Lebensdauern des Meßsignals und der Hintergrundstrahlung wird eine Diskriminierung der Emissionen durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung möglich.
Sofern es sich um eine Sonde für den Nukleinsäurenachweis handelt, stellt das "Ereignis" beispielsweise die Hybridisierung der Sonde mit dem Zieloligonukleotid dar. Umfaßt die erfindungsgemäße Sonde jedoch einen Oligo- oder Polypeptidanteil, kann das Ereignis beispielsweise auch die Spaltung oder aber die Bindung des Peptids an einen Liganden sein. Das "Ereignis" kann somit generell jede Aktivität darstellen, die zu einer Veränderung der räumlichen Anordnung der FRET-Paare zueinander führt, die eine diskriminierende Erfassung des Donor-Signals in der zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung ermöglicht.
Die Diskriminierung zwischen der Fluoreszenz des gewünschten Meßsignals und der unspezifischen Hintergrundstrahlung wird erfindungsgemäß daher erst möglich durch einen Fluorophor, der sein Signal in zeitlicher Hinsicht um mindestens den Faktor 10 länger abgibt als die Fluoreszenz-Emission der Probenumgebung. Damit wird das in den derzeit bekannten Verfahren störende "Hintergrundrauschen" durch unspezifische Autofluoreszenz bei Verwendung von bekannten MBs verhindert bzw. erheblich reduziert. Klingt z. B. die Autofluoreszenz – d. h. die Störfluoreszenz der Probenumgebung – bereits nach 200 ns nach Beendigung der UV-Anregung in Form eines Pulses ab und emittiert der erfindungsgemäße molecular beacon bei Hybridisierung an seine Targetsequenz insgesamt über einen Zeitraum von 0,5 ms bis 2 ms sein Meßsignal, so kann das nach dem Ablauf von 200 ns nach Beendigung des UV-Pulses erfaßbare Fluoreszenzsignal ausschließlich der Emission der erfindungsgemäßen Sonden zugeordnet werden. Eine schematische Darstellung der Erfassung der Autofluoreszenz sowie der SEF-Fluoreszenz mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung zeigt 1.
Die Applikation der dafür erforderlichen gepulsten UV-Anregung sowie die Vorrichtung und die Verfahren zur zeitaufgelösten Fluoreszenzmessung entsprechen dabei den im Stand der Technik bekannten Verfahren. Diese sind beispielsweise aus der deutschen Patentanmeldung 196 34 873 A1 bekannt (siehe auch R. Müller, C. Sander, M. Sauer, M. Deimel, D.S. Ko, S. Siebert, J. Arden-Jacob, G. Deltau, N.J. Marx, K.H. Drexhage, J. Wolfrum: Time-resolved identification of single molecules in solution with a pulsed semiconductor diode laser, Chem. Phys. Lett. 262, 716–722 (1996). Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Sonden besteht in der Möglichkeit, eine sehr viel höhere Anregungsenergie zu applizieren, ohne daß damit die Störung durch eine anderenfalls ebenso erfaßte Autofloureszenz der Probenumgebung zunähme. Diese erfindungsgemäß verwendete Anregungsenergie (UV-Diode) kann beispielsweise 300 % über der üblicherweise verwendeten Anregungsenergie liegen. Die hohe Quantenausbeute und das extrem schmalbandige Emissionsspektrum der verwendeten Sonden führen zu einer hohen Emissionsintensität in einem engen Frequenzbereich, während die UV-Diode die Sonde optimal anregen kann. Damit erhöht sich auch das spezifische Meßsignal (Ausgangssignal) der Fluorophor-Emission deutlich gegenüber konventionellen Fluorophoren. Des weiteren geht damit vorteilhafterweise die Erniedrigung der Nachweisgrenze des Detektionssystems einher.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Seltene-Erden-Farbstoffe (nachfolgend auch SEF) als Fluorophore für den erfindungsgemäßen molecular beacon eingesetzt. Dabei handelt es sich um Farbstoffe, die unter anderem Lanthanide wie Europium oder Terbium enthalten. SEF weisen in der Regel Fluoreszenzlebensdauern von etwa 0,5 bis 2,5 ms nach einem Anregungsimpuls auf (Hemmilä, I. (1990) Applications of fluorescence in Immunoassays, Wiley-Interscience). Dagegen sind organische Farbstoffe meist durch Fluoreszenzlebensdauern von nur wenigen ns bis zu μs gekennzeichnet. So emittiert der Farbstoff Cy5 nur bis zu etwa 1 ns nach der Anregung ein Fluoreszenzsignal (Quelle: Amersham Bioscience).
