DE10251894A1

DE10251894A1 - Peptidgebundene Chromogene zur Bestimmung von Enzymaktivitäten

Info

Publication number: DE10251894A1
Application number: DE10251894A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dipl.-Ing. Spichiger; Ursula Prof. Dr. Spichiger-Keller; Michael Dr. Linnhoff; Gleb Dr. Zhylyak
Original assignee: C CIT AG WAEDENSWIL; C-CIT AG
Current assignee: C CIT AG WAEDENSWIL; C-CIT AG
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2004-05-19
Also published as: WO2004041840A2; AU2003286158A8; WO2004041840A3; AU2003286158A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I): DOLLAR F1 wobei R Alkyl, Aryl, H, Aralkyl, CN sein kann, R¶3¶, R¶6¶, R¶7¶ und R¶8¶ gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO¶2¶, NH¶2¶, Alkyl, Aralkyl, Halogen oder Alkoxy sein können, A und B identisch oder verschieden eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C-Atome und bis zu 4 N-Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt, und B gegebenenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist, C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist und X ein H-Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist, und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.

Description

Die Messung von Enzymaktivitäten ist beispielsweise für die Diagnostik von Krankheitszuständen wie Thromboembolie, Fibrinolyse, Arthritis, Wundheilung wichtig oder beim Einsatz zur Verfolgung der antikoagulierenden Therapie in Laboratorien bzw. Hospitälern in der Diagnostik. Andererseits wird die Bestimmung der enzymatischen Aktivität als Mittel zur Detektion von Pyrogenen (Endotoxinen) verwendet, die während der Sterilisation in zu injizierenden Lösungen (LAL-Test) auftreten können. Die derzeit verwendete Technik basiert auf proteolytischen Aktivität der dabei verwendeten Enzyme. Die proteolytische Aktivität des Enzyms wird als Zunahme der optischen Dichte bei Spaltung einer Peptidbindung zwischen einer spezifischen Erkennungssequenz des Peptids und des dissozierbaren Chromogens gemessen (Witt, I. 1991). Dies führt zu einer Änderung des Spektrums und der Absorption bei 405 nm während der Spaltung (Farbstofflabel: p-Nitroanilin).

Aufgabe der Erfindung war es, Peptidsequenzen, insbesondere natürlich existierende mit neuen Arten von Chromogenen zu koppeln (labeln), die bei längeren Wellenlängen, vorzugsweise von mehr als 630 nm, absorbieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Verbindungen der chemischen Formeln (I) bis (IV):

wobei R alkyl, aryl, H, aralkyl, CN sein kann, R3, R6, R7 und R8 gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, alkyl, aralky, halogen oder alkoxy sein können,
A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, Beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,
C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist,
und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.

wobei R1 und R 2 gleich oder verschieden sein können und H, CN, halogen, C1 bis C4 alkyl, aryl oder aralkyl oder alkoxy ist,
R3, R6, R7 und R8 gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, alkyl, aralkyl, halogen oder alkoxy sein können,
A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,
C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist,
und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist,
und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.

wobei R1, R2 gleich oder v erschieden sind und alkyl, ary1, H, aralkyl, CN, sind, R3, bis R6 R8 gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralkyl, halogen oder alkoxy sein können mit der Bedingung daß mindestens ein Rest aus R3 bis R6 eine Aminogruppe ist,
A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,
C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist,
und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist,
und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.

wobei R1, R2 gleich oder v erschieden sind und alkyl, aryl, H, aralkyl, CN, sind, R3, bis R6 R8 gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralkyl, halogen oder alkoxy sein können,
A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist,
C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist,
und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist,
und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.

Es wurde gefunden, dass Attenuated total reflection spectroscopy (ATRS) (abgeschwächte totale Reflektionsspektroskopie) unter Verwendung eines planaren Dünnfilmwellenleiterchips, der chemisch z.B. mit einem selektiven chemischen Polymer modifiziert wurde, als optimale optische Technologie für einen Enzymtest, insbesondere für einen Endotoxintest geeignet ist. Das eingekoppelte Licht wandert innerhalb des planaren Wellenleiters und erzeugt ein evaneszentes Feld entlang der Oberfläche. Das evaneszente Feld wandert innerhalb des benachbarten Mediums und weist eine Eindringtiefe in Größe von wenigen Nanometern auf (ungefähr 10 nm) in der Z-Richtung des wandernden Lichts auf. Die Absorption des Lichts unter Verwendung der ATRS Technik innerhalb der benachbarten Schicht korreliert mit der Änderung der Konzentration des spezifischen Analyten.

Chromophorgelabelte Substrate können erfindungsgemäß grundsätzlich über 2 Methoden erhatlen werden. Diese Substrate werden mit integrierten optischen Wellenleitern als Messplattform in Verbindung mit low-cast Halbleiterlasern im Emissionswellenlängenbereich von über 630 nm eingesetzt.

