DE10240735A1

DE10240735A1 - Verwendung von Modulatoren der NO-Signalkaskade und pharmazeutische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE10240735A1
Application number: DE10240735A
Authority: DE
Inventors: Martin H. Dr. Deininger
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitätsklinikum Tübingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitätsklinikum Tübingen
Priority date: 2002-08-29
Filing date: 2002-08-29
Publication date: 2004-03-18
Also published as: WO2004024132A2; AU2003258654A1; WO2004024132A3

Abstract

Es wird eine Verwendung von Modulatoren der NO-Signalkaskade und von NO-Donoren beschrieben, wobei diese zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulation der humanen Endostatin-Expression eingesetzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Regulation der humanen Endostatin-Expression.
Endostatin ist ein ca. 20 kDa schweres C-terminales Fragment des körpereigenen Kollagen XVIII, von dem gezeigt werden konnte, daß es die Angiogenese und Tumorwachstum in vivo spezifisch hemmen kann (siehe O'Reilly et al., "Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth", Cell 88: 277-285, 1997).
Die Angiogenese oder Neovaskularisierung ist ein Vorgang, bei dem unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen neue Blutgefäße aus dem bestehenden Gefäßsystem aussprossen. Im gesunden erwachsenen Gewebe findet, abgesehen von der Wundheilung, chronischen Entzündungsprozessen oder bei der Menstruation, bzw. Schwangerschaft, keine Angiogenese statt. Eine pathologische Angiogense ist bspw. bei Psoriasis, diabetischen Retinopathien, Arthritis zu finden. Ferner fördert sie progressives Wachstum und Persistenz von Tumoren und deren Metastasen.
Die pathologische Angiogenese ist damit insbesondere in Verbindung mit Krebs, aber auch mit verschiedenen ischämischen und inflammatorischen Krankheiten von herausragender Bedeutung. Die Ischämie stellt eine Verminderung oder Unterbrechung der Durchblutung eines Organs oder Gewebes infolge mangelnder arterieller Blutzufuhr dar.
Insbesondere die Hypoxie, die als Folge der Ischämie eine verminderte Sauerstoffversorgung bestimmter Gewebe darstellt, ist in zahlreichen Krankheiten ein starker Stimulus für die Angiogenese. Zellen in Tumoren oder Wunden werden hypoxisch, wenn sie von den umgebenden Gefäßen zu weit entfernt sind.
Ohne Anschluß an die Blutversorgung werden Tumore nur wenige Millimeter groß. Erst wenn Blutgefäße ins Tumorgewebe eindringen und die Zellen mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgen, wächst der Tumor weiter. Der Sauerstoffmangel im Tumorgewebe löst die Bildung von größeren Mengen an VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aus. VEGF ist ein Wachstumsfaktor, den der Körper verwendet, um das Wachstum von Gefäßen zu stimulieren.
Durch diesen Faktor wird schließlich im Tumorgewebe die Gefäßneubildung ausgelöst.
Da – wie erwähnt – Angiogense im erwachsenen Körper kaum stattfindet, können Antagonisten der Angiogenese genützt werden, um bspw. das Wachstum von malignen Tumoren zu beeinflussen. Hier kommen neben natürlich vorkommenden Substanzen wie z.B. Endostatin oder Angiostatin auch Substanzen in Frage, die die Angiogenese stimulierenden Faktoren blockieren, also bspw. Antikörper gegen VEGF.
Das Ausmaß der Angiogenese wird v.a. durch die zelluläre Adhäsion von Endothelzellen bestimmt. Dhanabal et al., "Endostatin induces endothelial cell apoptosis", J. Biol. Chem. 274: 11721-11726, (1999) wiesen nach, daß durch Endostatin Apoptose in Endothelien bewirkt werden kann. Yamaguchi et al., "Endostatin inhibits VEGF-induced endothelial cell migration and tumor growth independently of zinc binding", EMBO J. 18: 4414-4423, (1999), konnten zeigen, daß Endostatin in vitro die endotheliale Proliferation und Migration hemmt. Diese Arbeitsgruppe konnte ferner nachweisen, daß Endostatin die durch VEGF (vascular endothelial growth factor) induzierte Migration von Endothelien inhibieren kann. Ferner wurde dargelegt, daß diese durch Endostatin vermittelte Inhibierung durch Gaben von VEGF wiederum aufgehoben werden kann.
Endostatin spielt demnach in der Kontrolle der Gefäßneubildung eine herausragende Rolle (siehe auch Moulton et al., "Angiogenesis inhibitors endostatin or TNP-470 reduce intimal neovasculatization and plaque growth in apolipoprotein Edeficient mice", Circulation 99: 1726-1732, (1999)).
Die biologische Funktion von Endostatin ist bis heute jedoch weitgehend ungeklärt. Boehm et al., "Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance", Nature 390: 404-407, (1997), zeigten, daß die Fähigkeit von Endostatin, die Neoangiogenese zu inhibieren, zumindest teilweise durch die Bindung an Zn²⁺ und durch die Prozessierung von Endostatin durch das Enzym Elastase verursacht wird (siehe Wen et al., "The generation of endostatin is mediated by elastase", Cancer Res. 59: 6052-6056, (1999)).
Endostatin ist nicht toxisch und verursacht auch keine Ausbildung von Chemoresistenzen. Boehm et al., "Zinc-binding of endostatin is essential for its antiangiogenic activity", Biochem. Biophys. Res. Commun. 252: 190-194, (1998), schlugen daher vor, Endostatin als neues und vielversprechendes Therapeutikum für solide Neoplasien, also insbesondere für Tumoren, zu verwenden.
Während also bei Tumoren gezielt die Endostatin-Expression gefördert werden soll, um eine Gefäßneubildung zu verhindern, besteht andererseits bei vielen Krankheiten das Bedürfnis, die Endostatin-Expression in den betroffenen Geweben zu inhibieren, um dort dadurch eine Gefäßneubildung vielmehr zuzulassen.
Pro-angiogene Therapien sind insbesondere von Interesse, um bspw. die Gefäßneubildung zu fördern, wenn verschlossene Gefäße umgangen werden sollen, oder um bspw. das Abheilen von Wunden zu beschleunigen.
So spielt die Angiogenese auch bei nicht-neoplastischen Krankheiten eine Rolle, wie bspw. beim Schlaganfall, der Alzheimer- Krankheit, der vaskulären Demenz, bei der plazentalen Insuffizienz usw.
In den meisten Fällen wird dabei auf den Einsatz von VEGF zurückgegriffen, um das Wachstum neuer Gefäße zu stimulieren. Die Gefäße, deren Bildung durch VEGF stimuliert wird, sind jedoch oft durchlässig und zerbrechlich. Darüber hinaus ist nicht bekannt, ob eine gesteigerte systemische Verabreichung von derartigen angiogenen Zytokinen nicht bisher ruhende Tumore stimulieren und/oder die Arteriosklerose beschleunigen wird.
