DE10242433A1

DE10242433A1 - DNA-Chips zur Bioprozeßkontrolle

Info

Publication number: DE10242433A1
Application number: DE10242433A
Authority: DE
Inventors: Jörg Dr. Feesche; Karl-Heinz Dr. Maurer; Roland Dr. Breves; Thomas Dr. Schweder; Michael Prof. Hecker; Britta JÜRGEN; Birgit Voigt
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA; Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA; Universitaet Greifswald
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2004-03-25
Also published as: WO2004027092A2; US20060040279A1; EP1537245A2; WO2004027092A3; AU2003258715A1; AU2003258715A8

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft die Auswahl prozeßkritischer Gene, die dazu geeignet sind, den Verlauf von Bioprozessen zu überwachen, und mit entsprechenden Nukleinsäure-Sonden dotierte Chips zur Überwachung des Verlaufs eines Bioprozesses. Sie eignen sich insbesondere zur Überwachung von Fermentationen, insbesondere von gramnegativen Bakterien wie E. coli oder von grampositiven Bakterien wie B. subtilis oder B. licheniformis, die für die industrielle Herstellung biologischer Produkte, etwa Proteine oder niedermolekularen chemischen Verbindungen, eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft mit Nukleinsäure-Sonden dotierte Chips, die dazu geeignet sind, den Verlauf von Bioprozessen zu überwachen sowie die Verwendung entsprechender Sonden auf solchen Chips, beziehungsweise Verfahren und Verwendungsmöglichkeiten, die auf derartigen Chips beruhen.
Bei der technischen Nutzung biologischer Prozesse stellt sich das sehr grundlegende Problem, deren Verlauf zu überwachen, um zum gewünschten Ergebnis zu gelangen, um Ressourcen zu schonen und/oder um in einer gegebenen Zeit ein optimales Ergebnis zu erzielen. Unter biologischen Prozessen sind beispielsweise die Kultur von Mikroorganismen auf einer Agarplatte oder in Schüttelkultur zu verstehen, insbesondere aber deren Fermentation, beziehungsweise die Gewinnung von Rohstoffen über die Fermentation von Mikroorganismen. Hierzu gibt es einen reichhaltigen Stand der Technik, sowohl was einzellige Eukaryonten wie Hefen oder Streptomyceten, als auch was gramnegative oder grampositive Bakterien angeht.
Die Überwachung derartiger Prozesse geschieht einerseits durch die Beobachtung der sich im Laufe des Prozesses wandelnden Eigenschaften und Anforderungen der betrachteten Organismen, was sich beispielsweise in der optischen Dichte und Viskosität des Mediums, in aufgenommenen oder abgegebenen Gasen, in Änderungen des pH-Werts oder sich wandelnden Nährstoffbedürfnissen niederschlägt.
Andererseits sind in den letzten Jahren verschiedene Techniken entwickelt worden, um die Stoffwechselprozesse der betreffenden Organismen auf der Ebene der Genexpression zu verfolgen. Eine gängige Methode hierfür ist die Verwendung von Genen für leicht nachzuweisende Proteine als Indikatoren für die Aktivität der Promotoren für die eigentlich interessierenden Gene (Promotor-Analyse, Genexpressions-Analyse).
Hierfür sind auch entsprechende Apparaturen (sogenannte (Bio-)Sensoren) entwickelt worden, um ein möglichst zeitnahes Ergebnis zu erhalten. Einen Überblick über die Anwendung der Sensor-Technologie auf biologische Fragen bietet beispielsweise der Aufsatz „Biosensor Microsystems" von G.Urban (2001) in Sensors Update, 8, S. 189–214.
Beispielsweise in der Arbeit „On-line monitoring of gene expression" (I.Biran et al., 1999, Microbiology, 145, S. 2129–2133) wird ein elektrochemischer Sensor zur On-line-Analyse von E. coli-Kulturen beschrieben. Demnach kann das lacZ-Gen unter die Kontrolle des Promotors des RpoS-abhängigen Gens osmY gebracht werden, welches bei Übergang einer Kultur in die stationäre Wachstumsphase exprimiert wird. Die hiervon abgeleitete, im Kulturmedium auftretende β-Galactosidase-Aktivität kann über einen elektrochemischen Sensor ermittelt werden. Das hierüber erhaltene Signal zeigt somit das Ende der exponentiellen Wachstumsphase der betreffenden Kultur an.
Andere Techniken befassen sich mit dem Nachweis der interessierenden mRNA, beziehungsweise der abgeleiteten Proteine selbst. Hierzu gehören (1.) die Proteom-Analyse, d.h. die Betrachtung der Veränderung der Ausstattung der betreffenden Zellen mit Proteinen, welche zumeist über 2-dimensionale Gelelektrophorese der Zellysate erfolgt, (2.) die Analyse der gebildeten mRNA (Transkriptom) über ein in analoger Weise erstelltes „genomisches DNA-Array" und (3.) die Chip-Technologie.
Letztere befindet sich in einem vergleichsweise frühen Entwicklungsstadium. Während die beiden zuerst genannten Methoden letzlich auf quantitativen Isolierungen und zeitaufwendingen Analysen der betreffenden Makromoleküle beruhen, liegt der Chip-Technologie das Prinzip zugrunde, auf physikalisch auslesbaren Trägern (Chips) Sonden für Proteine oder für Nukleinsäuren anzubringen, die unmittelbar auf das Vorhandensein der betreffenden Proteine, beziehungsweise Nukleinsäuren ansprechen. Gegenüber den beiden zuerst genannten Technologien verspricht man sich von derartigen Chips eine zum betrachteten Prozeß zeitnahe Analyse (At line-Analyse). Ein weiterer Vorteil ist der Bedarf an vergleichsweise kleinen Probenmengen.
Das Prinzip von Chip-basierten Messungen wird beispielsweise in dem Artikel „Real-time electrochemical monitoring: toward green analytical chemistry" von J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, S. A-F) schematisch in 2 vorgestellt. Demnach wird die zu analysierende Probe mit einer Erkennungsschicht (biorecognition layer) in Kontakt gebracht, bei der es sich beispielsweise um Enzym, Antikörper, Rezeptor oder DNA handeln kann; das hierüber empfangene Signal wird über einen Umwandler (Transducer), beispielsweise eine amperometrische oder potentiometrische Elektrode, über einen Verstärker (amplification/processing) als elektrische Spannung oder als elektrisches Potential ausgegeben. In der betreffenden Arbeit werden auch optische Systeme angesprochen, denen gegenüber die elektronisch auswertbaren Systeme hinsichtlich der Miniaturisierbarkeit und anderer Vorteile dem Autor günstiger erschienen.
Der Stand der Technik ist bezüglich des Aufbaus und der Funktionsweise derartiger Chips also breit aufgefächert: grundsätzlich wird zwischen Protein-bindenden und Nukleinsäuren, d.h. insbesondere mRNA erkennenden Chips unterschieden. Aufgrund der vorliegenden Erfindung können die Protein-spezifischen außer Betracht bleiben. mRNA erkennende Chips sind i.d.R. mit komplementären DNA-Molekülen dotiert. Unter den DNA-Chip-Analysen gibt es solche mit einer PCR-Amplifikation der Zielsequenz und solche ohne Amplifikation. Ferner gibt es solche mit optischer Auswertung der auf die Erkennung zurückzuführenden Signale und solche mit elektrischer Auswertung.
