DE10247430A1 - Method for determining the level of endotoxins in liquids - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten, einen Durchströmbehälter zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung bestimmter Trennelemente in einem Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten.The invention relates to a method for determining the content of endotoxins in liquids, a flow-through container for use in the method according to the invention and the use of certain separating elements in a method for determining the content of endotoxins in liquids.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten, einen Durchströmbehälter zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren und die Verwendung bestimmter Trennelemente in einem Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten.The invention relates to a method to determine the content of endotoxins in liquids Use in the method according to the invention and the use of certain separators in a process for Determination of the endotoxin content in liquids.
Flüssigkeiten, beispielsweise Wasser, wässerige Flüssigkeiten, biologische Flüssigkeiten, beispielsweise Sepsisblut, aber auch technische Flüssigkeiten, vor allem Flüssigkeiten, die mit dem menschlichen Körper in Berührung kommen oder stehen, können mit zellaktivierenden Komponenten, wie z.B. Pyrogen, zum Teil mit erheblichen Konsequenzen für daraus gefertigte Produkte belastet sein. Hierzu gehören z.B. Getränke, Infusions- und Injektionslösungen, Dialyseflüssigkeiten, Desinfektionslösungen, z.B. für die Reinigung von medizinischen Materialien, Spüllösung für gewerbliche Zwecke und für die Anwendung in der Medizin, z.B. zum Spülen des Bauchraums, der Hohlräume von Organen bei Operationen oder der Lunge zur Gewinnung von Bronchiallavagen, Flüssigkeitszusätze in klimatechnischen Anlagen zur Luftbefeuchtung oder Flüssigkeitsgemische, zur Kühlung von heißen Materialien während der Bearbeitung, z.B. in der Stahlindustrie.Liquids, for example Water, watery Liquids, biological liquids, for example sepsis blood, but also technical liquids, especially liquids, the one with the human body in touch can come or stand with cell activating components, e.g. Pyrogen, partly with significant ramifications for products made from it may be contaminated. These include e.g. Beverages, Infusion and injection solutions, Dialysis fluids, Disinfecting solutions e.g. For cleaning of medical materials, rinsing solution for commercial purposes and for use in medicine, e.g. for rinsing the Abdominal cavity, the cavities organs during surgery or the lungs to obtain bronchial lavage, Liquid additives in air conditioning Systems for air humidification or liquid mixtures, for cooling be called Materials during processing, e.g. in the steel industry.
Eine besondere Bedeutung hat aber die Abwesenheit von Pyrogen in injizierbaren Arzneimitteln (Parenteralia). Diese fieberinduzierenden Verunreinigungen, zu denen auch die Endotoxine gehören, stellen für den Menschen ein erhebliches Risiko dar. Im Extremfall bedeuten sie den Tod durch Schock. Im Kontakt mit immunkompetenten Zellen bewirken Pyrogene die Ausschüttung von Botenstoffen, die direkt auf das zentrale Thermoregulationszentrum im Gehirn einwirken. Die Pharmakopöe schreibt zwei Testsysteme zur Pyrogendetektion vor:
- 1. den in vivo Kaninchen-Pyrogen-Test, der nach Injektion der Prüfsubstanz die Erhöhung der Körpertemperatur ermittelt, und
- 2. den in vitro Limulusamöbozytenlysattest (LAL), der die Koagulation eines aus dem Blut des Pfeilschwanzkrebses gewonnenen Lysates mißt, ausgelöst durch das Endotoxin, eines Zellwandbestandteiles gramnegativer Bakterien.
- 1. the in vivo rabbit pyrogen test, which determines the increase in body temperature after injection of the test substance, and
- 2. the in vitro limulus amebocyte lysate test (LAL), which measures the coagulation of a lysate obtained from the blood of horseshoe crab, triggered by the endotoxin, a cell wall component of gram-negative bacteria.
Die gegenwärtig in der Pharmakopöe vorgeschriebene Pyrogentestmethode ist begrenzt auf den Nachweis in Parenteralia (Kaninchentest: biologische und pharmazeutische Arzneimittel; LAL: hauptsächlich pharmazeutische Arzneimittel). Die Prüfung von medizinischen Materialien ist im EU-Gesetz für Medizinprodukte seit 1995 geregelt und schreibt neben dem LAL-Test den Kaninchentest vor. Der Pyrogennachweis sollte darüber hinaus Medizinprodukte wie Implantate, medizinische Materialien, Dialyseprodukte, zelluläre Therapeutika und spezifische Therapeutika wie rekombinante Proteine einschließen.The one currently prescribed in the Pharmacopoeia Pyrogen test method is limited to detection in parenterals (Rabbit test: biological and pharmaceutical drugs; LAL: mainly pharmaceutical drugs). Testing medical materials is in the EU law for medical devices since 1995 regulated and writes the rabbit test in addition to the LAL test in front. The pyrogen detection should also include medical devices such as Implants, medical materials, dialysis products, cellular therapeutic agents and include specific therapeutics such as recombinant proteins.
Um den Kaninchen-Pyrogen-Test, welcher der
Arzneimittelsicherheit
Die bekannten Verfahren weisen einige Nachteile auf. Der Kaninchen-Pyrogen-Test ist aufgrund des Tierverbrauchs sehr teuer, auch ist es aus ethischen Gründen wünschenswert, seinen Einsatz zu beschränken. Außerdem ist die Selektivität des Tests unbefriedigend, da er auch auf Exotoxine anspricht. Der LAL-Test stellt auch keine befriedigende Alternative dar, da der Nachweis von Endotoxinen im Sepsisblut oder -plasma durch verschiedene Störfaktoren verfälscht wird. Es besteht beispielsweise eine deutliche Anfälligkeit gegen Störfaktoren wie Glucane aus Pilzinfektionen. Weiterhin wird z.B. in Anwesenheit von Cellulose eine Aktivierung des Test beobachtet. Bemühungen, den Einfluß der Störfaktoren zu unterdrücken, führen in der Regel zu deutlichen Einbußen in der Empfindlichkeit. Außerdem ist ein selektiver Nachweis von Endotoxinen nicht möglich. Der LAL-Test hat ferner den Nachteil, daß ebenfalls tierisches Material verwendet wird. Auch die bekannten Pyrogen-Tests, die auf Inkubation mit Vollblut basieren, weisen einige Nachteile auf. Zum einen kann es zu Interferenzen zwischen Probenmatrix und Vollblut kommen, was zu falsch positiven Resultaten führen kann. Zum anderen ist die Sensitivität der Methode nicht immer befriedigend. Außerdem ist auch diese Methode nicht in der Lage, zwischen Exo- und Endotoxinen zu unterscheiden.The known methods have some disadvantages on. The rabbit pyrogen test is very expensive due to animal consumption, it is also ethical establish desirable, to limit its use. Moreover is selectivity of the test unsatisfactory because it also responds to exotoxins. The LAL test is also not a satisfactory alternative since the Detection of endotoxins in sepsis blood or plasma by various confounders falsified becomes. For example, there is a clear vulnerability against disruptive factors like glucans from fungal infections. Furthermore, e.g. in the presence of Cellulose activation of the test was observed. efforts the influence of Disruptive factors too suppress, to lead usually to significant losses in sensitivity. Moreover selective detection of endotoxins is not possible. The LAL test also has the disadvantage that animal material is also is used. Also the well-known pyrogen tests based on incubation based on whole blood have some disadvantages. For one, it can interferences between sample matrix and whole blood come what lead to false positive results can. On the other hand, the sensitivity of the method is not always satisfactory. Moreover this method is also unable to distinguish between exo- and endotoxins to distinguish.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Verfahren zu überwinden, also ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxin in Flüssigkeiten bereitzustellen, welches in vitro ohne Beteiligung von Versuchtstieren durchgeführt werden kann, das überdies Störeinflüsse durch die Probenmatrix minimieren und eine höhere Sensitivität aufweisen soll. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren zur selektiven, das heißt von Exotoxinen unverfälschten Bestimmung des Gehalts an Endotoxinen in Flüssigkeiten bereitzustellen.The present invention lies thus the task based on the disadvantages of the known methods to overcome, a method for determining the level of endotoxin in liquids To be provided in vitro without the involvement of experimental animals carried out can be, moreover Interference caused by minimize the sample matrix and have a higher sensitivity should. Another task is to develop a selective method that is called unadulterated by exotoxins Providing determination of the endotoxin content in liquids.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.This task is accomplished by the in the claims Chen characterized embodiments of the present invention solved.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an Endotoxin in Flüssigkeiten bereitgestellt, was die folgenden Schritte umfaßt:
- (b) Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit einem oder mehreren Trennelement(en), die ein Trägermaterial umfassen, auf das ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist;
- (c) Trennung von Flüssigkeit und Trennelement(en); und
- (d) Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist.