Die Seltenerd-Komponente kann bevorzugt ein Diketonato-Komplex sein, der koordiniert mit einem Chelatbildner ist.
Als Diketonat können Euttaphen oder substituierte Derivate, als Chelatbildner können Phenanthrolin oder Bipyridin und ihre substituierten Abkömmlinge verwandt werden. Als Substituenten sind solche funktionellen Gruppen geeignet, die zur einer Kopplung (mit dem Linker) befähigt sind. Zu nennen sind insbesondere Amin-, Carboxylat-, Isocyanat-, Thioisocaynat-, Epoxy-, Thiol- oder Hydroxy-Substituenten.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Sonden Euttaphen (1-thenyl-,4,4,4-trifluor-1,3-butane-,1,3-dionato)(1,10-phenanthrolinato) Eu (+III)) als SEF auf (2). Dieser Farbkomplex ist gekennzeichnet durch eine Fluoreszenz-Emission noch bis etwa 1 ms nach seiner Anregung. Das Lumineszenzspektrum von Euttaphen zeigt 3.
Zur Bildung eines erfindungsgemäßen MB kann beispielsweise Euttaphen als Donor mit Cy5 als Akzeptor-Chromophor zu einem FRET-Pärchen kombiniert werden.
Die Auswahl von Chromophoren als geeignete FRET-Partner kann mittels der Untersuchung der Fluoreszenz-Emission eines möglichen Donors in Gegenwart eines möglichen Akzeptors erfolgen, wobei die Konzentration des Akzeptors variiert wird. Das Absorptionsspektrum muß dabei mit dem Emissionsspektrum des Donors deutlich überlappen. Die für einen Quenching-Effekt erforderliche Wechselwirkung (insbesondere der räumlichen Nähe) zwischen Donor und Akzeptor wird z. B. durch Konzentration der potentiellen FRET-Partner eingestellt. Die räumliche Nähe kann ggf. auch dadurch erzielt werden, daß ein Partner chemisch an ein Linker- oder Spacer-Molekül gebunden ist, welches bei Zusatz des zweiten Partners diesen zusätzlich anzubinden vermag. Nimmt die Emission des Donors bei steigender Konzentration des Akzeptors ab, ist dies ein deutliches Zeichen für die Quenchingaktivität des Akzeptors und damit für die Kompatibilität der verwendeten Farbstoffe als FRET-Paar. Beispielhaft für dieses Vorgehen ist die Darstellung der Abnahme der Fluoreszenz-Emission von Euttaphen in Abhängigkeit von der Konzentration von Cy5 in 4.
Nach der Wahl geeigneter FRET-Paare werden diese zur Bildung der erfindungsgemäßen Sonden miteinander verbunden. Diese kann beispielsweise mittels des Protokolls von Min Li und Paul R. Sevin (Amine-Reactive Forms of a Luminescent Diethylenetriaminepentaacteic Acid Chelate of Terbium an Europium: Attachment to DNA and Energy Transfer Measurements. Bioconjugate Chem. 1997, 8, 127–132) erfolgen. Dazu wird beispielsweise das Euttaphen-NH₂ verwendet und zunächst durch die Behandlung mit CSCl₂ an seinem NH₂ isothiocynatisiert. Anschließend erfolgt an dem Thiocynat-Rest eine Kopplung an einen aminomodifizierten Linker, beispielsweise ein aminomodifiziertes Oligonukleotid. Für die Kopplung des Linkers kann ebenso auf das Protokoll von Li und Sevin zurückgegriffen werden. Der Linker trägt ebenso einen Chromophor, beispielsweise Cy5. Die Kopplung des Farbstoffs an den Linker ist über bekannte Standardmethoden möglich.
Wie bereits ausgeführt, ermöglichen die erfindungsgemäßen Sonden die Diskriminierung zwischen Sondensignal und unspezifischer Hintergrund strahlung über die zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung. Gleichzeitig zeigen die erfindungsgemäß an die MB gekoppelten Farbstoffe ein Emissionsspektrum mit scharfen Emissionsbanden.
