DE10252806A1

DE10252806A1 - Verwendung von Fischlarven als Screening-Modell

Info

Publication number: DE10252806A1
Application number: DE2002152806
Authority: DE
Inventors: Matthias Dr. Austen
Original assignee: Develogen AG
Current assignee: Develogen AG
Priority date: 2002-11-13
Filing date: 2002-11-13
Publication date: 2004-06-03
Also published as: AU2003288055A1; WO2004044241A2; WO2004044241A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fischlarven, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven, als Modellorganismus zur Erforschung von Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und damit verbundenen Krankheiten, sowie zur Entwicklung entsprechender Präventions- und/oder Behandlungsstrategien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten oder Wirkstoffen, welche die Energiehomeostase beeinflussen, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierte Gene, Genprodukte oder Wirkstoffe, zur Prävention oder/und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und anderen Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z. B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts von Fischlarven, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fischlarven, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven, als Modellorganismus zur Erforschung von Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas und damit verbundenen Krankheiten, sowie zur Entwicklung entsprechender Präventions- und/oder Behandlungsstrategien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten oder Wirkstoffen, welche die Energiehomeostase beeinflussen, sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierte Gene, Genprodukte oder Wirkstoffe, zur Prävention oder/und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und anderen Krankheiten betreffend die Regulation des Körpergewichts als auch damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts von Fischlarven, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven.
Obesitas stellt heutzutage weltweit eine der häufigsten Stoffwechselerkrankungen dar. Obwohl in den westlichen Industriestaaten heute jeder dritte Einwohner als übergewichtig gilt, ist bislang noch relativ wenig über diese Krankheit bekannt. Obesitas ist definiert als eine Erhöhung des Körperfettgehalts infolge positiver Energiebilanz und kann durch verschiedene Faktoren, wie z.B. genetische, metabolische, biochemische, psychologische und verhaltensbedingte Faktoren ausgelöst werden. So kann Obesitas beispielsweise als reine Folge übermäßiger Nahrungsaufnahme, als psychosomatisches Symptom, bei Stoffwechselerkrankungen sowie bei seltenen angeborenen Syndromen auftreten.
Neben der reinen Vermehrung des Fettgewebes leidet der korpulente Patient zusätzlich häufig an Begleiterscheinungen, wie Leberzellverfettung, Fettleber und sekundären Fettstoffwechselstörungen mit erhöhten Serumlipidprotein-Konzentrationen. Zudem erkranken viele Patienten an den sogenannten Obesitas-Folgeerkrankungen, wie beispielsweise Hypertonie, Diabetes Mellitus, Gicht, Fettverteilungsstörungen, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, einigen Krebsarten, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe.
Obwohl bislang mehrere Gene beschrieben wurden, welche das homeostatische System zur Regulierung des Körpergewichts beeinflussen, wie beispielsweise Leptin, VCPI, VCPL oder der Peroxisome Proliferatoractivated Rezeptor-Gamma co-Aktivator, sind die eigentlichen molekularen Mechanismen und/oder Moleküle, welche Obesitas oder die Regulierung des Körpergewichts beeinflussen, nicht bekannt.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Ziel war deshalb, neuartige Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen, Genprodukten oder Wirkstoffen, welche die Energiehomeostase beeinflussen, bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe gelöst durch Verwendung von Fischlarven verschiedener Entwicklungsstadien, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven, als Modellorganismus zur Erforschung des homeostatischen Systems zur Regulierung des Körpergewichts. Fischlarven, insbesondere die Zebrafischlarven Danio rerio oder die Medakalarven Oryzias latipes, weisen aufgrund ihrer geringen Größe, der Möglichkeit von in vitro-Befruchtungen, der hohen Nachkommenzahl (50-300 Eier