- (b) contacting the liquid with one or more separating element (s) comprising a carrier material on which a binding protein for endotoxins is immobilized;
- (c) separation of liquid and separation element (s); and
- (d) Determination of the amount of endotoxin bound to the binding protein in step (b).
Zu den Beispielen Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung gehören allgemein fließfähige Medien, insbesondere niedriger und mittlerer Viskosität, newtonsche Flüssigkeiten und Sole. Bevorzugt sind Wasser, wässerige Lösungen, Emulsionen, Dispersionen und Suspensionen. Die Flüssigkeiten können biologischer Herkunft sein, wie Urin, Blut, flüssige Blutbestandteile, wie Serum oder Plasma oder andere Körperflüssigkeiten wie Speichel, Lymphe, Cerebrospinalflüssigkeit und ähnliches.To the examples liquids belong in the sense of the invention generally flowable media, especially low and medium viscosity, Newtonian liquids and brine. Water, aqueous solutions, emulsions, dispersions are preferred and suspensions. The liquids can be of biological origin, such as urine, blood, liquid blood components, such as Serum or plasma or other body fluids such as saliva, lymph, cerebrospinal fluid and the like.
Der Begriff "Endotoxin" unterliegt keinerlei Einschränkung und umfaßt im Rahmen der Erfindung alle Verbindungen, die sowohl einen Zucker als auch eine lipophile Gruppe aufweisen und bei Menschen einen phänotyp hervorrufen können, der SIRS ("Systemic Inflammatory Response Syndrome") genannt wird und der sich durch mindestens zwei der folgenden Symptome auszeichnet:
- (i) Körpertemperatur > 38 °C oder < 36 °C;
- (ii) Steigerung des Herzschlags (> 90 Schläge pro Minute);
- (iii) Tachypnoe (Rate >20/min) oder Hyperventilation (PaCO2 > 32 mm Hg);
- (iv) Leukocyten > 12.000/mm3 oder < 4.000/mm3 oder > 10 % unnreife Neutrophile.
- (i) body temperature> 38 ° C or <36 ° C;
- (ii) increased heartbeat (> 90 beats per minute);
- (iii) tachypnea (rate> 20 / min) or hyperventilation (Pa CO2 > 32 mm Hg);
- (iv) leukocytes> 12,000 / mm 3 or <4,000 / mm 3 or> 10% immature neutrophils.
Bevorzugt handelt es sich bei den Endotoxinen um Bestandteile der Zellwand gram-negativer Bakterien. Zumindest sind die Endotoxine in der Regel solchen Bestandteilen nachempfunden. Bevorzugte Endotoxine haben ein großes Molekulargewicht (zwischen 20.000 und 100.000) und/oder sind hitzestabil. Diese Endotoxine bestehen aus Lipid A (einem Glycosamin, welches mit C10-C20-Fettsäuren verestert ist) einem Kohlenhydratkern und dem Polysaccharid-O-Antigen (sich wiederholende Sequenzen linearer oder verzweigter Oligosaccharide, deren Kettenlänge zwischen den Bakterienstämmen schwankt). Das isolierte Lipid A kann auch allein ohne Kohlenhydratkern und dem Polysaccharid-O-Antigen als Endotoxin angesehen werden und stellt im Rahmen der Erfindung eine besonders bevorzugtes Endotoxin dar.The endotoxins are preferably components of the cell wall of gram-negative bacteria. At least the endotoxins are usually modeled on such components. Preferred endotoxins have a large molecular weight (between 20,000 and 100,000) and / or are heat stable. These endotoxins consist of lipid A (a glycosamine esterified with C 10 -C 20 fatty acids), a carbohydrate nucleus and the polysaccharide-O-antigen (repeating sequences of linear or branched oligosaccharides, the chain length of which varies between the bacterial strains). The isolated lipid A can also be regarded as an endotoxin alone without a carbohydrate nucleus and the polysaccharide O antigen and is a particularly preferred endotoxin within the scope of the invention.
Trennelemente sind inerte, oder im wesentlichen inerte Materialien und Vorrichtungen, welche imstande sind, aus der. Flüssigkeit eventuell darin enthaltene Endotoxine in einem für den Nachweis ausreichenden Umfang zu binden und zurückzuhalten, also abzutrennen.Separators are inert, or in essential inert materials and devices capable of are from the. liquid possibly contained endotoxins in a sufficient for the detection To bind and withhold scope, so separate.
Im Rahmen der Erfindung können sowohl ein monolithisches Trennelement als auch eine Vielzahl von Trennelementen (beispielsweise entsprechend behandelte Polymerbeads) zur Anwendung kommen.Within the scope of the invention, both a monolithic separator as well as a variety of separators (for example appropriately treated polymer beads) for use come.
Die Trennelemente umfassen ein Trägermaterial auf das mindestens ein Bindungsprotein für Endotoxine immobilisiert ist. Es können auch mehrere verschiedene Bindungsproteine auf dem Trägermaterial immobilisiert sein. Die Dissoziationskonstante des immobilisierten Bindungsproteins kann wesentlich geringer als im nicht immobilisierten Zustand sein.The separating elements comprise a carrier material immobilized on the at least one binding protein for endotoxins is. It can also several different binding proteins on the carrier material be immobilized. The dissociation constant of the immobilized Binding protein can be much lower than in the non-immobilized Condition.