Die beiden Faktoren – nämlich die scharfen Emissionsbanden der Farbstoffe und die weitgehende Ausschaltung der unspezifischen Autofluoreszenz selbst bei Erhöhung der Anregungsenergie – ermöglichen den Verzicht auf aufwendige Laser- und Auswertesysteme (z.B. ICCD (Intensified Coupled Charge Device)), die in dem Stand der Technik zur Optimierung der Meßsignale vor dem Hintergrund störender Autofloureszenz entwickelt wurden. Diese befinden sich in den handelsüblichen real-time PCR Thermocyclern in der Peripherie der Geräte – d.h. außerhalb des eigentlichen Thermoblocks – und kommunizieren mit den Proben über Lichtleitsysteme, in denen ggf. Filter oder Verstärker untergebracht sind.
Solche konstruktiv aufwendigen Systeme zur UV-Anregung können erfindungsgemäß nunmehr durch eine handelsübliche UV-Leuchtdiode zur Anregung der Fluorophore und eine handelsübliche Photodiode zur Erfassung des Meßsignals ersetzt werden. Vorteilhafterweise wird damit die Konstruktion einer auf die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angepaßte Vorrichtung erheblich vereinfacht und kostengünstiger.
In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die handelsüblichen Dioden unmittelbar in den Thermoblock eines Thermocyclers für eine real-time-PCR integriert. Die Integration der Dioden unmittelbar in den Thermoblock ermöglicht eine kompakte Bauweise des Thermocyclers, so daß dieser vorzugsweise auch tragbar oder mobil konstruiert sein kann.
Die erfindungsgemäßen Sonden erlauben demnach u.a. die spezifische und aussagekräftige real-time Detektion der Amplifikation von Zielnukleinsäuren mit einer niedrigen Nachweisgrenze, insbesondere die real-time-PCR in einem kompakt und einfach gestalteten Thermocycler. Die gegen über z.B. einem Photomultiplier möglicherweise verringerte Empfindlichkeit einer Photodiode wird durch das intensive sowie zeitaufgelöste Signal der erfindungsgemäßen Sonden ausgeglichen. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Sonden jedoch auch in isothermalen Amplikationsverfahren wie die Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) einsetzbar. Auch können die erfindungsgemäßen Sonden in der Array-Technologie Verwendung finden. Dies ist bereits für die klassischen molecular beacons bekannt (Liu X. et al. (2000)). Damit eröffnet sich für die erfindungsgemäßen Sonden das breite Anwendungsfeld der gesamten medizinischen, molekularbiologischen oder biochemischen Analytik und Diagnostik.
Darüber hinaus kann das System der Seltene-Erde-Farbstoffe als Fluorophor und einem dazu angepaßten Quencher – also das FRET-Pärchen – auch in einer Bindung an Oligopeptide oder Proteine erfolgreich eingesetzt werden. Der Einsatz des erfindungsgemäß verwendeten FRET-Pärchens ist somit nicht auf die Kopplung an Nukleinsäuren beschränkt. So ist es ebenso möglich, daß es zunächst in definierter Nachbarschaft zueinander gebunden an einem Protein vorliegt und im Falle einer Spaltung des Proteins oder auch aufgrund einer Konformationsänderung im Falle der Bindung an einen Liganden in räumlicher Distanz zueinander liegt, so daß die Fluoreszenz-Emission des Donor-Fluorophors nachweisbar wird. Damit sind diese hier vorgeschlagenen FRET-Pärchen auch in der Protein- oder Peptid-Analytik vorteilhaft einsetzbar.
Zur Bildung eines Protein-FRET-Komplexes kann beispielsweise über das Protokoll von Li and Selvin erfolgen (Min Li and Paul R. Selvin: Amine-Reactive Forms of a Luminescent Diethylenetriaminepentaacetic Acid Chelate of Terbium and Europium: Attachment to DNA and Energy Transfer measurements, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 127–132). Dazu wird Euttaphen-NH₂ wiederum in seine Isothiocyanat-Form überführt. Dieser Schritt kann analog zur Kopplung an DNA erfolgen.
In einem zweiten Schritt wird die Isothiocyanat-Form von Euttaphen mit einem Protein/Peptid gekoppelt, welches mit Cy5 markiert ist. Dies kann nach Takalo et al. erfolgen (Harri Takalo, Veli-Matti Mukkala, Heikki Mikola, Päivi Liitti, and Ilkka Hemmilä: Synthesis of Europium (III) Chelates suitable for Labelling of Bioactive Molecules, Bioconjugate Chem., 1994, 5, 278–282, siehe Synthesis of Chelates.pdf). Dazu wird das Protein/Peptid in Gegenwart der Isothiocyanat-Form von Euttaphen in Carbonat-Puffer (pH 9,3) bei Raumtemperatur für 16 h inkubiert. Die Aufreinigung ist anschließend über Gelchromatographie möglich.