Die optischen Detektionsmethoden erfordern zum Teil einen Verstärkungsmechanismus der Signale. Hierfür werden zum Beispiel Fluorophore, Acridiniumester oder eine indirekte Detektion über sekundäre Bindungsvorgänge, zum Beispiel über Biotin, Avidin/Streptavidin oder Digoxigenin beschrieben. Im letzteren Falle werden zum optischen Nachweis Digoxigenin-spezifische Antikörper eingesetzt, die mit einem Enzym markiert werden. Dabei wird die Enzymaktivität entweder kolorimetrisch oder über Lumineszenz nachgewiesen. Nach Westin et al. (2000), Nature Biotechnol., 18, S. 199–204, kann die Hybridisierung mit einer PCR auf dem DNA-Chip gekoppelt werden, um so die gesamte Nachweisreaktion auf einem Chip durchführen zu können („Lab-on-a-Chip-Konzept").
Weitere Arbeiten beschrieben die Entwicklung von DNA-Chips, die das Prinzip der Kapillarelektrophorese zur DNA-Sequenzierung, beziehungsweise Trennung miniaturisieren (Woolley und Mathies (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., 91, S. 11348–11352; Liu et al. (2000), Proc. Natl. Acad. Sci., 97, S. 5369–5374).
Elektrisch auslesbare DNA-Chips sind in einigen Publikationen prinzipiell bereits vorgestellt worden (Hoheisel (1999), DECHEMA Jahresbericht 1999., S.8–11; Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267–283). Wright et al. (2000; Anal. Biochem., 282, S. 70–79) nutzten einen „Ion-Channel-Sensor" (ICS) zur DNA-Detektion, wie er erstmalig von Cornell et al. (1997; Nature, 387, S. 580–583) beschrieben wurde. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Leitfähigkeit molekularer Ionenkanäle durch eine Bindungsreaktion detektiert wird. Im wesentlichen stellt der Sensor ein Impedanz-Element dar. Cheng et al. (1998; Nat. Biotechnol., 16, S. 541–546) zufolge können elektrische Impulse zu einer Verstärkung der Hybridisierungsreaktion auf optischen DNA-Chips genutzt werden. Fritsche et al. (2002; Laborwelt II) schlugen ein elektrisches Chip-System vor, das mit metallischen Nanopartikeln arbeitet, die zum Beispiel an Oligonukleotide gebunden sind. Bei diesem System wird durch eine sogenannte „metallische Verstärkung" während der Hybridisierungsreaktion ein Abfall des elektrischen Widerstandes an der Elektrode ausgelöst, der dann als Signal meßbar ist.
Ein weiterer Ansatz basiert auf einem elektrischen Detektionsprinzip, in dem DNA-Sonden verwendet werden, die durch die Markierung mit einem geeigneten Enzym (zum Beispiel alkalische Phosphatase) nach der Hybridisierung zu einem elektrisch aktiven Substrat führen, das dann durch eine Redox-Reaktion an der Elektrode detektierbar ist (Hintsche et al. (1997), EXS, 80, S. 267–283).
Wenn man sich dazu entscheidet, einen bestimmten Chip-Typus, beispielsweise einen auf Nukleinsäuren ansprechenden Chip zur Überwachung von Bioprozessen einzusetzen, so stellt sich das konkretere Problem, welche Genaktivitäten beobachtet werden sollen. Für die Anfertigung und den Gebrauch des entsprechend hergestellten Chips kann dann wieder auf den Stand der Technik zurückgegriffen werden.
In der Zahl der mit einem Nukleinsäure-Chip gleichzeitig analysierbaren Gene bestehen technisch bedingte Grenzen. So sind optisch auslesbare Chips, was die Zahl der Sonden, die auf dem Chip aufgebracht werden können, den elektrisch auswertbaren derzeit überlegen. Deren Grenzen werden durch die Miniaturisierbarkeit der elektronischen Meßeinheiten gesetzt.
Es stellt sich somit das biologische Problem, welche Genaktivitäten den betrachteten Prozeß, abbilden. Hierzu gehört auch die Überwachung der Produktbildung, wenn es sich beispielsweise um eine fermentative Produktherstellung handelt. Gleichzeitig sollten aber auch Kontrollgene eingeschlossen werden, die anzeigen, wenn der Prozeß sich in eine Richtung entwickelt, die nicht beabsichtigt ist. Im Zuge dieses Monitoring sollte aus Praktikabilitätsgründen einerseits eine nicht zu hohe Zahl an verschiedenen Genen beobachtet werden. Andererseits ist die Erfassung eines breiten Spektrums an Genaktivitäten mit ein und demselben Chip wünschenswert, beispielsweise um eine Vielzahl von möglichen Szenarien zu erkennen, beispielsweise aber auch wenn parallel mehrere Organismenstämme beobachtet oder derselbe Wirt zur Bildung verschiedener Produkte genutzt werden soll, damit nicht jedesmal ein neuer Chip entwickelt werden muß.
Von besonderem technischen Interesse sind biotechnologische Prozesse mit gram-positiven Bakterien. Denn diese werden besonders aufgrund ihrer Fähigkeit zur Sekretion zur industriellen Herstellung von Wertstoffen eingesetzt. Hierunter haben solche der Gattung Bacillus und hierunter, wiederum, die Spezies B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. agaradherens, B. licheniformis, B. lentus und B. globigii derzeit die wirtschaftlich größte Bedeutung.
Mit der simultanen Beobachtung der Aktivität mehrerer Gene in Bakterien (multiparametrische Erfassung) befassen sich beispielsweise die im folgenden vorgestellten und anschließend in Tabelle 1 zusammengefaßten Arbeiten.
In dem Artikel „Monitoring of genes that respond to process-related stress in large-scale bioprocesses" von Schweder et al. (1999), Biotech. Bioeng., 65, S. 151–159, wird die Veränderung der mRNA-Spiegel verschiedener durch Streß-Faktoren induzierbarer Gene, nämlich clpB, dnaK (induziert bei Hitzeschock), uspA (Glucose-Mangel), proU (osmotischer Streß), pfl und frd (O₂-Mangel) und ackA (Glucose-Überschuß) im Verlauf einer Fermentation von E. coli und in der nachfolgenden Konzentrierungsphase beschrieben. Sie wurden über eine PCR-basierte, auf herkömmliche Weise durchgeführte Methode erfaßt. Hierbei wurden unterschiedliche Expressionsraten bereits an verschiedenen Stellen des Reaktors und sekundenschnelle Reaktionen auf veränderte Bedingungen festgestellt. Die Gene proU und ackA waren während des Wachstums sehr aktiv, bei Glucose-Mangel aber deutlich weniger. Die Gene clpB, dnaK, pfl und frd blieben dagegen während des Wachstums konstant und zeigten bei Glucose-Überschuß und (damit verbunden) bei O₂-Mangel eine erhöhte Expression. uspA blieb sowohl bei Wachstum als auch bei Glucose-Mangel vergleichsweise konstant. Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Überlegung, die genannten Gene als Indikatoren für das Monitoring eines Bioprozesses einzusetzen; für uspA, zumindest, wurde diese Hoffnung jedoch enttäuscht.
Eine weitere Fermentation von E. coli wird in der Arbeit „Monitoring of genes that respond to overproduction of an insoluble recombinant protein in Escherichia coli glucose-limited fed-batch fermentations" von Jürgen et al. (2000), Biotech. Bioeng., 70, S. 217–224, beschrieben. Hierin wird die Expression der Gene Ion, dnaK, ibpB, htrA, ppiB, groEL, tig, s6, I9 und dps, teilweise auf mRNA-, teilweise auf Proteinebene, teilweise auf beiden Ebenen betrachtet. Dabei erfolgte die Untersuchung über 2D-PAGE, beziehungsweise die DNA-array-Technik. Angesichts der Ergebnisse, die in der vorliegenden Anmeldung in Tabelle 1 zusammengestellt sind, wird vorgeschlagen, rekombinante Bioprozesse wie die heterologe Protein-Herstellung über (unmittelbar) Prozeß-relevante Proteine und Reporter-Gene wie ibpB zu verfolgen.
