DE10256656A1

DE10256656A1 - Verfahren zur Herstellung von Cephalexin

Info

Publication number: DE10256656A1
Application number: DE10256656A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Menzler; Thomas Boller; Hans-Ulrich Petereit; Christian Dr. Meier
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2004-06-17
Also published as: EP1466006A1; AU2003283271A1; US7264943B2; JP2006500957A; KR20050083550A; HK1082000A1; IL161897A0; CN1685059A; CN1293200C; US20050084925A1; WO2004050893A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalexin mit Hilfe einer auf einem perlförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bildungsaktiven Mischpolymerisat immobilisierten Penicillinamidase.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalexin mit Hilfe einer auf einem perlförmigen, vernetzten hydrophilen, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktiven Mischpolymerisat immobilisierten Penicillinamidase.
Stand der Technik
Verfahren zur Synthese von halbsynthetischen Betalaktam Antibiotika durch Acylierung eines Betalaktam Rests (Betalaktamkern) mit einer aktivierten Seitenkette, wie etwa einem Amid oder einem Ester, unter Verwendung des Enzyms Penicillinacylase (Penicillinamidase) sind dem Fachmann gut bekannt.
Zumeist wird das Enzym dabei an einen festen, wasserunlöslichen Träger gebunden, und anschließend in wässriger Lösung mit dem Betalaktamkern und der aktivierten Seitenkette in Kontakt gebracht.
Nachteilig an den bisher offenbarten Verfahren ist die Tatsache, dass das Verhältnis der Synthese der gewünschten Verbindung durch das Enzym gegenüber der Hydrolyse der aktivierten Seitenkette zu wertlosen Seitenkettensäuren sowie auch zur Hydrolyse des gewünschten Produktes, der so genannte S/H-Wert, oft ungünstig ist, und eine wirtschaftliche Produktion erschwert.
Aus der WO 93/12250 ist es bekannt, dass der S/H-Wert bei der Synthese der halbsynthetischen Betalaktam-Antibiotika, Cephadroxil und Cephalexin durch auf Eupergit® (Röhm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Deutschland, siehe auch Vergleichsbeispiel 1) immobilisierter Penicillinamidase aus E. coli durch die Wahl der Reaktionsbedingungen günstig beeinflusst werden kann. Ein Einfluss der Natur des Trägermaterials wird hingegen nicht gelehrt. Nachteilig an dem in der WO 93/12250 gelehrten Verfahren ist insbesondere, dass das Cephalexin im Komplex mit beta-Naphthol aus dem Reaktionsgemisch isoliert wird, so dass nachfolgende Aufreinigungsschritte nötig sind, und Produktverluste auftreten.
Es wurde daher versucht, optimierte Trägermaterialen zu entwickeln. So offenbart die W097/04086 eine Penicillinamidase aus E. coli, die auf einem Trägermaterial aus einem Quellmittel und einem Polymer mit freien Aminogruppen immobilisiert ist, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Betalaktamderivaten. Das offenbarte Verfahren zur Herstellung von Cephalexin weist jedoch den Nachteil auf, dass der Betalaktamkern 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) im dreifachen molaren Überschuss zu der aktivierten Seitenkette D-Phenylglycinamid (PGA) eingesetzt wird. Werden überstöchiometrische Mengen Betalaktamkern eingesetzt, muss der Kern im industriellen Maßstab recycelt werden, um wirtschaftlich arbeiten zu können. Dies ist teuer und führt zu Ausbeuteverlusten. Außerdem führt dieser Umstand auch zu Verunreinigungen im Produkt, da der Kern labil ist.
Die EP 0 730 035 lehrt ebenfalls die Herstellung von Cephalexin auf einem spezifischen Träger in akzeptablen Ausbeuten. Allerdings beträgt die Korngröße des verwendeten Trägermaterials (Emphaze^TM) nur 60-80 μm. Dies ist von großem Nachteil für technische Anwendungen. So haben mit solchem Material gepackte Chromatographiesäulen nur eine geringe Fließgeschwindigkeit.
Ein Trägermaterial für Enzyme wird in der DE 198 04 518 beschrieben. Es wird erwähnt, dass das Material Verwendung finden könne für die enzymatische Synthese von Amoxycillin und Ampicillin. Eine Eignung für die Synthese von Cephalexin mittels immobilisierter Penicillinamidase wird nicht erwähnt.
Aufgabe und Lösung
Angesichts des oben diskutierten Stands der Technik lag der vorliegenden Erfindung daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren für die Synthese von Cephalexin zur Verfügung zu stellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.