1. Chromophorlabel, die direkt oder über einen geeigneten Spacer an BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg gekoppelt werden und bei der proteolytischen Spaltung keine oder nur eine geringe Änderung der Absorptionswellenlänge aufweisen. Diese liegt dabei im Bereich von > 630 nm. Derartige Substrate können nicht in Lösung eingesetzt werden, da die Proteolyse prinzipiell nicht spektrophotometrisch verfolgt werden kann. Stattdessen werden erfindungsgemäß solche Substrate über geeignete Spacer N-terminal auf dem Wellenleiter der optischen Chips immobilisiert und die Detektion der Proteolyse über die Absorptionsänderung im Bereich des evaneszenten Feldes des Wellenleiters zu verfolgt, die durch die Diffusion des Chromophors aus demselben induziert wird. Der Chromophor muss dazu nur über eine geringe Wasserlöslichkeit verfügen, da er dementsprechend auf das Volumen der Messzelle bezogen in nur sehr kleinen Mengen freigesetzt wird.
2. Chromophorlabel, die direkt über eine beim freien Chromophor als Donor des chromophoren Elektronensystems wirkende Aminogruppe carboxy-terminal als Amid an BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg gekoppelt sind und dementsprechend bei der Proteolyse einen bathochromen Shift des Absorptionsmaxiums zeigen. Wie im ersten Fall weisen solche Chromophore in freier Form bei > 630 nm ausreichende Absorption auf. Derartiggelabelte Peptidsubstrate sind allerdings für eine Immobilisierung auf dem Wellenleiter des optischen Chips nicht optimal, da die bei der geforderten Wellenlänge im evaneszenten Feld detektierbare Spezies, der freie Chromophor, nach der Proteolyse zum Großteil aus demselben herausdiffundiert und somit die Sensititivität des Systems immanent eingeschränkt ist. Die Detektion in Lösung mit herkömmlichen Konzentrationen von gelabeltem Substrat ist dagegen mit optischen Chips als Messplattform vorteilhaft, sofern die Wasserlöslichkeit des Chromophors genügend hoch ist.

Es wurde gefunden, dass Chromogene, welche direkt an das Substrat gebunden sind, nur eine beschränkte Molekülgröße aufweisen dürfen, um den enzymatischen Angriff durch die Zielprotease nicht zu behindern. Bekannte Beispiele sind 7-Amino-4-methycumarin (AMC) und 2-Aminacridon (2-AA).

Die folgenden Substrate und Koagulagene wurden hergestellt:

1 . BOC-Ser(Bn)-Gly-Arg(HCl)-pNA: Dieses Substrat wurde als Referenz für enzymatische Spaltungstest in Lösungen verwendet. Messungen auf einem Chip waren nicht möglich, da die Wellenlänge von ungefähr 405 nm mit dem Laserspektrometer nicht zugänglich ist.
2. Nilblau als Chromogen, das an 4-Aminobenzoesäure (als Linker) in Form eines Carboxylamids gekoppelt ist.
3. Meldolablau als Chromogen, das an 1,4-Phenylendiamin(Linker) gekoppelt ist. Dies führt weiter zu einem 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamindo)-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin.

Beide Substrate (im Folgenden auch als LAL-Substrate benannt) wurden durch Trypsin gespalten, obgleich ein spektraler Shift nicht auftrat. Jedoch konnte eine Änderung der Absorbanz bei bei 641 und 674 nm in Lösung entdeckt werden, da das Chromogen vom Substrat abgespalten wurde und in Lösung nahezu unlöslich ist. Die Absorptionsspektren und die Absorptionskoeffizienten wurden in verschiedenen Lösungsmitteln bei einem pH-Wert von 7 und einer Temperatur von 37°C charakterisiert.

Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Aminonaphthochinone alle Anforderungen an ein Chromogen, das an ein Peptid gekoppelt ist, erfüllen. Beispiele für erfindungsgemäße Naphthochinone sind:

Während 4 in Ethanol die langwelligste Absorptionsbande bei 479 nm besitzt, ist diese im Vergleich dazu bei 5 nm 33 nm bathochrom verschoben. Bei 6-Amino-2,3-dicyano-l,4-naphthochinon (6), bei dem für die Absorptionsbande aufgrund der im Vergleich zu den Chlorsubstituenten in 5 stärker elektronenziehend wirkenden Cyanosubstituenten ein weiterer bathochromer Shift erfolgt. Demzufolge liegt die Absorptionsbande von 6 in Ethanol bei etwa 630 nm.

Diese sind eine Klasse von Chromogenen, deren Spektren sich nach enzymatischer Hydrolyse ändern, insbesondere durch einen Wechsel des Absorptionsmaximums hin zu längeren Wellenlängen. Bei diesen Chromogenen ist das Chromogen über die Aminoendständige Gruppe an das Peptid (Arginin) an der 6-Amino-Position verbunden und wechselt sein Spektrum nach der Hydrolyse der Amid-Gruppe. Auch hier sind die Amino-1,4-naphthochinone gegebenenfalls über einen Linker an die Peptidsequenz gebunden.

Durch das Koppeln des Chromogens an das Peptid wurde beispielsweise das Substrat BOC-Ser-(Bz)-Gly-Arg-6ANC erzeugt; das Peptidsubstrat zeigte eine Absorbanz von A < 0,06 bei einer Wellenlänge λ = 479 nm und eine Basislinienabsorbanz bei 550 nm. Durch Zugabe von Trypsin bei einem pH-Wert von 7,4 zeigte sich schnell ein Absorptionsmaximum von freien ANC bei einer Wellenlänge λ = 479 nm und einer zweiter entsprechenden Wellenlänge λ 550 nm. Durch Vergleich der Effekte von elektronenakzeptierenden Substituenten auf die Absorptionsspektren von existierenden Chromophoren (7-Amino-4-methylcumarin und 2-Aminoacridon) wurde gefunden, dass der bathochrome Effekt von Elektronendonorsubstituenten in der Größenordnung von ungefähr 100 nm liegt.