Mit einer weiteren Beobachtung des Fermentationsverlaufs bei Expression eines rekombinanten Proteins durch E. coli befaßt sich die Arbeit „Genomic analysis of high-cell-density recombinant Escherichia coli fermentation and "cell conditioning" for improved recombinant protein yield" von R.T.Gill et al. (2001; Biotech. Bioeng., 72, S. 85–95). Hierin wird beschrieben, daß die Streß-Gene degP, uvrB, alpA, mltB, recA, ftsH, ibpA, aceA und groEL unter den genannten Bedingungen bei hoher Zelldichte gegenüber niedriger Zelldichte verstärkt exprimiert werden. Der Stärke der Reaktion nach gruppierten sie sich untereinander zu gewissen Clustern. Dies wurde über einen auf RT-PCR und DNA-Microarray beruhenden und durch Dot-blot- Analyse ergänzten Ansatz ermittelt, der auf Proben von zwei Zeitpunkten der Fermentation angewendet wurde, eben zu Beginn bei niedriger Zelldichte und gegen Ende bei hoher Zelldichte. Hieraus wurden „Cell Conditioning"-Ansätze entwickelt, um die Streß-Antwort der Zellen herabzusetzen.
Grundsätzliche Unterschiede in den Expressionsmustern gram-positiver Organismen gegenüber denen von gram-negativen Bakterien werden mit der Arbeit „Proteome and transcriptome based analysis of Bacillus subtilis cells overproducing an insoluble heterologous protein" von Jürgen et al. (2001), Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, S. 326–332 aufgedeckt. Darin wird die Expression u.a. der Gene dnaK, groEL, grpE, clpP, clpC, clpX, rpsB und rplJ in B. subtilis beschrieben, wie sie über die DNA-macro-array-Technik, beziehungsweise über zweidimensionale Polyacrylgelelektrophorese ermittelt werden können. Hiernach werden in gram-positiven zur Überexpression eingesetzten Bakterien die Gene für die Purin- und die Pyrimidin-Synthese sowie die bestimmter ribosomaler Proteine stärker exprimiert, als aufgrund der Erkenntnisse an gram-negativen Bakterien zu erwarten war. Ein weiterer Unterschied betrifft die Proteasen Lon und Clp.
Tab. 1: Gene, deren Expressionsänderung bei Fermentationen in den genannten Dokumenten beschrieben worden ist
Abk.: Glc: Glucose; σ: jeweiliger Transkriptionsfaktor gram-negativer Bakterien; +: erhöhtes mRNA-Niveau; –: verringertes mRNA-Niveau;
Es ist jeweils vermerkt, wenn nur auf verändertes Protein-Niveau getestet worden ist.
Prinzipiell könnten alle diese Gene im Verlaufe eines biologischen Prozesses wie der Bakterienkultur oder der Fermentation beobachtet werden und gäben damit jeweils eine ganz spezielle Aussage über den jeweiligen physiologischen Aspekt der betreffenden Kultur. Prinzipiell könnten damit alle dazu genutzt werden, um einen solchen Prozeß zu überwachen. Andererseits stellt sich angesichts des Aufwands die Frage, auf welche dieser Indikator-Gene ein entsprechendes Monitoring eingeschränkt werden kann, ohne daß wesentliche Aspekte übersehen werden. Denn je weniger Gene beobachtet werden müssen, desto einfacher sind die betreffenden Sensoren herstellbar und desto geringer wird der technische Aufwand für das gewählte Detektionssystem.
Während praktisch alle diese Gene jeweils für sich oder in Gruppen im Stand der Technik charakterisiert und teilweise als Indikatoren für den physiologischen Zustand der betreffenden Zellen diskutiert worden sind, geht die für die vorliegende Erfindung getroffene Auswahl an Genen für eine Kontrolle biologischer Prozesse, insbesondere Fermentationen von gram-positiven Bakterien nicht aus dem Stand der Technik hervor.
Es stellte sich somit die Aufgabe, Gene zu identifizieren, vorzugsweise einen repräsentativen Querschnitt von Genen zu identifizieren, die geeignet sind, um über Änderungen von Stoffwechselaktivitäten anzuzeigen, wie ein beobachteter Bioprozeß verläuft. Insbesondere sollte hier auf Fermentationen, besonders solche Fermentationen geachtet werden, die der Herstellung von biologischen Wertstoffen dienen. Dementsprechend sollten solche physiologischen Zustände erkennbar werden, die anzeigen, daß die betreffenden Zellen den Weg des optimalen Wachstumsverlaufs verlassen. Hierzu gehören beispielsweise Hungerzustände gegenüber verschiedenen Nährstoffen oder Streßsituationen wie beispielsweise Hitze- oder Kälteschock, Scherstreß, oxidativer Streß oder Sauerstofflimitation.
Ziel war es, Sonden für diese Gene zu entwickeln, um sie für die Überwachung (Monitoring) entsprechender Bioprozesse einsetzen zu können.
Eine weitere Aufgabe bestand darin, einen mit Sonden auf eine repräsentative Auswahl von Markergenen dotierten Sensor zu entwickeln, der geeignet ist, bei der Überwachung eines auf Mikroorganismen, insbesondere grampositiven oder gramnegativen Bakterien beruhenden Bioprozesses Änderungen der diesen Prozeß kennzeichnenden Stoffwechselaktivitäten schneller als nach herkömmlichen, insbesondere auf Gelelektrophoresen beruhende Methoden anzuzeigen. Hiermit sollte sich der Vorteil ergeben, mit möglichst kurzer Zeitverzögerung in den betreffenden Prozeß eingreifen zu können. Denn durch die Möglichkeit zu zeitnahen Regulationen sollte sich ein Bioprozeß effizienter durchführen lassen.
Solch ein Sensor sollte für mehrere miteinander vergleichbare Prozesse einsetzbar und mit vergleichsweise geringfügigen Variationen an spezifische Einsatzmöglichkeiten anzupassen sein. Vorzugsweise sollte er auf Bioprozesse auf der Grundlage von Bacillus-Spezies, insbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. lentus, B globigii, und ganz besonders auf B. licheniformis ausgerichtet sein. Unter Bioprozessen standen Fermentationen, insbesondere die technische Herstellung von Produkten, ganz besonders von überexprimierten Proteinen im Vordergrund.
Ferner sollte solch ein Sensor entsprechende Verfahren zur Messung des physiologischen Zustands der betrachteten Zellen sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten zur Überwachung der betrachteten biologischen Prozesse ermöglichen.
Der erste Teil dieser Aufgabe wird durch Identifizierung der folgenen Gene gelöst: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF.
Die weitergefaßte Aufgabe wird durch einen Chip gelöst, der mit Sonden für mindestens eines der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen dotiert ist.
Diese erfindungsgemäß zur Bioprozeßkontrolle einsetzbaren Gene werden zusammen mit den Funktionen der jeweils abgeleiteten Proteine und dem physiologischen Signal, für welches sie stehen, in folgender Tabelle 2 zusammengestellt, sofern letzteres aus der Funktion nicht eindeutig ersichtlich ist. Zusammenfassend handelt es sich um Gene, deren Genprodukte in folgenden Stoffwechselzusammenhängen aktiv werden: Zellwandsynthese, DNA-Replikation, Membrantransportmechanismen C-Metabolismus (Kohlenstoffhaushalt), Citratcyclus (Tricarbonsäurezyklus; TCA), Atmungskette, N-Metabolismus (Stickstoffhaushalt), P-Metabolismus (Phophathaushalt), Aminosäuresynthese, Purin-, und Pyrimidinsynthese, Translation, einschließlich ribosomaler Gene, Sekretion, Anaerobiosis und Sporulation, sofern die betreffenden Organismen dazu in der Lage sind.
