DE10258258A1 - Isolating nucleic acids from liquid samples, for isolating viral nucleic acid from donated blood, by retention on an inorganic oxide carrier, comprises treatment with protease to improve sensitivity and efficiency - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung bzw. Isolierung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen flüssigen Proben unter Einsatz anorganischer oxidischer Trägermaterialien in Kombination mit geeigneten Puffersystemen zur sauren Bindung und basischen Elution der Nukleinsäuren. Die Effektivität der Aufreinigung konnte gegenüber bekannten Verfahren durch Zugabe einer Proteinase zum Waschpuffer erheblich gesteigert werden.The invention relates to a method for the purification or isolation of nucleic acids, in particular from large-volume ones liquid Samples using inorganic oxidic carrier materials in combination with suitable buffer systems for acid binding and basic elution of nucleic acids. The effectiveness the purification could face known method by adding a proteinase to the washing buffer be significantly increased.
Die Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren aus komplexen biologischen Startmaterialien, wie Körperflüssigkeiten, ist von großer Bedeutung z.B. zum Nachweis viraler Erkrankungen.The isolation and purification of nucleic acids from complex biological starting materials, such as body fluids, is great Meaning e.g. for the detection of viral diseases.
Klassische Methoden für die Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Startmaterialen wie Blut oder Plasma beginnen mit der Lyse des biologischen Materials mittels eines Detergenz und/oder eines chaotropen Salzes. Diese Substanzen ermöglichen die Inaktivierung und Denaturierung von Proteinen und Enzymen. Nachfolgend werden mittels organischer Lösungsmittel wie z.B. Phenol und/oder Chloroform, Ethanolfällung und Zentrifugationsschritten die Nukleinsäuren gereinigt. Diese Methoden sind nicht nur sehr arbeitsintensiv und zeitaufwendig, sondern auch schwer zu automatisieren.Classic methods of isolation of nucleic acids from complex starting materials such as blood or plasma start with the lysis of the biological material by means of a detergent and / or of a chaotropic salt. These substances enable inactivation and Denaturation of proteins and enzymes. Below are means organic solvent such as. Phenol and / or chloroform, ethanol precipitation and centrifugation steps the nucleic acids cleaned. These methods are not only very labor intensive and time consuming but also difficult to automate.
Modernere Methoden basieren auf dem
Gebrauch von Festphasen bzw. Trägermaterialien.
In
Es besteht jedoch noch immer der Bedarf, Nukleinsäuren nicht nur schnell und einfach sondern auch quantitativ insbesondere aus großen Probenvolumina zu isolieren. Besonders effektive Verfahren werden vor allem dann benötigt, wenn die Probe biologischen Ursprungs ist und nur sehr wenige der nachzuweisenden Nukleinsäuren enthält. Ein Beispiel hierfür ist der Nachweis von viralen Nukleinsäuren in Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Blut.However, it still exists Need, nucleic acids not only quickly and easily but also quantitatively in particular from great Isolate sample volumes. Particularly effective procedures especially needed if the sample is of biological origin and very few of those to be detected nucleic acids contains. An example of this is the detection of viral nucleic acids in body fluids, such as plasma or Blood.
Für den Nachweis der isolierten viralen Nukleinsäuren werden z.B. bekannte Nukleinsäureamplifikationstechniken, wie z.B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR), branched-DNA Detection (bDNA) oder Nucleic Acid Sequence based Amplification (NASBA) verwendet.For the detection of the isolated viral nucleic acids is e.g. known nucleic acid amplification techniques, such as. Polymerase chain reaction (PCR), branched-DNA detection (bDNA) or nucleic acid sequence based amplification (NASBA) is used.
Voraussetzung für einen erfolgreichen und sensitiven Nachweis vitaler Partikel in Körperflüssigkeiten, wie z.B. Hepatitis B- oder C-Virus, (HBV, HCV) oder Humanes Immundefizienz Virus (HIV), über die genannten Nukleinsäureamplifikationstechniken ist die effiziente, quantitative Isolierung der viralen Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in möglichst reiner und nativer Form. Die Nachweisgrenze der kommerziell erhältlichen Testsysteme liegt bei etwa 100 bis 400 Nukleinsäure-Kopien pro ml Plasma. Die meisten Testsysteme sind zudem nur für einen Virustyp und auf den Einsatz von relativ kleinen Probenvolumina ausgerichtet (100-500μl Plasma).Prerequisite for a successful and sensitive Detection of vital particles in body fluids, such as. Hepatitis B or C virus, (HBV, HCV) or human immunodeficiency Virus (HIV), about the nucleic acid amplification techniques mentioned is the efficient, quantitative isolation of viral nucleic acids (DNA or RNA) in as pure as possible and native form. The detection limit of the commercially available Test systems are around 100 to 400 copies of nucleic acid per ml of plasma. Most Test systems are also only for a virus type and the use of relatively small sample volumes aligned (100-500μl Plasma).
Daraus ergibt sich z.B. für zwei wichtige Anwendungsfelder noch immer ein Problem aufgrund der zu geringen Empfindlichkeit der Nachweissysteme:
- 1.) Blutbanken, die durch hohe Probenaufkommen und Kostendruck bedingt sogenannte Mini-Pools bilden (aus bis zu 100 individuellen Spenderproben), müssen die potentiell aus einem einzelnen Serum herrührenden Viren im Pool erfassen können.
- 2.) Die Therapie von HCV und AIDS-Kranken erfordert das hochsensitive Monitoring der Viruskonzentration im Blut, da diese Viren in sehr geringer Kopienzahl (< 10 Kopien/ml) trotz Therapie persistieren können und deren Nachweis für die Therapiefortsetzung entscheidend ist.
- 1.) Blood banks, which form so-called mini-pools due to high sample volume and cost pressure (from up to 100 individual donor samples), must be able to record the viruses that potentially come from a single serum in the pool.