pro Woche), der Entwicklung der Nachkommen außerhalb des Muttertiers, den kurzen Entwicklungszeiten der Nachkommen (innerhalb der ersten 24 Stunden nach Befruchtung sind im Wesentlichen alle Organe angelegt, die Fischlarven schlüpfen nach 3 Tagen, die Geschlechtsreife der Fische tritt nach 3–4 Monaten ein) und der Möglichkeit, die Entwicklung von Organen und Geweben direkt an den lebenden, durchsichtigen Fischlarven zu beobachten, erhebliche Vorteile gegenüber den bislang bekannten Wirbeltiermodellorganismen, wie C. elegans, Drosophila melanogaster und Mus musculus, auf. Insbesondere wurde im Rahmen der zu der vorliegenden Erfindung führenden Studien ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung des Fett-, Glykogen- und/oder Blutzuckergehalts in Fischlarven, insbesondere Zebrafischlarven oder Medakalarven, entwickelt, welches sich zum Einsatz in der genetischen Funktionsanalyse sowie zur Analyse der Wirkung von pharmakologisch aktiven Substanzen eignet.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten, welche die Energiehomeostase beeinflussen, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Fischlarve, bei der die Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts, von denen angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflussen, moduliert wird,
(b) Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Parameter der Fischlarve und
(c) Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Bereitstellen einer Fischlarve, bei der die Aktivität des Zielgens oder/und Zielgenprodukts, von denen angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflussen, moduliert wird. Vorzugsweise erfolgt die Modulation der Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts der Fischlarve auf Genebene, Transkriptebene oder/und Genproduktebene. Geeignete Verfahren zur Modulation der Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts auf Genebene, Transkriptebene oder/und Genproduktebene sind dem Fachmann hinreichend bekannt, wie beispielsweise die Aktivierung oder Inhibierung der Transkription des Zielgens, Stabilisierung oder Destabilisierung der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA, Aktivierung oder Inhibierung der Translation der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA, Aktivierung oder Inhibierung des Splicens der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA oder/und Aktivierung oder Inhibierung des Zielgenprodukts.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modulation der Aktivität des Zielgens durch Aktivierung und Inhibierung der Transkription des Zielgens mittels regulatorischer Proteine, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren, welche im Zusammenspiel mit der RNA-Polymerase die Transkription des Zielgens initiieren bzw. verstärken, oder Repressoren, welche durch reversible Bindung an Signalstrukturen des Zielgens, wie z.B. Operator-Sequenzen, eine Transkription des Zielgens verhindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modulation der Aktivität des Zielgens durch Stabilisierung oder Destabilisierung der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA mittels regulatorischer Proteine oder Ribozyme. Der Begriff "regulatorische Proteine" umfasst in diesem Zusammenhang sowohl Proteine, welche beispielsweise durch Komplexbildung mit der mRNA zu einer Stabilisierung derselben führen, als auch Proteine, welche durch interne Spaltung der mRNA, Degradation vom 5'-Ende der mRNA her oder 3'-5'-exonukleolytische Degradation zu einer Destabilisierung bzw. einem Abbau der mRNA führen. Der Begriff "Ribozyme" stellt einen dem Fachmann hinreichend bekannten Fachbegriff dar, der hier nicht näher erläutert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modulation der Aktivität des Zielgens durch Aktivierung oder Inhibierung der Translation der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA mittels regulatorischer Proteine, Antisense- oder/und RNAi-Moleküle. Der Begriff "regulatorische Proteine" umfasst, wie an dieser Stelle verwendet, Proteine, welche die Translation der mRNA initiieren oder verstärken, wie beispielsweise Proteine, die durch Regulation der Phosphorylierung von Initiations- und Elongationsfaktoren zu einer Aktivierung der Translation der mRNA führen, als auch Proteine, welche die Translation der mRNA blockieren. Der