Die Verabreichung von pro- oder anti-angiogenen Substanzen, die mit den körpereigenen identisch sind, ist darüber hinaus nachteilig, da zum einen die Nebenwirkungen dieser Substanzen noch nicht ganz aufgeklärt sind und noch in Tierversuchen getestet werden müssen. Ferner ist die Herstellung dieser Substanzen mit erheblichen Kosten verbunden.
Vor diesem Hintergrund ist es daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, mit denen der Endostatin-Pegel beeinflußt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Modulatoren der Stickstoffmonooxid-Signalkaskade zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung der Endostatin-Expression.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.
Die Erfinder haben erkannt, daß es durch die Modulation der Stickstoffmonooxid-Signalkaskade (im folgenden "NO-Signalkaskade") möglich ist, direkt in den Geweben, in denen Endostatin exprimiert wird, die Menge an produziertem Endostatin gezielt zu regulieren. Im Gegensatz zum Stand der Technik wird damit erfindungsgemäß die Expression beeinflußt, so daß z.B. auf die externe Zufuhr von Endostatin verzichtet werden kann.
Unter "NO-Signalkaskade" werden hierbei alle intra-, inter- und extrazellulären Vorgänge verstanden, an denen NO (Stickstoffmonooxid) beteiligt ist, wobei NO enzymatisch (also durch die NO-Synthase) oder nicht-enzymatisch (also NO-Synthaseunabhängig mittels NO-Donoren) bereitgestellt werden kann.
Der Begriff "Modulatoren" umfaßt alle Substanzen oder Maßnahmen, die geeignet sind, die NO-Signalkaskade zu beeinflussen, sei es durch Hemmung oder Stimulierung der NO-Synthase oder durch Beeinflussung der Lieferung von NO unter Umgehung der NO-Synthase.
Aufgrund seiner Beteiligung an zahlreichen bioregulatorischen Reaktionen hat NO in den vergangenen Jahren eine wachsende Aufmerksamkeit erfahren. Das hoch reaktive Gas wird durch enzymatische Oxidation von Arginin produziert, wobei diese Reaktion durch die NO-Synthase (im folgenden: "NOS") katalysiert wird. Das menschliche Genom enthält drei unterschiedliche für die NOS kodierende Gene: nNOS, die in Neuronen gefunden wird, iNOS, die in Makrophagen (aber auch vielen anderen Zellen) induziert werden kann, und eNOS, die konstitutiv oder als Antwort auf spezifische Signale in Endothelzellen exprimiert wird.
Einmal gebildetes Stickstoffmonooxid diffundiert nur lokal durch die Gewebe und ist mit einer Halbwertzeit von 2 bis 30 Sekunden sehr instabil. NO ist ein gefäßerweiternder Stoff und spielt eine herausragende Rolle in der Vermittlung vieler lokaler zellulärer Interaktionen, wie bspw. die lokale Kontrolle der Kontraktibilität der arteriellen glatten Muskulatur. Neben den Gefäß-protektiven Funktionen ist das Radikal NO zytotoxisch im Rahmen der Immunantwort.
In eigenen Versuchen konnten die Erfinder nun zeigen, daß es möglich ist, in den Geweben, in denen Endostatin nachgewiesen werden konnte, eine Endostatin-Expression zu induzieren bzw. zu inhibieren und zwar gezielt durch Gaben von Modulatoren der NO-Signalkaskade.
Die Erfinder haben erkannt, daß es dadurch möglich ist, auf externe Gaben von Endostatin zu verzichten und den Endostatin-Level erstmals direkt im Körper zu beeinflussen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Modulatoren Hemmer der NO-Synthase eingesetzt.
Durch eine Hemmung der NO-Synthase kann die Produktion von NO reduziert bzw. inhibiert werden, wodurch auch die Expression von Endostatin gehemmt wird, was die Erfinder in eigenen Versuchen zeigen konnten.
Durch die verminderte Expression von Endostatin wirkt dieses Protein nicht mehr hemmend auf die Angiogenese, weshalb eine verstärkte bzw. normale Gefäßneubildung ausgehend von denjeni gen Zellen stattfinden kann, in denen die Endostatin-Expression gehemmt wird .
In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Hemmer der NO-Synthase Substanzen eingesetzt, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Aminoguanidin, N(G)-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME), N(G)-monomethyl-L-argininacetat (L-NNMA), N(omega)-Nitro-L-arginin, S-Methylisothioharnstoff, S-2-Aminoethylisothioharnstoff, S-Ethyliosthioharnstoff, 2-Amino-4-methylpyridin und L-N(6)-(1-Iminoethyl)lysin.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, daß es mit einer bestimmten Menge bspw. von Aminoguanidin möglich ist, gezielt die NO-Synthase zu inhibieren, und dadurch die Expression von Endostatin zu regulieren. Hierzu wurde die Endostatin-Expression und -Freisetzung in vier verschiedenen endothelialen Zellinien analysiert.
Die Erfinder stimulierten mittels H₂O₂ – einem Modell der Sauerstoffradikalbelastung – in verschiedenen Zelltypen die Endostatin-Expression und zeigten anschließend, daß es durch Gaben von NO-Hemmern möglich war, diese Induktion zu reduzieren.
Aminoguanidin, L-NAME, N(G)-monomethyl-L-argininacetat (L-NNMA), N(omega)-Nitro-L-arginin, S-Methylisothioharnstoff, S-2-Aminoethyliso-thioharnstoff, S-Ethyliosthioharnstoff, 2-Amino-4-methyl-pyridin und L-N(6)-(1-Iminoethyl)lysin sind im medizinischen Fachgebiet hinreichend bekannt und wurden in Tests eingehend geprüft. So wurde z.B. Aminoguanidin bspw. zur Inhibierung der NO-Bildung in der glatten Muskulatur und im Zusammenhang mit Diabetes zur Hemmung der Bildung von überzuckerten Proteinen, den sogenannten Advanced-Glycation-Products (AGE), eingesetzt.
Ein Einsatz dieser Substanzen zur Regulation der Endostatin-Expression ist bisher weder gezeigt noch vorgeschlagen worden.
Ferner werden in einer bevorzugten Ausführungsform NO-Fängerreagenzien als Modulatoren der NO-Signalkaskade eingesetzt.
Derartige NO-Fängerreagenzien sind bspw. Enzyme wie Zytochrom C Nitrit Reduktase, NADH: (flavo)rubredoxin Reduktase; sie dienen dazu, das in Geweben produzierte NO abzufangen. Durch diese Fängerreagenzien wird der NO-Gehalt in den betreffenden Geweben reduziert, wodurch eine Reduktion der Endostatin-Expression erzielt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verwendung der Modulatoren bei degenerativen und/oder infektiösen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (im folgenden: ZNS), und insbesondere bei der Alzheimer-Krankheit, beim Schädel-Hirn-Trauma und bei zerebraler Malaria.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, daß bei degenerativen und infektiösen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (im folgenden "ZNS") Endostatin von glialen, endothelialen, immunologischen und neuronalen Zellen exprimiert, sezerniert und durch die NO-Signalkaskade moduliert werden kann. Die Erfinder konnten zeigen, daß intrazelluläres und extrazelluläres Endostatin in diesem Zusammenhang nicht nur den Zelltod von Endothelien, sondern auch den Zelltod von Gliazellen und Neuronen bewirkte.