- 2.) The therapy of HCV and AIDS patients requires the highly sensitive monitoring of the virus concentration in the blood, since these viruses can persist in very small number of copies (<10 copies / ml) despite therapy and their detection is crucial for the continuation of therapy.
Versuche, das Probenvolumen zu erhöhen, schlagen zumeist aufgrund der begrenzten Bindungskapazität und/oder der Bindungsspezifität der eingesetzten Festphasen fehl.Attempts to increase sample volume fail mostly due to the limited binding capacity and / or the binding specificity of the used Solid phases fail.
Als Alternative werden gegenwärtig Vorkonzentrierungsverfahren benutzt, um eine hohe Sensitivität zu erlangen. Zellen oder Viren aus einer Probe werden über Filtration, Ultrahochzentrifugation oder über Affinitätsbindung an einen Antikörper-Festphasen-Komplex aus der Probe angereichert. Nach diesem Konzentrierungsschritt wird die DNA oder RNA extrahiert und in geeigneter Weise für die Nachweisreaktion aufgereinigt. Diese bekannten Konzentrierungsverfahren sind nicht nur arbeitsaufwendig und kostspielig sondern auch nicht automatisiert und zudem mit der potentiellen Gefahr von Verlusten, Kreuzkontaminationen und Probenverwechslungen behaftet.Pre-concentration processes are currently being used as an alternative used to high sensitivity to get. Cells or viruses from a sample are filtered, Ultra high centrifugation or over affinity binding to an antibody solid phase complex enriched from the sample. After this concentration step the DNA or RNA extracted and suitable for the detection reaction purified. These known concentration processes are not only labor-intensive and costly but also not automated and also with the potential risk of loss, cross-contamination and sample mix-ups.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren insbesondere aus großvolumigen biologischen Proben zur Verfügung zu stellen, das kein Vorkonzentrierungsverfahren benötigt und die bislang bekannten Methoden insbesondere in der Empfindlichkeit und Effektivität der Isolierung übertrifft.Object of the present invention it was therefore a method of purifying nucleic acids in particular from large volume biological samples available that does not require a pre-concentration process and the previously known methods especially in sensitivity and effectiveness insulation.
Es wurde gefunden, dass das aus WO 99/40098 bekannte Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren durch Bindung an feste Trägermaterialien unter sauren Pufferbedingungen erheblich verbessert werden kann, indem dem Waschpuffer eine Proteinase zugesetzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben.It was found that from WO 99/40098 known methods for isolating nucleic acids by binding to solid support materials can be significantly improved under acidic buffer conditions, by adding a proteinase to the wash buffer. The method according to the invention is particularly suitable for isolating nucleic acids from large volume Rehearse.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus flüssigen Proben gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:
- a) Bereitstellen einer flüssigen Probe, die Nukleinsäuren enthält;
- b) Bereitstellen eines Trägermaterials aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material;
- c) Vermischen der Probe aus Schritt a) mit einem Bindepuffer, so dass der pH-Wert des Gemisches unter 7 liegt;
- d) Behandeln der mittels eines Bindungspuffers angesäuerten Probe aus Schritt c) mit dem Trägermaterial aus Schritt b), wobei die Nukleinsäuren an das Trägermaterial gebunden werden;
- e) Abtrennen des Trägermaterials mit den gebundenen Nukleinsäuren von dem Rest der Probe und dem Bindungspuffer;
- f) Waschen des Trägermaterials mit einem Waschpuffer der zumindest eine Komponente enthält, die Proteine abbaut;
- g) Elution der in Schritt d) gebundenen Nukleinsäuren von dem Trägermaterial mit einem alkalischen Elutionspufter.
- a) Providing a liquid sample, the nucleus contains acids;
- b) providing a carrier material made of an inorganic hydroxyl-containing oxidic material;
- c) mixing the sample from step a) with a binding buffer so that the pH of the mixture is below 7;
- d) treating the sample from step c) acidified by means of a binding buffer with the carrier material from step b), the nucleic acids being bound to the carrier material;
- e) separating the carrier material with the bound nucleic acids from the rest of the sample and the binding buffer;
- f) washing the carrier material with a washing buffer which contains at least one component which degrades proteins;
- g) Elution of the nucleic acids bound in step d) from the carrier material with an alkaline elution buffer.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe aus zellfreier Körperflüssigkeit.In a preferred embodiment the liquid sample provided in step a) consists of cell-free Body fluid.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie ein nicht-ionisches Detergenz.In a preferred embodiment contains the binding buffer additionally at least one lysing component, such as a non-ionic detergent.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens ein Sulfatsalz, wie z.B. Ammoniumsulfat, Kobaltsulfat oder Zinksulfat.In a preferred embodiment contains the binding buffer additionally at least one sulfate salt, e.g. Ammonium sulfate, cobalt sulfate or zinc sulfate.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die in Schritt a) bereitgestellte flüssige Probe ein Volumen von über 2 ml.In a further preferred embodiment the liquid sample provided in step a) has a volume of more than 2 ml.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die in Schritt a) bereitgestellte Probe aus einer Mischung von mindestens 10 Einzelproben. Typischerweise werden dazu Aliquots aus jeder Einzelprobe entnommen und diese gemischt. Genauso können die Einzelproben vollständig gemischt werden und aus diesem Gemisch die in Schritt a) bereitzustellende Probe entnommen werden. Die Vorgehensweise des Mischens mehrerer Einzelproben, d.h. die Bildung von Proben-Pools, ist insbesondere für Anwendungen in Blutbanken vorteilhaft, da sie die Möglichkeit bietet, zumeist automatisch z.B. 10 bis 100 Einzelproben oder Aliquots der Einzelproben vor der Nukleinsäureisolierung zu mischen und auf einmal zu testen.In a further preferred embodiment the sample provided in step a) consists of a mixture of at least 10 incremental samples. Typically, aliquots are used taken from each incremental sample and mixed. They can do the same Incremental samples complete are mixed and from this mixture the one to be provided in step a) Sample can be taken. The procedure of mixing several Incremental samples, i.e. the formation of sample pools is particularly useful for applications advantageous in blood banks because it offers the possibility, usually automatically e.g. 10 to 100 incremental samples or aliquots of incremental samples prior to nucleic acid isolation to mix and test at once.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers in Schritt g) weniger als 1/10 des Volumens der in Schritt a) bereitgestellten Probe.In a preferred embodiment is the volume of the elution buffer in step g) is less than 1/10 of the Volume of the sample provided in step a).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt f) und oder Schritt g) eine oder mehrere Kugeln zur Unterstützung der Resuspension des Trägermaterials zugegeben.In a preferred embodiment in step f) and or step g) one or more balls for support the resuspension of the carrier material added.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zumindest enthaltend ein Trägermaterial aus einem anorganischen hydroxylgruppenhaltigen oxidischen Material, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.Object of the present invention is also a test kit to perform of the method according to the invention at least containing a carrier material from an inorganic hydroxyl group-containing oxidic material, a binding buffer and a washing buffer containing at least one component contains breaks down the proteins.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Isolierung und zum Nachweis von viralen Nukleinsäuren aus Körperflüssigkeiten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dabei so empfindlich, dass Proben eingesetzt werden können, die Viren in einer Kopienzahl von weniger als 200 pro ml Probe, besonders bevorzugt in einer Kopienzahl von weniger als 50 pro ml Probe enthalten.Object of the present invention is also the use of the insulation method according to the invention and for the detection of viral nucleic acids from body fluids. The method according to the invention is so sensitive that samples can be used that Viruses in a copy number less than 200 per ml sample, especially preferably contained in a copy number of less than 50 per ml of sample.