Zusätzlich wird in Tabelle 2 auf die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen verwiesen, die beispielsweise aus Bacillus subtilis und/oder Escherichia coli erhalten werden können und dieser Tabelle entsprechend im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung unter den Nummern SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 82 angegeben sind.
Tab. 2: Erfindungsgemäß zur Bioprozeßkontrolle einsetzbare Gene, die Funktionen der jeweils abgeleiteten Proteine und die damit verbundenen Signale und Verweis auf die aus den entsprechenden Organismen identifizierten Sequenzen, wie sie im Sequenzprotokoll zur vorliegenden Anmeldung angegeben sind.
Im Sequenzprotokoll umfassen die betreffenden DNA-Sequenzen die für das jeweilige Protein codierenden Bereiche sowie jeweils ca. 200 bp stromauf- und stromabwärts davon, ungeachtet dessen, ob diese Bereiche die jeweils vollständigen nichtcodierenden Bereiche des Gens erfassen oder in Bereiche hineinragen, die bereits die Nachbargene betreffen.
All diese Gene sind jeweils für sich im Stand der Technik beschrieben. Sie können für die verschiedenen Organismen aus allgemein zugänglichen Datenbanken entnommen werden. Dies trifft insbesondere auf die gut charakterisierten Spezies B. subtilis und E. coli zu, die allgemein als Modellorganismen der grampositiven, beziehungsweise gramnegativen Bakterien angesehen werden. Die beispielsweise im Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen wurden aus den Datenbanken des Institut Pasteur, 25,28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, Frankreich, entnommen, welche über die Internet-Adressen http://genolist.pasteur.fr/Colibri/ (für E. coli), beziehungsweise http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/ (für B. subtilis) zugänglich sind (Stand: 16.8.2002).
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungegmäße Chips mit zunehmend bevorzugt mindestens 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 32 oder 34 der genannten Sonden dotiert, um ein möglichst breites Spektrum an Stoffwechselsituationen zu erfassen.
Von den aufgeführten Genen sind die meisten sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien bekannt. Einzelne dieser Gene sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt lediglich aus einzelnen Organismengruppen wie etwa gramnegativen oder grampositiven Bakterien bekannt. Sollten hierzu in Zukunft homologe, d.h. über Hybridisierung erkennbare Vertreter in anderen Gruppen gefunden werden, so werden sie entsprechend in den Anspruchsbereich eingeschlossen. Denn erfindungsgemäß kommt es nicht darauf an, die exakte Nukleotidabfolge zu ermitteln sondern über Hybridisierung ein zutreffendes Signal zu erhalten. So kann beispielsweise das Gen groEL aus einem grampositiven Organismus wie B. subtilis über homologe Hybridisierung mit einer Sonde für das Gen groL aus E. coli identifiziert werden. Da die zugehörigen Genprodukte in beiden Organismenklassen dieselbe Funktion ausüben, nämlich die eines Chaperons, kann aus der Detektion dieses Signals auf eine Streßsituation des betrachteten Organismus geschlossen werden, bei der eine Vielzahl fehlgefalteter Proteine auftreten. Dieselbe Sonde ist analog auch auf andere Spezies anwendbar, die ein groL-ähnliches Chaperon bilden.
Andere Gene, die im betrachteten Organismus gleich reguliert sind und auf den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen liegen, können als gleichwertige Indikatoren dienen. So kann die beispielsweise die Wahl der für den Purin-Stoffwechsel charakterisitischen Gene purC oder purN in gewisser Hinsicht als willkürlich angesehen werden. In alternativen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden ein oder mehrere andere Gene ausgewählt, die ebenfalls für die Purin-Synthese benötigt werden, sofern sie für das selbe Signal stehen wie purC und/oder purN. Das gleiche gilt auch für die Gene der übrigen betrachteten Stoffwechselleistungen: Zellwandsynthese, DNA-Replikation, Membrantransportmechanismen C-Metabolismus (Kohlenstoffhaushalt), Citratcyclus (Tricarbonsäurezyklus; TCA), Atmungskette, N-Metabolismus (Stickstoffhaushalt), P-Metabolismus (Phophathaushalt), Aminosäuresynthese, Pyrimidinsynthese, Translation, einschließlich ribosomaler Gene, Sekretion, Anaerobiosis und ggf. Sporulation.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Chip auf grampositive Bakterien, insbesondere B. subtilis ausgerichtet. Hierfür empfiehlt es sich, ihn mit Sonden zu dotieren, die aus der Gruppe der Gene acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, gsiB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Chip auf gramnegative Bakterien, insbesondere E. coli ausgerichtet. Hierfür empfiehlt es sich, ihn mit Sonden zu dotieren, die aus der Gruppe der Gene clpP, cspA, cspB, dnaK, groL, ibpA, ibpB, katE, phoA, pstS, und trxA, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
Entsprechend den oben gemachten Ausführungen können von einzelnen Stoffwechselwegen jeweils einzelne Vertreter ausreichend sein, um ein entsprechendes Signal zu ergeben. Inbesondere bei elektronisch auswertbaren Chips ist es zudem notwendig, die Gesamtzahl der Sonden auf einem Chip gering zu halten. Chips bevorzugter Ausführungsformen sind deshalb dadurch gekennzeichnet, daß von folgenden Genpaaren jeweils nur eines oder ein anderes im betrachteten Organismus gleich reguliertes Gen aus dem jeweils durch eines dieser Gene gekennzeichneten Stoffwechselweg vorhanden ist: ahpC oder ahpF; clpC oder clpP; cspA oder cspB; ibpA oder ibpB; lctP oder ldh; phoA oder phoD; purC oder purN; pyrB oder pyrP.
Für bestimmte biologische Prozesse, insbesondere die Bildung gewerblich relevanter Verbindungen durch Mikroorganismen werden in der Regel nicht die Wildtyp-Stämme eingesetzt, sondern solche, die auf den betreffenden Prozeß ausgerichtet sind. Hierzu gehört neben der Transformaton mit den für die eigentliche Produktherstellung verantwortlichen Genen das Versehen mit Selektionsmarkern oder weitere Anpassungen des Stoffwechsels, bis hin zu Auxotrophien. Derartige Stämme besitzen ein besonderes Anforderungsprofil an die Wachstumsbedingungen und besitzen z.T. Stoffwechselgene, die gegenüber den Wildtypgenen mutiert sind. Da erfiundungsgemäße Chips vorteilhafterweise auf eben diese Stämme, ganz besonders den betrachteten Bioprozeß ausgerichtet sein sollen, müssen diese Stammspezifischen Eigenheiten berücksichtigt werden und können sich in der Wahl der betreffenden Sonden widerspiegeln. Das gilt insbesondere dann, wenn als Sonden nicht die kompletten Gensequenzen sondern nur Teile hiervon eingesetzt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich also um Chips die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Sonden handelt, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen.
Dies gilt besonders dann, wenn es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Abhängig von der Art des gewünschten Produkts werden verschiedene Organismen gewählt. Hierunter sind im Sinne der Erfindung nicht allein die produktionsstämme zu verstehen sondern auch alle dem Produktionsprozeß vorgeschalteten Organismen, beispielsweise zur Klonierung entsprechender Gene oder zur Auswahl geeigneter Expressionsvektoren.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces. Denn diese werden als Wirtszellen insbesondere für die Genprodukte von Eukaryonten eingesetzt, besonders wenn diese spezielle, nur durch diese Stämme durchführbare Modifikationen erfahren sollen. Hierzu gehören beispielsweise Glykosylierungen.