Durch den Einsatz von Hemmern der NO-Signalkaskade bei infektiösen Erkrankungen des ZNS wird die Expression von Endostatin inhibiert, wodurch das Protein seine apoptotische Wirkung auf Endothelien nicht ausüben kann.
Die Alzheimer-Krankheit ist eine progressive Demenz mit Störungen es Gedächtnisses, der Merkfähigkeit und der Orientierung. Eine fakultative neuropathologische Veränderung im Zusammenhang mit dieser Erkrankung ist bspw. ein Neuronenverlust, wobei der exakte Mechanismus des neuronalen Untergangs unklar bleibt.
Bei Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt waren, konnte Endostatin in Zellen aller kortikaler Schichten beobachtet werden. Ferner konnte Endostatin in Neuronen nachgewiesen, aber auch extrazellulär und in der direkten Umgebung von Blutgefäßen gefunden werden. Aus diesem Grund kann durch die Gabe von Hemmern der NO-Signalkaskade erreicht werden, daß die Produktion von Endostatin und damit dessen Freisetzung in umgebende Zellen gehindert werden kann. Durch diese Endostatin-Expressions-Inhibierung kann der Zelltod von Neuronen verhindert werden.
Im Zusammenhang mit dem Schädel-Hirn-Trauma spielen primäre Läsionen, wie Zerreißungen, Blutungen, Hirnödem, Ischämien etc. eine Rolle. Behandlungsstrategien für Schädel-Hirn-Traumata zielen auf Revaskularisierungstherapien ab, mit dem Ziel, den Blutfluß in der geschädigten Region zu verbessern.
Bei der zerebralen Malaria spielen inflammatorische Zytokine eine maßgebliche Rolle. Sie zerstören die endotheliale Integrität, induzieren die Aktivierung von Astrozyten und verursachen eine Immunantwort. Ein Ziel in der Therapie der pathogenen Phänomene der zerebraler Malaria ist es, zerstörte interzelluläre Endothelverbindungen und zerstörte gliale Zellsubstanzen zu behandlen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als Modulatoren der NO-Signalkaskade NO-Donoren eingesetzt.
Der Ausdruck "NO-Donor" impliziert hierin, daß die betreffende Verbindung den aktiven Botenstoff, nämlich NO, freisetzt.
Die Erfinder haben in eigenen Versuchen erkannt, daß durch die Gabe von NO-Donoren die Expression von Endostatin stimuliert werden kann. Eine gesteigerte Menge an Endostatin in den betreffenden Geweben kann zu einer reduzierten, oder sogar inhibierten Gefäßneubildung führen.
Dabei ist bevorzugt, wenn als NO-Donoren Substanzen eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Sodium-Nitroprussid; Spermin; Sydnonimine, insbesondere Molsidomin, 3-morpholino-sydnonimin (SIN-l); und organische Nitrate, insbesondere Glyceroltrinitrat.
Die oben genannten NO-Donoren sind im Fachgebiet hinreichend bekannte Substanzen und werden seit längerem in der Medizin eingesetzt. So findet Sodium-Nitroprussid als gefäßerweiternde Substanz bspw. seine Anwendung als Antihypertonikum.
Der Einsatz der genannten NO-Donoren zur Regulation der Endostatin-Expression ist bisher im Stand der Technik nicht bekannt und wird dort auch nicht vorgeschlagen.
In eigenen Versuchen konnten die Erfinder zeigen, daß bestimmte Mengen an Spermin und an Sodium-Nitroprussid die Expression von Endostatin induzierten. Auf diese Weise ist es möglich, durch die Gabe der genannten NO-Donoren die Expression von Endostatin hochzuregulieren.
Die Erfinder zeigten weiterhin, daß es möglich ist, diese durch NO-Donoren induzierte Endostatin-Expression wiederum durch andere Substanzen gezielt zu inhibieren.
Ferner werden bei einer anderen Ausführungsform Stimulatoren der NO-Synthase als Modulatoren der NO-Signalkaskade eingesetzt.
Die Induktion der NO-Synthasen gilt gemeinhin als Reaktion auf einen pathologischen Stimulus, wozu bspw. Hypoxie, Entzündung, Neoplasie und Trauma zählen, es sind aber auch biochemische (funktionelle) Stimulatoren zu erwähnen.
Derartige Stimulatoren sind aus der Literatur vielfältig bekannt; sie induzieren die Expression der NO-Synthasen. Diese produzieren vermehrt NO, wodurch die Endostatin-Expression in den betreffenden Geweben induziert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verwendung bei Tumoren, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Glioblastom, Astroblastom und Oligodendrogliom.
Die Erfinder konnten in eigenen Versuchen zeigen, daß in Geweben aus Tumoren, wie bspw. dem Glioblastom, Astroblastom oder Oligodendrogliom Endostatin exprimiert wird. In 7 verschiedenen Gliomzellinien konnte durch Zugabe von NO-Donoren, wie bspw. Sodium-Nitroprussid, die Expression von Endostatin induziert werden.
Weiterhin werden in einer anderen Ausführungsform physikalische Maßnahmen als Modulatoren der NO-Signalkaskade eingesetzt, um die Menge an NO in den betreffenden Geweben zu steuern. Derartige physikalische Maßnahmen können bspw. physikalische Gewebebelastungen sein. Über diese Steuerung des NO-Levels wird die Endostatin-Expression reguliert.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest einen der Modulatoren der NO-Signalkaskade enthält, um in einer der neuen Verwendungen eingesetzt zu werden.
Dabei ist nicht ausgeschlossen, daß die Zusammensetzung mehrere der genannten Modulatoren enthält.
Die Zusammensetzung kann darüber hinaus auch weitere Zusatzstoffe und/oder Träger enthalten, die üblicherweise bei der Zubereitung einer zu verabreichenden pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Solche Inhaltsstoffe sind z.B. Verdünnungsmittel, Bindemittel, Suspensionsmittel, Schmiermittel, Stabilisatoren usw. Dazu zählen, sind aber nicht hierauf beschränkt, z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche Öle, Polyethylenglykole, Monoglyceride, etc. Eine Übersicht über derartige Inhaltsstoffe findet sich bspw. in A. Kibbe, "Handbook of pharmaceutical Excipients", 3. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press.
Je nach Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung, also oral oder parenteral, wird die Zusammensetzung formuliert sein, also bspw, in Form von Kapseln, Tabletten oder aber flüssigen Zubereitungen. Die Verabreichung kann ferner, in Abhängigkeit vom Patienten und der Erkrankung, systemisch oder lokal und zielgerichtet vorgenommen werden.
Ferner kann die Zusammensetzung weitere aktive Inhaltsstoffe oder Arzneimittel aufweisen, wie bspw. Interferone u.ä.
Weitere Vorteile ergeben sich aus den Figuren und den nachfolgenden Beispielen.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren und in dem Beispiel näher erläutert.