Im Rahmen der Erfindung können als Bindungsproteine zum Beispiel eingesetzt werden:
- - BPI (bactericidal/permeability increasing protein), (Evans, T.J. et al. J. Infect. Dis. 171, 153–160; Ganzzano-Satoro, H. et al. Infect. Immun. 63, 2201–2205; Elsbach P. et al.. Prog. Clin. Biol. Res. 388, 41–51)
- - LBP (lipopolysaccharide binding Protein), (Tobias P. S. et al. J. Biol. Chem. 263, 13479–13481)
- – CD14 Zellrezeptor von Makrophagen/Monocyten, (Kirikae T. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 8, 13–26)
- – Faktor C (endotoxin neutralizing protein) aus dem Lysat von Limulus polyphemus. (Obayashi et al. Clina Chimca Acta 149, 55–56)
- – Serumalbumin
- – A1-Adenosinrezeptor (WO 97/44665)
- – EGFP (Enhanced green fluorescence protein) (Goh et al. Protein engineering 15 (2002) 493)
- – SAP (Serum amyloid P component) (WO 98/16556, WO 99/55731)
- - BPI (bactericidal / permeability increasing protein), (Evans, TJ et al. J. Infect. Dis. 171, 153-160; Ganzzano-Satoro, H. et al. Infect. Immun. 63, 2201-2205; Elsbach P et al. Prog. Clin. Biol. Res. 388, 41-51)
- - LBP (lipopolysaccharide binding protein), (Tobias PS et al. J. Biol. Chem. 263, 13479-13481)
- - CD14 cell receptor of macrophages / monocytes, (Kirikae T. et al. FEMS Immunol Med Microbiol 8, 13-26)
- - Factor C (endotoxin neutralizing protein) from Limulus polyphemus lysate. (Obayashi et al. Clina Chimca Acta 149, 55-56)
- - serum albumin
- - A1 adenosine receptor (WO 97/44665)
- - EGFP (Enhanced green fluorescence protein) (Goh et al. Protein engineering 15 (2002) 493)
- - SAP (Serum amyloid P component) (WO 98/16556, WO 99/55731)
Das Trägermaterial kann selbst Wechselwirkungen
mit den abzutrennenden mikrobiologischen Toxinen wechselwirken,
z.B. durch Sorption, insbesondere durch Adsorption, durch Mikrofiltration
oder durch Molekularsieb-Effekte. Das Trägermaterial ist jedenfalls
so auszuwählen,
daß eine
Immobilisierung von Proteinen möglich
ist. Das Trägermaterial
ist vorzugsweise porös,
wobei die Porengröße so ausgewählt ist,
daß die
für den
Stoffaustausch zur Verfügung
stehende Oberfläche
vergrößert wird,
ohne daß in
dem Trägermaterial
bei Durchströmen
mit der Flüssigkeit
ein zu großer
Gegendruck aufgebaut wird. Unter Immobilisierung des Proteins auf
dem Trägermaterial
wird eine kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkung verstanden,
die bevorzugt unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens
irreversibel ist. Ein Beispiel für
eine nicht kovalente Immobilisierung wäre eine Immobilisierung durch
Biotin/Streptavidin. Die kovalente Immobilisierung ist bevorzugt.
Diese erfolgt bevorzugt über
ein oder mehrere Carboxylgruppen des Proteins, wie in
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeit vor Schritt (b) in Schritt (a) mit einer Protease inkubiert. Dieser Schritt bewirkt den proteolytischen Abbau endotoxinbindender Proteine, z.B. den Abbau von Serumalbuminen, LBP, sCD14, und/oder BPI, soweit in der Flüssigkeit vorhanden, was vor allem bei biologischen Flüssigkeiten, insbesondere bei Serum der Fall ist. Damit ist es nun erstmals möglich, die Maskierung der Endotoxine durch in der Flüssigkeit vorhandene Proteine zu vermeiden und auf diese Weise die Empfindlichkeit des Verfahrens zu verbessern und ggf. gleichzeitig die Linearität zwischen Endotoxinmenge und Meßsignal in Schritt (d) zu erhöhen. Weiterhin ist es bevorzugt, die Protease nach erfolgter Inkubation zu inaktivieren. Dies hat den Vorteil, daß die Protease nicht die Bindungsproteine, die auf den Trennelementen immobilisiert sind, angreift, wenn in Schritt (b) die Flüssigkeit mit den Trennelementen in Kontakt gebracht wird. Eine besonders günstige Wahl stellt Proteinase K als Protease dar.In a preferred embodiment of the method according to the invention will the liquid before Step (b) in step (a) incubated with a protease. This Step causes the proteolytic breakdown of endotoxin-binding proteins, e.g. the degradation of serum albumin, LBP, sCD14, and / or BPI, to the extent in the liquid available, which is especially true for biological fluids, especially for Serum is the case. It is now possible for the first time to mask endotoxins through in the liquid to avoid existing proteins and thus sensitivity to improve the method and, if necessary, simultaneously the linearity between Amount of endotoxin and measurement signal increase in step (d). Furthermore, it is preferred to use the protease after incubation to inactivate. This has the advantage that the protease does not contain the binding proteins, which are immobilized on the separating elements, attacks when in Step (b) the liquid is brought into contact with the separating elements. A particularly cheap choice represents proteinase K as a protease.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Bindungsprotein Serumalbumin oder ein Fragment davon, wobei letzteres so gewählt ist, daß die Bindungsfähigkeit für Endotoxine erhalten bleibt also die Dissoziationskonstante um nicht mehr als 1,5 Größenordnungen, vorzugsweise um nicht mehr als eine Größenordnung, insbesondere nicht mehr als 50% ansteigt. Ein Fragment des Serumalbumins kann durch proteolytischen Verdau des intakten Proteins entstehen oder mit Hilfe von gentechnologischen Verfahren. Bevorzugt weist das Serumalbumin die Primärstruktur des Humanserumalbumins auf.In a preferred embodiment of the method according to the invention is the binding protein serum albumin or a fragment thereof, the latter so chosen is that the binding capacity for endotoxins The dissociation constant is therefore retained by no more than 1.5 orders of magnitude, preferably by no more than an order of magnitude, especially not increases more than 50%. A fragment of the serum albumin can by proteolytic digestion of the intact protein arise or with Help from genetic engineering. The serum albumin preferably has the primary structure of human serum albumin.
Serumalbumin hat die vorteilhafte Eigenschaft, Endotoxine selektiv zu binden, so daß ein selektiver Nachweis von Endotoxinen ermöglicht wird, auch wenn die Probe zusätzlich Exotoxine enthält.Serum albumin has the beneficial one Ability to selectively bind endotoxins so that a selective Allows detection of endotoxins will, even if the sample is additional Contains exotoxins.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Serumalbumin über ein oder mehrere Carboxylgruppen immobilisiert, wobei die Immobilisierung bevorzugt über eine kovalente Bindung besteht. Über Carboxylgruppen an Polymerbeads immobilisiertes humanes Serumalbumin bindet LPS aus beispielsweise gesundem Plasma um den Faktor 2,5 besser als über Aminogruppen immobilisiertes humanes Serumalbumin (HSA). Diese Erhöhung der Affinität für LPS basiert u.a. auf der Verschiebung des isoelektrischen Punktes als Folge der Immobilisierung des (humanen) Serumalbumins über Carboxylgruppen.In a preferred embodiment the method is serum albumin via one or more carboxyl groups immobilized, the immobilization preferably via a covalent bond exists. about Carboxyl groups immobilized on polymer beads human serum albumin binds LPS from healthy plasma by a factor of 2.5 better than over Amino group immobilized human serum albumin (HSA). This increase in affinity for LPS is based et al on the shift of the isoelectric point as a result the immobilization of (human) serum albumin via carboxyl groups.