Alternativ kann die Kopplung von Euttaphen-NH₂ über Derivate von DTA (4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-ylamin) nach einem Protokoll von Karsilayan et al. (Huriye Karsilayan, Ilkka Hemmilä, Harri Takalo, Airi Toivonen, Kim Petterson, Timo Lövgren, and Veli-Matti Mukkala: Influence of coupling Method an the Luminescence Properties, coupling Efficiency, and binding Affinity of Antibodies labelled with Europium(III) Chelates, Bioconjugate Chem., 1997, 8, 71–75, siehe Influence of Coupling Method an the Luminescence Properties.pdf) geschehen. Für eine spätere industrielle Herstellung mittels Syntheseautomaten ließe sich das Euttaphen-NH₂ auch nach einem Protokoll von Peuralahti et al. (Jari Peuralahti, Harri Hakal, Veli-Matti Mukkala, Kristiina Loman, Pertti Hurskainen, Outi Mulari, and Jari Hovinen: Introduction of Lanthanide(III) Chelates to Oligopeptides an Solid Phase, Bioconjugate Chem, 2002, 13, 870–875, siehe Introduction of Lanthanide(III) Chelates to Oligopeptides an Solid.pdf) an Peptide anbinden.
In einem weiteren alternativen Verfahren kann ein Oligopeptid zunächst mit einem Isocyanat bestückt werden. In einem zweiten Schritt erfolgt die Kondensation mit einem Amin-Liganden und dann erst die Komplexbildung mit Euttaphen. Auch hier kann das Oligopeptid zuvor mit einem Farbstoff gekoppelt werden. Dieses Vorgehen ist schematisch gezeigt in 5.
Ausführungsbeispiel:
Die Sonden, das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung lassen sich bevorzugt zum Nachweis pathogener Keime in Lebensmitteln sowie ihrer Quantifizierung in der Ausgangsprobe einsetzen.
Zur Bestimmung von Pathogenen in Proben wie beispielsweise Lebensmitteln sind vielfältige Verfahren bekannt, die überwiegend auf der Bestimmung der Keimzahl bzw. die Erfassung der vermehrungsfähigen Keime oder auf immunologischen oder biochemischen Nachweisreaktionen beruhen. Insbesondere die Keimzahlbestimmung impliziert eine vorherige Anreicherung der Pathogene, die einerseits zu einer langen Dauer (bis zu 72 Stunden) des Nachweises führt und das Verfahren aufgrund der Gefahr der Vermehrung auch potentiell pathogener Mikroorganismen nach dem Infektionsschutzgesetz anzeige- und genehmigungspflichtig macht.
Mit den erfindungsgemäßen Sonden kann dazu eine einfache, kostengünstige und auch von wenig geschultem Personal durchführbare Alternative zum Nachweis und zur Quantifizierung pathogener Keime bereitgestellt werden.
Dieses komplexe Nachweisverfahren umfaßt folgende Schritte, die nachfolgend im einzelnen beschrieben werden:

1. Isolierung der Pathogene aus der Lebensmittelprobe
1a. ggf. Lyseschritt
2. Amplifikation der Zielnukleinsäuren durch eine real-time-PCR mit verzögerter Fluoreszenzmessung als Marker für die Pathogene
3. Quantifizierung der Pathogen-Konzentration in der Ausgangsprobe über eine Standardkurve mit Kalibrierfaktoren.

zu 1. Isolierung der Pathogene (Beispiel Salmonella)
Die Keime werden vorzugsweise durch immunologische Verfahren aus der Probenumgebung spezifisch isoliert. Dabei wird bevorzugt auf die mit Antikörpern gegen spezifische Oberflächenmoleküle der nachzuweisenden Mikroorganismen beschichtete paramagnetische Partikel zurückgegriffen. Zum Nachweis von Salmonella kann dazu auf die sogenannten "Dynabeads anti-Salmonella" (Prod. No. 710.02) von der Fa. Dyna Biotech zurückgegriffen werden.