Es zeigen:
1a Western-Blots von LN-229-Gliomzell-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich des Zeitverlaufs der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Stimulation;
1b Western-Blots von LN-229-Gliomzell-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin (AG) und L-NAME und der Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid (SNP);
2a Western-Blots von SVHCEC-Endothelzell-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich des Zeitverlaufs der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Stimulation;
2b Western-Blots von SVHCEC-Endothelzell-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin (AG) und L-NAME und der Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid (SNP);
2c durchflußzytometrische Analysen der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin und L-NAME und die Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid in den endothelialen Zellinien MS1, SVR, YPEN-1;
3a Western-Blots von Jurkat-T-Zell-Lysaten (oben) und – Überständen (unten) bezüglich des Zeitverlaufs der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Stimulation;
3b Western-Blots von Jurkat-T-Zell-Lysaten (oben) und – Überständen (unten) bezüglich der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin (AG) und L-NAME und der Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid (SNP);
3c Western-Blots von U937-Makrophagen-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin (AG) und L-NAME und der Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid (SNP);
4a Western-Blots von SKNSH-Neuronen-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich des Zeitverlaufs der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Stimulation;
4b Western-Blots von SKNSH-Neuronen-Lysaten (oben) und -Überständen (unten) bezüglich der Endostatin-Inhibition durch Aminoguanidin (AG) und L-NAME und der Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid (SNP);
5 die Propidium-Iodid-Aufnahme nach Endostatin-Transduktion in SKNSH-Neuronen.
Beispiel
Material und Methoden
1. Patienten
Für die immunhistochemischen Experimente wurde die Expression von Endostatin in 41 Glioblastompatienten, 42 Oligodendrogliompatienten sowie 7 Kontrollpatienten ohne neuropathologische Veränderungen durchgeführt, ferner in 8 Patienten mit Morbus Alzheimer, 18 mit Schädel-Hirn-Trauma und 7 mit zerebraler Malaria.
2. Herstellung von rekombinantem Endostatin und Antikörperproduktion
Die cDNA des carboxyterminalen Endostatinfragments von Kollagen XVIII wurde mit RT-PCR aus einer Mausleber-mRNA-Probe kloniert und in einen pET-Expressionsvektor umkloniert (AGS, Heidelberg, Deutschland). Rekombinantes Endostatin wurde in BL21(DE3) E.coli-Zellen (AGS, Heidelberg, Deutschland) durch Induktion mit IPTG (Isopropyl-l-thio-β-D-galactosid) für 4 Stunden produziert und mittels Nickel-Chelat-Chromatographie aufgereinigt.
Die Protein-Konzentration wurde nach Bradford mit Rinderserum Albumin als Standard bestimmt (Bio-Rad, München, Deutschland). Die Endotoxin-Konzentration der Peptid-Lösung war < 10 pg/ml und wurde mit einem chromogenen "Limulus Amoebocyte-Lysat-Assay" (Bio-Whittaker, Inc., Walkersville, USA) bestimmt.
Um monoklonale Antikörper herzustellen, wurden Balb/c-Mäuse mit 50 μg rekombinantem Endostatin immunisiert und Hybridom-Zellinien nach Standardprozeduren hergestellt. Die Zellüberstände wurden mittels ELISA, Western-Blotting und Immunohistochemie auf ihre Spezifität hin geprüft und positive Linien subkloniert.
Die Spezifität der Antikörper wurde durch Blockierungsversuche mit rekombinantem Endostatin und mit einem Kontrollpeptid durchgeführt. Anschließend wurden die Antikörper affinitätsgereinigt (BMA Biomedicals, Augst, Schweiz), nochmals überprüft und in den unten dargestellten Versuchen in den angezeigten Konzentrationen verwendet.
Immunhistochemie
Für Markierungsversuche zum Nachweis von Endostatin wurden Objektträger, auf die Schnitte von Gewebeblöcken aus Patientenproben aufgebracht wurden, entparaffinisiert, in einem Mikrowellenherd inkubiert, mit unspezifischem Schweineserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) inkubiert und mit dem monoklonalen Antikörper Maus-anti-Endostatin (Herstellung: s.o.) bei einer Konzentration von 10 μg/ml über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurden die Schnitte für 30 min mit biotinyliertem Kaninchen-anti-Maus-IgG (DAKO, Hamburg, Deutschland) inkubiert, anschließend gewaschen und mit Streptavidin-AB-Komplex (DAKO) für 30 min inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt erfolgte die Gegenfärbung (Harris Hämalaun), Dehydrierung und Versiegelung.
Zur Charakterisierung der angefärbten Zellen wurde zunächst ein zellspezifisches Antigen gefärbt und danach Endostatin visualisiert. Dazu wurden die Schnitte entparaffinisiert, in einem Mikrowellenherd inkubiert und mit unspezifischem Schweineserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) inkubiert. Dann wurden differenzierende Antikörper gegen GFAP (glial fibrillary acidic protein, Boehringer, Mannheim, Deutschland), LCA (Leucocyte common antigen, DAKO), HLA-DR, -DP, DQ (DAKO), CD68 (Makrophagen, DAKO), CD3 (T-Zellen, DAKO), CD20 (B-Zellen, DAKO), CD31 (Endothelien, DAKO), von-Willebrandt-Faktor (Endothelien, DAKO), Neurofilament (Neurone, DAKO), Neuronen spezifische Enolase (Neurone, DAKO) , amyloid-β₁ _-40 (AB_1-40 Sigma, Deisenhofen, Deutschland) oder Tau Protein (DAKO) in einer Verdünnung von 10 – 100 μg/ml in 10 % BSA (bovines Serumalbumin)/TBS (Trisbalanced Saline) auf die Schnitte gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die gebundenen Antikörper wurden mit biotinyliertem Kaninchen anti-Maus IgG (DAKO) inkubiert und mit einem alkalische-Phosphatase-konjugiertem AB-Komplex (DAKO) visualisiert. Anschließend wurde mit "Fast-Blue-BB-Salz-Chromogen-Substrat-Lösung" entwickelt, was zu einem blauen Präzipitat an der Stelle gebundener Antikörper führte. Um Antikörper-Kreuzreaktivität in Doppelfärbeexperimenten zu vermeiden, wurden die Schnitte wiederum in einer Mikrowelle inkubiert. Dann wurde Endostatin wie oben beschrieben mit dem Antikörper Mausanti-Endostatin (Herstellung: s.o.) visualisiert.
Zellkultur und Stimulation
Die folgenden Zellinien wurden analysiert:

– SVHCEC Endothelzellinie, isoliert aus Kapillaren des Gehirns;
– Maus MS1, Maus SVR, Ratte YPEN-1 Endothelzellinien und die humane Neuroblastomzellinie SKNSH, jeweils erworben von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA);
– die humanen glialen Zellinien LN229, U373MG, U251MG, U87MG, T98G, LN319 und W428, erhalten von der Neurologischen Klinik, Universität Tübingen (Weller et al., "Anti-Fas/APO-1 anatibody-mediated apoptosis of cultured human glioma cells. Induction and modulation of sensitivity by cytokines", J. Clin. Invest. 94: 954-964, (1994);
– Jurkat T Zellen, Raji B Zellen und die U937 Makrophagen-Zellinie, erworben von ATCC.