Die bevorzugten Trennelemente sind
mit Serumalbumin beschichtete Polymerbeads, vorzugsweise Acylharzbeads,
wie in der Patentschrift
Bevorzugt weist das Trennelement eine Kapazität von mehr als 1,5 ng LPS pro ml Trennelement, bevorzugt von mehr als 2 ng/ml, insbesondere von etwa 2,5 ng/ml auf.The separating element preferably has a capacity more than 1.5 ng LPS per ml separating element, preferably more than 2 ng / ml, especially of about 2.5 ng / ml.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Trägermaterial porös und/oder dispergierfähig. Als Trägermaterial eignen sich alle Stoffe, auf die sich Proteine immobilisieren lassen, wie Filterpapiere oder Filtervliese, vorzugsweise mit einem Gehalt an organischen Fasern, oder Polymerbeads. Bevorzugte Trägermaterialien sind organische Polymerpartikel, insbesondere Polyacrylbeads, mit einem (mittleren) Durchmesser von vorzugsweise 10 bis 500 μm, besonders bevorzugt von 100 bis 300 μm, vor allem von etwa 200 μm, die bevorzugt porös sind. Bei den Trägermaterialien kann es sich auch um Gele und Membranen handeln. Dabei wird die Porosität bevorzugt so gewählt, daß die Oberflächenvergrößererung infolge der Porosität mindestens etwa 500 beträgt, insbesondere etwa 1000.In a preferred embodiment of the method according to the invention is the carrier material porous and / or dispersible. Suitable as a carrier material all substances on which proteins can be immobilized, such as Filter papers or filter fleeces, preferably containing organic fibers, or polymer beads. Preferred carrier materials are organic polymer particles, in particular polyacrylic beads, with a (mean) diameter of preferably 10 to 500 μm, particularly preferably from 100 to 300 μm, especially of about 200 microns that preferably porous are. With the carrier materials can they are also gels and membranes. The porosity is preferred chosen so that the Oberflächenvergrößererung due to the porosity at least is about 500, especially about 1000.
Als Trägermaterial kommt insbesondere Kunststoffe in Frage, nämlich Polyacrylate, Polymethacrylate, Polysulfon, Polyethersulfon, welche als funktionelle Gruppe Amine oder Amide tragen. Daneben sind auch als Trägermaterial Zellulose, Zelluloseester, Aggarose, Polytetrafluorethylen, Polycarbonat, oder Glasfasern, Keramik oder Metall denkbar. An Metall lassen sich Proteine durch Thiolgruppen immobilisieren, ähnliche Immobilisierungsmethoden existieren für die anderen genannten Trägermaterialien.Plastics in particular come as a carrier material in question, namely Polyacrylates, polymethacrylates, polysulfones, polyethersulfones, which wear amines or amides as a functional group. Are also next to it as a carrier material Cellulose, cellulose esters, aggarose, polytetrafluoroethylene, polycarbonate, or glass fibers, ceramics or metal. On metal Immobilize proteins with thiol groups, similar immobilization methods exist for the other carrier materials mentioned.
Wie bereits erwähnt kann das Trägermaterial selbst mit. den Endotoxin wechselwirken und die Funktion eines Filters oder Molekularsiebs ausüben. Die Porengrößen eines Filters betragen in der Regel 0,2 bis 20 μm. Zur Anstellung der gewünschten Verhältnisse von Filtratgeschwindigkeit und Scheidefähigkeit kann mit Druckfiltration gearbeitet werden. Je nach Viskosität des Fluids und der Art und Menge des erwarteten Toxins wird vorzugsweise mit Porengrößen von 1 bis 10 μm, insbesondere von 3 bis 8 μm gearbeitet. Bei Flüssigkeiten haben sich zum Teil auch Filter mit größeren Poren bewährt, wobei in jedem Falle auch die Teilchengröße des zu erwartenden Endotoxins zu berücksichtigen ist. Die Filterwirkung des Trägermaterials unterstützt in diesem Falle die endotoxinrückhaltenden Eigenschaften des auf dem Trägermaterial Bindungsproteins.As already mentioned, the carrier material itself With. the endotoxin interact and the function of a filter or molecular sieve. The Pore sizes one Filters are usually 0.2 to 20 μm. To hire the desired one conditions of filtrate speed and separability can be with pressure filtration be worked. Depending on the viscosity of the fluid and the type and Amount of the expected toxin is preferred with pore sizes of 1 to 10 μm, worked in particular from 3 to 8 μm. With liquids filters with larger pores have also proven their worth, whereby in any case also the particle size of the endotoxin to be expected to consider is. The filter effect of the carrier material supports in this case the endotoxin-retaining Properties of the on the substrate Binding protein.
Nachdem die Endotoxin enthaltende Flüssigkeit mit den Trennelementen in Kontakt gebracht worden ist, müssen die Trennelemente von der Flüssigkeit in Schritt (b) wieder abgetrennt werden, wobei die Endotoxine von den Trennelementen zurückgehalten werden. Insbesondere in den Fällen, in welchen das Trägermaterial in der Flüssigkeit dispergierfähig ist, bietet sich die Abtrennung durch Wirkung der Schwerkraft an. Dies kann durch Sedimentation oder Zentrifugation erfolgen. Im übrigen können das Inkontaktbringen gemäß Schritt (b) und Trennung gemäß Schritt (c) auch in einem Verfahrensschritt erfolgen, indem zum Beispiel die Flüssigkeit nach Art der Affinitätschromatographie durch die Trennelemente oder durch das Trennelement hindurch geführt wird, wobei die das Trennelement oder die Trennelemente die Affinitätssäule darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennung in Schritt (c) durch Inkontaktbringen des Trennelements oder der Trennelemente mit einer geeigneten Waschlösung vervollständigt. Bei der Waschlösung handelt es sich vorzugsweise um eine isotonische Lösung (z.B. 0,9 NaCl) und mehr bevorzugt um die sogenannte "Priming"-Lösung, welche Na+-, K+-, Cal+-, Mg2 +-, Cl–- und HCO– 3-Ionen enthält (z.B. Na+ 134; K+ 4; Ca2 + 1,75; Mg2 + 0,5; Cl– 106,5; HCO3 – 36; Konzentrationsangaben in mmol/l).After the liquid containing endotoxin has been brought into contact with the separating elements, the separating elements must be separated from the liquid again in step (b), the endotoxins being retained by the separating elements. In particular, in cases in which the carrier material is dispersible in the liquid, separation by the action of gravity is appropriate. This can be done by sedimentation or centrifugation. Otherwise, the contacting according to step (b) and separation according to step (c) can also take place in one process step gene, for example, by passing the liquid in the manner of affinity chromatography through the separating elements or through the separating element, the separating element or the separating elements representing the affinity column. In a preferred embodiment of the method according to the invention, the separation in step (c) is completed by contacting the separating element or the separating elements with a suitable washing solution. The washing solution is preferably an isotonic solution (for example 0.9 NaCl) and more preferably the so-called "priming" solution, which Na + -, K + -, Cal + -, Mg 2 + -, Cl - - and HCO - 3 ions (e.g. Na + 134; K + 4; Ca 2 + 1.75; Mg 2 + 0.5; Cl - 106.5; HCO 3 - 36; concentration in mmol / l).