Sensitive Schichten, On-chip Immobilisierung:
Die Chipoberfläche wurde unter Verwendung zweier verschiedener Verfahren chemisch modifiziert und funktionalisiert:

1. Durch Aufbringen einer selektiven Polymerschicht auf den Wellenleiter.
2. a) Durch Immobilisierung von spezifischen Chromophoren auf der Oberfläche des Chips, die durch einen Linker (Avidin-Biotin, Suberinsäure, Kohlenwasserstoffketten, Hexylendiamin, Sulfhydrylgruppen) verbrückt sind. b) Durch Immobilisieren chromogener Substrate (spezifischer Oligopeptid, der gelabelt wie vorstehend benannte Farbstoffe auftritt) auf dem Wellenleiter.

Innerhalb der polymeren Membran zeigte der Farbstoff einen spektralen Shift aufgrund verschiedener Mechanismen. Unter Verwendung chromogener Substrate wird der Farbstoff vom immobilisiertem Peptid nach Zugabe des Enzyms (z.B. Serinprotease) abgespalten. Nach Spaltung wechselt der Chromophor sein Spektrum oder wenigstens seine Verteilung und diffundiert aus der Erkennungschicht näher an die Oberfläche des Wellenleiters (diffusionsbeschränkter Prozess).

Aufbringen der Schichten des Erkennungsbereiches erfolgte (mittels eines Pipettors "Genesis NPS") mit einem aktiven Tip M (Volumina) von Tecan. Die Substrate können als optisch aktive Materialien auf definierten Gebieten auf der Oberfläche des optischen Chips abgelagert werden.

Biosensoren

Biosensoren basieren auf einer Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im weitesten Sinne spezifische Analyten erkennen mit physikochemischen Transduktoren, die ein biologisch erzeugtes Signal in elektrische Messsignale umwandeln. Bioaktive Erkennungskomponenten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf Antikörper, Enzyme, Zellorganellen oder ganze Mikroorganismen. Auch Peptide bzw. Proteine werden als Biomoleküle bezeichnet. Jedoch sind Peptide nicht bioaktiv, indem sie andere Moleküle umsetzen können oder spezifische Bindungen an weitere Moleküle fördern. Bei Biosensoren werden zwei Grundtypen voneinander unterschieden: Einerseits die sogenannten Bioaffinitätssensoren und andererseits die sogenannten Metabolismussensoren. Die Bioaffinitätssensoren generieren ein Signal durch Komplexbildung von bioaktiven Molekülen zu einem Analyten. Hierbei liegt nach der Messung wieder der Ausgangszustand vor. Während letztere auf einer spezifischen Erkennung und anschließenden Umsetzung von Substraten beruhen. Nach dem Messvorgang muss dieser Sensor entweder verworfen oder der Ausgangszustand wieder hergestellt werden.

Enzyme

Enzyme im Sinne der Erfindung sind hochspezialisierte Proteine, die biochemische Reaktionen katalysieren ohne dabei verbraucht zu werden. Ribozyme, die unter dem Begriff Enzyme subsumiert werden können, umfassen Ribonukleinsäuremoleküle. Enzyme übertreffen in ihren katalytischen Eigenschaften synthetische Katalysatoren. Enzyme weisen eine hohe Affinität und Selektivität zu bestimmten Substraten auf. Wichtig unter den Enzymen sind insbesondere Protestasen, die sogenannten Serinproteasen I, wie beispielsweise Trypsin, bakterielle Serinproteasen II, wie beispielsweise Subtilisin, Zysteinproteasen wie Papain, Aspertatproteasen, wie Penicilopepsin, Metalloproteasen I wie Borincoridoxidpeptidase A, bakterielle Metalloproteasen II, wie Thermolysin, umfassen. Proteasen verdauen stets an einer bestimmten Stelle an einem Peptid bzw. Protein. Endopeptidasen hydrolisieren innerhalb eines Proteins bestimmte Amidbindungen, während Exopeptidasen C oder N terminal eine bis drei Aminosäuren vom Peptid abspalten.

Chromogene

Chromogene sind Moleküle, die elektromagnetische Strahlung, beispielsweise sichtbares Licht, UV oder IR, absorbieren können. Der Begriff "Chromogen" umfasst dabei erfindungsgemäß auch die sogenannte Leukoform, wie auch das eigentliche Chromophor, das insbesondere im Bereich des sichtbaren Lichtes absorbiert. Üblicherweise zeichnen sich Chromogene durch ausgedehnte konjugierte Verbindungssysteme aus, bei denen die Π-Π*-Übergänge ins Sichtbare verschoben sind.

Weitere geeignete Chromogene neben den Grundkörpern Medolablau und Nilblau sind beispielsweise aminosubstituierte 1,4 Naphthochinone wie beispielsweise 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon und 6-Amino-2,3-dicyano-l,4-naphthochinon). Ebenso können natürlich auch die 4 bzw. 5 Aminonaphthochinone verwendet werden. Weitere geeignete Chromogene sind beispielsweise 2-anilino-3-chloro-l,4-naphthochinon, 2-(4-N,N-diethylamino-phenyl)-1,4-naphthochinon, 2,3-dicyano-1,4naphtholdiol, 2,3-dicyano-1,4-naphthochinon, 2,3-dicyano-l,4-naphthochinon-l-phenylenimin, 4-nitro[2.2]paracyclophane bzw. nitrierte Paracyclophane und einfache Cyclophane.