Nähere
Angaben zu den
Flüssige Proben im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z.B. Pufferlösungen und Homogenate oder komplexe biologische Flüssigkeiten, bevorzugt Proben biologischen Ursprungs, insbesondere humane und tierische Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Harn, Feces und Liquor. Besonders bevorzugt sind zellfreie Körperflüssigkeiten, wie Plasma, Serum, Liquor oder Harn.Liquid samples in the sense of the present invention are e.g. buffer solutions and homogenates or complex biological liquids, preferably samples of biological origin, especially human and animal body fluids such as blood, plasma, serum, urine, feces and cerebrospinal fluid. Particularly preferred are cell-free body fluids, such as plasma, serum, cerebrospinal fluid or urine.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut geeignet zur Isolierung von Nukleinsäuren aus großvolumigen Proben, d.h. nicht nur aus Proben zwischen 50 μl und 1 bis 2 ml, sondern insbesondere aus Proben mit einem Volumen von über 2 ml, vor allem aus Proben mit einem Volumen zwischen 2 und 10 ml.The method according to the invention is special well suited for the isolation of nucleic acids from large volume Samples, i.e. not only from samples between 50 μl and 1 to 2 ml, but especially from Samples with a volume of over 2 ml, mainly from samples with a volume between 2 and 10 ml.
Als Festphase bzw. Trägermaterial kann erfindungsgemäß ein Material verwendet werden, das an der Oberfläche Hydroxyl-Gruppen trägt, insbesondere anorganische oxidische Materialien. Geeignete Materialien sind z.B. Silikagel, Silikate, Metalloxide wie Eisenhydroxide, Hydroxylapatit oder Glas. Bevorzugt sind Materialien, die an der Oberfläche Si-OH Gruppen tragen. Die Trägermaterialien können porös oder unporös sein, in Form von z.B. Partikeln, Fasern, Membranen, Filtern oder entsprechend modifizierten Gefässwänden. Partikuläre Materialien werden im allgemeinen bevorzugt, da sie eine größere Bindungskapazität und -kinetik insbesondere in größeren Probenvolumina aufweisen. Besonders bevorzugt werden magnetisierbare Partikel, da deren Abtrennung aus einer Suspension einfach zu automatisieren ist. Eine erfindungsgemäß besonders gut geeignete Festphase sind magnetisierbare Silika-Partikel, wie MagPrep® Silica Partikel (Merck KGaA, Darmstadt).According to the invention, a material which carries hydroxyl groups on the surface, in particular inorganic oxidic materials, can be used as the solid phase or carrier material. Suitable materials are, for example, silica gel, silicates, metal oxides such as iron hydroxides, hydroxyapatite or glass. Materials which have Si-OH groups on the surface are preferred. The carrier materials can be porous or non-porous, in the form of, for example, particles, fibers, membranes, filters or appropriately modified vessel walls. Particulate materials are generally preferred because they have greater binding capacity and kinetics, particularly in larger sample volumes. Magnetizable particles are particularly preferred since their separation from a suspension is easy to automate. A according to the invention particularly suitable solid phase is magnetizable silica particles such as silica particles MagPrep ® (Merck KGaA, Darmstadt).
Als Äquilibrierungspuffer für das Trägermaterial wird vorzugsweise einer der im folgenden genannten Bindepuffer verwendet.As an equilibration buffer for the carrier material one of the binding buffers mentioned below is preferably used.
Komponenten, die Proteine abbauen, sind erfindungsgemäß insbesondere Enzyme wie Proteinasen, besonders bevorzugt Proteinase K.Components that break down proteins are particularly inventive Enzymes such as proteinases, particularly preferably proteinase K.
Nukleinsäuren sind erfindungsgemäß Ribonukleinsäuren (RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNA), wie z.B. genomische DNA oder RNA, insbesondere virale genomische DNA und/oder RNA.According to the invention, nucleic acids are in particular ribonucleic acids (RNA) or deoxyribonucleic acids (DNA), such as genomic DNA or RNA special viral genomic DNA and / or RNA.