Alle Zellinien wurden in RPMI 1640 Medium, unter Zusatz von Glutamax II (Gibco BRL, Paisley, Großbritannien), 10 % fetalem Kälberserum (Gibco), 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (Fluka, Buchs, Schweiz) bei 37°C und 5 % CO₂ kultiviert.
In Stimulationsexperimenten wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und in serumfreiem Medium aufgenommen. 2 mM CoCl₂ wurde für 24 Stunden zugegeben, ein Modell zellulärer Hypoxie, oder 20 mM H₂O₂ für 15 Minuten, um die Belastung mit Sauerstoffradikalen zu stimulieren. Bei diesem Modell, bzw. durch die Sauerstoffradikale, werden die Zellen zur Bildung von Endostatin stimuliert. In Screening-Experimenten wurden die Zellen danach für 24 Stunden in serumfreiem Medium inkubiert, in den zeitabhängigen Induktionsversuchen jeweils für die in den Figuren angegebene Zeitspanne. 2 mM Sodium-Nitroprussid (SNP, Sigma), ein NO-Synthase-unabhängiger NO-Donor, wurde den Zellen in serumfreiem Medium für 4 Stunden zugegeben, um eine kausale Verbindung zwischen NO-Bildung und Endostatin-Expression zu analysieren.
In den Inhibitionsexperimenten wurden die Zellen zunächst mit 5 mM Aminoguanidin (AG, Sigma) oder 1 mM N(G)-Nitro-Largininmethylester (L-NAME, Sigma) für 24 Stunden vorinkubiert und dann anschließend mit 20 mM H₂O₂ wie bereits oben beschrieben stimuliert und für 2 Stunden in serumfreiem Medium inkubiert.
Die Spezifität der erlangten Ergebnisse wurde z.T, durch Inkubation der Zellen mit einer weitaus niedrigeren SNP-Konzentration von 0,2 μM für die angegebene Zeitspanne und durch Vorinkubation für 24 h mit dem löslichen Guanylatzyklase-Inhibitor 1H-(1.2.4)Oxadiazolo(4,3-A)-quinoxalin-1-on (ODQ, Sigma-Aldrich) bei einer Konzentration von 20 μM und anschließender 100 μM SNP-Inkubation überprüft. Darüber hinaus wurden die Zellen in einzelnen Experimenten mit 400 U/ml Interferon-γ (Peprotech, Rocky Hill, USA) für 4 h in serumfreien Medium inkubiert. Die Zellen wurden anschließend für weitere Analysen trypsiniert, zentrifugiert und wie unten dargestellt weiterbehandelt.
Eine humane Buffy Coat Präparation wurde aus einem Erythrocytenkonzentrat mittels Histopaque (Sigma) Technik isoliert. Die Zellen wurden für 24 h in serumfreiem Medium (Bio Whittaker, X-VIVO^TM15) inkubiert, mit H₂O₂ wie beschrieben stimuliert und die Proteine der Zellen und des Überstandes wie unten angegeben isoliert.
Zerebelläre Körnerzellen wurden aus 8 Tage alten Spraque-Dawley-Ratten isoliert und in poly-L-Lysin-beschichtete Kulturplatten oder 24-Well-Platten ausgesät. Die Zellen wurden in einer Dichte von 2,1 × 10⁵ Zellen/cm² in basal modified Eagle's (BME) Medium mit 10 % fetalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und 20 μg/ml Gentamycin inkubiert. Zellen in depolarisierendem Medium wurden mit 20 mM KCl supplementiert, um eine Endkonzentration von 25 mM K⁺ zu erreichen. Ara-C (10 μM) wurde dem Kulturüberstand nach 24 Stunden zugegeben, um das Wachstum nichtneuronaler Zellen zu induzieren.
Rekombinantes Endostatin und irrelevante Kontrollproteine wurden in den angegebenen Konzentrationen zugegeben und für unterschiedliche Zeitspannen inkubiert. In Experimenten mit Inkuba tionszeiten über 24 Stunden wurde das Medium täglich gewechselt.
Protein-Präparation und Western Blotting
Konditionierter Überstand der Zellkulturen wurde gesammelt, die darin enthaltenen Proteine mittels Azeton-Fällung für 15 min bei –20°C isoliert und in der Folge in 2x Proben-Puffer aufgelöst. Die Auftrennung der Proteine erfolgte auf herkömmliche Weise auf einem 12%-SDS-Polyacrylamid-Gel, geblottet wurde auf PVDF-Membranen (Biorad, München). Die Nachweise erfolgten mit primären monoklonalen Antikörpern gegen Endostatin, oder gegen iNOS, eNOS oder nNOS. Die Visualisierung erfolgte mit einem HRP (Horse Raddisk Peroxidase)-konjugierten Zweitantikörper.
Durchflußzytometrie
Die Zellen wurden trypsiniert, zweimal gewaschen und anschließend mit Methanol für 15 Minuten bei 20°C permeabilisiert oder unfixiert und unpermeabilisiert analysiert. Die Zellen wurden mit einem monoklonalem Maus-anti-Endostatin und polyklonalen Ziege-anti-iNOS, Ziege-anti-eNOS oder Ziege-anti-nNOS (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, USA) für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Visualisierung erfolgte durch die Zugabe von FITC-konjugiertem Affen-anti-Ziegen- oder Kaninchen-anti-Maus-IgG (Serotech, Oxford, Großbritannien), und zwar für 30 Minuten bei 4°C. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und unter Verwendung eines FACScan-Zytometer (Becton Dickinson, Überlingen, Deutschland) und der CellQuest-Software analysiert. Kontrollen beinhalteten das Weglassen des Primärantikörpers, sowie die Verwendung von unspezifischen Primärantikörpern.
RNA-Extraktion und reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Hirntumorgewebe oder Zellinien wurden unfixiert gesammelt und die gesamte RNA mit dem RNeasy^® Minikit-Protokoll, wie vom Hersteller beschrieben, extrahiert (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland). cDNA wurde daraufhin mit Random Hexamers, RNAsin^® Ribonucleaseinhibitor und Moloney-Murine-Leukemia-Virus-Reverse-Transkriptase (Promega, Madison, USA) hergestellt. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37°C und 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Die cDNA-Konzentrationen wurden in allen Experimenten normalisiert, um vergleichbare PCR-Produkte zu erhalten. Die Polymerasekettenreaktion wurde anschließend mit dem Thermus aquaticus-(Taq)-DNA-Polymerase-Minikit (Promega) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Endostatin-spezifischen Primer waren: 5'-ATCGTCAACCTCAAGGACGA-3' und 5'-TAGCACGATGTAGGCGTGAT-3'.
Es wurde eine einzelne Bande erhalten, die einem 306-bp-Fragment der humanen Endostatin-cDNA entsprach, wie durch anschließende Subklonierung und Sequenzierung bestätigt wurde. Die RNA-Integrität der untersuchten Gewebe wurde mit β-Actin forward (5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3') und reverse (5'-GGAGCARTGATCTTGATCTTC-3')-Primern bestätigt, die ein 150-bp-Fragment der humanen (β-Actin-cDNA ergaben. Die Reaktionsbedingungen waren: Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, 30 Zyklen mit Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Annealing bei 55°C für 30 Sekunden und Elongation bei 72°C für eine Minute. Abschließend wurde die Reaktion bei 72°C für 10 Minuten inkubiert. Die resultierenden Reaktionsprodukte wurden auf Agarose-Gelen analysiert, die mit 0,5 mg/ml Ethidiumbromid gefärbt waren.