Figuren

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen beispielhaft erläutert. Es ist klar, dass die vorstehend erläuterten und nachstehend noch zu beschreibenden Merkmale nicht nur in Kombination, sondern auch in Alleinstellung beansprucht werden.
1 zeigt ein Syntheseschema für die Darstellung eines mit einem Eminonaphtochinon gelabelten Peptids.
2 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von 6-Amino-l,4-Naphtochinon.
3 zeigt das¹H-NMR-Spektrum von Verbindung 15.
4 zeigt das¹H-NMR-Spektrum von Verbindung 16.
5 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum von 6-Nitro-2,3-dichlor-l,4-naphthochinon (Verbindung 22).

DMF: N,N-Dimethylformamid
NEt₃: Triethylamin
EE: Essigsäureethylester
DC: Dünnschichtchromatographie
IBCF: Isobutylchloroformiat
AcOH: Eisesssig
iPrOH: 2-Propanol
BOC: Benzyloxycarbonyl
MeOH: Methanol
R_F: Retentionsfaktor
nBuOH: n-Butanol
ANC: Aminonaphthochinon
TsCC: Tosylchlorid
EtOH: Ethanol
DCM: Dichlormethan
FC: Flashchromatographie

Beispiel 1
Nilblau als chromogener Baustein
Synthese von 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5 yliden)benzoesäureamid

1.1. Synthese von 4-Amino-N-(9-diethylamino-benzo(a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid Schritt A: 4-Nitro- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 11.3 g Nilblau A wurden in 140 ml DMF eingerührt und 11 g NEt₃ zum Gemisch hinzugefügt, gefolgt von 7.2 g 4-Nitrobenzoesäure-N-oxy-succinimidylester. Nach Rühren über Nacht wurde das Lösungsmttel an Vakuum und Hochvakuum entfernt, der Rückstand auf Kieselgel 60 adsorbiert und die Titelverbindung nach Aufbringen desselben auf eine mit CHCl₃/EE 8:1 (v/v) konditionierte, mit Kieselgel 60 gefüllte Chromatographiesäule mit demselben Lösungsmittelgemisch eluiert. Ausbeute: 5.6 g Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.60 (CHCl₃/EE 11:1 v/v) Schritt B: 4-Amino-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 4 g 4-Nitro- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid wurden in 70 ml Eisessig gelöst und unter Rühren mit 10 g Zinkstaub versetzt. Nach einer halben Stunde Rühren wurde das Lösungsmittel im Vakuum weitgehend entfernt und der Rückstand mit CHCl₃ in einen Schütteltrichter überführt. Die organische Phase wurde mit 2 N NaOH gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der verbleibende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 aufgereinigt (CHCl₃/MeOH 40:1 v/v). Ausbeute: 2.2 g Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.24
1.2 Synthese von (4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid) Schritt A: 4-(N_αN_δN_ω tri-Z-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo(a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 2.88 g (N_αN_δN_ω tri-Z-L-arginin wurden unter Argon in 8 ml abs. DMF in der Hitze gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 0.7 ml NEt₃ und 0.65 ml IBCF zugegeben und das resultierende Gemisch während 20 min gerührt. Danach fügte man 1.32 g 4-Amino-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid zu und rührte das Reaktions-gemisch über 12 h bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl₃/EtOH 30:1 v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 2.89 g Reinheitskontrolle: DC R_F – 0.34 Schritt B: 4-( L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 750 mg 4-(N_αN_δN_ω tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid wurden in 20 ml Dioxan gelöst und unter Nachspülen mit 30 ml McOH zu einer vorhydrierten Suspension von 500 mg Palladium auf Aktivkohle (10%, etwa 50%o Wassergehalt) in 50 ml McOH gegeben. Nach 3 h Hydrieren bei intensivem Rühren unter 1.1 bar H₂ wurden 12.5 ml 1 %-ige methanolische HCl zum Reaktionsgemisch gegeben und dasselbe über Celite filtiert. Nachdem man das Filtrat im Vakuum vom Lösungsmittel befreit hatte, wurde der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (iPrOH/AcOH/H₂O 3:2:2 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 250 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.20 Schritt C: 4-(((Na BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 453 mg 4-(L-arginylamido)- N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid und 433 mg N_α-BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl-N-oxysuccinimidylester wurden mit einem Gemisch von 7.5 ml DMF und 91 mg NEt₃ versetzt und die resultierende Lösung über 12 h gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum wurde der resultierende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (iPrOH/AcOH/H₂O 4:1:1 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 350 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.18 Schritt D: 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid 222 mg 4-(((N_α BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5-yliden)benzoesäureamid wurden in einem Gemisch von 10 ml DCM und 10 ml TFA über 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum und anschließend im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl₃/MeOH/AcOH 1:2:2 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 180 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.17 (iPrOH/AcOH/H₂O 2:1:1 v/v/v)

Beispiel 2
Meldolablau als chromogener Baustein
Synthese von 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5 yliden)anilin