In einem konkreten Ausführungsbeispiel werden 25 g Lebensmittel mit 225 ml PBS Puffer suspendiert. Der Suspension werden Immunomagnetische Partikel hinzugegeben. Die Partikel tragen Antikörper gegen Oberflächenmoleküle der nachzuweisenden Keime. Die Inkubation erfolgt für 30 Minuten unter Rühren. Nachfolgend werden die magnetischen Partikel über einen Magneten entfernt. Das Pellet wird einmal mit 20 ml PBS-Puffer oder TEST Puffer (10 mmol/l Tris [pH 8], 150 mmol/l NaCl, 0,05 % TWEEN 20) gewaschen.
zu 1a. Lyse der isolierten Mikroorganismen
Für Mikroorganismen, die nicht durch den ersten Schritt der PCR lysiert werden, erfolgt ein Lyseschritt mit einem Lysepuffer mit Proteinase K (z. B. 50 mmol/l Tris-HCl (pH 8,5) 1 mmol/l EDTA, 0,1 % SDS und 1 mg/ml Proteinase K). Die Lyse erfolgt für eine Stunde bei 55°C, wobei permanent geschüttelt/gerührt wird. Danach wird die DNA über eine Affinitätschomatographiesäule (z. B. QI Aamp DNA Mini Kit von Qiagen) gebunden und eluiert. Ein Aliquot (< 50 μl) wird für die PCR verwendet.
zu 2. Amplifikation der Target-Nukleinsäuren
Die paramagnetischen Partikel einschließlich der gebundenen Mikroorganismen – oder ggf. ein Aliquot aus der Lyse – werden in ein PCR-Gefäß überführt, das mit den für die PCR erforderlichen Komponenten bestückt ist.
Die PCR für Salmonella entspricht dem Protokoll von W. Chen, G. Martinez, A. Mulchandani (2000): Molecular Beacon: A real time Polymerase Chain Reaction Assay for Detecting Salmonella, Analytical Biochemistry, 280, 166–172. Dabei werden allerdings die erfindungsgemäßen Sonden verwendet.
Die PCR für Legionella pneumophila wird nach dem Protokoll von N. Wellinghausen, C. Frost, R. Marre (2001): Detection of Legionellae in Hospital Water Samples by Quantitative real time Lightcycler PCR. Appl. Environ. Microbiol. 67, 3985–3993 durchgeführt.
Zuvor wurde über eine serielle Verbindung eine Kalibrierfunktion (Standardfunktion) für den Keim sowie für den Referenzkeim unter genau diesen konkreten PCR Bedingungen durchgeführt. Das Prinzip der Aufstellung einer Kalibrierfunktion und der nachfolgenden Quantifizierung der Pathogene in der Ausgangsprobe entspricht dabei dem dem Durchschnittsfachmann bekannten Verfahren, das beispielsweise von Fortin N Y, Mulchandani A. und Chen W. beschrieben wird ("Use of real-time Polymerase Chain Reaction and Molecular Beacons for the Detection of Escherichia coli O157:H7 (2001) in: Analytical Biochemistry 289, 281 bis 288).
In dem PCR-Verfahren werden erfindungsgemäße Sonden eingesetzt, die folgende Struktur aufweisen:
5' SEF-CGCTATACTGACACTGAGCGACGAAAGCGTAGCG_Cy5 3'
Als SEF wurde Euttaphen eingesetzt. Als Linker diente ein C6 Aminolinker mit der in 6 gezeigten Struktur.
Thermocycler mit Thermoblock
Der Thermocycler 1 (7) weist einen Patterngenerator 2 mit einem Ausgang 3 auf, zur Triggerung und Synchronisation der Pulssignale. Für den Generator kann je nach Bedarf und Ausbaustufe ein programmierbarer Timerstein, ein handelsübliches Microcontroller-Board oder ein PC mit I/O-Karte inklusive entsprechender Zusatzfunktion verwendet werden. Daneben ist ein über das Triggersignal getaktetes Ansteuermodul 4 für die UV-Diode sowie ein synchronisierter Leseverstärker mit Sample/Hold-Schaltung 5 für die Photodiode vorgesehen. Das analoge getaktete Ausgangssignal 6 kann für die weitere Auswertung mit handelsüblichen Analog/Digital-Konvertern digital gespeichert und weiterverarbeitet werden.
Der Thermoblock 8 (siehe 8) kann aus einem quaderförmigen Aluminium-Heizblock zur Aufnahme des Probengefäßes und der Sensorbauelemente für die real-time-Detektion bestehen. Dazu umfaßt er Peltier-Elemente 9 mit Kühlern 10 und Lüftern 11. Eine UV-LED-Diode 12 ist unterhalb des Probengefäßes 13 in einer Bohrung 14 untergebracht. Seitlich neben dem Probengefäß ist eine handelsübliche Photodiode 15 angeordnet.