In Schritt (d) erfolgt die Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist. Die Bestimmung unterliegt keiner bestimmten Einschränkung und kann im allgemeinen mit jeder im Stand der Technik bekannten Methode durchgeführt werden. Beispielsweise erfolgt dies dadurch, daß das Trennelement oder die Trennelemente einem Vollblut-Inkubationsverfahren unterzogen werden und die dabei gebildeten Mediatoren bestimmt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem Schritt (d) die folgenden Schritte umfaßt:
- (d1) Durchführung eines Vollblut-Inkubationsverfahren mit dem Trennelement oder den Trennelementen, wobei entsprechend der Menge des in Schritt (b) gebundenen Endotoxins Mediatoren gebildet werden;
- (d2) Bestimmung Menge eines oder mehrerer der in Schritt (c1) gebildeten
- (d1) performing a whole blood incubation process with the separating element or the separating elements, mediators being formed in accordance with the amount of the endotoxin bound in step (b);
- (d2) Determining the amount of one or more of those formed in step (c1)
Mediatoren sind endogene Pyrogene, also inflammatorische Botenstoffe, welche in der Reaktion auf exogene Pyrogene die Fieberantwort einleiten. Bei den Zellen, welche die Mediatoren ausschütten, handelt es sich hauptsächlich um Monozyten. Zu den Mediatoren gehören IL-1, insbesondere IL-1β, IL-6, Tumor Nekrose Faktor (TNF), Prostaglandin E2, NO und Neopterin.Mediators are endogenous pyrogens, i.e. inflammatory messengers that initiate the fever response in response to exogenous pyrogens. The cells that the mediators release are mainly monocytes. Mediators include IL-1, especially IL-1β, IL-6, tumor necrosis factor (TNF), prostaglandin E 2 , NO and neopterin.
Unter Vollblut-Inkubationsverfahren
werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verfahren verstanden,
wie sie in
Im allgemeinen kann die Bestimmung der Menge an Endotoxin, die in Schritt (b) an das Bindungsprotein gebunden worden ist, neben dem Vollblut-Inkubationsverfahren durch eines der beispielhaft aufgeführten folgenden Verfahren erfolgen:
- – Bestimmung mit Hilfe des LAL-Tests, wobei durch die erfindungsgemäß durchgeführte selektive Abtrennung der Endotoxine die vorstehend genannten Störeinflüsse vermieden werden können.
- – Bestimmung mit Hilfe von Monocytenzellkulturen. Hierbei werden nach der erfindungsgemäß durchgeführten selektiven Abtrennung der Endotoxine Monocytenzellkulturen mit dem zur Abtrennung verwendeten Bindungsprotein, das zum Beispiel auf Beads immobilisiert sein kann, in Kontakt gebracht. Die Monocytenaktivierung wird mit Antikörpern, die gegen Oberflächenproteine der Zellen gerichtet sind, im Durchflußcytometer oder mit ELISA bestimmt.
- – Markierung der Endotoxine auf der Oberfläche der Trennelemente durch geeignete Bindungsproteine. Es können beispielsweise BPI, LBP, CD14, Faktor C, Serumalbumin, A1-Adensosinrezeptor, EGFP, SAP oder Antikörper markiert werden (z.B. mit einer fluoreszierenden oder radioaktiven Markierung) und mit dem zur Abtrennung verwendeten immobilisierten Bindungsprotein in Kontakt gebracht werden, wobei eine Markierung der Endotoxine auf der Oberfläche der Trennelemente erfolgt. Nach Entfernung der markierten Bindungsproteine, die nicht Endotoxin gebunden haben, kann die Endotoxinmenge mit Hilfe der Markierungsintensität bestimmt werden, was z.B. durch ein Cytometer oder durch ein Fluoreszenzmeßgerät erfolgen kann.
- - Determination with the aid of the LAL test, the above-mentioned interferences being able to be avoided by the selective separation of the endotoxins carried out according to the invention.
- - Determination using monocyte cell cultures. Here, after the selective separation of the endotoxins according to the invention, monocyte cell cultures are brought into contact with the binding protein used for the separation, which may be immobilized on beads, for example. Monocyte activation is determined with antibodies directed against surface proteins of the cells in a flow cytometer or with ELISA.
- - Labeling of the endotoxins on the surface of the separating elements by means of suitable binding proteins. For example, BPI, LBP, CD14, factor C, serum albumin, A1 adensosin receptor, EGFP, SAP or antibodies can be labeled (for example with a fluorescent or radioactive label) and brought into contact with the immobilized binding protein used for the separation, a label the endotoxins occur on the surface of the separating elements. After removal of the labeled binding proteins that have not bound endotoxin, the amount of endotoxin can be determined with the aid of the labeling intensity, which can be done, for example, by a cytometer or by a fluorescence measuring device.
Der Bestimmung der Endotoxinmenge kann eine Trennung von Endotoxin und den Trennelementen und ggf. von den Bindungsproteinen vorausgehen, wobei in diesem Fall die Bestimmung des abgetrennten Endotoxins dann zum Beispiel durch Zellaktivierung (zum Beispiel mit Hilfe der oben erwähnten Monocytenkulturen) oder mit markierten Bindungsproteinen (siehe den vorangegangenen Abschnitt) oder mit Antikörpern oder ggf. rekombinanten Antikörperfragmenten kompetitiv oder in der Sandwich-Anordnung erfolgen kann.Determining the amount of endotoxin a separation of endotoxin and the separating elements and possibly preceded by the binding proteins, in which case the Determination of the separated endotoxin then, for example, by cell activation (for example using the monocyte cultures mentioned above) or with labeled binding proteins (see the previous section) or with antibodies or possibly recombinant antibody fragments can be done competitively or in a sandwich arrangement.