Aber auch die Ausrichtung erfindungsgemäßer Chips auf die Überwachung des Verlaufs, insbesondere des Wachstums von Zellkulturen höherer Eukaryonten, etwa von Nagetieren oder von Menschen werden umfaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii. Denn dies sind technisch besonders wichtige Produktionsstämme. Sie werden insbesondere zur Produktion niedermolekularer chemischer Verbindungen, etwa von Vitaminen oder von Antibiotika oder zur Produktion von Proteinen, insbesondere Enzymen eingesetzt. Hierbei sind besonders Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Oxidoreduktasen und Proteasen besonders hervorzuheben.
In einer nicht minder bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um gramnegative Bakterien, insbesondere um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella. Diese dienen sowohl im Labormaßstab beispielsweise der Klonierung und Expressionsanalyse als auch im großtechnischen Maßstab der Herstellung biologischer Wertstoffe.
Mit der vorliegenden Anmeldung werden nicht nur die oben beschriebenen Gene als interessante Kandidaten für die Prozeßüberwachung dargestellt sondern auch entsprechende Sequenzen zur Verfügung gestellt. Diese sind im Sequenzprotokoll aufgeführt, wobei die ungeradzahligen Sequenznummern jeweils die Gene und die geradzahligen Sequenznummern die abgeleiteten Genprodukte bezeichnen.
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Chips somit dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 und 81 aufgeführt sind.
Wie oben ausgeführt dienen die beobachteten Prozesse einem technischen Interesse, das mit weiteren spezifischen Genen verbunden ist. Hierbei handelt es sich beispielsweise in dem Fall, daß ein Protein hergestellt werden soll, um das Gen für dieses Protein und in dem Fall, daß eine niedermolekulare Verbindung hergestellt werden soll, um ein oder mehrere Genprodukte, die auf dem Syntheseweg der betreffenden Verbindung liegen. Es können auch andere zelleigene Gene betroffen sein, etwa Stoffwechselgene, die im Zuge der Produktherstellung verstärkt gebildet werden müssen, beispielsweise eine zelleigene Oxidoreduktase, wenn das Produkt aus einem Edukt oder einem Zwischenprodukt über Oxidation oder Reduktion erhalten werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich somit um Chips, die zusätzlich mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen dotiert sind, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Genen) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
In den Fällen, daß ein gebildetes Polypeptid selbst von Interesse ist oder eine endogene Aktivität verändert ist, handelt es sich in bevorzugten Ausführungsforme um Chips, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
Aus dem einleitend dargestellten Stand der Technik ist die Gestaltung von Chips bekannt, die mit Nukleinsäuren dotiert sind. Sie basieren auf dem Prinzip der Nukleinsäure-Hybridisierung der zu detektierenden mRNA mit der auf dem Chip vorgelegten Sonde. Je nach System zur Auswertung des durch die Hybridisierung ausgelösten Signals wird zwischen Chips mit einem optischen und mit einem elektrischen Analysesystems unterschieden. Erfindungsgemäß sind prinzipiell beide Systeme anwendbar.
Solche Chips werden folgendermaßen zur Kontrolle (Monitoring) des jeweils betrachteten Bioprozesses eingesetzt: Aus dem Prozeß wird zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Probe mit dem zu analysierenden biologischem Material entnommen; aus diesem wird, nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise unter Zellaufschluß und Verwendung einen denaturierenden Puffers RNA, insbesondere mRNA isoliert. Diese wird markiert vorteilhafterweise in einem Puffer über/durch den Chip geleitet. Bei Hybridisierung (Sandwich-Markierung) einer präparierten RNA mit der homologen auf dem Chip bereitgestellten Sonde (Target-Nukleinsäure, beispielsweise Target-DNA oder Target-Nukleinsäureanalog) ergibt sich ein entsprechendes optisch oder elektronisch auswertbares Signal. Dieses beruht beispielsweise auf der Hybridisierung mit einer zweiten Sonde oder auf einer sekundären Nachweisreaktion, etwa über eine RT-PCR.
Da von derselben Sonde in der Regel jeweils mehrere Moleküle an den Chip gebunden sind, ist die Stärke des Hybridisierungssignal über einen gewissen – im Einzelfall ggf. zu optimierenden – Bereich proportional zur Zahl der zum Zeitpunkt der Probennahme in der Probe vorhandenen spezifischen mRNA. Auf diese Weise ist die Stärke des Signals ein direktes Maß für die Aktivität des betreffenden Gens zu dem Zeitpunkt der Probennahme.
Die Zeitspanne zwischen Probennahme und Messung sollte dabei so kurz wie möglich gehalten werden, beispielsweise über eine weitgehend automatisierte Probennahme, deren Aufarbeitung und Leitung über/durch den Sensor.
Limitierend für die Brauchbarkeit einer Sonde ist also jeweils das Maß der Homologie zwischen der bereitgestellten Sonde und der mRNA, die über Hybridisierung erkannt werden soll. Letztlich entscheidet das Maß an Hybridisierung der Sonde mit der zu detektierenden mRNA (siehe oben) über deren Brauchbarkeit als Sonde und muß im Einzelfall experimentell optimiert und/oder über Anpassung der Signalauswertung berücksichtigt werden. Es muß unter den durch den Aufbau der Meßapparatur, und sonstigen Einflüssen vorgegebenen Bedingungen eine Hybridisierung erfolgen, die spezifisch nur auf das interessierende Gen zurückgeführt werden kann, ausreichend stark ist, um ein positives Signal zu ergeben, und andererseits nicht zu stark ist, als daß die mRNA nach Erzeugung des Signals wieder abdiffundiert, um die Bindungsstelle für das nächste Molekül freizumachen, beziehungsweise ein Abklingen des Signals zu ermöglichen.
Allerdings ist es nötig, vor Verwendung erfindungsgemäßer Chips für einen interessierenden Organismus das Maß der Homologie zwischen den betreffenden Genen abzuschätzen, bei nicht ausreichender Affinität der zu detektierenden mRNAs zu den voregelegten Sonden solche über dieselben erfindungsgemäßen Gene aus näher verwandten Spezies auf dem Chip zu verankern und Kalibrierungsmessungen durchzuführen, um verläßliche Aussagen darüber zu erhalten, welche Signalstärke welcher Konzentration an spezieller mRNA entspricht.
Um eine optimale Hybridisierung zu erreichen, sind Chips bevorzugter Ausführungsformen dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt werden. Denn dieser hybridisiert mit dem codierenden Strang der DNA, beziehungsweise mit der entsprechenden mRNA.
Erfindungsgemäße Chips sollten vorteilhafterweise mehrmals verwendbar sein, insbesondere während eines einzelnen beobachteten Prozesses, in dessen Verlauf eine ständige Überwachung erstrebenswert ist. Um hierfür die Haltbarkeit erfindungsgemäßer Chips, insbesondere gegenüber Nukleinsäure-hydrolysierenden Enzymen zu erhöhen, sind erfindungsgemäße Chip dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt werden. Eine DNA ist an sich weniger hydrolyseempfindlich als etwa eine RNA. Schwerhydrolysierbare Analoga, in denen beispielsweise das Phosphat des Zucker-Phosphatsrückgrats ersetzt ist, sind demgegenüber jedoch bevorzugt. Derartige Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt. Die betreffenden Sonden wären, etwa nach dem Vorbild des mit dieser Anmeldung verbundenen Sequenzprotokolls entsprechend zu synthetisieren.