2.1 Synthese von 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin Schritt A: 4-Nitro-N-(9-dimethylamino-benzo[ajphenoxazin-5-yliden)anilin (ETH^T 6005) 7.03 g Meldolablau und 3.28 g 4-Nitroanilin wurden unter Argon gesetzt. Anschließend gab man 172 ml über Molekularsieben getrocknetes DCE und 8 ml ebenfalls über Molekulasieben getrocknetes NEt₃ zu und kochte die resultierende Suspension während 12 h am Rückfluss. Nach dem Erkalten gab man 110 g neutrales Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe III) zum RG und engte im Vakuum und anschließend Hochvakuum ein. Das Rohprodukt wurde anschließend an 200 g neutralem Aluminiumoxid (Aktivitätsstufe III) chromatographiert (Gradient von Hexan/DCM 1/1 bis zu reinem DCM). Das resultierende Produkt wurde aus DCM/EE umkristallisiert. Ausbeute: 2.7 g Reinheitskontrolle: DC R_F. Schritt B: 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin Eine Suspension von 413 mg 4-Nitro-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin in 8 g Eisessig wurde bei RT unter Rühren mit 1.1 g Zinkstaub versetzt. Die zuvor tiefblaue Suspension ging dabei in eine hellgrüne Lösung über. Nach 15 min wurde das RG im Vakuum weitgehend von AcOH befreit und mit DCM in einen Schütteltrichtertrichter überführt. Man wusch mit 2 N NaOH und extrahierte die wässrige Phase nochmals mit DCM. Nach Trocknen über MgSO₄ und Einengen im Vakuum wurde die Titelverbindung in für die nachfolgende Kopplung ausreichender Reinheit erhalten. Ausbeute: 346 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.45 (MeOH/AcOH 2:1 v/v)
2.2 Synthese von 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylaminobenzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin Schritt A: 4-(N_αN_δN_ω tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin 378 mg N_α,N_δ,N_ω-tri-Z-L-arginin wurden unter Argon in 1.2 ml abs. DMF in der Hitze gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 66 mg abs. NEt₃ und 90 mg IBCF zugegeben und das resultierende Gemisch während 20 min gerührt. Danach fügte man eine Lösung von 250 mg 4-Amino-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin in 3.5 ml DMF zu und rührte das Reaktionsgemisch über 12 h bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (CHCl₃/MeOH/AcOH 13:1:1 v/v/v) aufgereinigt. Das resultierende Acetat wurde in DCM aufgenommen, mit 2 N NaOH gewaschen und die organische Phase über K₂CO₃ getrocknet und im Vakuum eingeengt. Ausbeute: 338 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.21 Schritt B: 4-( L-arginylamido)-N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin 200 mg 4-(N_α,N_δ,N_ω-tri-Z-L-arginylamido)- N-(9-dimethylamino-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin wurden in 18 ml McOH suspendiert respektive teilweise gelöst und zu einer vorhydrierten Suspension von 155 mg Palladium auf Aktivkohle (10%, etwa 50% Wassergehalt) in 6 ml McOH gegeben. Nach 2 h Hydrieren bei intensivem Rühren unter 1.1 bar H₂ wurden einige Tropfen Eiseesig ins Reaktionsgemisch gegeben und dasselbe über Cellit filtiert. Nach Befreien des Filtrats vom Lösungsmittel im Vakuum wurde die Titelverbindung in für die nachfolgende Umsetzung ausreichender Reinheit erhalten. Ausbeute: 105 mg Reinheitskontrolle: DC R_F. Schritt C: 4-(((N_α BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-dimethylaminobenzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin 73 mg N_α BOC-(benzyl-L-serinyl))-L-glycyl-N-oxysuccinimidylester und 81 mg 4-( L-arginylamido)-N-(9-dimethylammo-benzo[a]phenoxazin-5-yliden)anilin wurden mit einem Gemisch von 1 ml DMF und 22 mg NEt₃ versetzt und die resultierende Lösung über 12 h gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Hochvakuum wurde der resultierende Rückstand chromatographisch über Kieselgel 60 (nBuOH/AcOH/H₂O 5:1:1 v/v/v) aufgereinigt. Ausbeute: 65 mg Reinheitskontrolle: DC R_F = 0.23 Schritt D: 4-((Benzyl-L-serinyl-L-glycyl)-L-arginylamido)-N-(9-diethylamino-benzo[aJphenoxazin-5-yliden)anilin

Beispiel 3
Naphthochinon als chromogener Baustein
Zunächst wurde Verbindung 4 nach dem in der Literatur beschriebenen Verfahren synthetisiert (vgl. experimenteller Teil) und anschließend an Z-Arg(Z₂)-OH (13) gekoppelt.
Nach dem entschützen zu 16 erfolgte die Synthese des Substrats 18 BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC ohne Schwierigkeiten (s. Schema 2).
Schema 2: Schema der Synthesen von 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) und BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18)
Synthesestrategie zur Darstellung der Chromogenlabel 4, 5 und 6 Da die Synthese von 5 und 21 ausgehend über 22 ohne Schwierigkeiten erfolgt, wurde alternativ die Synthese von 4 folgendermaßen durchgeführt:
Für die Darstellung von 6 wurde folgender Weg gewählt:
Alternativ erfolgte die Umsetzung von 5 zu 6 über 25:

3.1 Synthese von 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) 3.1.1 p-Toluolsulfonsäure- β-naphthylamid (8) 55.7 g (389 mmol) β -Naphthylamin (7) wurden in 111 g (1.4 mol = 113 ml) Pyridin gelöst und unter Rühren bei RT portionsweise mit 84.8 g (393 mmol = 1.01 eq.) TsCl versetzt. Man liess etwa 2 h rühren, dann wurde das RG auf das Gemisch von 175 ml konz. HCl und 500 g Eis gegossen. Das RP wurde abfiltriert und das Filtrat einmal mit Ether extrahiert. Daraufhin wurde das RP in DCM gelöst und die Lösung mit der Etherphase vereinigt. Man wusch mit ges. CuSO₄ (bis keine Intensivierung der Farbe mehr festzustellen war) und ges. NaCl, trocknete über MgSO₄ und engte an RV und HV ein. DC (H/EE 2:1) zeigte nur geringe, am Startfleck verbleibende rötliche Verunreinigungen an. Ausbeute: 101.98 g (342.9 mmol = 88%). 3.1.2 1,6-Dinitro p-toluolsulfonyl-2-naphthylamid (9) 29.7 g (100 mmol) Tosylat 8 wurden in 89 ml auf 55 °C erwärmtem Eisessig gelöst und unter Rühren langsam mit 20.8 ml 72%-iger HNO₃ (aus Gemisch von 18 ml 65%-iger HNO₃ und 4.5 ml rauchender HNO₃) versetzt. Man liess das RG unter Rühren auf RT abkühlen, worauf ein Teil des Produkts in Form eines hellgelben Festkörpers auskristallisierte, versetzte das RG mit 10 ml Wasser und saugte nach 10 min über eine Glasfilternutsche ab. Durch Waschen mit wenig halbkonzentrierter HOAc und Trocknen am HV wurde die Titelverbindung in reiner Form gewonnen. Ausbeute: 27.9 g (72 mmol = 72%). 3.1.3 6-Nitro-2-diazo-l-naphthol (10) 13 g (33.6 mmol) 9 wurden in 26 ml konz. H_ZSO₄ eingerührt und das Gemisch anschließend auf 40°C erwärmt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Das RG wurde dann auf < 20°C gekühlt und unter Rühren mit der Lösung von 3.12 g (45 mmol = 1.3 eq.) NaNO₂ in 14.3 ml konz. HzSO₄ versetzt. Danach gab man unter Rühren portionsweise 52 ml Eisessig zu und rührte das RG, bis keine Phasentrennung mehr sichtbar war. Anschließend wurde das RG langsam in 1.51 Eiswasser (50% Eis) gegeben und das Ganze über Nacht stehengelassen. Das Produkt wurde abgesaugt und am HV getrocknet. Ausbeute: 6.67 g (31 mmol = 92%). 3.1.4 6-Nitro-l-naphthol (11) 7.82 g (36.3 mmol) 10 wurden unter Kühlen (∼ 10 °C) im Gemisch von jeweils 58.6 ml Eisessig und konz. H₂SO₄ gelöst. Diese Lösung gab man über einen Zeitraum von etwa 15 nun zur gut gerührten, auf 55°C erwärmten Suspension von 19.55 g Cu₂O in 156 ml EtOH. Anschließend erwärmte man das RG auf 80 °C, wobei man darauf achtete, dass diese Temperatur nicht überschritten wurde, gab noch 5.45 g Cu₂O zum RG und ließ noch 30 min rühren. Anschließend wurde das RG durch eine Glasfilternutsche (D3) filtriert, der Rückstand mit wenig siedendem EtOH gewaschen und das Filtrat am RV bei 60°C Badtemperatur eingeengt, bis man den Grossteil des gebildeten Essigesters entfernt hatte. Dasselbe wurde in 780 ml Eis/Wassermischung eingerührt (2/3 Eis) und das resultierende Gemisch über Nacht bei RT stehengelassen. Anderntags wurde mit DCM extrahiert, der Extrakt über MgSO₄ getrocknet, am RV eingeengt und der resultierende bräunlich orangerote Festkörper am HV getrocknet. Die Titelverbindung wurde durch Filtration über Kieselgel (∅ = 5 cm, h = 5 cm, Hexan/Essigester 3:1) und anschließendes Einengen und Trocknen rein in Form eines orangeroten Festkörpers gewonnen. Rf: 0.25 (Hexan/Essigester 3:1) Ausbeute: 2.61 g (13.8 mmol = 38%). 3.1.5 6-Amino-l-naphthol (12) 2.1 g (11.1 mmol) 11 wurden in 21 ml iPrOH gelöst und zum gut vorhydrierten Gemisch von 5.5 ml Ra-Ni Suspension und 5.5 ml iPrOH gegeben. Das RG wurde unter intensivem Rühren 3 h bei RT unter 3 bar H2 hydriert, anschließend saugte man den Katalysator über eine Glasfilternutsche ab und wusch mit Aceton nach. Das RP wurde in wenig Aceton gelöst über Kieselgel filtriert (∅ = 5 cm, h = 10 cm, Hexan/Essigester 3:2), anschließend in Essigester gelöst und 12 daraus nach Versetzen mit Hexan in Form farbloser Kristalle erhalten. Rf: 0.28 (Hexan/Essigester 3:2) Ausbeute: 1.64 g (10.3 mmol = 93%).
3.1.6 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) Zu einer auf 10°C gekühlten, gerührten Lösung von 400 mg (2.52 mmol) 6-Amino-1-naphthol (12) in 24.8 ml McOH, welche man in einem 500 ml Zweihalskolben vorgelegt hatte, tropfte man unter sanftem Ar-Strom über eine 1/2 h eine gekühlte Lösung (5-10°C) von 1.55 g (5.78 mmol = 2.3 eq.) Kaliumnitrodisulfonat (Fremysches Salz) [14, 15] in 25 ml 1/6 M KHP₂O₄ und 88 ml Wasser. Nachdem im RG kein Edukt mehr vorhanden war, etwa nach 45 min, wurde das RG mit Essigester extrahiert, der Extrakt über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Nach Aufreinigung über FC (∅ = 3 cm, h = 20 cm, Hexan/Essigester 3:2) wurden 271 mg (1.56 mmol = 62%) reine Titelverbindung in Form dunkelvioletter Kristalle erhalten. Rf: 0.32 (DCM/Essigester 10:1)