Die Erfindung betrifft ferner einen
Durchströmbehälter (
Die Flüssigkeit durchströmt zur Abtrennung der Endotoxine den Durchströmbehälter, wobei die Trennelemente und das daran gebundene Endotoxin zurückgehalten werden. Die Trennelemente sind dabei lösbar oder unlösbar im Durchströmbehälter angeordnet. Bei Trennelementen, die mit dem Durchströmbehälter lösbar verbunden sind, hat es sich bewährt, wenn sich die Trennelemente als Segmente in einem Rahmen, z.B. aus Polystyrol, befinden. Die Verwendung solcher Segmente hat dank der Austauschbarkeit derselben den Vorteil der mehrfachen Verwendbarkeit eines Durchströmbehälters. Insbesondere bei der Verwendung flüssiger Medien, wie Blut oder Blutbestandteilen, hat sich eine lösbare Anordnung von Trennelementen mit einem Trägermaterial (ggf. auf Basis eines Austauscherharzes) als vorteilhaft erwiesen, da diese nach Erschöpfung der Aufnahmekapazität der Trennelemente dem Durchströmgerät zur Inkubation in einem Inkubationsgefäß (und gegebenenfalls zur Regeneration) entnommen werden können. Der Durchströmbehälter selbst ist meist rohr-, trichter- oder kastenartig aus inertem Material, wie Kunststoff oder Metall mit einem ovalen, rechteckigen, kreisrunden, mehreckigen oder beliebigen anderen Querschnitt, wobei die Größe der Querschnittsfläche im Bereich der Trennelemente vor allem von der Viskosität des Prüfmediums, der vorgesehenen Durchsatzmenge, von der vorbestimmten Durchsatzgeschwindigkeit (Filtrationsgeschwindigkeit), der erwarteten Art und möglichen Konzentration der Endotoxine, ob im Haupt- oder Nebenstrom, und dergleichen bestimmt ist.The liquid flows through the flow-through container to separate the endotoxins, the separating elements and the endotoxin bound to them being retained. The separating elements are detachably or non-detachably arranged in the flow-through container. In the case of separating elements which are detachably connected to the flow-through container, it has proven useful if the separating elements are located as segments in a frame, for example made of polystyrene. Thanks to their interchangeability, the use of such segments has the advantage of being able to use a flow-through container more than once. in particular Especially when using liquid media such as blood or blood components, a detachable arrangement of separating elements with a carrier material (possibly based on an exchange resin) has proven to be advantageous, since after the absorption capacity of the separating elements has been exhausted, the flow-through device for incubation in an incubation vessel ( and if necessary for regeneration) can be removed. The flow container itself is usually tubular, funnel-shaped or box-like made of inert material, such as plastic or metal with an oval, rectangular, circular, polygonal or any other cross-section, the size of the cross-sectional area in the area of the separating elements mainly from the viscosity of the test medium , the intended throughput, the predetermined throughput rate (filtration rate), the expected type and possible concentration of the endotoxins, whether in the main or secondary flow, and the like is determined.
Die Filtrationsgeschwindigkeit und -menge des Flüssigkeitsstroms kann nach dem Prinzip der Druckfiltration durch Pumpen oder durch Saugen und z.B. bei Flüssigkeit durch Ausnutzung der Schwerkraft durch den Durchströmbehälter in Abhängigkeit von der Querschnittsfläche und der Schicht- bzw. Filterkuchendicke des Trennelements vorbestimmt werden. So wird auch bei einem fließfähigen Medium unterhalb der Nachweisgrenze liegender bzw. extrem niedriger Endotoxin-Konzentration auf dem Wege der Anreicherung überhaupt noch ein Endotoxinnachweis bzw. ein sicherer Nachweis ermöglicht.Filtration speed and - amount of liquid flow can be based on the principle of pressure filtration by pumping or by Sucking and e.g. with liquid by using gravity through the flow tank in Dependence on the cross-sectional area and the layer or filter cake thickness of the separating element is predetermined become. So even with a flowable medium below the Limit of detection of lying or extremely low endotoxin concentration on the way to enrichment at all still enables endotoxin detection or reliable detection.
Durch Messung der Durchflußmenge kann bei quantitativer Abtrennung der Endotoxine durch Bindung an das Bindungsprotein (gegebenenfalls in Verbindung mit Mikro- oder Ultrafiltration) die Konzentration an Endotoxin in der Flüssigkeit, z.B. im Blut oder Serum, bestimmt werden.By measuring the flow rate at quantitative separation of the endotoxins by binding to the binding protein (if necessary in connection with micro or ultrafiltration) Concentration of endotoxin in the liquid, e.g. in the blood or Serum to be determined.
Unter Durchströmbehälter im vorliegenden Sinne werden z.B. auch Zwei-Kammer-Sammelbehälter verstanden, deren beide Kammern durch ein Trennelement getrennt sind. Sie können nach Beschickung einer Kammer vor allem für die Untersuchung von Flüssigkeiten verwendet werden, beispielsweise unter Ausnutzung der Schwerkraft als Durchströmungshilfe. Gegenstand des Verfahrens ist demgemäß auch ein Durchströmungsbehälter mit mindestens zwei Öffnungen, einer Zufuhröffnung und einer Austrittsöffnung sowie mit damit lösbar oder unlösbar verbundenen Trennelementen zur Abtrennung von Endotoxinen, wobei das Trennelement im Durchströmungsbereich zwischen der Zufuhr- und der Austrittsöffnung angeordnet ist. Vorzugsweise ist das Trennelementldie Trennelemente im wesentlichen senkrecht zur Haupt-Durchströmungsrichtung und/oder so angeordnet, daß eine Zwangsdurchströmung des Trennelements erzielt wird, z.B. durch eine Erstreckung des Trennelements im wesentlichen über den ganzen Querschnittsbereich des Durchstrombehältnisses im Bereich des Sitzes des Trennelements. Insbesondere weist der Durchstrombehälter im jeweiligen Öffnungsbereich (Zufuhröffnung, Austrittsöffnung) Dichtungselemente auf, die ein toxin-undurchlässigen Verschluß, z.B. mit Kappen oder anderen Deckelverschlüssen gewährleisten. Zum Verschluß der Öffnungen sind den Öffnungen angepaßte, gegebenenfalls Dichtungselemente aufweisende Deckel vorgesehen. Ein besonderer Vorteil liegt darin, daß die Abtrennung der Endotoxine und das Vollblut-Inkubationsverfahren in demselben Behälter durchgeführt werden kann, so daß Handhabungsprobleme, die beim Behälterwechsel entstehen könnten, entfallen. Es ist ohne weiteres möglich, zunächst die mikrobiologischen Toxine aus dem Fluid abzutrennen und anschließend den Durchstrombehälter durch dafür vorgesehene Deckel zu verschließen und an mikrobiologische Fachlabors zur Untersuchung zu verschicken.Under flow tank in the present sense e.g. also understood two-chamber collection containers, whose two chambers are separated by a separating element. You can go after Feeding a chamber mainly for the examination of liquids are used, for example using gravity as a flow aid. Accordingly, the method also relates to a flow-through container with at least one two openings, a feed opening and an outlet opening as well as solvable with it or unsolvable connected separating elements for the separation of endotoxins, wherein the separator in the flow area is arranged between the feed and the outlet opening. Preferably the separating element is essentially vertical to the main flow direction and / or so arranged that a Forced flow of the separating element, e.g. by extending the Separator essentially over the entire cross-sectional area of the flow container in the area of the seat of the separating element. In particular, the flow container in the respective opening area (Feed opening, outlet opening) Sealing elements which have a toxin-impermeable closure, e.g. ensure with caps or other lid closures. To close the openings are the openings adapted, optionally provided with sealing elements cover. A particular advantage is that the endotoxins are separated and the whole blood incubation procedure is carried out in the same container can, so handling problems, those when changing containers could arise omitted. It is readily possible to start with the microbiological Separate toxins from the fluid and then through the flow container intended for this To close the lid and to be sent to microbiological laboratories for examination.