Insbesondere sollte dieses Verfahren die Realisierung eines günstigen S/H-Wertes ermöglichen. Weiterhin sollte das verwendete Trägermaterial eine für industrielle Verfahren günstige Korngröße von 120 bis 250 um aufweisen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren. Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den auf Anspruch 1 zurückbezogenen Unteransprüchen definiert.
Insbesondere gelingt es auf nicht vorhersehbare und technisch einfache Weise, die obige Aufgabe zu lösen, indem man perlförmige, vernetzte hydrophile, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktive Trägerpolymermaterialien, die herstellbar sind durch inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase, die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel bestehen, wobei als Monomere

(a) 5 – 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %ige wässrige Lösungen bilden
(b) 30 – 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann
(c) 20 – 60 Gew.-% vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen mit der Maßgabe, dass sich a), b) und c) zu 100 Gew.-% addieren, enthalten sind und als Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1,0 bis 1 : 4,0 verwendet wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus einem organischen Lösungsmittel aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 – 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt ist, wobei das Verhältnis Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase 1 : 2,0 bis 1 : 4,0 beträgt, und in dieser Form in Gegenwart von eines Polymerisationsinitiators und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden, mit der Maßgabe, dass das Verhältnis der Monomeren zum Verdünnungsmittel 1 : 1,7 bis 1 : 2,4 beträgt, mit Penicillinamidase beschichtet, und diese beschichteten Träger in Kontakt bringt mit einer wässrigen Lösung, die
- (i) 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und
- (ii) D-Phenylglycinamid in Verhältnissen von 1 : 2 bis 2 : 1, bevorzugt 1,5 : 1 bis 1 : 1,5, besonders bevorzugt in annähernd equimolaren Verhältnissen, d.h. in Verhältnissen von 1,2:1 bis 1:1,2 enthält.

Das verwendete Trägermaterial und das Verfahren zu seiner Herstellung sind in der DE 198 04 518 beschrieben.
Ausführung der Erfindung
Herstellung des Trägermaterials
Monomere
Um die Hydrophilie des Monomerengemischs zu gewährleisten, muss dieses zum überwiegenden Teil aus hydrophilen Monomeren bestehen. Unter hydrophilen Monomeren sind solche Monomere zu verstehen, die bei Raumtemperatur wenigstens 10%-ige wässrige Lösungen bilden und vorzugsweise keine ionischen oder durch Säure- oder Basenzusatz ionisierbaren Gruppen enthalten.
Die Monomere a) sind 5 – 40, 8 – 35, insbesondere 9 – 12 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %-ige wässrige Lösungen bilden.
Als Monomere a) sind insbesondere Acrylamid und/oder Methacrylamid geeignet, wobei Methacrylamid bevorzugt wird. Weitere Beispiele sind Hydroxyalkylester von ungesättigten polymerisierbaren Carbonsäuren, wie Hydroxyethylacrylat und Hydroxyethylmethacrylat oder N-Vinylpyrrolidon.
Monomere b) sind 30 – 50, bevorzugt 35 – 45 Gew.-% radikalisch polymerisierbaren Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, bevorzugt einer Oxirangruppe (Epoxygruppe), die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann. Insbesondere Oxirangruppen sind geeignet, um Liganden unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität zu binden.
Bevorzugte Monomere b) sind Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether. Besonders bevorzugt werden gleichzeitig beide Monomere in etwa gleichen Mengen eingesetzt.
Monomere c) sind 20 – 60, insbesondere 25 – 55, besonders bevorzugt 40 – 55 Gew.-% hydrophile, vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen. Bevorzugte Monomere c) sind N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N"-Methylen-bis-Methacrylamid. N,N'-Methylen-bis-Methacrylamid wird besonders bevorzugt. Gegebenenfalls können auch 0 – 10 Gew.-% weiterer vernetzender, radikalisch polymerisierbarer Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen eingesetzt werden. Geeignet sind hydrophile Di(meth)acrylate, wie z. B. Polyethylenoxid-Di(meth)acrylate.
Die Monomere a), b) und c) addieren sich jeweils zu 100 Gew.-%.
Verdünnungsmittel
Die Monomerenphase besteht aus den Monomeren a) bis c), die in einem Verdünnungsmittel, das ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1,0 bis 1 : 4,0 sein muss, gelöst sind. Besonders günstige Mischungsverhältnisse für Methanol und Wasser liegen bei 1 : 1,2 bis 1: 2,5, insbesondere bei 1: 1,3 bis 1 : 1,7.
Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel
Besonders kritisch ist das Verhältnis Monomere zu Verdünnungsmittel. Dieses muss im Bereich von 1 : 1,7 bis 1 : 2,4, besonders bevorzugt im Bereich von 1,9 bis 2,1 liegen.
Kontinuierliche Phase
Als kontinuierliche Phase eignet sich ein organisches Lösungsmittel, das ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit 4 bis 7 C-Atomen ist. Bevorzugt ist n-Heptan und besonders bevorzugt Cyclohexan.
Verhältnis Monomerenphase/kontinuierlicher Phase Das Verhältnis von der Monomerenphase zur kontinuierlichen Phase, gebildet durch das organische Lösungsmittel muss bei 1 : 2,0 bis 1 : 4,0, bevorzugt zwischen 1 : 2,8 bis 1 : 3,3.
Weitere Verfahrensbedingungen
Als weitere Bestandteile enthält die suspendierte Monomerphase in an sich bekannter Weise Polymerisations-Initiatoren, bevorzugt sind schwefelfreie Initiatoren, besonders bevorzugt ist 4,4'-Azobis-(4-Valeriansäure), sowie Schutzkolloide (Emulgatoren), wie z. B. ein Mischpolymerisat aus 95 Teilen n-Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid mit Molekulargewichten (Gewichtsmittel) im Bereich von 30.000 bis 80.000.
Die Perlpolymerisation (auch als Suspensionspolymerisation bezeichnet) wird ansonsten in bekannter Weise ausgeführt, indem z. B. die kontinuierliche Phase und dem Schutzkolloid vorgelegt wird und die Monomerenphase, in der sich auch der Initiator befindet unter Rühren z. B. bei 40 bis 60 °C in der organischen Phase verteilt wird und anschließend auf 60 – 70 °C erhitzt wird. Das Wasser/Methanol-Gemisch kann z. B. über einen Zeitraum von 6 Stunden nahezu vollständig azeotrop ausgekreist werden. Man lässt den Ansatz für ca. 3 – 5 Stunden zu Ende reagieren und kühlt anschließend auf Raumtemperatur ab. Die entstandenen Perlen werden abgesaugt und z. B. für 12 Stunden im Vakuum getrocknet. Alternativ dazu können die Perlpolymerisate auch abfiltriert und mit Wasser gewaschen werden. Bevorzugt wird ein Trocknung in einem Wirbelschichttrockner vorgenommen, da sich auf diese Weise Lösungsmittelreste besonders effektiv entfernen lassen.
Die erhaltenen Polymerperlen (= Trägerpolymermaterial) haben eine Größe im Bereich von 50 bis 500 μm, insbesondere von 120 bis 250 μm.
Unter der Bindungskapazität wird diejenige enzymatische Aktivität verstanden, die sich bei maximaler Beladung des Trägerpolymermaterials mit einem bestimmten Enzym erreichen lässt. Die Bindungskapazität wird ausgedrückt als Penicillinamidase-Aktivität in Units pro g Trägerpolymerperlen [U/g feucht]. Die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen beträgt bei dieser Meßmethode mindestens 220 [U/g feucht].
Die Quellbarkeit der Polymerperlen in Wasser wird ausgedrückt durch die Quellungszahl [ml feucht / ml trocken]. Die erfindungsgemäßen Trägerpolymerperlen weisen eine Quellungszahl von nicht mehr als 1,5 auf.
Beschichtung des erfindungsgemäß verwendbaren Trägermaterials
In den Beispielen wird das Trägermaterial bei pH 7,5 in Kaliumphosphatpuffer beschichtet. Es ist dem Fachmann jedoch klar, dass es eine ganze Vielzahl von weiteren Verfahren gibt, mit denen eine zufriedenstellende Beschichtung gewährleistet wird.
Synthese von Cephalexin
Die Edukte (i) 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und (ii) D-Phenylglycinamid werden in Konzentrationen von 10-500 mM, bevorzugt 50-300 mM und besonders bevorzugt von 150-250 mM eingesetzt.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Synthese von Cephalexin mit günstigem S/H-Verhältnis (Synthese/Hydrolyse). Vorteilhaft ist es dabei, daß dies unter Verwendung eines Trägermaterials mit Teilchengrößen im Bereich von 50 – 500 μm, insbesondere von 120 bis 250 μm erreicht wird. Dadurch werden bessere anwendungstechnische Eigenschaften erzielt, z. B. höhere Fließgeschwindigkeiten in Festbettreaktoren. Aus den höheren Fließgeschwindigkeiten resultieren bessere Raum-Zeit-Ausbeuten. Auch in Batchverfahren bieten die größeren Trägerteilchen Vorteile, da sie schneller abfiltriert werden können. Dies erhöht wiederum die Raum-Zeit-Ausbeute und damit die Wirtschaftlichkeit des Prozesses.