3.2 Synthese von BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18) 3.2.1 Z-Arg(Z₂)-6ANC (15) 1.038 g (1.8 mmol) Z-Arg(Z₂)OH (13) wurden mit einem Rührmagneten unter Ar in einem ausgeheizten und mit Septum verschlossenem 25 ml Kolben vorgelegt und mittels einer Spritze mit 2.7 ml absolutem THF versetzt. Nachdem man durch Rühren bei RT eine klare Lösung erhalten hatte, wurde das RG auf -5°C gekühlt und unter Rühren durch das Septum mit 249 μl (181.8 mg = 1.8 mmol, Hamilton-Spritze) absolutem NEt₃, gefolgt von 234 μl (246.3 mg = 1.8 mmol, Hamilton-Spritze) frisch destilliertem Isobutylchloroformiat versetzt. Man ließ etwa 1/2 h bei -5°C rühren und gab dann die Lösung von 156 mg (0.9 mmol= 0.5 eq.) 6-Amino-l,4-naphthochinon (4) in 1.5 ml trockenem DMF in einem Schuss zu. Nach 1/2 h Rühren bei –5°C wurde die Kühlung entfernt und das RG noch 6 h bei RT gerührt. Das RG wurde am RV eingeengt und gründlich am HV getrocknet. Nach Aufreinigung via FC ((6 = 3 cm, h = 20 cm, DCM/Essigester 11:1 bis nach der Elution von überschüssigem 6ANC (4), dann DCM/Essigester 10:1) wurden 270 mg (369 μmol = 41%)7 reine Titelverbindung in Form eines hellgelben Festkörpers erhalten. Rf: Z-Arg(Z₂)-6ANC (15): 0.25 (DCM/Essigester 10:1) 6ANC (4): 0.32 (DCM/Essigester 10:1) P1 (Nebenprodukt): 0.53 (DCM/Essigester 10:1 3.2.2 Arg-6ANC (16) 100 mg (137 μmol) Z-Arg(Z₂)-6ANC (15) wurden in ca. 4 ml 1,4-Dioxan gelöst und unter Nachspülen mit wenig McOH zu der vorhydrierten Suspension von 37 mg Pd/Aktivkohle (10%, 50% Wassergehalt) in 10 ml McOH gegeben. Das Gemisch wurde unter intensivem Rühren für 2 1/2 h unter 1.2 bar H₂ in einem Rührautoklaven hydriert. Man gab 2.28 ml 1%-ige methanolische HCl (273 μmol = 2 eq.) zum RG und saugte den Katalysator unter Nachspülen mit McOH über eine mit Celite gestopfte Glasfilternutsche ab. Das Filtrat wurde an RV und HV zur Trockene eingeengt und via FC (∅6 = 1 cm, h = 20 cm, 1-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1) aufgereinigt. Nach Einengen an RV und HV wurden 56.6 mg (126 μmol = 92%o) Titelverbindung als Diacetat in Form eines grünlich-gelben Festkörpers erhalten. Rf: 0.47 (1-Butanol/HOAc/Wasser 3:1:1) 3.2.3 BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18) 26 mg (57.8 μmol) Arg-6ANC (16) und 36 mg (80 μmol = 1.38 eq.) BOC-Ser(Bz)-Gly-OSu (17) wurden in 0.4 ml trockenem DMF gelöst (bräunlichgelbe Lösung) und 13.8 μl (10.5 mg = 1.8 eq.) NEt₃ mittels einer GC-Spritze zugefügt. Das RG wurde über Nacht geschüttelt und anschließend am HV vom Lösungsmittel befreit. Die nach FC (∅ = 1 cm, h = 20 cm, CHCl₃/MeOH/HOAc 8:1:1 bis kurz vor (gut sichtbarer) Elution von 18, dann CHC1₃/MeOH/HOAc 7:1:1) erhaltene Produktfraktion wurde an RV und HV zur Trockene eingeengt und anschließend zur Abtrennung von Resten von Kieselgel in CHC suspendiert und filtriert. Nach Einengen resultierten 27 mg (37.2 μmol = 64%) der geringfügig apolar verunreinigten Titelverbindung als Monoacetat in Form eines bräunlich-gelben Pulvers. Rf: 0.11- 0.25 (CHC1₃/MeOH/HOAc 8:1:1)
3.3 Synthese von 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (5) 3.3.1 6-Nitro-2,3-dichlor-l,4-naphthochinon (22) 5 g (22 mmol) 2,3-Dichloro-l,4-naphthochinon wurden zu 15 ml konz. H₂SO₄ gegeben und das Gemisch unter Rühren auf 80°C erwärmt, bis man eine klare Lösung erhielt. 30 ml rauchende HNO₃ wurden zugegeben und das RG während 1 h bei 80 – 90°C gerührt. Anschließend wurde dasselbe in 800 ml Eiswasser gegeben und die Fällung abgesaugt. Das Filtrat wurde mit Ether extrahiert und mit der Extrakt mit der Lösung der Fällung in Ether vereinigt. Man wusch zweimal mit ges. NaHCO₃ und einmal mit ges. NaCl, trocknete über MgSO₄ und engte ein. Das RP wurde auf 3 große Polylöffel Kieselgel aufgezogen und via FC (∅ = 5 cm, h = 20 cm, Hexan/Essigester 5:1) aufgereinigt. Dabei resultierten 1.12 g (4.13 mmol = 16.5%) reine Titelverbindung in Form zitronengelber Blättchen. Rf: 5-Nitro-2,3-dichlornaphthochinon (22): 0.38 (Hexan/Essigester 5:1) 5-Nitro-2,3-dichlornaphthochinon: 0.16 (Hexan/Essigester 5:1) 3.3.2 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (5) a.) 135 mg (0.5 mmol) 6-Nitro-2,3-dichloro-l,4-naphthochinon (22) wurden in 0.7 ml heissem Eisessig gelöst und unter Ar die Lösung von 450 mg SnCl₂ Dihydrat (2 mmol) in 3-4 Tropfen konz. HCl zugegeben. Das RG wurde bei Rühren unter Ar auf 80°C erhitzt, bis Farbumschlag von violett nach schmutziggelb erfolgte (wenige Minuten). Durch Zugabe von 0.7 ml konz. HCl fällte man das Hydrochlorid von 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthohydro-chinon und saugte ab. Nach Trocknen am HV löste man das RP in wenig Wasser (ca. 5 ml) und säuerte mit viel konz. HCl an. Das nach etwa halbstündigem Kühlen im Eisschrank auskristallisierte Hydrochlorid wurde abgesaugt und am HV gründlich getrocknet. Es resultierten 81 mg (287 μmol = 57%) 6-Amino-2,3-dichloro-l,4-naphthohydrochinonhydrochlorid in Form eines leicht gelblichen Pulvers. b.) 22.8 mg (81 μmol) Hydrochlorid wurden in 2 ml Wasser gelöst und unter Rühren mit einer Lösung von etwa 500 mg FeC₁₃ in einigen ml Wasser versetzt, worauf sich das RG augenblicklich tiefviolett färbte. Nach etwa • h Rühren wurde das RG mit Essigester extrahiert, der Extrakt über MgSO₄ getrocknet und eingeengt. Es resultierten 19 mg (78 μmol = 97%) reine Titelverbindung in Form tiefvioletter Kristalle. Rf: 0.45 (Hexan/Essigester 1:1)