Zum Nachweis einer mRNA ist oft keine Hybridisierung über die ganze Seqzuenzlänge erforderlich. Die spezifischen Sonden brauchen deshalb weniger den Bereich des Gens zu umfassen, der in mRNA umgeschrieben wird, als den, der tatsächlich als mRNA nachzuweisen ist. Vorteilhaft ist hierfür eine Auswahl eines Bereichs, der nahe dem 5'-Ende der mRNA liegt, da dieser zuerst in mRNA transkribiert wird und somit nach Aktivitierung des Gens als erstes nachweisbar ist. Dies kommt einem zeitnahen Nachweis entgegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäße Chips somit dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden Genbereiche umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
mRNA-Moleküle liegen oft in einer Sekundärstruktur vor, die auf Hybridisierung einzelner mRNA-Bereiche mit eigenen, anderen Bereichen beruht. So kommt es beispielsweise zu Loop- oder Stem-loop-Strukturen. Solche Bereiche hybridisieren in der Regel jedoch weniger leicht mit anderen Nukleinsäuremolekülen, auch wenn diese homolog sind.
In bevorzugten Ausführungsformen sind erfindungsgemäße Chips deshalb dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
Die für die Nachweisreaktion eingesetzten Sonden brauchen nur Teile der zu detektierenden mRNA zu umfassen, sofern das über sie erhältliche Signal noch spezifisch genug ist. Diese Spezifität setzt die untere Grenze für die Länge der betreffenden Sonden.
Vorzugsweise ist also ein erfindungsgemäßer Chip dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden eine Länge von weniger als 200 Nukleotiden, und zunehmend bevorzugt von weniger als 150, 120, 100, 80, beziehungsweise von 20 bis 60, 30 bis 50 und besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweisen.
Erfindungsgemäße Chips sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bindung der mRNA an die betreffende Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
In dem bereits erwähnten Artikel J. Wang (Acc. Chem. Res.; ISSN 0001-4842; Rec. Sept. 12, 2001, S. A-F) werden die Vorteile eines elektrisch auswertbaren Systems gegenüber einem optischen System diskutiert. Ferner wird auf verschiedene im Stand der Technik entwickelte Ausführungsformen solcher Sensoren verwiesen.
So beträgt zum gegenwärtigen Zeitpunkt die Zeitspanne von der Probennahme bis zum Messen des Signals für optisch auswertbare Chips ungefähr 24 h. Mithilfe eines elektrischen Systems liegt der Zeitbedarf momentan bei ca. 2h. Demgegenüber ist die Zahl der gleichzeitig analysierbaren Proben bei elektrisch auswertbaren Chips derzeit auf maximal 12 Sonden beschränkt, wobei jedoch eine rasche Entwicklung dafür spricht, daß in Kürze auf einem Chip mehr Analyseplätze zur Verfügung gesdtellt werden können. Limitierend hierfür sind die elektronischen Auswerte-Einheiten für die verschiedenen Signale.
Die Herstellung entsprechender elektronisch auswertbarer Chips wird beispielsweise in den Patentanmeldungen WO 00/62048 A2, WO 00/67026 A1 und WO 02/41992 beschrieben, deren Offenbarungsgehalt vollständig in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Die Funktionsweise elektrisch auslesbarer Chips einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann wie folgt beschrieben werden: Die genspezifischen Sonden sind auf an sich bekannte Weise kovalent an magnetische Beads gebunden, die sich in hierfür vorgesehenen Kammern der Chips befinden. Die spezifische Hybridisierung der entsprechenden mRNA an die jeweiligen Beads erfolgt in dieser Hybridisierungskammer, die temperierbar ist und von den betreffenden Lösungen durchspült werden kann. Die Beads werden in dieser Kammer durch einen Magneten festgehalten. Nach der Hybridisierung der RNA-Proben an die Beads-gebundenen DNA-Sonden erfolgt ein Waschschritt zur Beseitigung der nicht-gebundenen RNA, so daß in der Inkubationskammer nur noch spezifische Hybride vorhanden sind, undzwar gebunden an den magetischen Beads.
Nach dem Waschen wird eine Detektionssonde in die Inkubationskammer eingeleitet, die über eine Biotin-Extravidin-gebundene alkalische Phosphatase markiert ist. Diese Sonde bindet an eine zweite freie Region der hybridisierten mRNA. Dieses Hybrid wird anschließend erneut gewaschen und mit dem Substrat der alkalischen Phosphatase Para-Aminophenolphosphat (pAPP) inkubiert. Die enzymatische Reaktion in der Inkubationskammer führt zur Freisetzung des redoxaktiven Produkts para-Aminophenol (pAP). Dieses wird nun über den Red/Ox-Elektrode auf dem elektrischen Chip geleitet und das Signal zu einem Potentiostaten gesendet.
Eine System-spezifische Software (zum Beispiel MCDDE32) liest die erhaltenen Daten und die Ergebnisse können mit Hilfe eines weiteren Programms (zum Beispiel Origin) auf einem Computer ausgewertet und dargestellt werden.
Selbstverständlich ist dieser Prozeß sowohl hinsichtlich der technischen Gestaltung der Chips als auch der Auswertung variierbar. So kann beispielsweise die Nachweisreaktion auch durch eine andere, wegen des elektrischen Meßprinzips vorzugsweise jedoch eine Redoxreaktion erfolgen.
Eine Leistung der vorliegenden Erfindung besteht darin, prozeßkritische Gene identifiziert und der Analyse über entsprechend gestaltete Biochips zugänglich gemacht zu haben. Der Vorteil von Chips gegenüber konventionellen Nachweismethoden besteht neben dem Zeitgewinn darin, daß mit der Bereitstellung mehrerer Sonden auf einem Träger gleichzeitig in derselben Probe die Aktivitäten von mehreren verschiedenen Genen nachgewiesen werden können.
So wird mit der vorliegenden Erfindung die Verwendung entsprechender Sonden zur Verfügung gestellt, die so ausgewählt sind, daß sie ein für die meisten Fermentationsverläufe repräsentatives Bild über verschiedene physiologische Zustände der betreffenden gramnegativen und grampositiven ergeben. Dies gilt insbesondere für die der Spezies E. coli (vgl. Beispiel 1 und 1), B. subtilis (vgl. Beispiel 2 und 2) und B. licheniformis (vgl. Beispiel 3 und 3). Die hierin beschriebenen Sonden, die spezifisch für die Gene ibpB, dnaK, acoA und sigB sind, können nun auf an sich bekannte Weise an entsprechende Chips gebunden und zur Analyse von Bioprozessen eingesetzt werden.
Ein eigener Erfindungsgegenstand ist somit die Verwendung einer Sonde für mindestens eines der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen, gebunden an einen zuvor beschriebenen Chip zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Gegenstands ergeben sich aus den oben gemachten Ausführungen zu den erfindungsgemäßen Chips.
Einen weiteren eigenen Erfindungsgegenstand bilden entsprechend dem oben Gesagten Verfahren zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Chips.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella handelt.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines erfindungsgemäßen Chips zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus dar.
Bevorzugte Ausführungsformen solcher Verwendungen wie auch der Verwendung der in der vorliegendnen Erfindung definierten Gensonden ergeben sich aus den bisher gemachten Auführungen.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Vewendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella handelt.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Vewendung dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße Vewendung dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Analyse der Expression der Gene ibpB und dnaK des gramnegativen Bakteriums Escherichia coli
Für die Bestimmung der ibpB- und dnaK-mRNA-Level vor und nach Überproduktion eines unlöslichen Modellproteins (α-Glycosidase von Saccharomyces cerevisiae) in Escherichia coli wurde die Slot-blot-Analyse verwendet. Der E. coli Stamm RB791 [F^–, IN(rmD – rmE)1, λ^–, lacl^qL₈] wurde für die Experimente verwendet. Dieser Stamm enthält das Plasmid pKK177glucC mit dem Gen der α-Glucosidase, dessen Expression durch den tac-promoter und die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert wird. Weiterhin trägt dieser Stamm das Plasmid pUBS520, das eine minor-argU-tRNA konstitituiv exprimiert (Brinkmann et al., 1989).