Die Bindung der Nukleinsäuren aus der Probe an das Trägermaterial erfolgt durch einfaches Absenken des pH-Wertes auf unter pH 7, bevorzugt unter pH 6. Dazu wird ein Bindepuffer verwendet, der einen pH-Bereich von 1 bis 6, vorzugsweise von 3 bis 5, aufrechterhalten kann. Geeignete Puffer sind z.B. Formiat-, Acetat-, Citratpuffer oder andere Puffersysteme, die in dem genannten pH-Bereich ausreichende Pufferkapazität besitzen.The binding of the nucleic acids the sample to the carrier material is done by simply lowering the pH to below pH 7, preferably below pH 6. A binding buffer is used that has a pH range from 1 to 6, preferably from 3 to 5. suitable Buffers are e.g. Formate, acetate, citrate buffers or other buffer systems, which have sufficient buffer capacity in the pH range mentioned.
Die Pufferkonzentration wird je nach Volumen und Pufferkapazität der zu untersuchenden Probenflüssigkeit ausgewählt. Vorzugsweise wird ein Bindepuffer mit einer Konzentration von 100–200 mM verwendet, der einen pH-Wert zwischen 4 und 5 hat, z.B. ein Puffer aus Essigsäure, der mit Natronlauge, Kalilauge oder mit Tris-Base auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 eingestellt wurde. Dem Bindepuffer können Nukleaseinhibitoren zugesetzt werden; geeignete Nukleaseinhibitoren sind dem Fachmann bekannt.The buffer concentration depends on Volume and buffer capacity the sample liquid to be examined selected. A binding buffer with a concentration of 100-200 mM is preferably used, which has a pH between 4 and 5, e.g. a buffer of acetic acid, the with sodium hydroxide solution, potassium hydroxide solution or with Tris base to a pH value was set between 4 and 5. The binding buffer can be nuclease inhibitors be added; suitable nuclease inhibitors are known to the person skilled in the art known.
Ein Bindepuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung enthält weder ionische Detergenzien noch andere Ionen in hohen Konzentrationen, so dass während der Bindung der Nukleinsäuren an das Trägermaterial keine chaotropen Bedingungen vorliegen. Bevorzugt enthält der Bindepuffer keine ionischen Detergenzien oder chaotropen Substanzen. Sollten dennoch derartige Verbindungen enthalten sein, dann wird die Konzentration der ionischen Detergenzien und chaotropen Substanzen so gewählt, dass das Gemisch aus Probe und Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM enthält. Besonders bevorzugt enthält dazu der Bindepuffer weder ionische Detergenzien noch chaotrope Substanzen in Konzentrationen > 500 mM, bevorzugt > 200 mM.A binding buffer according to the includes the present invention neither ionic detergents nor other ions in high concentrations, so while binding of nucleic acids to the carrier material there are no chaotropic conditions. The binding buffer preferably contains no ionic detergents or chaotropic substances. Should nevertheless such compounds are contained, then the concentration of the ionic detergents and chaotropic substances so chosen that the mixture of sample and binding buffer neither ionic detergents still contains chaotropic substances in concentrations> 500 mM, preferably> 200 mM. It particularly preferably contains the binding buffer neither ionic detergents nor chaotropic substances in concentrations> 500 mM, preferably> 200 mM.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer zusätzlich mindestens eine lysierende Komponente, wie z.B. nicht-ionische Detergezien. Bevorzugt werden als lysierende Komponente Triton®, Tween®, NP 40 oder Mischungen davon eingesetzt.In a preferred embodiment, the binding buffer additionally contains at least one lysing component, such as, for example, nonionic detergents. NP are preferred as the lysing component Triton ®, Tween ®, used 40 or mixtures thereof.
Der Zusatz der lysierenden Komponente ist vor allem von Bedeutung, wenn die Probe zuvor noch keinen lysierenden Bedingungen unterworfen worden ist und daher beispielsweise noch intakte Viren etc. enthalten kann. Um eine quantitative Isolierung der gesamten viralen Nukleinsäuren zu ermöglichen, müssen daher durch Zugabe der lysierenden Komponente die viralen Partikel zunächst zerstört werden. Die benötigte Menge an lysierender Komponente ist dem Fachmann bekannt.The addition of the lysing component is especially important if the sample has not previously been lysed Conditions has been subjected and therefore, for example, still can contain intact viruses etc. For quantitative isolation of the total viral nucleic acids must therefore enable the viral particles are first destroyed by adding the lysing component. The needed The amount of lysing component is known to the person skilled in the art.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Bindepuffer erfindungsgemäß zusätzlich ein oder mehrere Sulfatsalze, wie Kobaltsulfat, Zinksulfat oder bevorzugt Ammoniumsulfat. Es wurde gefunden, dass dieser Zusatz die Bindung und somit auch die Isolierung von insbesondere RNA verbessert. Bevorzugt liegt die Konzentration der Sulfatsalze im Gemisch von Bindepuffer und Probe unter 300 mM. Besonders bevorzugt enthält der Bindepuffer zwischen 100 und 200 mM Ammoniumsulfat.In a particularly preferred embodiment contains the binding buffer additionally according to the invention or more sulfate salts such as cobalt sulfate, zinc sulfate or preferred Ammonium sulfate. This additive was found to bind and thus the isolation of RNA in particular is also improved. Prefers is the concentration of the sulfate salts in the mixture of binding buffer and sample below 300 mM. The binding buffer particularly preferably contains between 100 and 200 mM ammonium sulfate.