Beispiele
(Die folgende Bestimmungsmethode ist dem Fachmann auf den Gebiet poröser Trägerpolymermaterialien an sich geläufig und wird nur der Vollständigkeit halber aufgeführt) Bestimmung der Bindungskapazität für Penicillinamidase ( = Penicillin G-Acylase) aus E. coli (EC 3.5.1.11)
a) Kovalente Bindung von Penicillinamidase an das Trägerpolymermaterial
1 g Trägerpolymermaterial werden zu 1530 Units Penicillinamidase in 5 ml sterilem 1 M Kalium-Phosphat-Puffer pH 7,5 gegeben und für 48 h bei 23 °C inkubiert.
Anschließend werden die Polymerperlen auf eine Fritte aus gesintertem Glas (Porösität 2 oder 3) gegeben und zweimal mit entionisierten Wasser und anschließend zweimal mit 0,1 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, mittels Absaugens auf der Fritte gewaschen. Das Feuchtgewicht der erhaltenen, mit Penicillin-Acylase beladenen Perlen wird bestimmt.
b) Bestimmung der Bindungskapazität
250 – 300 mg feuchtes mit Penicillinamidase gekoppeltes Trägerpolymermaterial (Polymerperlen) werden in 20 ml einer 2 %-igen Penicillin-G-Lösung in 0,05 M Kalium-Phosphatpufter pH 7,5, enthaltend 0,05 Ethyl-4-hydroxybenzoat, bei 37 °C gegeben. Unter gleichmäßiger Rührung erfolgt eine Titration frei gewordener Phenylessigsäure mit 0,5 M NaOH bei einem konstantem pH-Wert von 7.8 für die Dauer von 10 Minuten, wobei der Verbrauch an NaOH aufgezeichnet wird.
Anschließend werden die Polymerperlen wie unter a) über eine Glasfritte mittels Durchsaugen von 20 ml 0,05 M Kalium-Phosphatpuffer pH 7,5, enthaltend 0,05 % Ethyl-4-hydroxybenzoat, gewonnen und die Messung zweimal wiederholt.
c) Berechnung der Bindungskapazität
Der lineare Bereich der Messkurven (üblicherweise der Bereich von 1 – 5 min) wird für die Berechnung zugrunde gelegt und auf ein 10 min Intervall extrapoliert. Die Bindungskapazität wird als Penicillinamidase Einheiten pro g feuchten Trägerpolymermaterials (U/g feucht) angegeben. Eine Einheit entspricht einem μmol hydrolysiertem Penicillin G pro Minute (μmol/min); 1 l 0,5M NaOH ist dabei äquivalent zu 500 μmol hydrolysiertem Penicillin G. (Der Wassergehalt des Trägerpolymermaterials ist in etwa konstant und kann daher vernachlässigt werden.)
Vergleichsbeispiel 1
1530 Units Penicillinamidase aus E. coli werden in 6 ml sterilem 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5 gelöst. Die Lösung wird zu 1 g Eupergit ® C (Röhm GmbH & Co. KG, Darmstadt, Deutschland) gegeben, und die erhaltene Suspension wird 72 Stunden bei 23° C inkubiert. Die Polymerperlen werden auf einem gesinterten Glasfilter gesammelt und mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer gewaschen. Die nachfolgende Cephalexin-Synthese und die Bestimmung des S/N-Wertes folgen den Beispielen 5 bzw. 6.
Eupergit® C (ein Copolymer aus N,N'-methylenbis-methacrylamid, Allylglycidylether und Methacrylamid) sowie Verfahren zu seiner Herstellung werden in der DE-C 27 22 751 , der US-A 4 90 713 bzw. der US-A 45 11 694 beschrieben.