Adenovirale Transduktion von Endostatin in Zellen des ZNS
Zur Herstellung von einem adenoviralen Endostatin-tragenden Vektor sowie Null und green fluorescent protein (GFP)-tragenden Kontrollvektoren wurde die cDNA murinen Endostatins von zwei Wochen alten C57BL/6-Mäuselebern durch PCR isoliert. Zusätzlich wurde die 18-Aminosäuren-lange E3/19K-Signalsequenz (MRYMILGLLALAAVCSAA) oberhalb der Endostatin-Sequenz eingefügt, um die Signalsequenz-murines Endostatin (ss-mEndo) Kassette zu bilden. Dieses Konstrukt wurde in das adenovirale Shuttle-Plasmid pAd/CMV.1 eingefügt und mit E1-deletierter Ad5 DNA rekombiniert. Der das resultierende Endostatin kodierende adenovirale Vektor wurde dann in 293 Zellen (ATCC) amplifiziert. Eine ähnliche Strategie wurde benutzt, um Kontrollviren mit GFP oder ohne Transgen herzustellen. Die Zellen wurden mittels Plaque-bildendem Assay in 293 Zellen titriert.
Für die Transduktionen wurden adenovirale Vektor-Präparationen in Serum-reduziertem Opti-MEM-Medium (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) verdünnt und in multiplicity of infection (MOI)-Einheiten bis zu 1000 zu 3 × 10⁵ Zellen pro 6-Well-Platte zugegeben. Die Transduktion erfolgte bei 37°C für 3 Stunden, dann wurde das virenhaltige Medium aspiriert, die Zellen in frischem Medium für 48 Stunden kultiviert und in der Folge analysiert wie beschrieben.
3. Ergebnisse
Zunächst wurde die Expression von Endostatin in Erkrankungen des ZNS untersucht.
Um die basale Expression von Endostatin in Zellen der untersuchten Gewebe zu analysieren, wurden die Färbeexperimente der verschiedenen Zellen ausgewertet.
Expression von Endostatin in glialen Neoplasien
Sowohl in den untersuchten Astrozytomen als auch in den Oligodendrogliomen fanden sich Endostatin-exprimierende Makrophagen/Mikrogliazellen und Tumorzellen in Regionen soliden Tumorwachstums.
In Gehirnen von Patienten, die an Morbus Alzheimer verstarben, konnte Endostatin in Zellen aller cortikaler Schichten beobachtet werden.
In Patienten, die nach Schädel-Hirn-Trauma (SHT) starben, akkumulierten Endostatin-exprimierende Zellen in und in der Nähe von Arealen mit Gewebezerstörung.
In Gehirnen von Patienten, die an zerebraler Malaria verstarben, fand sich Endostatin-Expression hauptsächlich in Makrophagen und Mikrogliazellen in Dürck'schen Granulomen.
Mechanismen der Endostatin-Regulation in glialen Zellen
Durchflußzytometrie und Western-Blotting von LN229-Lysaten und Überständen wurden benutzt, um Endostatin-Expression und – Sekretion nach Vorinkubation der Zellen mit den NOS-Inhibitoren Aminoguanidin und L-NAME und nach Gabe des chemischen NO-Donors Sodium-Nitroprussid zu analysieren. In allen analysierten Über ständen fand sich hier die 20 kDa Endostatin-Bande, die in den Gliomzelllysaten schwächer war.
Um Mechanismen der Endostatin-Induktion in Gliomzellen zu identifizieren wurde die Endostatin-Expression und -Sekretion nach H₂O₂-Stimulation, einem Modell der Sauerstoffredikalbelastung, analysiert. Um detailliertere Informationen über die Endostatin Induktion zu zeigen, wurden eine sequentielle Durchflußzytometrie, RT-PCR und Western Blotting von LN229 Lysaten und Überständen bis 4 h nach H₂O₂-Stimulation durchgeführt. In 1a sind die Ergebnisse der Western-Blots bezüglich des Zeitverlaufs der Endostatin-Expression in LN229-Lysaten (oben) und LN229-Überständen (unten) dargestellt. Es konnte hier eine schnelle Induktion der Endostatin-Sekrektion nach 1 h und intrazelluläres Endostatin 3 h nach H₂O₂-Stimulation beobachtet werden. Die Western-Blotting-Ergebnisse der Lysate zeigten nur schwach Endostatin-immunreaktive Banden.
Für die Analyse der Endostatin-Expression und -Sekretion wurden die Zellen mit den NOS-Inhibitoren Aminoguanidin und L-NAME vorinkubiert und der chemische NO-Donor Sodium-Nitroprussid hinzugegeben. In Inhibitionsversuchen (also bei Gaben von Aminoguanidin und L-NAME) wurden die Zellen 1 h nach H₂O₂-Stimulation geerntet und analysiert.
Die Ergebnisse dieser Studien sind anhand der Western-Blots in 1b gezeigt. Aminoguanidin ist mit AG, Sodium-Nitroprussid mit SNP abgekürzt. In den Western-Blots ist klar zu sehen, daß in LN229-Überständen die Endostatin-Sekretion hauptsächlich durch Aminoguanidin reduziert werden und durch Sodium- Nitroprussid induziert werden konnte. Nur schwach immunreaktive Banden wurden in LN299-Lysaten beobachtet.
Diese Daten zeigen sowohl den Einfluß der NO-Signalkaskade auf die Endostatin-Expression und -Sekretion, als auch detaillierte pharmakologische Daten zur Inhibition der Endostatin-Expression in Gliomzellen.
Mechanismen der Endostatin-Regulation in verschiedenen Endothelzelliniens SVHCEC-, MS1-, SVR- und YPEN-1-Zellen Zunächst wurde untersucht, ob endotheliale Endostatin-Expression und -Sekretion in den verschiedenen Endothelzellinien durch Zugabe von H₂O₂ induziert werden kann. Western-Blotting der Zelllysate zeigte die Induktion von Endostatinimmunreaktiven Banden hauptsächlich in YPEN-1-Zellen. In den Überständen konnte die Induktion von Endostatin-immunreaktiven Banden hauptsächlich in SVHCEC- und YPEN-1-Zellen beobachtet werden. Genauere Untersuchungen der Endostatin-Expression und -Sekretion wurden dann mit der Endothelzellinie SVHCEC durchgeführt. In Western-Blots wurde der Zeitverlauf der Endostatin-Induktion nach H₂O₂-Gabe in Zelllysaten und -überständen beobachtet. Die Ergebnisse dieser Stimulation sind in den Western-Blots der 2a gezeigt. In den SVHCEC-Überständen (2a, unten) konnte eine deutliche Endostatin-Induktion bis 4 h nach H₂O₂-Gabe nachgewiesen werden.