Das Trägermaterial mit den daran gebundenen Nukleinsäuren wird dann in einem nächsten Schritt mit mindestens einem Waschpuffer mindestens einmal gewaschen. Der pH-Wert der Waschpuffer liegt typischerweise zwischen 4 und 7, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5. Die Pufferkonzen tration kann geringer sein als beim Bindepuffer; sie sollte im Bereich von 1 bis 50 mM, vorzugsweise bei etwa 5 bis 15 mM liegen. Gegebenenfalls kann einer der Waschpuffer Zusatzstoffe, beispielsweise Chelatbildner wie EDTA, chaotrope Substanzen und/oder nichtionische Detergenzien enthalten. Die erfindungsgemäß offenbarten Waschpuffer eluieren die gebundenen Nukleinsäuren nicht, selbst wenn diese unter Zusatz von chaotropen Substanzen an das Trägermaterial adsorbiert wurden. In einem Waschpuffer entsprechend der vorliegenden Erfindung sind Zusätze von organischen Lösungsmitteln und/oder chaotropen Substanzen nicht notwendig, um die vorzeitige Elution von Nukleinsäuren zu vermeiden. Wesentlicher Bestandteil des Waschpuffers ist erfindungsgemäß mindestens eine Komponente, die Proteine abbaut, wie z.B. eine Proteinase. Es wurde gefunden, dass durch den Zusatz einer solchen Komponente zum Waschpuffer die Effektivität der Nukleinsäureisolierung stark verbessert werden kann. Erstaunlicherweise bewirkt der Zusatz von Proteinasen zum Bindepuffer keinen derartigen Effekt. Besonders bevorzugt wird dem Waschpuffer Proteinase K zugesetzt.The carrier material with the attached nucleic acids then in a next step washed at least once with at least one wash buffer. The pH of the wash buffer is typically between 4 and 7, preferably between 4.5 and 6.5. The buffer concentration can be lower than with the binding buffer; it should be in the range of 1 to 50 mM, preferably are about 5 to 15 mM. If necessary, one of the wash buffers Additives, for example chelating agents such as EDTA, chaotropic substances and / or contain nonionic detergents. The disclosed according to the invention Wash buffers do not elute the bound nucleic acids, even if they do were adsorbed onto the carrier material with the addition of chaotropic substances. In a wash buffer according to the present invention Additions of organic solvents and / or chaotropic substances not necessary for early elution of nucleic acids to avoid. According to the invention, an essential component of the washing buffer is at least a component that breaks down proteins, e.g. a proteinase. It has been found that by adding such a component to the Wash buffer the effectiveness nucleic acid isolation can be greatly improved. Amazingly, the addition does no such effect from proteinases to binding buffer. Especially Proteinase K is preferably added to the washing buffer.
Typischerweise enthält der Waschpuffer 0,1 bis 4 mg/ml eines Enzyms wie Proteinase K, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 1 mg/ml.Typically, the wash buffer contains 0.1 to 4 mg / ml of an enzyme such as Proteinase K, particularly preferred between 0.2 and 1 mg / ml.
Die Elution, d.h. das Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial, erfolgt dann durch eine einfache Erhöhung des pH-Wertes auf über 7,5. Der dazu verwendete Elutionspufter sollte einen pH-Bereich von 7,5 bis 9, vorzugsweise 8 bis 8,5 aufrechterhalten. Geeignete Puffer sind z.B. Tris-HCl-Puffer, Tricin, Bicin und andere Puffer, die in diesem pH-Bereich puffern, vorzugsweise Tris/HCl. Die Pufferkonzentration sollte 5 bis 10 mM, vorzugsweise etwa 8 bis 10 mM betragen. Gegebenenfalls kann der Elutionspufter Chelatbildner wie EDTA und/oder andere Inhibitoren von Nukleasen enthalten.The elution, i.e. the detachment of the bound nucleic acids from the carrier material, is then done by simply increasing the pH to over 7.5. The elution buffer used for this should have a pH range of 7.5 maintained to 9, preferably 8 to 8.5. Suitable buffers are e.g. Tris-HCl buffer, tricin, bicin and other buffers that buffer in this pH range, preferably Tris / HCl. The buffer concentration should be 5 to 10 mM, preferably about 8 to 10 mM. If necessary the elution buffer chelating agents such as EDTA and / or other inhibitors of nucleases included.
In einer bevorzugtem Ausführungsform beträgt das Volumen des Elutionspuffers weniger als 1/10 des Volumens der ursprünglich eingesetzten flüssigen Probe. Auf diese Weise werden die isolierten Nukleinsäuren zugleich aufkonzentriert.In a preferred embodiment is the volume of the elution buffer is less than 1/10 of the volume of the originally used liquid sample. In this way, the isolated nucleic acids are simultaneously concentrated.
Die eluierten Nukleinsäuren sind direkt, ohne weitere Reinigungsschritte, für molekularbiologische Anwendungen, wie z.B. für Ampifikationsreaktionen, einsetzbar.The eluted nucleic acids are directly, without further purification steps, for molecular biological applications, such as. For Ampification reactions, can be used.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren wird typischerweise so durchgeführt, daß z.B. ein die Nukleinsäuren enthaltendes Plasma mit dem Bindepuffer versetzt und in ein Probenröhrchen gegeben wird. Das Probenröhrchen kann bereits das bevorzugte Trägermaterial enthalten. Genauso kann die Zugabe des Trägermaterials nach dem Einfüllen der flüssigen Probe erfolgen. Nach einer Inkubationszeit von typischerweise 1 bis 10 Minuten wird der Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex vom Überstand abgetrennt und der Überstand verworfen. Mit einem Waschpuffer wird resuspendiert, erneut abgetrennt und der Überstand erneut verworfen. Es können auch mehrere dieser Waschschritte gegebenenfalls mit Waschpuffern unterschiedlicher Zusammensetzung nacheinander ausgeführt werden. Dementsprechend kann eine erfindungsgemäße Reagenzzusammenstellung, d.h. ein Test-Kit, auch mehrere Waschpuffer enthalten. Schließlich wird der Elutionspuffer zum Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplex hinzugefügt und nach Abtrennung des Trägermaterials der die Nukleinsäuren enthaltende Überstand in ein neues leeres Röhrchen überführt. Dieses Eluat kann dann direkt für weitere Analysenmethoden (PCR, NASBA) eingesetzt werden. Bei der Verwendung von z.B. entsprechenden magnetischen Partikeln kann die zur Abtrennung des Überstands häufig eingesetzte Zentrifugation durch das Anlegen eines magnetischen Felds ersetzt werden.The insulation method according to the invention and purification of nucleic acids is typically done that e.g. a the nucleic acids containing plasma with the binding buffer and placed in a sample tube becomes. The sample tube may already be the preferred carrier material contain. Likewise, the addition of the carrier material after filling the liquid sample respectively. After an incubation period of typically 1 to 10 Minutes the carrier material-nucleic acid complex from the supernatant separated and the supernatant discarded. Resuspend with a wash buffer and separate again and the supernatant rejected again. It can also several of these washing steps, if necessary with washing buffers different compositions are carried out in succession. Accordingly, a reagent composition according to the invention, i.e. a test kit, also containing several wash buffers. Eventually the elution buffer to the carrier material-nucleic acid complex added and after separation of the carrier material of the nucleic acids containing supernatant transferred to a new empty tube. This Eluate can then be used directly for further analysis methods (PCR, NASBA) can be used. In the Using e.g. corresponding magnetic particles can to separate the supernatant frequently centrifugation used by applying a magnetic field be replaced.