Vergleichsbeispiel 2
Der WO 97/04086 folgend wird unter Verwendung des dort offenbarten Typ A Enzyms bzw. Typ B Enzyms eine Cephalexin-Synthese wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
Vergleichsbeispiel 3
Auf Sepabeads® FP-EP bzw. Sepabeads® FP-EP/G (Resindion S.R.I., Mailand, Italien) wird Penicillinamidase aus E. coli immobilisiert wie in Vergleichsbeispiel 1 gezeigt. Die nachfolgende Cephalexin-Synthese und die Bestimmung des S/H-Wertes folgen den Beispielen 5 bzw. 6.
Sepabeads® FP-EP bzw. Sepabeads® FP-EP/G ist ein hochpolymeres vernetztes acrylisches Copolymer, welches wie Eupergit ® Oxirangruppen trägt. Die durchschnittliche Teilchengröße beträgt nach Herstellerangaben 150-300 μm.
Vergleichsbeispiel 4
Ermittlung der Fließgeschwindigkeit einer mit EmphazeTM bzw. dem erfindungsgemäß verwendbaren Material gepackten Chromatographiesäule.
Material: Emphaze Ultralink^TM Biosupport Medium, Lot#DC53515, Pierce, mittlere Teilchengröße nach Herstellerangaben 50-80 μm; Erfindungsgemäß verwendbares Material, mittlere Teilchengröße 208 μm.
Chromatographiesäulen aus Borsilikatglas mit Glasfrittenboden und Polypropylenendkappen (Abmessung der Säule 1×20 cm) wurden leer auf eine vergleichbare Auslaufgeschwindigkeit geprüft. Die Trägermaterialien wurden über Nacht in Wasser suspendiert und anschließend mit Wasser in die jeweilige Säule gespült und durch Sedimentation und langsames Auslaufen der Flüssigkeit wurde ein gepacktes Bett mit einer Höhe von 6,5 cm erhalten. Durch leichtes Klopfen wurden eventuelle Hohlräume entfernt. Die oben offenen Säulen hatten durch Wasserzulauf eine konstante Wassersäule von 23 cm. Die Fließgeschwindigkeit wurde nur durch den hydrostatischen Druck erzielt. Mittels Stoppuhr und 10ml-Meßzylinder wurde die Fließgeschwindigkeit bestimmt.
Für das erfindungsgemäß verwendbare Präparat wurde eine Fließgeschwindigkeit von 4,25 ml pro Minute bestimmt. Für EmphazeTM wurde eine Fließgeschwindigkeit von 0.71 ml pro Minute bestimmt. Die Eignung sphärischer Partikel zum Betrieb in Festbettreaktoren ist umso besser, je höher die Fließgeschwindigkeit ist (höhere Raum-Zeit-Ausbeute). Der Druckabfall in Festbettreaktoren lässt sich auch mathematisch berechnen: K. Buchholz und B. Gödelmann in „Characterization of immobilized biocatalysts", Dechema Monographien Band 84, Hrsg. K. Buchholz, VCH Weinheim 1979, Seiten 128-129).
Man erkennt deutlich die gegenüber EmphazeTM besseren anwendungstechnischen Eigenschaften des erfindungsgemäß einsetzbaren Materials für den Einsatz in Festbettreaktoren.
Beispiele 1 - 3
Übereinstimmende Versuchsbedingungen in den Beispielen 1 – 3:
In einem 2 l Rührkolben mit Thermometer, Wasserabscheider, Rückflusskühler, Stickstoffeinleitungsrohr werden ein organisches Lösungsmittel, 3 g eines Mischpolymerisats aus 95-Teilen n-Butylmethacrylat und 5 Teilen 2-Trimethylammoniumethlymethacrylat-Chlorid als Schutzkolloid und 5 g Trockeneis vorgelegt. Unter Rühren und Durchleiten von Stickstoff wird bei 50 °C eine Monomerenphase bestehend aus Wasser und Methanol im Verhältnis 1 : 1,5 (Beispiel 1) bzw. aus Formamid (Beispiele 2 und 3) als Verdünnungsmittel, sowie
10 g Methacrylamid,
20 g Allylglycidylether,
20 g Glycidylmethacrylat und
50 g Methylen-bis-methacrylamid sowie 2 g 4,4'-Azobis-4-cyanovaleriansäure (als Polymerisationsinitiator) in der organischen Phase verteilt und anschließend zum Sieden bei 65 – 70 °C erhitzt. Der Ansatz wird für ca. 6 h inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die entstandenen Polymerperlen werden abgesaugt, gewaschen und im Wirbelschichttrockner getrocknet. Anschließend wird die Bindungskapazität für Penicillinamidase (U/g feucht] und die Quellzahl bestimmt [ml feucht/ml trocken] bestimmt.