Zur Untersuchung auf Endotoxine werden die Trennelemente oder das Trennelement zunächst mit der Endotoxin enthaltenden Flüssigkeit in Schritt (b) in Kontakt gebracht, die vorzugsweise zuvor mit einer Protease inkubiert worden war. Anschließend wird in Schritt (c) die Flüssigkeit von den Trennelementen oder dem Trennelement getrennt, wozu ggf. auch ein Waschritt gehören kann. Schließlich werden die Trennelemente oder das Trennelement in Schritt (c) mit Vollblut enthaltenden Zubereitungen inkubiert und auf an sich bekannte Weise, z.B. mit Hilfe des ELISAs bzw. RIAs auf die Bildung von Mediatoren, insbesondere auf IL-1, vor allem auf IL-1β, ferner auf IL-6, TNF, Prostaglandin E2, NO und/oder Neopterin, untersucht.To test for endotoxins, the separating elements or the separating element are first brought into contact with the liquid containing endotoxin in step (b), which preferably had previously been incubated with a protease. The liquid is then separated from the separating elements or the separating element in step (c), which may also include a washing step. Finally, the separating elements or the separating element in step (c) are incubated with preparations containing whole blood and in a manner known per se, for example with the aid of the ELISA or RIA, for the formation of mediators, in particular on IL-1, especially on IL-1β , also examined for IL-6, TNF, prostaglandin E 2 , NO and / or neopterin.
Tierisches oder menschliches Vollblut, wie z.B. frisch gewonnenes, gegebenenfalls verdünntes Blut gesunder menschlicher Spender kann dabei ohne Trennung von Einzelkomponenten eingesetzt werden. Der Einsatz von Säugetierblut ist bevorzugt, insbesondere der von humanem Vollblut. Die Leukozyten liegen so in ihrer natürlichen Zusammensetzung und Umgebung vor. Dies gilt insbesondere auch für die Monozyten, die hauptsächlich die Mediatoren freisetzen. Gleichzeitig sind die Serumkomponenten anwesend, die auf die Wirkung eines Toxins Einfluß haben könnten. Das Vollblut enthält in der Regel gerinnungsverzögernde oder gerinnungshemmende Bestandteile, wie Zitrat, so z.B. in einer Endkonzentration von 0,38%, oder Heparin, wie Na-Heparin oder Heparin-Fraktionen, wobei die Erkenntnis wichtig ist, daß die gerinnungsverzögernden oder -hemmenden Bestandteile auch die Inkubationsreaktion nicht beeinträchtigen oder gar verfälschen. Eine Verdünnung der Vollblutzubereitung, z.B. mit isotonischen Lösungen oder mit einem Zellkulturmedium, beispielsweise mit RMPI 1640 oder z.B. mit einer physiologischen Kochsalzlösung (20%ige Verdünnung) ist von Vorteil. Vorsorglich können Antibiotika, wie Penicillin oder Streptomycin, ohne Störung der Reaktion zugegeben werden. Die Inkubation wird bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise im Bereich von 35 bis 38°C über einen Zeitraum von ca. 2 bis 24 Stunden durchgeführt. Bei der Durchführung der Vollblut-Inkubation ist auf den Ausschluß von störenden Kontaminationen von Gerät und Reagenzien zu achten.Whole animal or human blood, such as freshly obtained, possibly diluted, blood from healthy human donors can be used without separation of individual components. The use of mammalian blood is preferred, especially that of human whole blood. The leukocytes are thus in their natural composition and environment. This applies in particular to the monocytes, which mainly release the mediators. At the same time, the serum components are present that could influence the effect of a toxin. Whole blood generally contains anticoagulant or anticoagulant components, such as citrate, for example in a final concentration of 0.38%, or heparin, such as Na-heparin or heparin fractions, it being important to recognize that the anticoagulant or anticoagulant components also do not impair or even falsify the incubation reaction. A dilution of the whole blood preparation, for example with isotonic solutions or with a cell culture medium, for example with RMPI 1640 or with a physiological saline solution (20% dilution) is advantageous. As a precaution, antibiotics such as penicillin or streptomycin can be added without disturbing the reaction. The incubation is carried out at elevated temperatures, preferably in the range from 35 to 38 ° C a period of about 2 to 24 hours. When carrying out the whole blood incubation, care must be taken to avoid disruptive contamination of the device and reagents.
Zur Positivkontrolle können Preparationen von gram-negativen und gram-positiven Bakterien, wie Endotoxin und Lipoteichonsäure, zur Negativkontrolle z.B. pyrogenfreie physiologische Kochsalzlösung verwendet werden.Preparations from gram-negative and gram-positive bacteria, such as endotoxin and lipoteichoic acid Negative control e.g. pyrogen-free physiological saline is used become.
Nach dem Vollblutinkubationsverfahren wird die körpereigene Primärreaktion der Bildung von Mediatoren auf Gabe von Endotoxin zur Untersuchung herangezogen. Es sind alle Blutkomponenten vorhanden, die gegebenenfalls für eine Interaktion der Toxine mit Leukozyten notwendig sind, z.B. LPS-bindendes Protein LBP, bakterizides Permeabilitäts-erhöhendes Protein BPI, lösliches CD14, Definsine, usw. Das Vollblut-Inkubationsverfahren kann im übrigen auch mit dem Vollblut von Betroffenen mit einer Flüssigkeit, das aus dem individuellen Umfeld stammt, durchgeführt werden. So kann bei Applikation einer definierten Endotoxinmenge die individuelle Empfindlichkeit festgestellt und ein überempfindlicher Patient identifiziert werden.After the whole blood incubation procedure becomes the body's own primary reaction the formation of mediators for the administration of endotoxin was used for the investigation. There are all blood components that may be needed for an interaction the toxins with leukocytes are necessary, e.g. LPS binding protein LBP, bactericidal permeability-increasing protein BPI, soluble CD14, Definsine, etc. The whole blood incubation procedure can also with the whole blood of those affected with a liquid that comes from the individual Environment originated, carried out become. So when applying a defined amount of endotoxin the individual sensitivity determined and a hypersensitive Patient to be identified.