Für ein effektives Waschen des Trägermaterial-Nukleinsäure-Komplexes und für eine effektive Elution der Nukleinsäuren vom Trägermaterial, ist es bei der Verwendung von partikulären Trägermaterialien wichtig, dass das Trägermaterial nach der Abtrennung homogen in den Puffern resuspendiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden bei Zugabe des Waschpuffers und/oder des Elutionspuffers daher zusätzlich ein oder bevorzugt mehrere Kugeln zugegeben. Diese Kugeln bestehen aus in den Puffern inerten, festen Materialien, bevorzugt aus Glas, einem harten Kunststoff oder Metall. Das Material der Kugeln geht keine Wechselwirkung mit Nukleinsäuren ein. Die Kugeln sind größer als die Partikel des Trägermaterials, bevorzugt zwischen 100 und 1000-fach größer. Diese Kugeln bewirken bei sanftem Schütteln des Reaktionsgefäßes eine homogene Verteilung des Trägermaterials in der Pufferlösung und dieser Prozesschritt ist sehr einfach zu automatisieren. Insbesondere wird das Trägermaterial effektiv von der Gefäßwandung gelöst und Verklumpungen werden aufgelöst. Als besonders effektiv hat sich die Zugabe der Kugelnbei der Verwendung magnetisierbarer Trägermaterialien und in Automationsprozessen erwiesen.For an effective washing of the carrier material-nucleic acid complex and for an effective elution of the nucleic acids from the carrier material, it is in the Use of particulate support materials important that the backing material after separation, is resuspended homogeneously in the buffers. In a preferred embodiment when adding the washing buffer and / or the elution buffer therefore additional one or preferably more balls added. These balls exist from solid materials inert in the buffers, preferably glass, a hard plastic or metal. The material of the balls goes no interaction with nucleic acids. The balls are bigger than the particles of the carrier material, preferably between 100 and 1000 times larger. These balls cause with gentle shaking of the reaction vessel one homogeneous distribution of the carrier material in the buffer solution and this process step is very easy to automate. In particular becomes the carrier material effectively from the vessel wall solved and clumps are broken up. The addition of the balls has been found to be particularly effective in use magnetizable carrier materials and proven in automation processes.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Test-Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Test-Kit enthält zumindest eine Festphase, bevorzugt eine Silika-Festphase, einen Bindepuffer und einen Waschpuffer, der mindestens eine Komponente enthält, die Proteine abbaut.Object of the present invention is also a test kit for performing the method according to the invention. The test kit contains at least one solid phase, preferably a silica solid phase, one Binding buffer and a washing buffer containing at least one component contains breaks down the proteins.
Weitere optionale Bestandteile sind z.B.:
- – einen oder mehrere weitere Waschpuffer
- – ein Elutionspufter zum Ablösen der gebundenen Nukleinsäuren vom Trägermaterial
- – ein oder bevorzugt mehrere Kugeln in geeigneter Darreichungsform, z.B. in Puffer oder Wasser, die zur effektiven Resuspension des Trägermaterials in Wasch- und/oder Elutionspuffer benutzt werden
- – eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
- - one or more additional wash buffers
- - An elution buffer to detach the bound nucleic acids from the carrier material
- - One or preferably several balls in a suitable dosage form, for example in buffer or water, which are used for effective resuspension of the carrier material in washing and / or elution buffer
- - Instructions for performing the method according to the invention
Die bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens angeführten bevorzugten Zusammensetzungen der Reagenzien gelten auch für die Bestandteile des erfindungemäßen Test-Kits.The description of the method according to the invention cited preferred compositions of the reagents also apply to the constituents of the test kit according to the invention.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, mit relativ einfachen und kostengünstigen Handhabungen eine geringe Anzahl von viralen Genomkopien aus einem großen Volumen – wie zum Beispiel einem Pool von Spenderplasmen – zu extrahieren und anzureichern, so daß die nachgeschaltete Nachweisreaktion gesicherte Ergebnisse liefert. Der gesamte Prozess kann mit Hilfe von magnetischen Silika Partikeln automatisiert in weniger als einer Stunde aus vielen Primärröhrchen parallel in einem Hochdurchsatz-Verfahren hochreine virale Nukleinsäuren extrahieren und ersetzt das Vorkonzentrierungsverfahren.The present invention does it possible with relatively simple and inexpensive Manipulates a small number of viral genome copies from one huge Volume - like for example a pool of donor plasmas - to extract and enrich, So that the downstream detection reaction provides reliable results. The whole process can be done with the help of magnetic silica particles automated from many primary tubes in parallel in less than an hour Extract high-purity viral nucleic acids in a high-throughput process and replaces the pre-concentration process.
Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet erstmals die Möglichkeit, eine sehr geringe Kopienzahl (< 50 Kopien) von z.B. Viren in flüssigen Proben nachzuweisen. In Blutbanken werden häufig mehrere Einzelproben von Körperflüssigkeiten, wie Plasma oder Serum, zu sogenannten Proben-Pools vereinigt. Damit auch in diesem Probenpools geringe Kopienzahlen von Viren nachgewiesen werden können, ist es zumeist nicht ausreichend, eine Probe von 100 μl zu untersuchen. Durch das erfindungsgemäße Verfahren können nun auch Kopienzahlen von z.B. unter 50 Viren in großvolumigen Proben über 2 ml nachgewiesen werden. Zudem beträgt das Elutionsvolumen nach der Isolierung der Nukleinsäuren bevorzugt weniger als 1/10 des ursprünglich eingesetzten Probenvolumens, so dass zugleich eine große Verringerung des Probenvolumens und somit eine Aufkonzentrierung der Nukleinsäuren möglich ist.The method according to the invention opens for the first time the possibility, a very small number of copies (<50 Copies) of e.g. Viruses in liquid Evidence of samples. Multiple incremental samples are often taken from blood banks Body fluids such as plasma or serum, combined into so-called sample pools. So this too Sample pools low copy numbers of viruses can be detected, it is mostly not sufficient to examine a sample of 100 μl. By the inventive method can now also copy numbers of e.g. under 50 viruses in large volume Samples about 2 ml can be detected. In addition, the elution volume is after isolation of the nucleic acids preferably less than 1/10 of the sample volume originally used, so that at the same time a great one Reduction of the sample volume and thus a concentration of nucleic acids possible is.
Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, daß ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die bevorzugten Ausführungsformen und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.Even without further versions it is assumed that a Expert can use the above description in the broadest scope. The preferred embodiments and examples are therefore only as descriptive, not as in any way limiting disclosure.
Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.The complete revelation of all and listed below Applications, patents and publications is incorporated by reference into this application.
BeispieleExamples
Beispiel 1) Basisprotokoll S für kleine PlasmaprobenExample 1) Basic protocol S for little ones plasma samples
1,5mg MagPrep® Silica Partikel (Merck KGaA) werden in 900μl Bindepuffer TAAN (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Dieser Bindepuffer-Mix enthält zudem interne Kontroll-RNA und/oder -DNA.1.5 mg MagPrep ® silica particles (Merck KGaA) are resuspended in 900μl binding buffer TAAN (200mM acetate-Tris pH 4.0, 0.5% NP40, 200mM ammonium sulfate). This binding buffer mix also contains internal control RNA and / or DNA.
100μl Plasmaprobe werden mit 900μl Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1–10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 500μl Waschpuffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.100μl plasma sample are mixed with 900μl binding buffer homogeneously mixed. After 1-10 Minutes of incubation are magnetized and the supernatant carefully separated. After removing the magnetic field, the particles are washed with 500μl washing buffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0.5mg / ml Proteinase K) resuspended and incubated up to 10 minutes at room temperature.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 500μl Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 100μl Elutionspufter (10mM Tris/HCl pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert.The supernatant is carefully removed after magnetization and again with 500μl Wash buffer added. After removing the magnetic field, the Particles are resuspended, magnetized and the supernatant discarded. The elution of the nucleic acids of after 10 minutes incubation in 100μl elution buffer (10mM Tris / HCl pH 8.5) at 80 ° C. After magnetization, the eluate is transferred to a new, sterile vessel.
Beispiel 2) Basisprotokoll XL für Pools und großvolumige EinzelprobenExample 2) Basic protocol XL for Pools and large volume Single samples
Es wird ein Plasmapool hergestellt, in dem von 24 Plasmaproben jeweils 0,1ml entnommen und in einem geeigneten Probenröhrchen vereinigt werden. Eine der Plasmaproben enthält Virus-Partikel.A plasma pool is made in which 0.1 ml of 24 plasma samples are taken and in one suitable sample tubes be united. One of the plasma samples contains virus particles.
7,5mg MagPrep® Silica Partikel werden in 7,6ml Bindepuffer TA (200mM Acetat-Tris pH 4.0, 0,5% NP40, 200mM Ammoniumsulfat) resuspendiert. Der Bindepuffer TA enthält zudem interne Kontroll-RNA und/oder -DNA. Die 2,4ml des Plasmapools werden mit 7,6ml Bindepuffer-Mix homogen gemischt. Nach 1–10 Minuten Inkubation wird magnetisiert und der Überstand sorgfältig abgetrennt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel mit 5ml Waschpuffer (10mM Tris-HCl pH 6.6; 0,5mg/ml Proteinase K) resuspendiert und bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.7.5 mg MagPrep ® silica particles are resuspended in 7.6 ml binding buffer TA (200mM acetate-Tris pH 4.0, 0.5% NP40, 200mM ammonium sulfate). The binding buffer TA also contains internal control RNA and / or DNA. The 2.4 ml of the plasma pool are mixed homogeneously with a 7.6 ml binding buffer mix. After 1–10 minutes of incubation, magnetization is carried out and the supernatant is carefully separated. After removal of the magnetic field, the particles are resuspended with 5 ml washing buffer (10 mM Tris-HCl pH 6.6; 0.5 mg / ml Proteinase K) and incubated for up to 10 minutes at room temperature.
Nach Magnetisierung wird der Überstand sorgfältig entfernt und wieder mit 5ml Waschpuffer versetzt. Nach Entfernung des Magnetfeldes werden die Partikel resuspendiert, magnetisiert und der Überstand verworfen. Die Elution der Nukleinsäuren von den Partikeln erfolgt nach 10-minütiger Inkubation in 100μl Elutionspufter (10mM Tris/HCl pH 8,5) bei 80°C. Nach Magnetisierung wird das Eluat in ein neues, steriles Gefäß transferiert.The supernatant is carefully removed after magnetization and again mixed with 5 ml wash buffer. After removing the magnetic field the particles are resuspended, magnetized and the supernatant discarded. The nucleic acids are eluted from the particles after 10 minutes Incubation in 100μl Elution buffer (10mM Tris / HCl pH 8.5) at 80 ° C. After magnetization the eluate is transferred to a new, sterile vessel.