Claims

Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Mikroorganismen in einer Probe oder einer Lebensmittelprobe, aufweisend folgende Verfahrensschritte: – Isolierung der Mikroorganismen aus der Probe, – Überführung der isolierten Mikroorganismen in ein PCR-Gefäß, – Amplifikation der Zielnukleinsäure durch eine real-time PCR als Marker für die Mikroorganismen, – Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure mittels einer Sonde mit mindestens zwei Fluorophoren, die ein FRET-Paar bilden, wobei die Fluorophoren so gewählt sind, daß erst nach der Hybridisierung der Sonde mit dem Zielnukleotid ein erkennbares Signal von dem Fluorophor emittiert wird, dass eine gegenüber der Fluoreszenzemission der Probenumgebung verlängerte Lebensdauer aufweist, so dass das Meßsignal durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung von der Autofluoreszenz der Probenumgebung differenzierbar ist, – Erfassen der Fluoreszenzemission mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung, – Quantifizierung der Pathogen-Konzentration in der Ausgangsprobe über eine Standardkurve mit Kalibrierfaktoren.
Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Anreicherung der Mikroorganismen über einen mit Mikroorganismen spezifischen Liganden beschichteten Träger.
Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch den Einsatz eines mit Antikörpern beschichteten Mikropartikels zur Anreicherung der Mikroorganismen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Nachgang zur Isolierung der Pathogene ein Lyseschritt erfolgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde eingesetzt wird, bei der die Differenz zwischen der Lebensdauers des Signals und derjenigen der Probenumgebung mindestens Faktor 10 beträgt.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Sonde als Fluorophor einen Seltene-Erde-Farbstoff umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Seltene-Erde-Farbstoff einen Diketonat-Komplex oder Derivate davon umfaßt, der mit einem Chelatbinder oder Derivaten davon koordiniert.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelatbinder ausgewählt ist aus der Gruppe der Phenanthrolin oder Bipyridin sowie deren Derivaten.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate Substituenten mit folgenden funktionellen Gruppen aufweisen: Amin-, Carboxylat-, Isocyanat-, Thioisocaynat-, Epoxy-, Thiol- oder Hydroxy-Gruppen.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das FRET-Paar von Euttaphen und Cy5 gebildet wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Sonde zur Detektion des Zieloligonukleotids in der Probenumgebung ein Oligonukleotid eingesetzt wird, das eine zu dem Zieloligonukleotid komplementäre Detektionssequenz und zwei die Probensequenz am 3'- und 5'-Ende flankierende, zueinander komplementäre Oligonukleotidsequenzabschnitte umfasst, die entweder mit einem Quencher oder einem Fluorophor zur Bildung eines gemeinsamen FRET-Paars verbunden sind, wobei das FRET-Paar so gewählt ist, daß im Falle der Hybridisierung der Detektionssequenz mit der Zielsequenz ein Signal von dem Fluorophor emittiert wird, das durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung von der Autofluoreszenz der Probenumgebung differenzierbar ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass eine Vorrichtung zur Durchführung einer real-time PCR mit einem Heizblock, Mitteln zum Kühlen, Mitteln zum Heizen, Mitteln zum Anregen von PCR-Reportern sowie Mitteln zum Erfassen der von den PCR-Reportern ausgesendeten Meßsignale eingesetzt wird, wobei als Mittel zum Anregen der Reporter eine UV-LED und als Mittel zum Erfassen der Meßsignale eine Photodiode eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die UV-LED und die Photodiode in den Heizblock integriert sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch eine NASBA.
Oligonukleotid als Sonde zur Detektion eines Zieloligonukleotids in einer Probenumgebung, umfassend eine zu dem Zieloligonukleotid komplementäre Detektionssequenz und zwei die Probensequenz am 3'- und 5'-Ende flankierende, zueinander komplementäre Oligonukleotidsequenzabschnitte, die entweder mit einem Quencher oder einem Fluorophor zur Bildung eines gemeinsamen FRET-Paars verbunden sind, wobei das FRET-Paar von Euttaphen und Cy5 gebildet wird, so daß im Falle der Hybridisierung der Detektionssequenz mit der Zielsequenz ein Signal von dem Fluorophor emittiert wird, das durch eine zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung von der Autofluoreszenz der Probenumgebung differenzierbar ist.
Verwendung eines Oligonukleotids gemäß Anspruch 15 in einem Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14.