Begriff "Antisense-Moleküle" stellt einen dem Fachmann hinreichend bekannten Fachbegriff dar, der hier nicht näher erläutert wird. Bevorzugte Antisense-Moleküle sind kurze DNA-, RNA- oder Nukleinsäureanaloga-Fragmente (wie z.B. PNAs, LNAs, Phosphorothiot-Oligonukleotide, Morpholino-Oligonukleotide, 2-Fluoro-RNAs oder Mischverbindungen davon) mit einer Nukleinsäuresequenz von wenigstens 10 Nukleotiden, die zu einem Teilbereich der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA komplementär sind. Vorzugsweise weisen die Antisense-Moleküle eine Länge von 15–30 Nukleotiden und mehr bevorzugt von 20–25 Nukleotiden auf. Auch der Begriff "RNAi-Moleküle" stellt einen dem Fachmann bekannten Fachbegriff dar und wird hierin nicht näher erläutert. Bevorzugte RNAi-Moleküle sind doppelsträngige RNA-Moleküle mit einer Länge von wenigstens 10 Basenpaaren, vorzugsweise wenigstens 18 Basenpaaren, und besonders bevorzugt wenigstens 20 Basenpaaren. Besonders bevorzugt weisen die RNAi-Moleküle eine Länge zwischen 18 und 28 Basenpaaren und mehr bevorzugt eine Länge zwischen 20 und 23 Basenpaaren auf. Die RNAi-Moleküle können entweder synthetisch oder Verktor-basiert in den Zielzellen hergestellt werden (Elbashir et al., Nature 41 1: 494–498, 2001; Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 5515-5520, 2002). Die Sequenz der RNAi-Moleküle ist so gewählt, dass sie mit spezifischen Sequenzbereichen der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA korrespondiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modulation der Aktivität des Zielgens durch Aktivierung oder Inhibierung des Splicens der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA. Verfahren zur Aktivierung oder Inhibierung des Splicens von mRNA sind dem Fachmann hinreichend bekannt und werden nicht näher erläutert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Modulation der Aktivität des Zielgenprodukts durch Wechselwirkung des Zielgenprodukt mit einem Aktivator, Inhibitor und/oder Antikörper. Der Begriff "Aktivator", wie hierin verwendet, umfasst Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Proteinsubstrate, Proteincofaktoren sowie kleine organische Moleküle, die zu einer Stabilisierung des Zielgenprodukts und/oder zu einer Steigerung der Aktivität des Zielgenprodukts führen. Im Gegensatz dazu umfasst der Begriff "Inhibitor", wie hierin verwendet, Proteine, Proteinfragmente, Peptide oder kleine organische Moleküle, die zu einer Destabilisierung des Zielgenprodukts und/oder zu einer Verringerung oder Inhibierung der Aktivität des Zielgenprodukts führen. Des Weiteren sieht die vorliegende Erfindung auch vor, dass die Aktivität des Zielgenprodukts durch Bindung eines Zielgenprodukt-spezifischen Antikörpers verringert oder inhibiert wird. Der Begriff "Antikörper" stellt einen gebräuchlichen Fachbegriff dar und wird nicht näher erläutert.
Vorzugsweise werden die zuvor beschriebenen regulatorischen Enzyme, Repressoren, Ribozyme, Antisense- oder RNAi-Moleküle, Aktivatoren, Inhibitoren und/oder Antikörper durch Transformation in entsprechende Zielzellen der Fischlarve, z.B. Zellen eines bestimmten Organs oder Gewebes, gebracht. Die Transformation kann direkt oder mithilfe von Expressionsvektoren nach bekannten Verfahren erfolgen, z.B. durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Lipofektion, Elektroporation, Partikelbeschuss oder virale Infektion. Geeignete Expressionsvektoren umfassen sowohl virale Systeme, wie beispielsweise retrovirale (Lin et al., Science 265: 666–669, 1994) oder adenovirale Systeme, als auch verschiedene bakterielle Plasmide. Solche Vektoren sind dem Fachmann hinreichend bekannt (Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Darüberhinaus kann das Einbringen in die Larve durch Mikroinjektion im frühen (bevorzugt 1–8-Zellenstadium) Embryonalstadium erfolgen. Dies gilt auch für das Einbringen von Transgenen, etwa zur Expression von RNAi-vermittelnden kurzen RNAs oder zur Expression von anderen RNAs (kodierend oder nicht kodierend) (Stuart et al., Development 103: 403–412, 1998; Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), 4th ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000; Thermes et al., Mech. Dev.: 91, 2002; Medaka homepage http://biol1.bio.nagoya-u.ac.jp: 8000/; Sui et al., 2002, supra).