Die Nukleinsäuren der gewonnenen Eluate werden durch (RT)-PCR und geeignete Gensonden amplifiziert und nachgewiesen (z.B. mit Hilfe eines Thermocyclers wie des ABI Prism 7000 (TagMan®) der Firma Applied Biosystems oder des LightCycler® der Firma Roche).The nucleic acids of the eluates obtained are amplified by (RT) PCR and appropriate gene probes and detected (eg, using a thermal cycler such as the ABI Prism 7000 (TaqMan ®) manufactured by Applied Biosystems or the LightCycler ® from Roche).
Beispiel 3) Einfluss von grossen Probenvolumina auf die SensitivitätExample 3) Influence of large sample volumes for sensitivity
Die Ergebnisse dieses Beispiels sind
in
100μl Virus-positives Plasma (versetzt
mit 600 Kopien HIV: -gestreifte Balken- und 200 Kopien HBV:-gepunktete
Balken – in
Wie die
Beispiel 4) Auswirkung von Sulfat-Salzen auf die Isolierung von RNAExample 4) Impact of sulfate salts on the isolation of RNA
100μl von HBV- und HIV-positivem Plasma (jeweils ca. 1000 Kopien) werden mit MagPrep® Silica Partikeln und 900μl eines Bindepuffers inkubiert, der entweder kein Ammoniumsulfat (Probe #1) oder 200mM Ammoniumsulfat (Probe # 2) enthält. Die weitere Isolierung erfolgt gemäß Beispiel 1.100μl of HBV- and HIV-positive plasma (approx. 1000 copies each) are incubated with MagPrep ® silica particles and 900μl of a binding buffer, which either contains no ammonium sulfate (sample # 1) or 200mM ammonium sulfate (sample # 2). The further isolation takes place according to example 1.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind
in
Es zeigt sich deutlich, dass die Ausbeute von RNA-Molekülen durch Zugabe von Ammoniumsulfat zum Bindepuffer bis zur gewünschten Sensititvität verbessert werden kann.It clearly shows that the Yield of RNA molecules by adding ammonium sulfate to the binding buffer to the desired one Sensitivity improved can be.
Beispiel 5) Auswirkung der Zugabe von Proteinase KExample 5) Impact the addition of Proteinase K
Vier Plasmaproben a 100μl werden bereitgestellt. Eine Plasmaprobe wird mit Proteinase K bei einer Konzentration von 0.5mg/ml für 4 Stunden vorinkubiert (Probe#1). Dann werden alle vier Plasmaproben mit Viruspartikeln (HIV und HBV; jeweils 1000 Kopien/ml) versetzt.Four plasma samples of 100μl each provided. A plasma sample is made with Proteinase K at a Concentration of 0.5mg / ml for Pre-incubated 4 hours (sample # 1). Then all four plasma samples with virus particles (HIV and HBV; 1000 copies / ml each).
Die vier Proben werden analog des Basisprotokolls S (Beispiel 1) extrahiert, wobei bei Probe #1, #2 und #3 der Waschpuffer keine Proteinase K enthält. Bei Probe #3 werden dem Bindepuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt. Bei Probe #4 werden dem Waschpuffer 0,5mg/ml Proteinase K zugesetzt.The four samples are analogous to the Basic protocol S (Example 1) extracted, with sample # 1, # 2 and # 3 the wash buffer contains no Proteinase K. At sample # 3, the Binding buffer 0.5 mg / ml Proteinase K added. Be at sample # 4 0.5 mg / ml Proteinase K was added to the wash buffer.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind
in
Die Ergebnisse zeigen, dass nur bei Zugabe der Proteinase zum Waschpuffer die gewünschte Effektivität der Isolierung der Nukleinsäuren erzielt werden kann.The results show that only Add the proteinase to the wash buffer to achieve the desired effectiveness of the isolation of nucleic acids can be achieved.
Die Zugabe von Proteinase K zum Bindepuffer oder die Vorinkubation der Probe mit Proteinase K zeigt keine wesentliche Verbesserung.The addition of Proteinase K to the binding buffer or the preincubation of the sample with Proteinase K shows no essential Improvement.
Beispiel 6) optimale Konzentration des Trägermaterials bei großem und kleinem ProbenvolumenExample 6) optimal concentration of the carrier material with big and small sample volume
Je 100μl HIV-positives Plasma (ca.
1000 copies) wird entweder gemäß Basisprotokoll
S (Beispiel 1) extrahiert (gestreifte Balken) oder mit 2,3 ml virus-freiem
Plasma gemischt und gemäß des Basisprotokolls
XL (Beispiel 2) extrahiert (graue Balken). Als Trägermaterial
werden MagPrep® Silica Partikel
eingesetzt. Die Menge des Trägermaterials wird
variiert. Die jeweils pro ml Plasma eingesetzte Menge ist in
Auf der Y-Achse ist die Ausbeute an isolierten Nukleinsäuren in % angegeben. Die Ausbeute für 15mg/ml wurde gleich 100% gesetzt.The yield is on the Y axis on isolated nucleic acids stated in%. The yield for 15mg / ml was set to 100%.
Die Ergebnisse zeigen, dass beim Einsatz großer Probenvolumina über 2 ml die Menge des Trägermaterials im Verhältnis zu der bei kleinen Probenvolumina benötigten Menge reduziert werden kann. Weiterhin wird deutlich, dass die Menge des eingesetzten Trägermaterials bei großen Probenvolumina weniger Einfluß auf die Ausbeute hat. Eine geringere Konzentration an Trägermaterial von etwa 2 bis 3 mg/ml führt zu leicht besseren Ausbeuten als die doppelte Menge von ca. 6 mg/ml.The results show that the Use large Sample volumes above 2 ml the amount of the carrier material in relation to be reduced to the amount required for small sample volumes can. It is also clear that the amount of carrier material used for large Sample volumes have less impact the yield has. A lower concentration of carrier material from about 2 to 3 mg / ml yields slightly better than double the amount of approx. 6 mg / ml.
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