In den nächsten Experimenten wurden die Effekte von zwei NOS-Inhibitoren und einem chemischen, NOS-unabhängigen NO-Donor auf die Expression und Sekretion von Endostatin in der Endothelzel linie SVHCEC mit Durchflußzytometrie, Western-Blotting der Lysate und Überstände analysiert.
Dazu wurden SVHCEC-Zellen mit dem Inhibitor der NOS-Induktion, Aminoguanidin, einem hauptsächlichen, aber nicht kompletten Inhibitor von iNOS, und L-NAME, einem NOS-Inhibitor, der alle drei NOS-Isoformen inhibiert, für 24 Stunden vor der H₂O₂-Gabe, und mit Sodium-Nitroprussid, einem chemischen, NOS-unabhängigen NO-Donor, für 4 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in den Western-Blots der 2b gezeigt, wobei hier wiederum Aminoguanidin mit "AG" und Sodium-Nitroprussid mit "SNP" abgekürzt wurde. Western-Blotting der SVHCEC-Lysate (2b, oben) zeigte sogar stärkere Endostatin-Banden nach L-NAME-Gabe. In SVHCEC-Überständen ( 2b, unten) war eine Reduktion von Endostatin durch L-NAME und eine Induktion von Endostatin durch Sodium-Nitroprussid zu erkennen. Parallele Western-Blotting-Analysen der SVHCEC-Lysate mit Antikörpern gegen die drei NOS-Isoformen zeigte eine deutliche Reduktion der nNOS-Expression durch Aminoguanidin und L-NAME sowie eine schwächere iNOS- und eNOS-Expression (2b, Mitte).
Um zu zeigen, daß die beschriebene Modulation der Endostatin-Expression nicht auf SVHCEC-Zellen beschränkt ist, wurde mittels Durchflußzytometrie die Endostatin-Expression nach Aminoguanidin und L-NAME-Vorinkubation und nach Sodium-Nitroprussidgabe in MS1-, SVR- und YPEN-1-Zellen analysiert. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihen sind in 2c gezeigt. Aminoguanidin ist mit "AG", Sodium-Nitroprussid mit "SNP" abgekürzt, die Endostatin-produzierenden Zellen sind im Fenster "R1" der Dot-Plots dargestellt, deren relativer Prozentsatz jeweils unter den Dot-Plots. Im Vergleich zu H₂O₂-stimulierten Zellen konnte eine deutliche Reduktion der Endostatin-Expression in allen analysierten Zellinien durch Aminoguanidin beobachtet werden (siehe 2c, 1. Reihe Dot-Plots). L-NAME verursachte eine geringere Endostatin-Expression in SVR- und YPEN-Zellen (siehe 2c, 2. Reihe Dot-Plots, Mitte und rechts).
Im Vergleich zu unstimulierten Endothelzellinien fand sich eine deutliche Endostatin-Induktion durch Sodium-Nitroprussid in SVR-Zellen (siehe 2c, 3. Reihe Dot-Plots, Mitte).
In weiteren Versuchen wurden SVHCEC-Zellen mit Interferon-γ, einem weiteren NO-Donor, Spermin und niedrigeren Sodium-Nitroprussid-Konzentrationen inkubiert. Im Vergleich zu unstimulierten SVHCEC-Zellen zeigte Western-Blotting von SVHCEC-Lysaten und Überständen die Induktion von Endostatin durch Interferon-γ, durch Spermin und durch 100 μM Sodium-Nitroprussid.
In parallelen Versuchen wurden die Zellen mit ODQ (siehe oben) vor der Sodium-Nitroprussid-Zugabe inkubiert, was eine deutliche Reduktion der intrazellulären Expression und der extrazellulären Sekretion von Endostatin verursachte. Durch ODQ kann die Guanylatzyklase inhibiert werden, welche den intrazellulären NO-Rezeptor darstellt. Dies zeigt, daß die Guanylatzyklase, der intrazelluläre NO-Rezeptor, die Endostatin-Expression und – Sekretion vermittelt.
Mechanismen der Endostatin-Regulation in Immunzellen
RT-PCR mit Endostatin-spezifischen Oligonukleotiden zeigte eine Endostatin-mRNA-Expression in Jurkat-T-Zellen, Raij-B-Zellen und U937 Makrophagen.
In weiteren Experimenten wurde analysiert, ob die Expression und Sekretion in der humanen Buffy-Coat-Präparation durch H₂O₂-Gabe induziert werden kann. Es wurde eine sequentielle Analyse der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Gabe von Jurkat-T-Zellen mittels Durchflußzytometrie und Western Blotting der Lysate und Überstände durchgeführt. Western-Blotting zeigte im Vergleich zu unstimulierten Präparationen stärkere Endostatinimmunreaktive Banden in den Zelllysaten und eine Induktion der Endostatin-Sekretion in den Überständen von Jurkat-T-Zellen und U937-Makrophagen. Im Überstand vn Raji-B-Zellen konnten mehrere schwerere Banden beobachtet werden.
Um ein genaueres Bild der Endostatin-Induktion zu erlangen, erfolgte dann die sequentielle Analyse der Endostatin-Expression nach H₂O₂-Gabe von Jurkat-T-Zellen mittels Durchflußzytometrie und Western-Blotting der Lysate und Überstände bis 4 h nach H₂O₂-Stimulation. Die Ergebnisse dieser Studien sind in den Western-Blots des 3a gezeigt. Interessanterweise fand sich die stärkste intrazelluläre Endostatin-Expression nach 3 h (siehe 3a, oben) und die stärkste Endostatin-Sekretion nach 4 h (siehe 3a, unten).
Um eine kausale Beziehung zwischen Endostatin-Induktion und der NO-Signalkaskade zu beschreiben, wurden Jurkat-T-Zellen und U937-Makrophagen mit den NOS-Inhibitoren Aminoguanidin und L- NAME vor H₂O₂-Gabe und dem NO-Donor Sodium-Nitroprussid inkubiert und dann mit der Durchflußzytometrie und Western-Blotting der Lysate und der Überstände analysiert. Diese Ergebnisse bezüglich den Jurkat-T-Zellen sind in den Western-Blots der 3b gezeigt, in denen Aminoguanidin mit "AG" und Sodium-Nitroprussid mit "SNP" abgekürzt wurde. In den Zelllysaten (3b, oben) verursachten Aminoguanidin und L-NAME überraschenderweise sogar eine stärkere Expression einer Endostatinimmunreaktiven Bande. In den Überständen (siehe 3b, unten) fand sich interessanterweise eine fast vollständige Reduktion der Endostatin-Sekretion nach Amminoguanidin und eine komplette Inhibition der Endostatin-Sekretion nach L-NAME-Vorbehandlung. Nach Sodium-Nitroprussid-Gabe fand sich jedoch keine Endostatin-Sekretion.