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Parameter der Fischlarve. Bevorzugte metabolische Parameter der Fischlarve sind metabolische Parameter, die in Zusammenhang mit dem homeostatischen System zur Regulation des Körpergewichts stehen, wie beispielsweise Körperfett, Glykogen oder/und Blutzucker.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens der Körperfettgehalt der Fischlarve gemessen. Dies erfolgt vorzugsweise durch Zugabe eines lipophilen Farbstoffs zu der Fischlarve und quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischlarve eingelagerten Farbstoffs. Beispiele für mögliche lipophile Farbstoffe, welche zur Bestimmung des Körperfettgehalts der Fischlarve verwendet werden können, umfassen Öl-Rot O (Oil red O; 1-([4-(Xylylazo)-xylyl]azo)-2-naphthol), Sudan Schwarz B (C₂₉H₂₄N₆), Sudan IV (C₂₄H₂₀N₄₀), Sudan Red 7B (C₂₄H₂₁N₅), wobei der lipophile Farbstoff Öl-Rot O besonders bevorzugt ist. Die quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischlarve eingelagerten Farbstoffs kann nach herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, wie z.B. visuelle oder/und photometrische Bestimmung des eingelagerten Farbstoffs. Besonders bevorzugt erfolgt die quantitative Bestimmung des eingelagerten Farbstoffs im Fall des lipophilen Farbstoffs Öl-Rot O durch Extraktion des fettgebundenen Farbstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel, wie beispielsweise Isopropanol, und photometrische Bestimmung des extrahierten Farbstoffs bei einer Wellenlänge von 525 nm.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zusätzlich zum oder statt des Körperfettgehalts der Fischlarve der Glykogengehalt der Fischlarve gemessen. Geeignete Verfahren zur Bestimmung des Glykogengehalts von Fischlarven sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens zusätzlich zur oder statt der Bestimmung des Körperfettgehalts oder/und Glykogengehalts der Fischlarve eine Bestimmung des Blutzuckerspiegels der Fischlarve. Geeignete Verfahren und Messgeräte zur Bestimmung des Blutzuckerspiegels von Fischlarven sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung des Blutzuckerspiegels der Fischlarve mithilfe eines Messgeräts, dass ein sehr geringes Blutvolumen (ca. 1μl) benötigt, beispielsweise das Gerät One Touch Ultra (LifeScan Inc., Milpitas, USA). Die Gewinnung des Blutes der Fischlarven erfolgt beispielsweise durch Öffnen der Schwanzarterie in physiologischer Pufferlösung mit anschließender leichter Zentrifugation.
Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve. Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve durch Vergleich des in Schritt (b) des Verfahrens gemessenen Gehalts des wenigstens einen metabolischen Parameters der Fischlarve, bei der die Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts, von denen angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflussen, moduliert wird, mit dem einer Referenzfischlarve und Auswertung der erhaltenen Daten. Liefert beispielsweise die Messung des Körperfettgehalts einer Fischlarve, bei der die Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts, von denen angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflussen, moduliert wird, im Vergleich zu der einer Referenzfischlarve, eine Zunahme des Fettgehalts, handelt es sich bei dem Zielgen oder/und Zielgenprodukt um ein Gen oder/und Genprodukt, welche für die Aktivierung bzw. Aufregulation des homeostatischen Systems zur Regulation des Körpergewichts verantwortlich sind. Liefert die Messung des Körperfettgehalts hingegen eine Abnahme des Fettgehalts, so handelt es sich bei dem Zielgen oder/und Zielgenprodukt um ein Gen oder/und Genprodukt, welche zu einer Inhibierung bzw. Abregulation des homeostatischen Systems zur Regulation des Körperfettgehalts verantwortlich sind. Ergibt der Vergleich der Messungen jedoch, dass beide Fischlarven einen vergleichbaren Körperfettgehalt aufweisen, sind das Zielgen oder/und Zielgenprodukt nicht an der Regulation des homeostatischen Systems zur Regulation des Körpergewichts beteiligt. Mihilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können demzufolge nicht nur Gene oder/und Genprodukte identifiziert und/oder charakterisiert werden, welche die Energiehomeostase bei einem gesunden Menschen regulieren, sondern auch Gene oder/und Genprodukte, welche für die Entstehung von Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, wie beispielsweise Obesitas, und damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe verantwortlich sind. Vorzugsweise sieht die vorliegende Erfindung daher vor, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch mit genetisch veränderten Fischlarven, z.B. transgenen Fischlarven oder durch Mutation oder insertionell veränderten Fischlarven, durchgeführt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Fischlarve die Zebrafischlarve Danio rerio. Die Zebrafischlarve kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren in jedem möglichen Entwicklungsstadium zur Identifikation und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten, welche die Energiehomeostase beeinflussen, verwendet werden. Vorzugsweise ist die Fischlarve jedoch 8 Tage, besonders bevorzugt 8 bis 14 Tage alt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Fischlarve die Medakalarve Oryzias latipes.