Beispiel 4
Enzymatische Spaltung von BOC-Ser(Bz)-Gly-Arg-6ANC (18) mit Trypsin (bovine pancreas)
Stammlösungen:

TRIS-Puffer: 4.41 g (30 mmol) CaCl₂ . 2 H₂O und (2x konz.) 1.211 g (10 mmol) TRIS in 100 ml Wasser, mit 0.1 M HCl auf pH 7.4 eingestellt
Trypsin: 1 mg Trypsin (bovine pancreas) in 100 ml 0.001 M HCl gelöst, 5 ml davon mit 0.001 M HCl auf 100 ml verdünnt => 0.5 mg/l.
Substrat: 4.34 mg (6 μmol) in 240 ml DMSO gelöst, dazu 2.4 ml TRIS-Puffer (2x) und 2.16 ml Wasser. Konzentration: 1.25 mM Die Stammlösung wurde zweimal in einer Pasteurpipette über etwas Baumwolle filtriert. Nach zweitägigem Stehenlassen des für die Versuche nicht verwendeten Rests hatte sich ein feiner, aber deutlicher Bodensatz gebildet.

Messlösungen:
Die Messlösungen wurden direkt in den Messküvetten derart hergestellt, dass in 2 ml Gesamtvolumen 25 μg/1 Trypsin, 100 μl DMSO (5%), einfache TRIS-Pufferkonzentration (0.015 M CaC1₂, 0.005 M TRIS) und die angegebene ideale Substratkonzentration enthalten waren. Die Trypsinlösung wurde nach 15 minütigem Tempern der Lösung auf 37.2 °C unmittelbar vor Messbeginn zugegeben.

Claims

Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I):
wobei R alkyl, aryl, H, aralkyl, CN sein kann, R₃, R₆, R₇ und R₈ gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralky, halogen oder alkoxy sein können, A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist, C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminate Aminogruppen ist, und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.
Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (II)
wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und H, CN, Halogen, C1 bis C4 alkyl, aryl oder aralkyl oder alkoxy ist, R₃, R₆, R, und R₈ gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralkyl, halogen oder alkoxy sein können, A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist, C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist, und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist, und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.
Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (III)
wobei R₁, R₂ gleich oder verschieden sind und alkyl, aryl, H, aralkyl, CN, sind, R₃, bis R₆ gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralkyl, Halogen oder alkoxy sein können mit der Bedingung, dass mindestens ein Rest aus R₃ bis R₆ eine Aminogruppe ist, deren einer Stickstoffsubstituent das Motif X-A-B-C- aufweist, wobei A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, Beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist, C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist, und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist, und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.
Chemische Verbindung der allgemeinen Formel (IV)
wobei R₁, R₂ gleich oder v erschieden sind und alkyl, aryl, H, aralkyl, CN, sind, R₃, bis R₆ gleich oder verschieden sein können und H, CN, NO₂, NH₂, alkyl, aralkyl, Halogen oder alkoxy sein können, A und B identisch oder verschieden sein können eine alpha, Beta oder gamma Aminosäure sein können, die 2 bis 15 C Atome und bis zu 4 N Atome, 2 Schwefelatome und 6 Sauerstoffatome umfaßt und B gegebenfalls ein Dipeptid ist, das aus diesen Aminosäuren gebildet ist, C Arginin, Lysin, Tyrosin, Phenylalanin oder Tryptophan und ihre Homologen ist, und X ein H Atom oder eine in der Peptidchemie übliche Schutzgruppe für terminale Aminogruppen ist, und L ein optionaler Linkerbaustein ist, der in der Lage ist, mit C eine Peptidbindung auszubilden.