Für
Reihenprüfungen
oder Vergleichsprüfungen über gewisse
Zeiträume
hat sich aus Gründen der
Standardisierbarkeit die Verwendung von tiefgefrorenem Blut bzw.
von kollektiven tiefgefrorenen Blutes in Form standardisierter Bluteinheitsdosen
bewährt
(
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann z.B. mit Vollblutzubereitung gearbeitet werden aus 8 ml physiologischer Kochsalzlösung von klinischer Qualität und 2 ml heparenisiertem Vollblut (Blutabnahme mit 7,5 ml heparinisierten Monovetten, Firma Sarstedt) von gesunden Spendern. Die mit Vollblut-Zubereitung bestückten Durchstrombehälter werden im Inkubationsschrank z.B. bei 37°C, 5% CO2 über Nacht (18 – 24 Stunden) inkubiert. Die inkubierte Lösung kann mit einer Pipette gut aufgemischt, in sterile Flakonröhrchen überführt und z.B. zwei Minuten bei 4000g und Raumtemperatur zentrifugiert werden. Die dabei gebildeten Überstände werden gegebenenfalls in der Kälte zwischengelagert. Anschließend erfolgt beispielsweise durch ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) oder durch RIA (radioimmuno assay) oder durch ähnliche Verfahren unter Verwendung monoklonaler oder polyklonaler, gegebenenfalls rekombinanter Antikörper die Bestimmung der Menge an gebildetem Mediator.To carry out the method according to the invention, whole blood preparation can be used, for example, from 8 ml of physiological saline of clinical quality and 2 ml of heparenized whole blood (blood collection with 7.5 ml of heparinized monovettes, Sarstedt) from healthy donors. The flow-through containers equipped with whole blood preparation are incubated in the incubation cabinet, for example at 37 ° C., 5% CO 2 overnight (18-24 hours). The incubated solution can be mixed well with a pipette, transferred to sterile flacon tubes and centrifuged for two minutes at 4000g and room temperature. The supernatants formed are stored temporarily in the cold if necessary. The amount of mediator formed is then determined, for example, by ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) or by RIA (radioimmunoassay) or by similar methods using monoclonal or polyclonal, optionally recombinant antibodies.
Die Figuren zeigen:The figures show:
Die vorliegende Erfindung wird nun in bezug auf Beispiele näher erläutert, welche in keiner Weise eine Beschränkung des erfindungsgemäßen Gegenstandes darstellen.The present invention will now with respect to examples explains which in no way limits the subject matter of the invention represent.
BeispieleExamples
Vorbereitung der Matisse-beadsPreparation of the Matisse beads
5 ml Matisse-Beads (Fresenius Hemocare) werden in 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt und mit 0,9% NaCl auf 50 ml Gesamtvolumen überschichtet. Unter gelegentlichem Schwenken werden die Beads ca. 10 Minuten gewaschen.5 ml of Matisse beads (Fresenius Hemocare) transferred to 50 ml Falcon tubes and overlaid with 0.9% NaCl to a total volume of 50 ml. Occasionally The beads are swirled for about 10 minutes.
Durch Zentrifugation (2 Minuten 3000 rpm Heraeaus varifuge, ~ 2100 g) werden die Beads sedimentiert und der Überstand komplett abgenommen.By centrifugation (2 minutes 3000 rpm Heraeaus varifuge, ~ 2100 g) the beads are sedimented and the supernatant completely removed.
Die Beads werden nun mit Priming-Lösung überschichtet (Fresenius Hemocare) und unter gelegentlichem Schwenken mind. 10 Minuten equilibriert. Nach erneuter Zentrifugation (2 Minuten 3000 rpm Heraeus varifuge, ~ 2100 g), wird durch Abnahme eines Teils des Überstandes das Gesamtvolumen auf 10 ml reduziert. Anschließend werden 2% DMSO (Sigma, "zellkulturgetestet") hinzugegeben und vermischt.The beads are now covered with a priming solution (Fresenius Hemocare) and with occasional swiveling at least 10 Minutes equilibrated. After centrifugation again (2 minutes 3000 rpm Heraeus varifuge, ~ 2100 g), is obtained by removing a part of the supernatant the total volume reduced to 10 ml. Then 2% DMSO (Sigma, "cell culture tested") are added and mixed.
Inkontaktbringen der Matisse-Beads mit Plasmaproben, die unterschiedliche Mengen an Endotoxin enthaltenContacting the Matisse beads with plasma samples containing different amounts of endotoxin
Je 100 μl Suspension der vorbereiteten Beads werden mit 100 μl Plasmaproben im 2 ml-Eppendorfgefäß gemischt. Die Beads werden entweder mit einer abgeschnittenen Pipettenspitze (steril & pyrogenfrei) oder mit einer Eppendorf Multipette (ebenfalls steril und pyrogenfrei mit abgeschnittener Spitze) aliquotiert.100 μl suspension of the prepared beads are mixed with 100 μl plasma samples in 2 ml increments village vessel mixed. The beads are either aliquoted with a cut pipette tip (sterile & pyrogen-free) or with an Eppendorf Multipette (also sterile and pyrogen-free with a cut tip).
Mit Endotoxin versetzte PlasmaprobenSpiked with endotoxin plasma samples
Plasma von 5 Spendern (A-E) wird durch Zentrifugation (10' ~ 2100 g) aus Li-Heparin-Blut (Sarstedt, "Monovette") gewonnen. Ein Teil hiervon wird in Aliquots bei –80°C gelagert und als Nullkontrollen verwendet.Plasma from 5 donors (A-E) will by centrifugation (10 '~ 2100 g) from Li-heparin blood (Sarstedt, "Monovette"). A part of these are stored in aliquots at -80 ° C and used as zero controls.
Der Rest wird zu gleichen Teilen gemischt und mit LPS von E. coli 0-113 versetzt (0, 12.5, 25, 50, 100 und 200 pg/ml) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit soll gelöstes LPS von Bindungsproteinen so gebunden werden wie dies in physiologischer Weise auch geschieht. Die Aliquots werden bei –80°C gelagert.The rest will be in equal parts mixed and mixed with LPS from E. coli 0-113 (0, 12.5, 25, 50, 100 and 200 pg / ml) incubated for 2 hours at room temperature. In this Time should be solved LPS of binding proteins can be bound as this in physiological Way also happens. The aliquots are stored at -80 ° C.
ProbenvorbreitungProbenvorbreitung
Das Plasmaproben werden auf der Laborbank aufgetaut.The plasma samples are on the laboratory bench thawed.
Komponenten des Komplement-Systems werden durch 30 Minuten Inkubation bei 56°C inaktiviert. Anschließend wird 1 Minute gevortext und abzentrifugiert (2 Minuten 6000 upm, Heraeus pico oder fresco, entspricht ~ 2100 g). Je 100 μl Überstand werden in ein 2 ml-Eppendorfgefäß überführt.Components of the complement system inactivated by incubation at 56 ° C for 30 minutes. Then will Vortexed for 1 minute and centrifuged (2 minutes 6000 rpm, Heraeus pico or fresco, corresponds to ~ 2100 g). 100 μl of supernatant are transferred to a 2 ml Eppendorf tube.
Sofern ein Protease-Inkubation stattfinden soll, werden die Proben mit 0,8 mg/ml Proteinase-K inkubiert (16h bei 37°C), anschließend 15' bei 95°C inaktiviert.If a protease incubation is to take place, the samples are incubated with 0.8 mg / ml Proteinase-K (16h at 37 ° C), then inactivated 15 'at 95 ° C.
Die Ergebnisse sind in den
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