Zusätzlich zu dem bislang beschriebenen Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten, welche die Energiehomeostase beeinflussen, betrifft ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Wirkstoffen, welche die Energiehomeostase beeinflussen, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Fischlarve,
(b) Verabreichen einer Testsubstanz, von der angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflusst, an die Fischlarve,
(c) Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Parameter der Fischlarve und
(d) Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Bereitstellen einer Fischlarve. Vorzugseise ist die Fischlarve die zuvor bereits beschriebene Zebrafischlarve Danio rerio oder die Medakalarve Oryzias latipes. Neben Wildtyp-Fischlarven sieht die vorliegende Erfindung jedoch auch vor, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit genetisch veränderten Fischlarven durchgeführt wird.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verabreichen einer Testsubstanz, von der angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflusst, an die Fischlarve. Als Testsubstanz eignen sich insbesondere Peptide, Aptamere und niedermolekulare organische Moleküle. Um eine effiziente Wirkstoffsuche zu ermöglichen, sieht die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform vor, dass die Testsubstanz aus einer Substanzbibliothek ausgewählt ist.
Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Parameter der Fischlarve. Vorzugsweise handelt es sich bei dem wenigstens einen metabolischen Parameter, wie zuvor bereits beschrieben, um einen metabolischen Parameter des homeostatischen Systems zur Regulation des Körpergewichts, wie beispielsweise Körperfett, Glykogen und Blutzucker. Das Messen des Gehalts des wenigstens einen metabolischen Parameters der Fischlarve erfolgt wie zuvor bereits beschrieben.
Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve und erfolgt analog wie zuvor bereits beschrieben.
Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Fischlarven zur Untersuchung des homeostatischen Systems zur Regulation des Körpergewichts werden erstmals Verfahren bereitgestellt, die eine einfache, schnelle, kostengünstige und hochspezifische Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen, Genprodukten oder Wirkstoffen erlauben, welche die Energiehomeostase beeinflussen und mit der Entstehung von Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und anderen Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe in Verbindung stehen. Aufgrund der o.g. zahlreichen Vorteile, die die Fischlarve, insbesondere die Zebrafischlarve Danio rerio oder die Medakalarve Oryzias latipes, als Modellorganismus gegenüber bislang bekannten Modellsystemen aufweist, können die erfindungsgemäßen Verfahren in jedem herkömmlichen Standardlabor schnell, einfach, kostengünstig und ohne großen apparativen Aufwand eingesetzt werden, um Gene und/oder Genprodukte bzw. Wirkstoffe zu identifizieren und/oder zu charakterisieren, welche die Energiehomeostase beeinflussen. Werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Zebrafischlarven Danio rerio in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt, kann die Bestimmung des Ausmaßes der Beeinflussung des homeostatischen Systems zur Regulation des Körpergewichts direkt am lebenden Fisch beobachtet werden, z.B. durch visuell sichtbare Zu- oder Abnahme des Fettgehalts der untersuchten Fischlarve gegenüber einer Referenzfischlarve.
Ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein durch das zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifiziertes Gen oder/und Genprodukt oder einen durch das zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Wirkstoff und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und Hilfsmittel. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann in einer topisch, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan odertransdermal verabreichbaren Form vorliegen und kann mithilfe von herkömmlichen, im Stand der Technik gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten oder als intravenöse Injektion hergestellt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird zur Prävention oder/und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und anderen Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe eingesetzt.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung einem Patienten mit einem der o.g. Krankheiten in einer Menge verabreicht, die ausreichend ist, um die mit der Krankheit verbundenen Symptome zu lindern, eine weitere Ausbreitung der Krankheit zu verhindern, die Krankheit vollständig zu heilen und/oder ein Wiederauftreten der Krankheit zu verhindern. Die zu verabreichende Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung hängt dabei von mehreren Faktoren ab, wie z.B. der Wahl des zu verabreichenden Gens, Genprodukts oder Wirkstoffs (Spezifität, Wirksamkeit etc.), der Art der Verabreichung (Tablette, Injektion etc.), der Art und dem Ausmaß der Erkrankung und dem Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des Patienten, und kann ohne Weiteres von einem Fachmann unter Berücksichtigung der o.g. Faktoren bestimmt werden.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung erfolgt topisch, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan oder transdermal. Vorzugsweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten oder als intravenöse Injektion verabreicht.
Ein vierter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines durch die zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Gens und/oder Genprodukts oder Wirkstoffs zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und anderen Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundenen Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe.