Die Kultivierung wurde als Fed-batch-Fermentation in einem 6 l-Biostat ED Fermentor (Fa. B. Braun Biotech. Int., Melsungen) durchgeführt. Alle Fermentationen erfolgten in einem Glukose-Ammonium basierten Mineralsalzmedium bei einer Temperatur von 35°C wie bei Teich et al. (1998; J. Biotechnol., Bd. 8, S. 197–210) beschrieben. Die Induktion erfolgte durch die Zugabe von 1 mM IPTG.
Für die mRNA-Analyse wurden die Zellen in 400μl (1:1 (v/v)) Killing-Puffer (20mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM NaN₃, 5 mM MgCl₂) aufgenommen und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet bei –80°C bis zur weiteren Analyse gelagert. Gesamt-RNA wurde mit dem High Pure-RNA Isolation Kit (Fa. Roche Diagnostics) isoliert. Definierte Mengen der isolierten RNA wurden mit 10 × SSC (1.5 M NaCl, 0.15 M Na-Citrat, pH 7) verdünnt und auf eine positiv geladene Nylonmembran aufgetragen. Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit einer Digoxigenin-markierten spezifischen RNA-Sonde entsprechend der Vorgaben des Handbuchs von Roche Diagnostics. Die RNA-Sonden wurden in vitro mit der T7 RNA Polymerase von einem PCR-Produkt synthetisiert, das eine T7-Promotorsequenz enthielt. Die folgenden Primer wurden für die Synthese der entsprechenden PCR-Produkte verwendet:
Die Hybridisierungssignale auf dem Filter wurden mit dem Lumi-Imager von der Firma Roche Diagnostics quantifiziert (1).
Man erkennt, daß 1 h nach Induktion des Expressionssystems und damit verbundener Bildung von Proteinaggregaten (inclusion bodies) sowohl ibpB als auch dnaK maximal exprimiert werden. Beide Chaperone werden offensichtlich zu diesem Zeitpunkt benötigt. Umgekehrt können beide Gene als Marker für diesen speziellen physiologischen Zustand von E. coli angesehen werden.
Beispiel 2
Analyse der Expression des Gens acoA des grampositiven Bakteriums Bacilllus subtilis
Für die Analyse der acoA-mRNA-Level vor und nach Glukoselimitaton wurden die Northernblot-Analyse sowie die realtime-RT-PCR mit Hilfe des LightCyclers (Fa. Roche Diagnostics) verwendet. Die PCR-Primer für diese Analyse sollten zueinander ähnliche Eigenschaften (GC-Gehalt, Schmelzpunkt etc.) besitzen. Die Größe des entsprechenden PCR-Produkts sollte zwischen 300 und 750 bp (optimal: 500 bp) liegen. Zum Ableiten der Primersequenzen wurde das Computerprogramm „Primer 3" verwendet. Diese Programm ist unter http://wwwgenome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, beziehungsweise http://wwwgenome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi im Internet frei verfügbar (Stand 9.9.2002).
Der Stamm, der für diesen Versuch verwendet wurde, ist Bacillus subtilis 168. Die Zellen wurden in Minimalmedium (Stülke et al., 1993; J. Gen. Microbiol., Bd. 139, S. 2041–2045) kultiviert. Die Hauptkultur wurde mit einer Übernachtkultur so beimpft, dass eine Anfangs-OD_{540 nm} von 0,05 erreicht wurde. Die Kultur wurde in einem kleinen Fermentor (500 ml Arbeitsvolumen) bei 37°C inkubiert. Die erste Probenahme für die RNA-Analyse erfolgte bei einer OD von 0,4 (entspricht Nullprobe in der exponentiellen Wachstumsphase, beziehungs weise vor dem Streß). Das Probenvolumen wird dabei genau auf OD 16 eingestellt ( zum Beispiel OD₅₀₀ = 0,4 → 16:0,4 = 40 ml ernten). Die zweite Probe für die RNA-Isolation erfolgte 30 min, 1 h sowie 2 h nach dem Übergang in die stationäre Wachstumsphase.
Der Aufschluß der Zellen erfolgte mit dem Gerät RiboLyser (Fa. ThermoLifeSciences) durch eine mechanische Zerstörung der Zellen durch die im Reaktionsgefäß vorhandenen Glaskügelchen (Glasperlen 0,1–0,11 mm ⌀, Fa. B. Braun Biotech) hervorgerufen durch die Drehbewegungen des RiboLysers. Um RNAse-Aktivität zu vermeiden, wird dem Reaktionsansatz saures Phenol zugesetzt. Nach dem Zellaufschluß werden die Reaktionsgefäße auf Eis gestellt, um sie etwas abkühlen zulassen.
Die RNA-Isolation und Reinigung erfolgte mit dem KingFisher (Fa. ThermoLifeSciences). Der KingFisher ist ein Pipettierautomat. Es werden an Magnetpartikel gebundene biologische Substanzen mittels Stabmagneten in verschiedene Reaktionsgefäße überführt. Zur Isolation der gesamten RNA aus den aus lysierten Zellen wird der KingFisher in Kombination mit dem MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (Fa. Roche Diagnostics) genutzt. Das Gerät wird bei 4°C betrieben.
Die Analyse der acoA-mRNA Mengen vor und nach dem Streß erfolgte mit Hilfe der Northern-blot-Analysen nach Standard-Protokollen. Das Ergebnis ist in 2 dargestellt.
Tabelle 3: Über Quantifizierung der Signale der Northern-blot-Analyse von Figur 2 ermittelte Expressionsniveaus des Gens acoA zu verschiedenen Zeitpunkten während das Wachstums von B. subtilis.
Man erkennt, daß das Gen acoA in der frühen stationären Phase maximal exprimiert wird, daß hier also im vorliegenden Beispiel Glucose-Limation aufgetreten ist. Dieses Gen kann also als Markergen für diesen speziellen physiologischen Zustand von B. subtilis angesehen werden, beziehungsweise eine erfindungsgemäße Sonde für dieses Gen sollte diesen Zustand anzeigen können.
Beispiel 3
Analyse mRNA-Niveaus der Gene dnaK und sigB des grampositiven Bakteriums Bacillus licheniformis bei Hitzeschock
Die Bestimmung der dnaK- und gsiB-mRNA-Mengen von B. licheniformis-Zellen während eines Hitzeschocks wurde mittels Northern-blot-Analyse durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Zellen des Stammes B. licheniformis DSM16 in LB-Medium bei 37°C kultiviert. Mit einer Vorkultur im logarithmischen Wachstumszustand wurde die Fermenterkultur so beimpft, daß eine OD₅₀₀ von ca. 0,05 erreicht wurde. Bei einer OD von 0,4 wurde die erste Probe für die RNA-Isolation genommen. Diese Probe stellt die Kontrolle dar. Der Hitzestreß erfolgte für 10 Minuten bei 54°C. Im Anschluß daran wurde wiederum eine Zellprobe für die RNA-Isolation entnommen.
Die Zellen beider Proben (Kontrolle, Streß) wurden wiederum mittels des Geräts RiboLyser (siehe oben) aufgeschlossen. Aus dem Lysat wurde mit Hilfe des Geräts KingFisher (siehe oben) und des MagNA Pure LC RNA Isolation Kit I (siehe oben) die Gesamt-RNA isoliert.