Die wesentlichen Versuchsparameter und die Ergebnisse der Beispiele 1 – 3 sind der nachstehenden Tabelle zu entnehmen.
Beispiel 4
Synthese von Cephalexin
Die Reaktion wird bei 25° C und pH 7.5 in einem Festbettreaktor durchgeführt. 10 ml einer wässrigen Lösung eines Gemisches aus 0,2 M 7-ADCA und 0,2 M D-Phenlyglycinamid werden über eine Säule mit 0,5 ml der immobilisierten Penicillinamidase geführt. Während der Reaktion wird der pH-Wert durch Zusatz von HCl in einem angeschlossenen gerührten Vorratsbehälter konstant gehalten. Zu bestimmten Zeitabständen werden Proben entnommen und wie in Beispiel 5 gezeigt mittels HPLC analysiert.
Beispiel 5
Die Produkte der Reaktion aus Beispiel 4 sowie der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 wurden durch HPLC unter Verwendung einer RP -8 Säule (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) analysiert. Als Laufmittel wurde steriler 67 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,5 verwendet. Cephalexin wurde mit einer 30 %igen (Volumen/Volumen) wässrigen Methanol-Lösung eluiert.
Aus der HPLC-Analyse wurde die Synthesegeschwindigkeit von Cephalexin (V_Ceph) sowie die Hydrolysegeschwindigkeit von D-Phenylglycin (V_D-PhG) bestimmt und daraus der S/H-Wert (Verhältnis Synthesegeschwindigkeit/Hydrolysegeschwindigkeit (V_Ceph/V_D-PhG) errechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
Der Wert für das erfindungsgemäße Verfahren setzt sich aus 7 parallel durchgeführten Versuchsreihen zusammen, die folgende S/H-Werte ergaben: 5,3; 4,7; 3,6; 4,6; 4,3; 5,2; 4,7;
Man erkennt deutlich den gegenüber den Vergleichsbeispielen signifikant um ca. 30% verbesserten S/H-Wert, der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreichbar ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Cephalexin, dadurch gekennzeichnet, dass perlförmige, vernetzte hydrophile, gegenüber Liganden mit nucleophilen Gruppen bindungsaktive Trägerpolymermaterialien, die herstellbar sind durch inverse Perlpolymerisation einer Monomerenphase, die aus Monomeren und einem Verdünnungsmittel bestehen, wobei als Monomere (a) 5 – 40 Gew.-% hydrophile radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe, die bei Raumtemperatur wenigstens 10 %ige wässrige Lösungen bilden, (b) 30 – 50 Gew.-% radikalisch polymerisierbare Monomere mit einer Vinylgruppe und einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, die in einer polymeranalogen Reaktion mit den nucleophilen Gruppen der Liganden kovalente Bindungen eingehen kann, (c) 20 – 60 Gew.-% vernetzende radikalisch polymerisierbare Monomere mit zwei oder mehr ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppen, mit der Maßgabe, dass sich a), b) und c) zu 100 Gew.-% addieren, enthalten sind und als Verdünnungsmittel ein Gemisch aus Methanol und Wasser im Verhältnis 1 : 1,0 bis 1 : 4,0 verwendet wird, wobei die Monomerenphase in einer kontinuierlichen Phase aus einem organischen Lösungsmittel aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff mit 5 – 7 Kohlenstoffatomen zu Tröpfchen verteilt ist, wobei das Verhältnis Monomerenphase zu kontinuierlicher Phase 1 : 2,0 bis 1 : 4,0 beträgt, und in dieser Form in Gegenwart von eines Polymerisationsinitiators und eines Schutzkolloids radikalisch polymerisiert werden, mit der Maßgabe, dass das Verhältnis der Monomeren zum Verdünnungsmittel 1 : 1,7 bis 1 : 2,4 beträgt, mit Penicillinamidase beschichtet werden, und diese beschichteten Träger in Kontakt gebracht werden mit einer wässrigen Lösung, die (i) 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure und (ii) D-Phenylglycinamid im Verhältnis von 1:2 bis 2:1, enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Monomere a) Acrylamid und/oder Methacrylamid b) Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidylether c) N,N'-Methylen-bis-Acrylamid oder N,N"-Methylen-bis-Methacrylamid eingesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als organisches Lösungsmittel Cyclohexan verwendet wird.
Verfahren nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Penicillinamidase aus E. coli stammt.
Verwendung eines Trägerpolymermaterials nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 zur Synthese von Cephalexin.