Ein vierter Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft das in einer bevorzugten Ausführungsform der zuvor genannten Verfahren verwendete Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts von Fischlarven, umfassend:

(a) Zugabe eines lipophilen Farbstoffs zur Fischlarve und
(b) quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischlarve eingelagerten Farbstoffs.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Zugabe des lipophilen Farbstoffs zur Fischlarve. Dies erfolgt vorzugsweise durch Abtöten der Fischlarven, Inkubation der abgetöteten Fischlarven in einer Färbelösung, umfassend den lipophilen Farbstoff, und Entfernen des nichtfettgebundenen lipophilen Farbstoffs. Geeignete lipophile Farbstoffe, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen die bereits zuvor genannten Farbstoffe.
Schritt (b) umfasst die quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischarve eingelagerten Farbstoffs und erfolgt analog wie zuvor bereits beschrieben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts in Zebrafischlarven Danio rerio oder Medakalarven Oryzias latipes. Da die Zebrafischlarve zu Beginn ihrer Entwicklung durchsichtig ist, ermöglicht diese Fischspezies eine besonders einfache Bestimmung des Fettgehalts.
Vorzugsweise sind die Zebrafischlarven mindestens 8, insbesondere 8–14 Tage alt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um das erste bislang beschriebene Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts von Fischlarven. Bislang bekannte Verfahren zur Messung von Triglyceriden, wie beispielsweise Standard-Enzym FS, funktionieren mit Fischlarven nicht.
Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch 1 und das nachfolgende Beispiel näher beschrieben.
1 zeigt die Anfärbung des Fettgewebes von Zebrafischlarven Danio rerio in verschiedenen Entwicklungsstadien mit Öl-Rot O.
A: 27 Stunden alt,
B: 5 Tage alt,
C: 9 Tage alt, Fischlarven wurden ab dem 5ten Tag gefüttert,
D: 9 Tage alt, Fischlarven wurden nicht gefüttert.
Beispiel: Fettgehaltsbestimmung mit Öl-Rot O
Die Fischlarven wurden zunächst durch Inkubation in eiskalter Tricainlösung getötet. Für die Anfärbung der Fischlarven mit Öl-Rot O wurde zunächst eine Färbelösung aus 60 % Isopropanol/Öl-Rot O und 40 % PBS hergestellt. Diese Färbelösung wurde 10 min stehen gelassen, danach wurden unlösliche Farbpartikel über einen Zeitraum von 15 min abzentrifugiert. Die abgetöteten Fischlarven wurden für 20 min in der Färbelösung inkubiert und die Färbelösung so gut wie möglich entfernt. Nicht-fettgebundener Farbstoff wurde durch Inkubation in 60 % Isopropanol-PBS, 40 % Isopropanol-PBS und 20 % Isopropanol-PBS für jeweils 4 min entfernt. Anschließend wurde die Fischlarve nochmals 2× für jeweils 10 min in PBS-T gewaschen. Der in der Larve gebundene Farbstoff wurde anschiließend mittels Extraktion mit Isopropanol über einen Zeitraum von 15 min extrahiert. Pro 20 Larven wurden dabei 500 μl Isopropanol für die Extraktion verwendet. Der Extraktionsüberstand wurde im Photometer bei 525 nm vermessen. Die entfärbten Larven wurden nach der Extraktion nochmals 2× mit PBS-T gewaschen. Dann wurden sie homogenisiert, beispielsweise mithilfe eines FastPep-Geräts der Fa. Savant, und ihr Proteingehalt wurde gemessen. Ein korrigierter/relativer Fettwert ergab sich somit nach Teilung des bei 525 nm gemessenen Absorptionswerts durch den Proteingehalt.
Zur Vereinfachung der Versuchsdurchführung können einzelne als auch die gesamten Inkubationen in Behältereinsätzen mit Netzboden, wie beispielsweise Netwell der Fa. Costar mit einer Maschenweite von 0,75 μm durchgeführt werden.