Die Durchflußzytometrie-Ergebnisse für U937-Makrophagen zeigten eine deutliche Reduktion der Endostatin-Expression nach Aminoguanidin und L-NAME-Vorinkubation und eine massive Induktion durch Sodium-Nitroprussidgabe. Western-Blotting-Resultate sind in 3c dargestellt und zeigen hauptsächlich eine massive Endostatin-Induktion in Zelllysaten nach Sodium-Nitroprussid-Gabe (3c, oben). In den Überständen fand sich eine diskrete Reduktion der Endostatin-Sekretion nach L-NAME-Vorinkubation und eine leichte Induktion nach Sodium-Nitroprussid-Gabe ( 3c, unten).
Mechanismen der Endostatin-Regulation in Neuronen
Um Mechanismen der neuronalen Endostatin-induktion zu untersuchen, wurde die Neuroblastom-Zellinie SKNSH u.a. nach H₂O₂-Stimulation analysiert. Die Ergebnisse der Durchlfußzytometrie zeigten, daß Endostatin am stärksten nach 3 h nach H₂O₂-Gabe exprimiert wurde. Interessanterweise zeigten die Western-Blotting-Resultate der SKNSH-Lysate (siehe 4a, oben) eine schnelle Induktion einer 50 kDa schweren Endostatinimmunreaktiven Bande nach 1 h, die sich bis 4 h nach H₂O₂-Gabe deutlich verringerte. In den Überständen zeigte eine ungefähr 22 kDa und 25 kDa schwere Doppelbande denselben Verlauf (siehe, 4a, unten).
In einer nächsten Versuchsreihe wurde analysiert, ob die NO-Signalkaskade eine Rolle bei der Endostatin-Induktion spielt. Dazu wurden SKNSH-Neurone mit Aminoguanidin und L-NAME vorinkubiert und dann mit H₂O₂ stimuliert. Zusätzlich wurde der Effekt des chemischen, NOS-unabhängigen NO-Donors Sodium-Nitroprussid auf die Endostatin-Expression und -Sekretion analysiert. Die Ergebnisse zu diesen Ansätzen sind in den Western-Blots der 4b gezeigt. Die Durchflußzytometrie zeigte eine deutliche Reduktion der Endostatin-Expression nach Vorinkubation mit beiden NOS-Inhibitoren (22,95 % für AG und 32, 98 % für L-NAME, jeweils mit Bezug auf 59,81 % ohne Inihibitor) und eine diskrete Induktion nach Sodium-Nitroprussidgabe. Western-Blotting von SKNSH-Lysaten (siehe 4b, oben) und SKNSH-Überständen (siehe 4b, unten) bestätigte im Vergleich mit stimulierten Präparationen diese Ergebnisse. Interessanterweise fand sich eine massive Endostatin-Sekretion nach Sodium-Nitroprussid-Gabe.
Adenovirale Endostatin-Transduktion
Adenovirale Endostatin-Transduktion wurde dann benutzt, um mögliche Veränderungen in der Expression der NO-Synthasen und der PCNA (Proliferating-cell nuclear antigen)-Expression durch zelluläre Endostatin-Expression zu analysieren.
Für die Transduktionen wurde der unter "2. Adenovirale Transduktion von Endostatin in Zellen des ZNS" beschriebene, Endostatin-tragende Vektor (Ad-ss-mEndo) eingesetzt; die Transduktion wurde mit Mock-Transduktionen kontrolliert. Die Endostatin-Transduktion führte zu einer Endostatin-Expression und -Sekretion in allen Zellen. Die Endostatin-Transduktion bewirkte darüber hinaus eine retrograde Modulation der NO-Signalkaskade. Dies deutet darauf hin, daß bei einer erhöhten Endostatin-Expression eine Feedback-Hemmung der Expression der intrazellulären NO-Synthasen durch Endostatin stattfindet.
In 5 sind ferner die Ergebnisse einer Propidium-Iodid-Anfärbung für transduzierte neuronale SKNSH-Zellen dargestellt.
Durch Anfärben der Zellkerne mit Propidium-Iodid, das mit der DNA interkaliert, kann man zum einen unterscheiden, in welcher Phase des Zellzyklus sich eine Zelle befindet. Andererseits wird diese Methode auch verwendet, um Zellen, die der Apoptose unterliegen, zu erfassen.
Die Färbeergebnisse zeigten, daß die Transduktion der SKNSH-Zellen mit dem Endostatin-tragenden Vektor zu einer vermehrten Propidium-Iodid-Aufnahme führte (siehe 5). Diese stärkere Aufnahme von Propidium Iodid stellt ein Indiz für vermehrten Zelltod dar. Dieses Ergebnis konnte auch in abgeschwächter Form bei LN229-Gliomzellen beobachtet werden (nicht gezeigt).
Mit einem selbst hergestellten Antikörper gegen Endostatin gelang den Erfindern der Nachweis, daß Endostatin in Glioblastomen, Astrozytomen, Oligodendrogliomen exprimiert wird, außerdem ferner in Patienten mit Morbus Alzheimer, Schädel-Hirn-Trauma und zerebraler Malaria, aber nur in geringem Maße in neuropathologisch unveränderten Kontrollen in vivo. Mittels Durchflußzytometrie, RT-PCR und Western-Blotting wurden die Mechanismen der Endostatin-Induktion und Modulation sowie die Auswirkungen intrazellulärer Überexpression und etrazellulärer Akkumulation von Endostatin in 7 Gliom-Zellinien, 4 Endothel-Zellinien, 3 Immun-Zellinien und einer neuronalen Zellinie analysiert.
Endostatin-Expression und -Sekretion wurde in unterschiedlicher Ausprägung in allen untersuchten Zelltypen durch Stimulation mit H₂O₂ induziert. Diese Induktion konnte durch die Inhibitoren der NO-Signalkaskade Aminoguanidin und L-NAME reduziert werden.

Claims

Verwendung von Modulatoren der NO-Signalkaskade zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulation der humanen Endostatin-Expression.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Modulatoren Hemmer der NO-Synthase eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hemmer der NO-Synthase Substanzen eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Aminoguanidin, L-NAME, N(G)-monomethyl-L-argininacetat (L-NNMA), N(omega)-Nitro-L-arginin, S-Methylisothioharnstoff, S-2-Aminoethyliso-thioharnstoff, S-Ethyliosthioharnstoff, 2-Amino-4-methyl-pyridin und L-N(6)-(1-Iminoethyl)lysin.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Modulatoren NO-Fängerreagenzien eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung bei degenerativen und/oder infektiösen Erkrankungen des ZNS erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung bei degenerativen und/oder infektiösen Erkrankungen des ZNS erfolgt, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend, Alzheimer-Krankheit, Schädel-Hirn-Trauma und cerebrale Malaria.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Modulatoren der NO-Signalkaskade NO-Donoren eingesetzt werden.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als NO-Donoren Substanzen eingesetzt werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Sodium-Nitroprussid; Spermin; Sydnonimine, insbesondere Molsidomin, 3-morpholino-sydnonimin (SIN-l); und organische Nitrate, insbesondere Glyceroltrinitrat.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Modulatoren Stimulatoren der NO-Synthase eingesetzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung bei Tumoren erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Verwendung bei Tumoren erfolgt, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Glioblastom, Astroblastom und Oligodendrogliom.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend zumindest einen der Modulatoren der NO-Signalkaskade zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11.