Definierte Mengen der isolierten RNA wurden wiederum nach Standardmethoden über Gelelektrophorese aufgetrennt und wie oben mit einer Digoxigenin-markierten spezifischen DNA-Sonde nach Herstellerangaben hybridisiert. Die Sonden zur Detektion der jeweiligen mRNA wurden nach Standard-Methoden mit der T7 RNA Polymerase von PCR-Produkten dieser Gene synthetisiert, die jeweils in Vektoren mit T7-Promotor kloniert worden waren. Das Ergebnis der Hybridisierungen mit der dnaK- und der sigB-spezifischen Sonde ist in 3A, beziehungsweise B dargestellt.
Man erkennt, daß beide Sonden für die Hitzeschocksituation ein Signal ergeben, das über dem der Kontrolle liegt, wobei die dnaK-Sonde gegenüber der Kontrolle ein besonders klares Ergebnis liefert.
Beschreibung der Figuren
1: ibpB und dnaK als Markergene des gram-negativen Bakteriums Escherichia coli für die Bildung von Proteinaggregaten (inclusion bodies; vgl. Beispiel 1); Induktion des Expressionssystems bei 0h; ab diesem Zeitpunkt entstehen Proteinaggregate.
A: Expression des Gens ibpB; bestimmt über Isolierung der mRNA zum betreffenden Zeitpunkt, Bindung an einer Nylon-Membran und Hybridisierung mit einer ibpB-spezifischen Digoxigenin-markierten Sonde.
B: Expression des Gens dnaK; bestimmt ananlog A.
2: Das Gen acoA als Markergen des gram-positiven Bakteriums Bacillus subtilis für Glukoselimitation und Acetoinanwesenheit, bestimmt über Northern-blot-Analyse mit einer acoA-Sonde (vgl. Beispiel 2).
A: RNA-Gel mit folgender Bahnenbelegung:

1. frühe logarithmische Phase (OD₅₀₀ = 0,4)
2. Transient-Phase (Übergang von der exponentiellen zur stationären Phase)
3. frühe stationäre Phase (45 min nach Ende der logarithmischen Phase)
4. späte stationäre Phase (180 min nach Ende der logarithmischen Phase)
5. Erholung nach Zugabe von Glucose

B: Northernblot des unter A gezeigten Gels mit einer acoA-Sonde
3: Die Gene dnaK und sigB als Markergene des gram-positiven Bakteriums Bacillus licheniformis für Hitzeschock, bestimmt über Northern-blot-Analyse mit dnaK-, beziehungsweise sigB-Sonden (vgl. Beispiel 3).
A: Northernblot, getestet mit der dnaK Sonde; mit der folgender Bahnenbelegung:
M Marker
Co Kontrolle
54°C Nach dem Hitzeschock von 54°C
Co Kontrolle
54°C Nach dem Hitzeschock von 54°C
B: Northernblot, getestet mit der sigB-Sonde; Bahnenbelegung wie in A.

Claims

Chip, dotiert mit Sonden für mindestens eines der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen.
Chip nach Anspruch 1, dotiert mit zunehmend bevorzugt mindestens 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 28, 30, 32 oder 34 der genannten Sonden.
Chip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dotiert mit Sonden, die aus der Gruppe der Gene acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, gsiB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
Chip nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dotiert mit Sonden, die aus der Gruppe der Gene clpP, cspA, cspB, dnaK, groL, ibpA, ibpB, katE, phoA, pstS, und trxA, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen ausgewählt sind.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß von folgenden Genpaaren jeweils nur eines oder ein anderes im betrachteten Organismus gleich reguliertes Gen aus dem jeweils durch eines dieser Gene gekennzeichneten Stoffwechselweg vorhanden ist: ahpC oder ahpF; clpC oder clpP; cspA oder cspB; ibpA oder ibpB; lctP oder ldh; phoA oder phoD; purC oder purN; pyrB oder pyrP.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Sonden handelt, die auf die betreffenden Gene aus dem für den Bioprozeß gewählten Organismus ansprechen.
Chip nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii.
Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella handelt.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, zunehmend bevorzugt mehrere Sonden von den Sequenzen abgeleitet sind, die im Sequenzprotokoll unter den Nummern SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 und 81 aufgeführt sind.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 11, zusätzlich dotiert mit mindestens einer Sonde für ein zusätzliches Gen, insbesonderen einem solchen, das in einem Stoffwechsel-bedingten Zusammenhang zu dem oder den prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Genen) steht, ganz besonders für eines von diesen oder dieses selbst.
Chip nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem prozeßbedingt zusätzlich exprimierten Gen um das für ein gewerblich einsetzbares Protein handelt, insbesondere um eine Amylase, Cellulase, Lipase, Oxidoreduktase oder Protease, oder um eines, das auf einem Syntheseweg für eine niedermolekulare chemische Verbindung liegt oder diesen wenigstens zum Teil reguliert.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden einzelsträngig, in Form des codogenen Strangs bereitgestellt werden.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden in Form einer DNA, vorzugsweise eines Nukleinsäureanalogs zur Verfügung gestellt werden.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden Genbereiche umfassen, die von dem zu untersuchenden Organismus in mRNA umgeschrieben werden, insbesondere die Genbereiche, die nahe dem 5'-Ende der mRNA liegen.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden auf Fragmente der betreffenden Nukleinsäuren ansprechen, insbesondere auf solche, die in der betreffenden mRNA, bezogen auf die jeweilige Gesamt-mRNA ein geringes Maß an Sekundärfaltung aufweisen.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine, bevorzugt mehrere Sonden eine Länge von weniger als 100 Nukleotiden, vorzugsweise von 20 bis 60 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 45 bis 55 Nukleotiden aufweisen.
Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bindung der mRNA an die betreffende Sonde ein elektrisches Signal ausgelöst wird.
Verwendung einer Sonde für mindestens eines der folgenden Gene: acoA, ahpC, ahpF, citB, clpC, clpP, codY cspA, cspB, des, dnaK, eno, glnR, groEL, groL, gsiB, ibpA, ibpB, katA, katE, lctP, ldh, opuAB, phoA, phoD, pstS, purC, purN, pyrB, pyrP, sigB, tnrA, trxA und ydjF, beziehungsweise für im betrachteten Organismus gleich regulierte Gene aus den jeweils durch diese Gene gekennzeichneten Stoffwechselwegen, gebunden an einen in den Ansprüchen 1 bis 19 bezeichneten Chip zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
Verfahren zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus durch Einsatz eines Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt.
Verwendung eines Chips nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Bestimmung des physiologischen Zustands eines einen biologischen Prozeß durchlaufenden Organismus.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem für den Bioprozeß ausgewählten Organismus um einen Vertreter einzelliger Eukaryonten, grampositiver oder gramnegativer Bakterien handelt.
Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den einzelligen Eukaryonten um Protozoen oder um Pilze handelt, hierunter insbesondere Hefe, ganz besonders Sacharomyces oder Schizosaccharomyces.
Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den grampositiven Bakterien um Coryneforme Bakterien oder solche der Gattung Bacillus handelt, hierunter inbesondere B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. lentus oder B. globigii.
Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den gramnegativen Bakterien um solche der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 oder 28 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des physiologischen Zustands zu verschiedenen Zeitpunkten desselben Prozesses durchgeführt wird, optional unter Einsatz mehrerer baugleicher Chips.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20 oder 28 bis 33, wobei es sich bei dem Prozeß um eine Fermentation, insbesondere um die fermentative Herstellung eines gewerblich einsetzbaren Produkts, besonders bevorzugt um die Herstellung eines Proteins oder einer niedermolekularen chemischen Verbindung handelt. SEQUENZPROTOKOLL