Anmerkung: Um Unterschiede in der pro Inkubationsgefäß gegebenen Futtermenge und somit Fehler bei der Auswertung des Versuchs vollständig auszuschließen, kann bei genetischen Screens nach bzw. während der Überexpression eines Gens, nach einer Vorbehandlung mit einer chemischen Substanz, nach Injektion von Antisense-Oligonukleotiden oder nach einer RNAi-Behandlung eine Co-Inkubation mit Kontrolllarven, die eine genetische Markierung tragen, beispielsweise durch Überexpression eines fluoreszierenden Proteins, wie GFP, ein mittels einer Färbereaktion leicht nachzuweisendes Enzyms, wie β-Galactosidase, oder eine veränderte Pigmentierung, erfolgen. Unterschliedliche Umweltbedingungen können dann als Ursache für Unterschiede im Fettgehalt der Fischlarven ausgeschlossen werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Genen oder/und Genprodukten, welche die Energiehomeostase beeinflussen, umfassend: (a) Bereitstellen einer Fischlarve, bei der die Aktivität eines Zielgens oder/und Zielgenprodukts, von denen angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflussen, moduliert wird, (b) Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Parameter der Fischlarve und (c) Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgen oder/und Zielgenprodukt auf Genebene, Transkriptebene oder/und Genproduktebene moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgen der Fischlarve moduliert wird durch Aktivierung oder Inhibierung der Transkription des Zielgens, Stabilisierung oder Destabilisierung der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA, Aktivierung oder Inhibierung der Translation der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA oder/und Aktivierung oder Inhibierung des Splicens der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung oder Inhibierung der Transkription des Zielgens durch regulatorische Proteine oder/und Repressoren erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierung oder Destabilisierung der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA durch regulatorische Proteine oder/und Ribozyme erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierung oder Inhibierung der von dem Zielgen abgeleiteten mRNA durch regulatorische Proteine, Antisense- oder/ und RNAi-Moleküle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgenprodukt der Fischlarve moduliert wird durch Wechselwirkung mit einem Aktivator, Inhibitor oder/und Antikörper.
Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Wirkstoffen, welche die Energiehomeostase beeinflussen, umfassend (a) Bereitstellen einer Fischlarve, (b) Verabreichen einer Testsubstanz, von der angenommen wird, dass sie die Energiehomeostase beeinflusst, an die Fischlarve, (c) Messen des Gehalts von wenigstens einem metabolischen Paramter der Fischlarve und (d) Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Testsubstanz ausgewählt wird aus einer Substanzbibliothek, umfassend Peptide, Aptamere und niedermolekulare organische Moleküle.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine metabolische Parameter der Fischlarve Körperfett, Glykogen oder/und Blutzucker ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Körperfettgehalt der Fischlarve gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Körperfettgehalt der Fischlarve gemessen wird durch Zugabe eines lipophilen Farbstoffs und quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischlarve eingelagerten Farbstoffs.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der lipophile Farbstoff Öl-Rot O, Sudan Schwarz B, Sudan IV oder Sudan Red 7B ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des eingelagerten Farbstoffs durch visuelle oder/und photometrische Bestimmung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Bestimmen des Ausmaßes der Beeinflussung der Energiehomeostase der Fischlarve durch Vergleich des Gehalts des wenigstens einen metabolischen Parameters der Fischlarve mit dem einer Referenzfischlarve und Auswertung der erhaltenen Daten erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischlarve die Zebrafischlarve Danio rerio oder die Medakalarve Oryzias latipes ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischlarve mindestens 8 Tage, insbesondere 8–14 Tage alt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 identifiziertes Gen oder/und Genprodukt oder einen durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 identifizierten Wirkstoff und gegebenenfalls pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und Hilfsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Prävention oder/und Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und andere Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundene Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe.
Verwendung eines durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17 identifizierten Gens oder/und Genprodukts oder Wirkstoffs zur Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, insbesondere Stoffwechselerkrankungen, wie Obesitas, und andere Krankheiten, betreffend die Regulation des Körpergewichts, als auch damit verbundene Krankheiten, wie Essstörungen, Kachexie, Diabetes Mellitus, Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit, Hypercholesterinämie, Dyslipidämie, Osteoarthrose, Gallensteinleiden, Krebs, wie z.B. Krebs der Genitalorgane, und Schlafapnoe.
Verfahren zur Bestimmung des Fettgehalts von Fischlarven, umfassend (a) Zugabe eines lipophilen Farbstoffs zur Fischlarve und (b) quantitative Bestimmung des proportional zum Fettgehalt der Fischlarve eingelagerten Farbstoffs.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der lipophile Farbstoff Öl-Rot O, Sudan Schwarz B, Sudan IV oder Sudan Red 7B ist.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung des eingelagerten Farbstoffs durch visuelle oder/und photometrische Bestimmung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischlarve die Zebrafischlarve Danio rerio oder die Medakalarve Oryzias latipes ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Fischlarve mindestens 8, insbesondere 8 bis 14 Tage alt ist.